Name: Metody hodowli bezpośredniej i pośredniej w badaniu biodegradowalnych materiałów implantologicznych in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Poznaj trzy metody hodowli komórek do oceny cytokompatybilności biodegradowalnych materiałów implantologicznych in vitro. Techniki te pozwalają badać interakcje między komórkami a implantami w różnych scenariuszach klinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy doceniają wsparcie finansowe ze strony U.S. National Science Foundation (nagroda NSF CBET 1512764 i NSF PIRE 1545852), National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), University of California (UC) Regents Faculty Development Fellowship, Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) oraz UC-Riverside Dissertation Research Grant (Jiajia Lin). Autorzy doceniają Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) na Uniwersytecie Kalifornijskim w Riverside za wykorzystanie SEM/EDS oraz dr Perry Cheung za użycie instrumentów XRD. Autorzy doceniają również Thanh Vy Nguyen i Queenie Xu za częściową redakcję. Autorzy chcieliby również podziękować Cindy Lee za nagranie narracji do filmu. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym artykule są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation lub National Institutes of Health.

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Różne metody hodowli komórkowych mogą być stosowane do oceny cytokompatybilności in vitro biomateriałów będących przedmiotem zainteresowania w różnych aspektach zastosowań in vivo. W artykule przedstawiono trzy metody hodowli in vitro , tj. hodowlę bezpośrednią, hodowlę bezpośrednią i hodowlę ekspozycji, w celu naśladowania różnych scenariuszy in vivo , w których biodegradowalne materiały implantologiczne są używane wewnątrz ludzkiego ciała. Metoda hodowli bezpośredniej jest stosowana ...

Przez dziesięciolecia, materiały biodegradowalne były szeroko badane i wykorzystywane w zastosowaniach biomedycznych, takich jak ortopedyczny1,2, dental3,4, oraz craniomaxillofacial5 zastosowań. W przeciwieństwie do implantów i materiałów trwałych, biodegradowalne metale, ceramika, polimery i ich kompozyty stopniowo rozkładają się w organizmie w czasie w wyniku różnych reakcji chemicznych w środowisku fizjologicznym. Na przykład metale ulegające biodegradacji, takie jak stopy magnezu (Mg)1,6,7 i stopy (Zn)8,9 są obiecującymi materiałami na urządzenia do mocowania kości. Ich biodegradowalność może wyeliminować konieczność wtórnych operacji w celu usunięcia implantów po wygojeniu kości. Biodegradowalna ceramika, taka jak cementy fosforanowo-wapniowe (CPC), wykazała ekscytujący potencjał w leczeniu osteoporotycznych złamań kompresyjnych kręgów w przezskórnej kyfoplastyce10. CPC zapewniają mechaniczne wsparcie dla złamanego trzonu kręgu i stopniowo ulegają degradacji po wygojeniu się złamania.
Biodegradowalne polimery, takie jak niektóre polisacharydy i poliestry, były również szeroko badane pod kątem zastosowań biomedycznych. Na przykład hydrożel chitozanowy jako biodegradowalny polisacharyd wykazał swoje zdolności do zapobiegania infekcjom i regeneracji tkanki skórnej11. Kwas poli-L-mlekowy (PLLA), poli(kwas glikolowy) (PGA) i poli(kwas mlekowo-ko-glikolowy) (PLGA) są szeroko badanymi poliestrami do produkcji porowatych rusztowań 2D lub 3D do zastosowań w inżynierii tkankowej12,13,14. Co więcej, materiały kompozytowe integrują dwie lub więcej faz metali, ceramiki i polimerów, aby zapewnić zaawansowane funkcje dla szerokiego zakresu zastosowań biomedycznych15,16,17. Na przykład kompozyty PLGA i fosforanu wapnia mogą być używane do wytwarzania biodegradowalnych rusztowań do zastosowań takich jak naprawa ubytków kości czaszki18. Te biodegradowalne rusztowania i implanty mogą wspierać i promować wzrost komórek i tkanek, a następnie stopniowo ulegać degradacji w organizmie w miarę upływu czasu.
Jak pokazano w Tabeli Uzupełniającej 1, różne materiały biodegradowalne mogą mieć różne mechanizmy degradacji, produkty i szybkości. Na przykład stopy magnezu, takie jak Mg-2 % wag. Zn-0,5 % wag. Ca (ZC21)1, Mg-4 wt% Zn-1 wt% Sr (ZSr41)19 i Mg-9 wt% Al-1 wt% (AZ91)20, ulegają degradacji w reakcji z wodą, a produkty ich degradacji obejmują głównie jonyMg2+, jony OH-, gazH2 i osadzanie minerałów. Szybkość degradacji metali ulegających biodegradacji różni się w zależności od ich składu, geometrii i środowiska degradacji. Na przykład Cipriano i wsp.19 poinformowali, że druty ZSr41 (Ø1,1 × 15 mm) straciły 85% masy, podczas gdy czyste druty Mg o tej samej geometrii straciły 40% masy po wszczepieniu do kości piszczelowej szczura przez 47 dni. Biodegradowalne materiały ceramiczne, takie jak hydroksyapatyt (HA) i fosforan β-triwapniowy (β-TCP), mogą ulegać degradacji w wyniku rozpuszczania cieczy zewnątrzkomórkowej pod wpływem roztworu lub rozpadać się na małe cząstki, a następnie rozkładać się zarówno w wyniku rozpuszczania cieczy zewnątrzkomórkowej, jak i procesów resorpcji za pośrednictwem komórek. Produkty degradacji tych ceramiki na bazie fosforanu wapnia mogą obejmować jony Ca2+, jony (PO4)3-, jony OH- i depozycje mineralne21. Na szybkość degradacji ceramiki fosforanowo-wapniowej istotny wpływ ma jej struktura krystaliczna. Na przykład Van Blitterswijk i wsp.22 stwierdzili, że kwas hialuronowy z mikroporami 40% obj. nie stracił masy, podczas gdy β-TCP z mikroporami 40% obj. stracił 30 ± 4% masy po wszczepieniu do kości piszczelowych królików przez 3 miesiące. Polimery takie jak PLGA14,23 mogą ulegać degradacji w wyniku hydrolizy wiązań estrowych w obecności wody, a produkty degradacji obejmują głównie kwas mlekowy i glikolowy. W przypadku PLGA 50/50 może minąć jeden miesiąc, a w przypadku PLGA 95/5 kilka miesięcy, aby osiągnąć całkowitą degradację24.
Testy odpowiedzi komórkowej i cytokompatybilności są kluczowe dla oceny i badań przesiewowych tych biodegradowalnych materiałów implantologicznych do zastosowań biomedycznych. Jednak obecne normy Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej (ISO), takie jak ISO 10993-5:2009 "Biologiczna ocena wyrobów medycznych - Część 5 Testy cytotoksyczności in vitro", zostały początkowo zaprojektowane do oceny cytotoksyczności nieulegających degradacji biomateriałów, takich jak stopy Ti i stopy Cr-Co in vitro25. W szczególności norma ISO 10993-5:2009 obejmuje jedynie badania cytotoksyczności ekstraktu in vitro, badania bezpośredniego kontaktu i pośredniego kontaktu. W teście ekstraktu ekstrakt przygotowuje się przez zanurzenie próbek w płynach ekstrakcyjnych, takich jak pożywki hodowlane z surowicą i roztworami soli fizjologicznej, w jednym ze standardowych warunków czasu i temperatury. Zebrany ekstrakt lub rozcieńczenie dodaje się następnie do hodowli komórkowej w celu zbadania cytotoksyczności. W przypadku testu bezpośredniego kontaktu bezpośredni kontakt między próbką a komórkami uzyskuje się poprzez umieszczenie badanej próbki na ustalonej (przylegającej) warstwie komórek. W pośrednim badaniu kontaktowym pożywka hodowlana zawierająca surowicę i stopiony agar jest pipetowana w celu pokrycia ustalonych komórek. Próbkę umieszcza się następnie na zestalonej warstwie agaru z filtrem lub bez.
Standardy ISO wykazały pewne ograniczenia, gdy są stosowane do oceny materiałów biodegradowalnych in vitro. W przeciwieństwie do materiałów nieulegających degradacji, zachowania degradacyjne materiałów biodegradowalnych są dynamiczne i mogą się zmieniać w różnym czasie lub w różnych warunkach środowiskowych (np. temperaturze, wilgotności, składzie mediów i typie ogniw). Test ekstraktu ocenia jedynie cytotoksyczność produktów degradacji materiału i nie odzwierciedla dynamicznego procesu degradacji próbki. Zarówno testy kontaktu bezpośredniego, jak i pośredniego zgodnie z normą ISO charakteryzują jedynie interakcje między ustalonymi komórkami a próbkami. Ponadto w badaniu kontaktu pośredniego materiały i komórki znajdują się w różnych mikrośrodowiskach, które nie odzwierciedlają środowiska in vivo i nie uwzględniają dynamicznej degradacji materiałów biodegradowalnych.
Celem tego artykułu jest wprowadzenie i omówienie metod testowania cytokompatybilności dla różnych biodegradowalnych materiałów implantologicznych, aby rozwiązać wyżej wymienione ograniczenia metod opisanych w obecnych normach ISO. Metody przedstawione w tym artykule uwzględniają dynamiczne zachowanie degradacyjne materiałów implantów oraz różne okoliczności interakcji komórka-materiał in vivo. W szczególności w tym artykule przedstawiono trzy metody testowania cytokompatybilności, a mianowicie hodowlę bezpośrednią, kulturę bezpośredniej ekspozycji i kulturę ekspozycji dla różnych materiałów biodegradowalnych, w tym polimerów biodegradowalnych, ceramiki, metali i ich kompozytów do zastosowań w implantach medycznych.
W metodzie hodowli bezpośredniej, komórki zawieszone w pożywce hodowlanej są bezpośrednio umieszczane na próbkach, oceniając w ten sposób interakcje między nowo zasianymi komórkami a implantami. W hodowli z bezpośrednią ekspozycją próbki umieszcza się bezpośrednio na ustalonej warstwie komórkowej, aby naśladować interakcje implantów z ustalonymi komórkami gospodarza w organizmie. W hodowli ekspozycyjnej próbki umieszcza się w odpowiednich wkładkach studzienkowych, a następnie wprowadza do dołków hodowlanych z ustalonymi komórkami, co charakteryzuje reakcje ustalonych komórek na zmiany w środowisku lokalnym wywołane degradacją implantu, gdy nie mają one bezpośredniego kontaktu z implantami. Metody hodowli bezpośredniej i hodowli z bezpośrednią ekspozycją oceniają komórki mające bezpośredni lub pośredni kontakt z materiałami implantów w tej samej hodowli. Kultura ekspozycyjna charakteryzuje komórki mające pośredni kontakt z materiałami implantu w określonej odległości w tej samej studzience.
Ten artykuł przedstawia szczegółowy opis testów cytokompatybilności dla różnych materiałów biodegradowalnych i ich interakcji z komórkami modelowymi, czyli mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi ze szpiku kostnego (BMSC). Protokoły obejmują zbieranie, hodowlę, wysiew, utrwalanie, barwienie i obrazowanie komórek, a także analizy materiałów i pożywek postkulturowych, które mają zastosowanie do różnych biodegradowalnych materiałów implantologicznych i szerokiej gamy typów komórek. Metody te są przydatne do badań przesiewowych materiałów biodegradowalnych do różnych zastosowań biomedycznych pod względem odpowiedzi komórek i cytokompatybilności in vitro.

<table><tbody><tr><td>Pipeta serologiczna 10 ml</td><td>VWR</td><td>490019-704</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowe płytki poddane kulturom tkankowym</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 15 ml (polipropylen)</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>Igła 18 G</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>25&frac12; Igła G</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>4&,6-diamidyn-2-dilekan fenyloindolu (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka stożkowa (polipropylen)</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m nylonowe sitko</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-105-0135</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Mąka 488-falloidyna</td><td>Technologie życia</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>LABCONCO</td><td>Klasa II, typ A2</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>Rotor F-35-6-30, Wirówka5430</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste okrągłe naczynie z topionego kwarcu</td><td>Technologia AdValue</td><td>FQ-4085</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>SANYO</td><td>MCO-19AIC</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik zamrażarki CoolCell</td> Pojemnik piankowy <td>Corning</td><td>432000</td><td>przeznaczony do regulacji spadku temperatury</td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-1020</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>EDX oprogramowanie analityczne</td><td>Oxford Instruments</td><td>AztecSynergy</td><td></td></tr><tr><td>Spektroskopia rentgenowska z dyspersją energii (EDX)</td><td>FEI</td><td>50mm2 X-Max50 SDD</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>SH30910</tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>VWR</td><td>100496-496</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ oprogramowanie</td><td>National Institutes of Health i Laboratorium Oprzyrządowania Optycznego i Obliczeniowego (LOCI, University of Wisconsin)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opcyjna spektrometria emisyjna z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-OES)</td>Mikroskop optyczny <td>PerkinElmer</td><td>Optima 8000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>VistaVision</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna (P/S)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.,</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>VWR</td><td>model SB70P</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>VWR</td><td>97062-730</td><td></td></tr><tr><td>Elektroniczny mikroskop skaningowy (SEM)</td><td>Ostrze</td> chirurgiczne <td>FEI Nova NanoSEM 450</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>76353-728</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych</td><td>VWR</td><td>T-75, MSPP-90076</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki Transwell</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctowego (Trypsin-EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Przyrząd do dyfrakcji rentgenowskiej (XRD)</td><td>PANalytical</td><td>Empireum serii 2</td><td></td></tr></tbody></table>

metody hodowli bezpośredniej i pośredniej w badaniu biodegradowalnych materiałów implantologicznych in vitro

Direct and Indirect Culture Methods for Studying Biodegradable Implant Materials In Vitro

W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat, materiały biodegradowalne były intensywnie badane do zastosowań biomedycznych, takich jak implanty ortopedyczne, dentystyczne i czaszkowo-szczękowo-twarzowe. Aby przeprowadzić badania przesiewowe materiałów biodegradowalnych do zastosowań biomedycznych, konieczna jest ocena tych materiałów pod kątem odpowiedzi komórek in vitro, cytokompatybilności i cytotoksyczności. Normy Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej (ISO) są szeroko stosowane w ocenie biomateriałów. Jednak większość norm ISO została pierwotnie ustanowiona w celu oceny cytotoksyczności materiałów nieulegających degradacji, zapewniając w ten sposób ograniczoną wartość dla badań przesiewowych materiałów biodegradowalnych. 
Ten artykuł przedstawia i omawia trzy różne metody hodowli, a mianowicie metodę hodowli bezpośredniej, metodę hodowli bezpośredniej ekspozycji oraz metodę hodowli ekspozycji do oceny cytokompatybilności in vitro biodegradowalnych materiałów implantologicznych, w tym biodegradowalnych polimerów, ceramiki, metali i ich kompozytów, z różnymi typami komórek. Badania wykazały, że metody hodowli wpływają na reakcje komórek na materiały biodegradowalne, ponieważ ich dynamiczna degradacja wywołuje różnice czasoprzestrzenne na granicy faz i w środowisku lokalnym. W szczególności metoda hodowli bezpośredniej ujawnia reakcje komórek osadzonych bezpośrednio na implantach; metoda hodowli z bezpośrednim narażeniem wyjaśnia reakcje ustalonych komórek gospodarza wchodzących w kontakt z implantami; Metoda hodowli ekspozycyjnej ocenia ustalone komórki gospodarza, które nie mają bezpośredniego kontaktu z implantami, ale są pod wpływem zmian w środowisku lokalnym spowodowanych degradacją implantu. 
Ten artykuł zawiera przykłady tych trzech metod hodowli do badania cytokompatybilności in vitro biodegradowalnych materiałów implantologicznych i ich interakcji z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi ze szpiku kostnego (BMSC). Opisuje również, jak zbierać, przechodzić, hodować, wysiewać, utrwalać, barwić, charakteryzować komórki oraz analizować pożywki i materiały postkulturowe. Metody in vitro opisane w tym artykule naśladują różne scenariusze środowiska in vivo, poszerzając zastosowanie i znaczenie badań cytokompatybilności in vitro różnych biomateriałów do różnych zastosowań biomedycznych.

Rysunek 4 przedstawia reprezentatywne obrazy fluorescencyjne BMSCs w warunkach kontaktu bezpośredniego i pośredniego z zastosowaniem różnych metod hodowli. Rysunek 4A,B przedstawia BMSCs w warunkach kontaktu bezpośredniego i pośredniego po analogicznej 24-godzinnej hodowli bezpośredniej z stopami magnezu ZC211. Stopy ZC21 składają się w 97,5% masowych z magnezu, w 2% masowych z cynku i w 0,5% masowych z wapnia. Komórki, k...

Wprowadzamy trzy metody hodowli bezpośredniej, hodowli bezpośredniej ekspozycji i kultury ekspozycji do oceny cytokompatybilności in vitro biodegradowalnych materiałów implantologicznych. Te metody in vitro naśladują różne interakcje komórka-implant in vivo i mogą być stosowane do badania różnych materiałów biodegradowalnych.

Metody hodowli bezpośredniej i pośredniej w badaniu biodegradowalnych materiałów implantologicznych in vitro

Over the past several decades, biodegradable materials have been extensively explored for biomedical applications such as orthopedic, dental, and ...

Metody hodowli bezpośredniej i pośredniej do badania biodegradowalnych materiałów implantologicznych in vitro. W ciągu ostatnich kilku dekad materiały biodegradowalne były szeroko badane pod kątem zastosowań biomedycznych, takich jak implanty ortopedyczne, dentystyczne i czaszkowo-twarzowe. Aby przeprowadzić badania przesiewowe materiałów biodegradowalnych do zastosowań biomedycznych, konieczna jest ocena tych materiałów pod kątem odpowiedzi komórkowych in vitro, cytokompatybilności i cytotoksyczności.Normy Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej są szeroko stosowane w ocenie biomateriałów. Jednak większość norm ISO została pierwotnie ustanowiona w celu oceny toksyczności stylu materiałów nieulegających degradacji, zapewniając w ten sposób ograniczoną wartość dla badań przesiewowych materiałów biodegradowalnych. W tym filmie przedstawimy i omówimy trzy różne metody hodowli, a mianowicie metodę hodowli bezpośredniej, metodę hodowli bezpośredniej ekspozycji oraz metodę hodowli ekspozycji do oceny cytokompatybilności in vitro biodegradowalnych materiałów implantologicznych.W szczególności metoda hodowli bezpośredniej ocenia interakcje między nowo wysianymi komórkami a implantami. Hodowla z bezpośrednią ekspozycją naśladuje interakcje między ustalonymi komórkami w organizmie a implantami. Hodowla ekspozycyjna charakteryzuje interakcje między ustalonymi komórkami a implantami, gdy nie są one ze sobą w bezpośrednim kontakcie, ale w tym samym środowisku, w którym materiały ulegają degradacji.Ten film zawiera przykłady zastosowania tych trzech metod hodowli do badania cytokompatybilności in vitro biodegradowalnych materiałów implantologicznych i ich interakcji z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi ze szpiku kostnego. Metody in vitro opisane w tym filmie naśladują różne scenariusze środowiska in vivo, poszerzając zastosowanie i znaczenie badań cytokompatybilności in vitro różnych materiałów do różnych zastosowań biomedycznych. Postępujemy zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Institutional Animal Care and Use Community na Uniwersytecie Kalifornijskim w Riverside w zakresie pobierania komórek i tkanek.Przygotowanie hodowli komórkowych. Trzy metody hodowli opisane w tym filmie mają ogólne zastosowanie do różnych typów komórek, które przylegają. W tym miejscu BMSC zebrane od szczurów odsadzonych od odsadzonych od szczurów zostaną przedstawione jako przykład przygotowania hodowli komórkowych Pobieranie mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego od szczurów odsadzonych od piersi.Schemat ideowy na tym rysunku przedstawia kroki zbierania BMSC od szczurów odsadzonych od piersi. Usuń skórę i mięśnie oraz tkanki łączne, aby wyciąć kość udową z uśpionego szczura. Umieść kości udowe w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej pożywkę do hodowli komórkowych.Umieść stożkowe rurki na lodzie do czasu przeprowadzenia ekstrakcji komórek. Przenieść kości na szalkę Petriego w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Odetnij końce kości za pomocą ostrza chirurgicznego i przepłucz szpik kostny do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, przemywając jamę szpiku kostnego pożywką do hodowli komórkowych za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 25 1/2.Przefiltrować zawiesinę komórkową za pomocą filtra o średnicy 70 mikrometrów, a następnie odwirować pod ciśnieniem 126-krotności grawitacji przez pięć minut, aby uzyskać granulki komórek: Odessać pożywkę supernatantową i uzupełnić 10 ml świeżej pożywki. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Odpipetować zawiesinę bezpośrednio na wewnętrznym dnie kolby T-75 i dodać pożywkę, aby zwiększyć objętość do 25 mililitrów.Hoduj komórki w inkubatorze w standardowym, sterylnym środowisku hodowli komórek, które ma 37 stopni Celsjusza, wilgotną atmosferę z 5% dwutlenkiem węgla i 95% powietrzem. Po trzech do siedmiu dniach wypłucz nieprzylegające komórki, odsysając stare podłoże i uzupełniając je świeżymi. Kontynuuj hodowlę i karmienie komórek świeżą pożywką, aż będą gotowe do przejścia przez komórkę, zamrożenia lub użycia w eksperymencie.Przygotowanie próbki i sterylizacja. Wysterylizuj lub zdezynfekuj wszystkie próbki przed hodowlą komórkową. Metody sterylizacji lub dezynfekcji dla różnych typów próbek różnią się w zależności od różnych właściwości materiałów.Ogólnie rzecz biorąc, należy używać promieniowania ultrafioletowego do dezynfekcji metali ulegających biodegradacji do badań in vitro. Metody hodowli komórkowych. Schemat ideowy na tym rysunku przedstawia etapy metody hodowli bezpośredniej.W tym filmie BMSC zostały wyhodowane na płytce pochodzącej z magnezu umieszczonej w studzienkach 12-dołkowej płytki poddanej działaniu kultury tkankowej jako przykład ilustrujący metodę hodowli. Użyj kolby z 90% konfluentem, aby określić stężenie komórek w zawiesinie komórek za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową za pomocą świeżej pożywki do zalecanego stężenia komórek potrzebnego do badania na komórkach in vitro.Umieścić próbki na środku 12-dołkowych płytek do hodowli tkankowych. Przepłukać płytki hodowlane kolejno 2 ml PBS i 2 ml DMEM, aby skalibrować ciśnienie osmotyczne w sterylnych warunkach. Dodać 3 ml rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do każdego dołka na interesujące nas próbki.Hodować komórki w inkubatorze w standardowych warunkach hodowli komórkowej przez 24 godziny. Schemat ideowy w zniekształceniu przedstawia etapy hodowli bezpośredniej ekspozycji. Przygotować zawiesinę komórek o wymaganych stężeniach komórek w oparciu o projekt doświadczalny dla różnych typów komórek i zamierzonych zastosowań.Przepłukać płytki hodowlane kolejno 2 ml PBS i 2 ml DMEM, aby skalibrować ciśnienie osmotyczne w sterylnych warunkach. Dodać 3 ml rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do każdej studzienki. Hoduj komórki w wilgotnym inkubatorze w standardowych warunkach hodowli komórkowej przez 24 godziny lub do momentu, gdy komórki osiągną zbieżność od 50% do 80%.Po 24 godzinach przepłukać komórki w dołku płytką PBS za pomocą pipety w celu usunięcia pływających martwych komórek. Zdezynfekowane lub wysterylizowane próbki należy umieścić bezpośrednio na przylegających komórkach. Dodaj 3 ml świeżej pożywki do każdej studzienki.Hodować komórki w standardowych warunkach hodowli komórkowej przez kolejne 24 godziny. Schemat ideowy na tym rysunku przedstawia etapy metody hodowli ekspozycji. Początkowe etapy przygotowania komórek są takie same jak w przypadku hodowli z bezpośrednią ekspozycją.Następnie umieść próbki we wkładkach studzienkowych o wielkości porów membrany 0,4 mikrometra i umieść wkładki studzienkowe z próbkami w każdej studzience z komórkami. Hodować komórki w standardowych warunkach hodowli komórkowej przez kolejne 24 godziny. Charakterystyka komórek po kulturze.W przypadku hodowli bezpośredniej i hodowli z bezpośrednią ekspozycją należy utrwalić, wybarwić, zobrazować i przeanalizować komórki przylegające zarówno do płytek studzienkowych, jak i próbek. W celu hodowli ekspozycyjnej przeanalizuj komórki przylegające do płytek studzienkowych. Zebrać pożywkę po hodowli z każdej studzienki do odpowiedniej stożkowej probówki o pojemności 15 ml w celu dalszej analizy.Zebrać wszystkie próbki po hodowli do dalszej analizy. Przepłukać komórki przylegające do obu próbek i płytek studzienkowych trzykrotnie za pomocą PBS. Dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu do każdej płytki.Umieść pokrywkę z powrotem na płytce studzienki i pozwól PFA zareagować przez 20 minut. Po 20 minutach odessać PFA i przelać go do butelki na odpady. Przepłukać płytkę studzienki trzy razy za pomocą PBS w celu usunięcia PFA i przenieść odpady do butelki na odpady.Przygotuj zapasy robocze środków barwiących zgodnie z instrukcjami producenta. Dodaj 200 do 400 mikrolitrów rozcieńczonego środka barwiącego Alexa Fluor 488 Phalloidin do każdej studzienki, aby pokryć komórki na płytce studzienki i próbkę. Owiń płytkę studzienki folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło i pozwól Alexa Fluor 488 Phalloidin reagować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Zbierz środek barwiący Alexa Fluor 488 Phalloidin i dozuj go do odpowiedniej butelki na odpady. Opłucz płytki ścienne trzy razy za pomocą PBS, aby usunąć nadmiar falloidyny Alexa Fluor 488 i dozuj zużyty PBS do odpowiedniej butelki na odpady. Dodaj 200 do 400 mikrolitrów rozcieńczonego DAPI do każdego dołka, aby pokryć komórki w studzience i na próbce.Zawiń płytkę studzienki w folię aluminiową i pozwól DAPI reagować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać płytkę studzienki trzy razy za pomocą PBS i dozować zużyty PBS do odpowiedniej butelki na odpady. Po barwieniu zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.Jeśli to możliwe, oprócz obrazów fluorescencyjnych należy wykonywać obrazy komórek z kontrastem fazowym. Należy zobrazować komórki na próbkach ulegających biodegradacji tak szybko, jak to możliwe lub natychmiast po barwieniu, aby uniknąć lub ograniczyć możliwe zmiany spowodowane ciągłą degradacją próbek. W przypadku hodowli bezpośredniej i hodowli z bezpośrednią ekspozycją należy zobrazować i ocenić dwa typy komórek.Po pierwsze, komórki na próbkach mające bezpośredni kontakt z próbkami, a po drugie, komórki przylegały do płytki studzienki otaczającej próbki w bezpośrednim kontakcie z próbkami, jak pokazano na rysunku. W przypadku hodowli ekspozycyjnej, jak pokazano tutaj, podczas wykonywania obrazów fluorescencyjnych komórek należy skorzystać z przewodnika obrazu, aby określić, czy reakcja komórki byłaby inna w odpowiedzi na dynamiczny gradient degradacji próbek. Obraz i analiza komórek znajdujących się oddzielnie w obszarze wewnątrz pierścienia wewnętrznego, w odległości 3,5 mm od środka, oraz w pierścieniu zewnętrznym, który znajduje się w odległości 7 mm od środka.Dla każdej próbki i podczas pobytu na płytkach hodowlanych należy losowo wykonać co najmniej pięć obrazów z każdego obszaru zainteresowania, w którym komórki stykają się pośrednio lub pośrednio z próbkami w określonej odległości. Na podstawie wszystkich obrazów komórek uzyskanych w kroku 4.3 określ ilościowo morfologię komórki, mierząc obszar rozprzestrzeniania się komórek i współczynnik proporcji do analizy obrazu. Policz liczbę komórek w każdym obszarze obrazu.Obliczyć gęstość adhezji komórek w warunkach bezpośredniego i pośredniego kontaktu jako liczbę komórek na jednostkę powierzchni. Analizy postkulturowe pożywek i próbek. Zanim zafiksujesz się na sobie, zbierz media postkulturowe.Zmierzyć wartości pH pożywki postkulturowej w każdym dołku natychmiast po pobraniu za pomocą wstępnie skalibrowanego pH-metru. Postępując zgodnie z poprzednim etapem pomiaru pH, zebrać i rozcieńczyć pożywkę, stosując pożądany współczynnik rozcieńczenia w celu uzyskania optymalnych pomiarów stężeń jonów. Zmierzyć stężenia jonów będących przedmiotem zainteresowania w pożywce po hodowli za pomocą indukcyjnie sprzężonego plazmowo-optycznego spektrometru emisyjnego, w skrócie ICP-OES.Po badaniu komórkowym in vitro próbki biodegradowalne mogą zmieniać wymiary, masę, morfologię powierzchni, mikrostrukturę i skład. Analiza postkulturowa próbek pomaga zrozumieć mechanizm degradacji próbek. Po hodowli komórkowej należy wykonać zdjęcia próbek, aby pokazać możliwe zmiany w wymiarach próbki, kolorze, morfologii i innych widocznych cechach.Wysuszyć lub odwodnić próbki postkulturowe i zmierzyć masę, wymiar i objętość próbki, aby określić ilościowo wszelkie zmiany masy, wymiaru i objętości. Użyj skaningowego mikroskopu elektronowego, aby scharakteryzować mikrostrukturę i morfologię próbek. Spektroskopię rentgenowską z dyspersją energii i defrakcję promieniowania rentgenowskiego należy wykorzystać do scharakteryzowania składu i fazy produktów degradacji na próbkach.Użyj FTIR lub ATR, aby wykryć wiązanie chemiczne na powierzchniach próbki. Reprezentatywne wyniki. Na rysunku przedstawiono reprezentatywne obrazy fluorescencyjne komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w warunkach bezpośredniego i pośredniego kontaktu przy użyciu różnych metod hodowli.Na tym rysunku przedstawiono przykładowe dane dotyczące ilościowo określonej gęstości adhezji komórek. Jak pokazano na rysunku A, w 24-godzinnej hodowli z bezpośrednią ekspozycją, BMSC w bezpośrednim kontakcie z ZC21 mają znacznie większą gęstość adhezji komórek niż jakakolwiek inna grupa. Jak pokazano na rysunku B, w warunkach kontaktu pośredniego w hodowli ekspozycji bezpośredniej, gęstość adhezji BMSC jest znacznie wyższa dla grupy ZC21 niż dla grupy magnezu.Nie wykazuje jednak znaczącej różnicy w porównaniu z grupami kontrolnymi T64 i tylko komórkami. Tutaj rysunek A pokazuje wartość pH pożywek postkulturowych po kulturze bezpośredniej ekspozycji i hodowli bezpośredniej. W przypadku hodowli z bezpośrednią ekspozycją wartości pH pożywek mieszczą się w zakresie od 8,3 do 8,4 dla wszystkich próbek.W hodowli bezpośredniej wartości pH pożywek wahają się od 7,9 do 8 we wszystkich grupach. Rysunek B przedstawia stężenie jonów magnezu w pożywkach postkulturowych. Zarówno w kulturze z bezpośrednim narażeniem, jak i w kulturze bezpośredniej, ich stężenia jonów magnezu w grupach ZC21 i magnezu są znacznie wyższe niż w innych grupach kontrolnych.Rysunek ten przedstawia wzorce XRD dla ZSr41 i czystego magnezu po trzydniowej hodowli ekspozycji. Zaobserwowano fazy krystaliczne o różnym składzie, takim jak magnez, tlenek i hydroksyapatyt. Tutaj rysunek A przedstawia nakładanie obrazów SEM i map EDX składu pierwiastkowego powierzchni magnezu pokrytego tlenkiem magnezu oraz kontrolę podłoży magnezowych i szkła po 24 godzinach bezpośredniej hodowli za pomocą BMSC.Rysunek B przedstawia ilościowy skład pierwiastkowy powierzchni próbki, wskazując na różne osady powstałe podczas hodowli komórkowej. Wnioski. W tym filmie przedstawiliśmy trzy różne metody in vitro do oceny cytokompatybilności biodegradowalnych materiałów implantologicznych w oparciu o różne projekty eksperymentalne i zamierzone zastosowania. Interakcje między materiałami i różnymi typami komórek można badać za pomocą metody hodowli bezpośredniej, metody hodowli bezpośredniej ekspozycji i metody hodowli ekspozycji.W tym filmie przedstawiono kluczowe metody in vitro do badania wpływu materiałów biodegradowalnych wraz z produktami ich degradacji na zachowanie komórek w różnych zastosowaniach implantów medycznych.

direct-indirect-culture-methods-for-studying-biodegradable-implant

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Filmy jedwabne stanowią nową klasę biomateriałów, które można łatwo dostosować do szerokiego zakresu zastosowań biomedycznych. Przedstawiony system hodowli na filmach jedwabnych jest wysoce adaptowalny do różnorodnych analiz in vitro. System ten stanowi platformę projektowania biomateriałów, umożliwiającą optymalizację in vitro przed bezpośrednim przejściem do modeli in vivo.

System hodowli na filmach jedwabnych do analiz in vitro i projektowania biomateriałów

W tym filmie zademonstrujemy techniki modyfikacji porowatych metalowych implantów w celu poprawy ich funkcjonalności i kontroli migracji komórek. Techniki obejmują opracowywanie gradientów porów w celu kontrolowania ruchu komórek w 3D oraz wytwarzanie naśladowców błony podstawnej w celu kontrolowania ruchu komórek w 2D. Opisano również opartą na HPLC metodę monitorowania integracji implantów in vivo poprzez analizę białek krwi.

Wieloskalowa modyfikacja implantów metalowych z gradientami porów, polielektrolitami i ich pośrednie monitorowanie in vivo

Tutaj prezentujemy technikę obrazowania opartą na fluoroforach, która pozwala na wykrywanie żywotności komórek na nieprzezroczystym tytanowym rusztowaniu, jak również wykrywanie przebłysków zanieczyszczeń rusztowania. Ten protokół rozwiązuje problem z obrazowaniem interakcji komórka-komórka lub komórka-metal na nieprzezroczystych rusztowaniach.

Obrazowanie żywotności komórek na nieprzezroczystych rusztowaniach — na przykładzie nowatorskiego implantu z dzianiny tytanowej

Tutaj prezentujemy protokół oceny tworzenia biofilmu w jamie ustnej na materiałach tytanowych i cyrkonowych dla łączników protez dentystycznych, w tym analizę żywotności komórek bakteryjnych i cech morfologicznych. Do analizy biofilmu w jamie ustnej wykorzystuje się model in situ związany z potężnymi technikami mikroskopowymi.

Tworzenie biofilmu w jamie ustnej na różnych materiałach do implantów dentystycznych

Liczba nowatorskich biomateriałów zaprojektowanych do naprawy dużych uszkodzeń kości stale rośnie, mając na celu przyspieszenie gojenia kości i przezwyciężenie komplikacji związanych z przeszczepem kości. W tym miejscu przedstawiamy multidyscyplinarną strategię przedklinicznych badań biokompatybilności biomateriałów do naprawy kości.

Profil zgodności biologicznej biomateriałów do regeneracji kości

Ta metodologia ma na celu ocenę cytotoksyczności biomateriałów poprzez przygotowanie rozpuszczalnych ekstraktów, przy użyciu testów żywotności i analizy fenotypowej, w tym cytometrii przepływowej, RT-PCR, immunocytochemii i innych technik biologii komórkowej i molekularnej.

Dostęp do cytotoksyczności i odpowiedzi komórek na biomateriały

Protokół pokazuje nowatorski model eksperymentalny in vitro, który może podsumować biologię dwóch rodzajów przylegających linii komórkowych za pomocą trójwymiarowego (3D) wydrukowanego rusztowania. Opisano budowę tego modelu i procedury operacyjne, od przygotowania komórek i hodowli komórek po analizę i ocenę.

Model kohodowli z wykorzystaniem dwóch typów przylegających linii komórkowych

Niniejszy protokół opisuje model eksperymentalny oparty na barwieniu tuszem, który może być wykorzystany do dekontaminacji powierzchni implantów in vitro i badań chropowatości, aby przyczynić się do podejmowania decyzji klinicznych.

Wpływ metod mechanicznych stosowanych w leczeniu peri-implantitis na dekontaminację i chropowatość powierzchni implantów

Niniejsze pilotażowe badanie in vitro miało na celu ocenę skuteczności czyszczenia trzech różnych narzędzi dekontaminacyjnych oraz możliwych zmian powierzchni po zabiegu, przy użyciu permanentnego czerwonego tuszu do naśladowania obecności biofilmu doustnego.

Pilotażowe badanie in vitro mające na celu ocenę zdolności czyszczenia oraz wpływu różnych metod dekontaminacji na powierzchnie implantów

Opisujemy protokół obserwacji i analizy trajektorii toczenia się komórek na podłożach z asymetrycznym wzorem receptorów. Uzyskane dane są przydatne przy projektowaniu podłoży z wzorem receptorów do bezznakowej separacji i analizy komórek.

Badanie trajektorii toczenia się komórek na asymetrycznych wzorach receptorów

Poznaj trzy metody hodowli komórek do oceny cytokompatybilności biodegradowalnych materiałów implantologicznych in vitro. Techniki te pozwalają badać interakcje między komórkami a implantami w różnych scenariuszach klinicznych.

Metody hodowli bezpośredniej i pośredniej w badaniu biodegradowalnych materiałów implantologicznych in vitro

Przeglądaj więcej filmów