Metody hodowli bezpośredniej i pośredniej w badaniu biodegradowalnych materiałów implantologicznych in vitro

Metody hodowli bezpośredniej i pośredniej do badania biodegradowalnych materiałów implantologicznych in vitro. W ciągu ostatnich kilku dekad materiały biodegradowalne były szeroko badane pod kątem zastosowań biomedycznych, takich jak implanty ortopedyczne, dentystyczne i czaszkowo-twarzowe. Aby przeprowadzić badania przesiewowe materiałów biodegradowalnych do zastosowań biomedycznych, konieczna jest ocena tych materiałów pod kątem odpowiedzi komórkowych in vitro, cytokompatybilności i cytotoksyczności.

Normy Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej są szeroko stosowane w ocenie biomateriałów. Jednak większość norm ISO została pierwotnie ustanowiona w celu oceny toksyczności stylu materiałów nieulegających degradacji, zapewniając w ten sposób ograniczoną wartość dla badań przesiewowych materiałów biodegradowalnych. W tym filmie przedstawimy i omówimy trzy różne metody hodowli, a mianowicie metodę hodowli bezpośredniej, metodę hodowli bezpośredniej ekspozycji oraz metodę hodowli ekspozycji do oceny cytokompatybilności in vitro biodegradowalnych materiałów implantologicznych.

W szczególności metoda hodowli bezpośredniej ocenia interakcje między nowo wysianymi komórkami a implantami. Hodowla z bezpośrednią ekspozycją naśladuje interakcje między ustalonymi komórkami w organizmie a implantami. Hodowla ekspozycyjna charakteryzuje interakcje między ustalonymi komórkami a implantami, gdy nie są one ze sobą w bezpośrednim kontakcie, ale w tym samym środowisku, w którym materiały ulegają degradacji.

Ten film zawiera przykłady zastosowania tych trzech metod hodowli do badania cytokompatybilności in vitro biodegradowalnych materiałów implantologicznych i ich interakcji z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi ze szpiku kostnego. Metody in vitro opisane w tym filmie naśladują różne scenariusze środowiska in vivo, poszerzając zastosowanie i znaczenie badań cytokompatybilności in vitro różnych materiałów do różnych zastosowań biomedycznych. Postępujemy zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Institutional Animal Care and Use Community na Uniwersytecie Kalifornijskim w Riverside w zakresie pobierania komórek i tkanek.

Przygotowanie hodowli komórkowych. Trzy metody hodowli opisane w tym filmie mają ogólne zastosowanie do różnych typów komórek, które przylegają. W tym miejscu BMSC zebrane od szczurów odsadzonych od odsadzonych od szczurów zostaną przedstawione jako przykład przygotowania hodowli komórkowych Pobieranie mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego od szczurów odsadzonych od piersi.

Schemat ideowy na tym rysunku przedstawia kroki zbierania BMSC od szczurów odsadzonych od piersi. Usuń skórę i mięśnie oraz tkanki łączne, aby wyciąć kość udową z uśpionego szczura. Umieść kości udowe w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej pożywkę do hodowli komórkowych.

Umieść stożkowe rurki na lodzie do czasu przeprowadzenia ekstrakcji komórek. Przenieść kości na szalkę Petriego w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Odetnij końce kości za pomocą ostrza chirurgicznego i przepłucz szpik kostny do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, przemywając jamę szpiku kostnego pożywką do hodowli komórkowych za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 25 1/2.

Przefiltrować zawiesinę komórkową za pomocą filtra o średnicy 70 mikrometrów, a następnie odwirować pod ciśnieniem 126-krotności grawitacji przez pięć minut, aby uzyskać granulki komórek: Odessać pożywkę supernatantową i uzupełnić 10 ml świeżej pożywki. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Odpipetować zawiesinę bezpośrednio na wewnętrznym dnie kolby T-75 i dodać pożywkę, aby zwiększyć objętość do 25 mililitrów.

Hoduj komórki w inkubatorze w standardowym, sterylnym środowisku hodowli komórek, które ma 37 stopni Celsjusza, wilgotną atmosferę z 5% dwutlenkiem węgla i 95% powietrzem. Po trzech do siedmiu dniach wypłucz nieprzylegające komórki, odsysając stare podłoże i uzupełniając je świeżymi. Kontynuuj hodowlę i karmienie komórek świeżą pożywką, aż będą gotowe do przejścia przez komórkę, zamrożenia lub użycia w eksperymencie.

Przygotowanie próbki i sterylizacja. Wysterylizuj lub zdezynfekuj wszystkie próbki przed hodowlą komórkową. Metody sterylizacji lub dezynfekcji dla różnych typów próbek różnią się w zależności od różnych właściwości materiałów.

Ogólnie rzecz biorąc, należy używać promieniowania ultrafioletowego do dezynfekcji metali ulegających biodegradacji do badań in vitro. Metody hodowli komórkowych. Schemat ideowy na tym rysunku przedstawia etapy metody hodowli bezpośredniej.

W tym filmie BMSC zostały wyhodowane na płytce pochodzącej z magnezu umieszczonej w studzienkach 12-dołkowej płytki poddanej działaniu kultury tkankowej jako przykład ilustrujący metodę hodowli. Użyj kolby z 90% konfluentem, aby określić stężenie komórek w zawiesinie komórek za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową za pomocą świeżej pożywki do zalecanego stężenia komórek potrzebnego do badania na komórkach in vitro.

Umieścić próbki na środku 12-dołkowych płytek do hodowli tkankowych. Przepłukać płytki hodowlane kolejno 2 ml PBS i 2 ml DMEM, aby skalibrować ciśnienie osmotyczne w sterylnych warunkach. Dodać 3 ml rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do każdego dołka na interesujące nas próbki.

Hodować komórki w inkubatorze w standardowych warunkach hodowli komórkowej przez 24 godziny. Schemat ideowy w zniekształceniu przedstawia etapy hodowli bezpośredniej ekspozycji. Przygotować zawiesinę komórek o wymaganych stężeniach komórek w oparciu o projekt doświadczalny dla różnych typów komórek i zamierzonych zastosowań.

Przepłukać płytki hodowlane kolejno 2 ml PBS i 2 ml DMEM, aby skalibrować ciśnienie osmotyczne w sterylnych warunkach. Dodać 3 ml rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do każdej studzienki. Hoduj komórki w wilgotnym inkubatorze w standardowych warunkach hodowli komórkowej przez 24 godziny lub do momentu, gdy komórki osiągną zbieżność od 50% do 80%.

Po 24 godzinach przepłukać komórki w dołku płytką PBS za pomocą pipety w celu usunięcia pływających martwych komórek. Zdezynfekowane lub wysterylizowane próbki należy umieścić bezpośrednio na przylegających komórkach. Dodaj 3 ml świeżej pożywki do każdej studzienki.

Hodować komórki w standardowych warunkach hodowli komórkowej przez kolejne 24 godziny. Schemat ideowy na tym rysunku przedstawia etapy metody hodowli ekspozycji. Początkowe etapy przygotowania komórek są takie same jak w przypadku hodowli z bezpośrednią ekspozycją.

Następnie umieść próbki we wkładkach studzienkowych o wielkości porów membrany 0,4 mikrometra i umieść wkładki studzienkowe z próbkami w każdej studzience z komórkami. Hodować komórki w standardowych warunkach hodowli komórkowej przez kolejne 24 godziny. Charakterystyka komórek po kulturze.

W przypadku hodowli bezpośredniej i hodowli z bezpośrednią ekspozycją należy utrwalić, wybarwić, zobrazować i przeanalizować komórki przylegające zarówno do płytek studzienkowych, jak i próbek. W celu hodowli ekspozycyjnej przeanalizuj komórki przylegające do płytek studzienkowych. Zebrać pożywkę po hodowli z każdej studzienki do odpowiedniej stożkowej probówki o pojemności 15 ml w celu dalszej analizy.

Zebrać wszystkie próbki po hodowli do dalszej analizy. Przepłukać komórki przylegające do obu próbek i płytek studzienkowych trzykrotnie za pomocą PBS. Dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu do każdej płytki

Umieść pokrywkę z powrotem na płytce studzienki i pozwól PFA zareagować przez 20 minut. Po 20 minutach odessać PFA i przelać go do butelki na odpady. Przepłukać płytkę studzienki trzy razy za pomocą PBS w celu usunięcia PFA i przenieść odpady do butelki na odpady.

Przygotuj zapasy robocze środków barwiących zgodnie z instrukcjami producenta. Dodaj 200 do 400 mikrolitrów rozcieńczonego środka barwiącego Alexa Fluor 488 Phalloidin do każdej studzienki, aby pokryć komórki na płytce studzienki i próbkę. Owiń płytkę studzienki folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło i pozwól Alexa Fluor 488 Phalloidin reagować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Zbierz środek barwiący Alexa Fluor 488 Phalloidin i dozuj go do odpowiedniej butelki na odpady. Opłucz płytki ścienne trzy razy za pomocą PBS, aby usunąć nadmiar falloidyny Alexa Fluor 488 i dozuj zużyty PBS do odpowiedniej butelki na odpady. Dodaj 200 do 400 mikrolitrów rozcieńczonego DAPI do każdego dołka, aby pokryć komórki w studzience i na próbce.

Zawiń płytkę studzienki w folię aluminiową i pozwól DAPI reagować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać płytkę studzienki trzy razy za pomocą PBS i dozować zużyty PBS do odpowiedniej butelki na odpady. Po barwieniu zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Jeśli to możliwe, oprócz obrazów fluorescencyjnych należy wykonywać obrazy komórek z kontrastem fazowym. Należy zobrazować komórki na próbkach ulegających biodegradacji tak szybko, jak to możliwe lub natychmiast po barwieniu, aby uniknąć lub ograniczyć możliwe zmiany spowodowane ciągłą degradacją próbek. W przypadku hodowli bezpośredniej i hodowli z bezpośrednią ekspozycją należy zobrazować i ocenić dwa typy komórek.

Po pierwsze, komórki na próbkach mające bezpośredni kontakt z próbkami, a po drugie, komórki przylegały do płytki studzienki otaczającej próbki w bezpośrednim kontakcie z próbkami, jak pokazano na rysunku. W przypadku hodowli ekspozycyjnej, jak pokazano tutaj, podczas wykonywania obrazów fluorescencyjnych komórek należy skorzystać z przewodnika obrazu, aby określić, czy reakcja komórki byłaby inna w odpowiedzi na dynamiczny gradient degradacji próbek. Obraz i analiza komórek znajdujących się oddzielnie w obszarze wewnątrz pierścienia wewnętrznego, w odległości 3,5 mm od środka, oraz w pierścieniu zewnętrznym, który znajduje się w odległości 7 mm od środka.

Dla każdej próbki i podczas pobytu na płytkach hodowlanych należy losowo wykonać co najmniej pięć obrazów z każdego obszaru zainteresowania, w którym komórki stykają się pośrednio lub pośrednio z próbkami w określonej odległości. Na podstawie wszystkich obrazów komórek uzyskanych w kroku 4.3 określ ilościowo morfologię komórki, mierząc obszar rozprzestrzeniania się komórek i współczynnik proporcji do analizy obrazu. Policz liczbę komórek w każdym obszarze obrazu.

Obliczyć gęstość adhezji komórek w warunkach bezpośredniego i pośredniego kontaktu jako liczbę komórek na jednostkę powierzchni. Analizy postkulturowe pożywek i próbek. Zanim zafiksujesz się na sobie, zbierz media postkulturowe.

Zmierzyć wartości pH pożywki postkulturowej w każdym dołku natychmiast po pobraniu za pomocą wstępnie skalibrowanego pH-metru. Postępując zgodnie z poprzednim etapem pomiaru pH, zebrać i rozcieńczyć pożywkę, stosując pożądany współczynnik rozcieńczenia w celu uzyskania optymalnych pomiarów stężeń jonów. Zmierzyć stężenia jonów będących przedmiotem zainteresowania w pożywce po hodowli za pomocą indukcyjnie sprzężonego plazmowo-optycznego spektrometru emisyjnego, w skrócie ICP-OES.

Po badaniu komórkowym in vitro próbki biodegradowalne mogą zmieniać wymiary, masę, morfologię powierzchni, mikrostrukturę i skład. Analiza postkulturowa próbek pomaga zrozumieć mechanizm degradacji próbek. Po hodowli komórkowej należy wykonać zdjęcia próbek, aby pokazać możliwe zmiany w wymiarach próbki, kolorze, morfologii i innych widocznych cechach.

Wysuszyć lub odwodnić próbki postkulturowe i zmierzyć masę, wymiar i objętość próbki, aby określić ilościowo wszelkie zmiany masy, wymiaru i objętości. Użyj skaningowego mikroskopu elektronowego, aby scharakteryzować mikrostrukturę i morfologię próbek. Spektroskopię rentgenowską z dyspersją energii i defrakcję promieniowania rentgenowskiego należy wykorzystać do scharakteryzowania składu i fazy produktów degradacji na próbkach.

Użyj FTIR lub ATR, aby wykryć wiązanie chemiczne na powierzchniach próbki. Reprezentatywne wyniki. Na rysunku przedstawiono reprezentatywne obrazy fluorescencyjne komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w warunkach bezpośredniego i pośredniego kontaktu przy użyciu różnych metod hodowli.

Na tym rysunku przedstawiono przykładowe dane dotyczące ilościowo określonej gęstości adhezji komórek. Jak pokazano na rysunku A, w 24-godzinnej hodowli z bezpośrednią ekspozycją, BMSC w bezpośrednim kontakcie z ZC21 mają znacznie większą gęstość adhezji komórek niż jakakolwiek inna grupa. Jak pokazano na rysunku B, w warunkach kontaktu pośredniego w hodowli ekspozycji bezpośredniej, gęstość adhezji BMSC jest znacznie wyższa dla grupy ZC21 niż dla grupy magnezu.

Nie wykazuje jednak znaczącej różnicy w porównaniu z grupami kontrolnymi T64 i tylko komórkami. Tutaj rysunek A pokazuje wartość pH pożywek postkulturowych po kulturze bezpośredniej ekspozycji i hodowli bezpośredniej. W przypadku hodowli z bezpośrednią ekspozycją wartości pH pożywek mieszczą się w zakresie od 8,3 do 8,4 dla wszystkich próbek.

W hodowli bezpośredniej wartości pH pożywek wahają się od 7,9 do 8 we wszystkich grupach. Rysunek B przedstawia stężenie jonów magnezu w pożywkach postkulturowych. Zarówno w kulturze z bezpośrednim narażeniem, jak i w kulturze bezpośredniej, ich stężenia jonów magnezu w grupach ZC21 i magnezu są znacznie wyższe niż w innych grupach kontrolnych.

Rysunek ten przedstawia wzorce XRD dla ZSr41 i czystego magnezu po trzydniowej hodowli ekspozycji. Zaobserwowano fazy krystaliczne o różnym składzie, takim jak magnez, tlenek i hydroksyapatyt. Tutaj rysunek A przedstawia nakładanie obrazów SEM i map EDX składu pierwiastkowego powierzchni magnezu pokrytego tlenkiem magnezu oraz kontrolę podłoży magnezowych i szkła po 24 godzinach bezpośredniej hodowli za pomocą BMSC.

Rysunek B przedstawia ilościowy skład pierwiastkowy powierzchni próbki, wskazując na różne osady powstałe podczas hodowli komórkowej. Wnioski. W tym filmie przedstawiliśmy trzy różne metody in vitro do oceny cytokompatybilności biodegradowalnych materiałów implantologicznych w oparciu o różne projekty eksperymentalne i zamierzone zastosowania. Interakcje między materiałami i różnymi typami komórek można badać za pomocą metody hodowli bezpośredniej, metody hodowli bezpośredniej ekspozycji i metody hodowli ekspozycji.

W tym filmie przedstawiono kluczowe metody in vitro do badania wpływu materiałów biodegradowalnych wraz z produktami ich degradacji na zachowanie komórek w różnych zastosowaniach implantów medycznych.