Name: Wytwarzanie większej biomasy biofilmu bakteryjnego za pomocą urządzeń do mikropłytek głębinowych PCR-Plate (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania większej biomasy biofilmu bakteryjnego za pomocą urządzeń do mikropłytek głębinowych PCR-Plate. Technika umożliwia wysokoprzepustowe badania biofilmów z użyciem barwienia krystalicznej fioletowej i testowania wrażliwości na antybiotyki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tej pracy zostało zapewnione przez granty operacyjne dla DCB z Natural Science and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN- 2016-05891) oraz dla MRM i GRG z programu Government of Canadian Genomics Research and Development Initiative Grant (GRDI) (GRDI7 2254557).

1. Aseptyczne przygotowanie kultury do wzrostu biofilmu (Dni 0-1)
<ol>
	<li>W dniu 0 należy umieścić pożądany szczep (szczepy) bakteryjny (szczepy) do testów z kriokonserwowanego materiału (w glicerolu lub dimetylosulfotlenku (DMSO)) bezpośrednio na płytce z agarem odżywczym z selekcją przeciwdrobnoustrojową, zgodnie z wymaganiami szczepu. Inkubować płytki agarowe w optymalnej temperaturze (37 °C) i czasie (18-22 h) dla wzrostu szczepu.</li>
	<li>Następnego dnia (dzień 1) zaszczepić kolonię z płytki agarowej w 5 ml pożywki wzrostowej w optymalnych warunkach wzrostu. Kultury te zostaną wykorzystane jako inokulatory początkowe dnia 2 dla urządzeń do biofilmu (patrz krok 2.2; <silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: W tym badaniu E. coli K-12 BW21153 i P. aeruginosa PAO1 hodowano na podłożu Luria-Bertani (LB) w temperaturze 37 °C przez 18 godzin z wytrząsaniem przy 160 obrotach na minutę (rpm).
	<ol>
		<li>Przygotować co najmniej 3 niezależnie hodowane szczepy w celu wytworzenia kontrprób biologicznych do pomiaru biofilmu ze względu na statystyczną zmienność tworzenia biomasy biofilmu na urządzeniach z kołkowaną pokrywą.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie i inokulacja płytek (Dzień 2)
<ol>
	<li>Napełnij zewnętrzne studzienki autoklawizowanej 96-dołkowej płytki polipropylenowej o pojemności 1,1 ml / studzienkę sterylną wodą o pojemności 750 μl / studzienkę (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2A). Wypełnić studzienki kontroli ujemnej (studzienki z nieinokulowanymi pożywkami; kolumna B) 750 μl pożywki wzrostowej, a pozostałe studzienki 675 μl pożywki wzrostowej. 
	UWAGA: Krok 2.1 powyżej i kroki poniżej zawierają listę odpowiednich objętości dla urządzenia do biofilmu ze studni głębinowej. W przypadku stosowania standardowego urządzenia do tworzenia biofilmu, objętości należy zmienić w następujący sposób: 75 μl kultury inokulum na 20 μl; 675 μL pożywki wzrostowej do 180 μL; 750 μL sterylnej wody/pożywki wzrostowej do 200 μL; 800 μl barwienia CV/kwasu octowego/roztworów płuczących do 210 μl. Dodatkowo, dla kroku 3.6 poniżej, absorbancję przy 500 nm (A550 nm) można odczytać bezpośrednio w mikropłytce polistyrenowej po wymieszaniu przy użyciu standardowej mikropłytki do biofilmu.</li>
	<li>Używając kultur nocnych dnia 1, standaryzuj kultury do gęstości optycznej przy 600 nm (OD600nm) = 1,0 lub do standardu McFarlanda 0,5-1 jednostek.</li>
	<li>Stworzyć 10-krotne seryjne rozcieńczenie każdej znormalizowanej kultury w probówkach lub 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania głębokościowego, aż do osiągnięcia rozcieńczenia 10-3.</li>
	<li>Zaszczepić pożywkę zawierającą studzienki, jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 2B 75 μl rozcieńczonej kultury 1 x 10-3, w celu uzyskania końcowego rozcieńczenia bakteryjnego w studzience 10-4.</li>
	<li>Ostrożnie włożyć autoklawowaną płytkę do PCR (z kołdrową pokrywką) do zaszczepionej płytki z głęboką studzienką. Inkubować płytki w optymalnych warunkach odkształcania (37 °C) z wytrząsaniem (maksymalnie 160 obr./min) w inkubatorze o wilgotności 50-60% przez 24 godziny.</li>
</ol>
3. Oznaczanie biomasy biofilmu za pomocą urządzeń wykorzystujących barwienie CV (Dzień 3)
<ol>
	<li>W asepcie usunąć pokrywę z biofilmem z każdego urządzenia i spłukać, wkładając do autoklawowanej płytki głębinowej przygotowanej z 800 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)/studzienki na 30 sekund w celu usunięcia komórek planktonu.</li>
	<li>W przypadku barwienia CV biomasy należy przenieść przykrytą pokrywę płytki PCR do nowej płytki przygotowanej z 800 μl/basenik 0,1% (w/v) CV w dH2O i barwić przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć nadmiar plamy, spłukując kołkowaną pokrywkę w głębokiej płytce przygotowanej z 800 μl/dołek sterylnego PBS. Pozostaw płytki do wyschnięcia na 10 minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego z kołkami skierowanymi do góry.</li>
	<li>Przenieść pokrywkę wysuszonej płytki PCR na płytkę zawierającą 800 μl/basenik 30% (v/v) kwasu octowego i pozostawić pokrywkę do odbarwienia przez 5 minut.</li>
	<li>Zdjąć odbarwioną pokrywkę kołka PCR i dokładnie wymieszać roztwór, pipetując. Przenieść 200 μl z płytek głębokich do standardowej 96-dołkowej mikropłytki i zmierzyć absorbancję roztworu odbarwiającego o długości fali 550 nm (A550 nm) w czytniku mikropłytek w ultrafiolecie (UV) / widzialnym (Vis).</li>
	<li>Korzystając ze zmierzonych wartości A550 nm, odejmij średnią wartość ślepej próby (kontrola ujemna) A550 nm od każdej wartości próbki biofilmu. Uśrednić wartość każdej odjętej ślepej próby próbki biofilmuA 550 nm reprezentującej próbkę biologiczną powtórzoną.</li>
</ol>
4. Wyzwanie dla biofilmów z antybiotykami do obliczenia ich 24-godzinnej wartości MBEC (Dzień 3)
<ol>
	<li>Przygotować podstawowy roztwór przeciwdrobnoustrojowy w wodzie, który jest dwukrotnie (2x) większy od stężenia pożądanego najwyższego stężenia przeciwdrobnoustrojowego, które ma być badane.</li>
	<li>Stwórz serię dwukrotnych rozcieńczeń przeciwdrobnoustrojowego roztworu podstawowego w 2x stężonej pożywce wzrostowej, tak aby uzyskać 8 stężeń przeciwdrobnoustrojowych.</li>
	<li>Jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 2B, napełnij zewnętrzne studzienki autoklawizowanej płytki głębinowej 750 μl/studzienkę sterylną wodą. Wypełnić kolumny B (kontrola ujemna; brak bakterii) i C (kontrola dodatnia; brak ekspozycji na środki przeciwdrobnoustrojowe) płytki pożywką wzrostową o stężeniu 750 μl/basenik. Napełnij pozostałe studzienki 750 μl/studzienkę serii rozcieńczeń przeciwdrobnoustrojowych, jak pokazano na <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2B.</li>
	<li>Zdejmij i wypłucz kołkowaną pokrywkę zgodnie z opisem w kroku 3.1 i przenieś je do przeciwbakteryjnej płytki prowokacyjnej.</li>
	<li>Inkubować płytki z wytrząsaniem (maks. 160 obr./min) w odpowiednich warunkach odkształcania i dla pożądanego czasu ekspozycji.</li>
</ol>
5. Odzyskiwanie biomasy biofilmu z przyklejonych pokryw (Dzień 4)
<ol>
	<li>Zdejmij kołki odsłonięte na działanie środków przeciwdrobnoustrojowych i spłucz zgodnie z opisem w kroku 3.1. Przenieść kołkowaną pokrywę na płytkę z głęboką studzienką o stężeniu 750 μl/studzienkę w studzienkach wewnętrznych i 750 μl/studzienkę sterylną dH2O w studzienkach zewnętrznych.
	<ol>
		<li>Aby przygotować 70 ml pożywki regeneracyjnej, połącz 35 ml 2x stężonego LB, 0,7 ml 100% tween-20, 3,5 ml 20x uniwersalnego roztworu neutralizującego i 30,8 ml sterylnego dH2O w sterylnej butelce.</li>
		<li>Aby przygotować 20x skoncentrowany uniwersalny roztwór neutralizujący, dodaj 1,0 g L-histydyny, 1,0 g L-cysteiny i 2,0 g zredukowanego glutationu do końcowej objętości 20 ml dH2O. Przefiltruj wysterylizuj roztwór przez filtr 0,2 μm i przechowuj w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść urządzenie z kroku 5.1 w wtórnym pojemniku umieszczonym w sonikującej łaźni wodnej. Poddaj urządzenia działaniu sonikacyjnym przez 30 minut, aby usunąć biofilm z kołków do podłoża regeneracyjnego.</li>
	<li>Po sonikacji zdejmij kołkowaną pokrywkę i umieść sterylną płaską pokrywę płytki na płytce z pożywką do odzyskiwania studni głębinowych. Kołkowaną pokrywę można wyrzucić.</li>
	<li>Inkubować płytki z pożywką regeneracyjną z kroku 5.3 w optymalnych warunkach wzrostu szczepu przez noc (16-18 godzin).</li>
</ol>
6. Wyznaczanie wartości MBEC urządzenia (Dzień 5)
<ol>
	<li>Następnego dnia przenieść 200 μl z każdej studzienki inkubowanej płytki głębinowej z kroku 5.4 na nową 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania. Odczytaj średnicę zewnętrzną600 nm każdej studzienki za pomocą czytnika mikropłytek UV/Vis z zakresu.</li>
	<li>Odejmij wartości OD600 nm kontroli ujemnej (nieinokulowana ślepa próba) od każdego biofilmu zawierającego próbkę.</li>
	<li>Obliczyć wartość MBEC dla każdej próbki, używając wartości OD600 nm, gdzie wartość MBEC jest najniższym stężeniem przeciwdrobnoustrojowym, które spowodowało najniższą wartość OD600 nm (nie do odróżnienia od nieinokulowanej kontroli) dla określonego gatunku/szczepu drobnoustrojowego traktowanego przeciwdrobnoustrojowo.</li>
</ol>

<ol><li>Verderosa, A. D., Totsika, M., Fairfull-Smith, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Biofilm+Eradication+Agents%3A+A+Current+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bacterial Biofilm Eradication Agents: A Current Review.</a> Frontiers in Chemistry. 7, 1-17 (2019).</li>
<li>Sharma, D., Misba, L., Khan, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+versus+biofilm%3A+An+emerging+battleground+in+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Resistance+and+Infection+Control%22%5BJournal%5D)">Antibiotics versus biofilm: An emerging battleground in microbial communities.</a> Antimicrobial Resistance and Infection Control. 8 (1), 1-10 (2019).</li>
<li>Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+strategies+of+infectious+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Survival strategies of infectious biofilms.</a> Trends in Microbiology. 13 (1), 34-40 (2005).</li>
<li>Lagacé-Wiens, P. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+antimicrobial+resistance+over+10+years+among+key+bacterial+pathogens+from+Canadian+hospitals%3A+results+of+the+CANWARD+study+2007-16%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Trends in antimicrobial resistance over 10 years among key bacterial pathogens from Canadian hospitals: results of the CANWARD study 2007-16.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74, Suppl 4 22-31 (2019).</li>
<li>Karlowsky, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+susceptibility+of+urinary+Escherichia+coli+isolates+to+first-+and+second-line+empirically+prescribed+oral+antimicrobials%3A+CANWARD+surveillance+study+results+for+Canadian+outpatients%2C+2007-2016%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">In vitro susceptibility of urinary Escherichia coli isolates to first- and second-line empirically prescribed oral antimicrobials: CANWARD surveillance study results for Canadian outpatients, 2007-2016.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 54 (1), 62-68 (2019).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-specific+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiology. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li>
<li>Amato, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+metabolism+in+bacterial+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The role of metabolism in bacterial persistence.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 1-9 (2014).</li>
<li>Flemming, H. -C., Neu, T. R., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EPS+matrix%3A+The+%26%2334%3Bhouse+of+biofilm+cells.%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The EPS matrix: The &#34;house of biofilm cells.&#34.</a> Journal of Bacteriology. 189 (22), 7945-7947 (2007).</li>
<li>Dela Fuente-Núñez, C., Reffuveille, F., Fernández, L., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilm+development+as+a+multicellular+adaptation%3A+Antibiotic+resistance+and+new+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilm development as a multicellular adaptation: Antibiotic resistance and new therapeutic strategies.</a> Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 580-589 (2013).</li>
<li>Høiby, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+impact+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">The clinical impact of bacterial biofilms.</a> International Journal of Oral Science. 3 (2), 55-65 (2011).</li>
<li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+and+analyzing+static+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Growing and analyzing static biofilms.</a> Current Protocols in Microbiology. 01, Unit 1B.1 (2005).</li>
<li>Coffey, B. M., Anderson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+in+the+96-well+microtiter+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation in the 96-well microtiter plate.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, 631-641 (2014).</li>
<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+dish+Biofilm+formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microtiter dish Biofilm formation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2437(2010).</li>
<li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+on+biofilm+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li>
<li>Harrison, J. J., Turner, R. J., Ceri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+metal+susceptibility+testing+of+microbial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High-throughput metal susceptibility testing of microbial biofilms.</a> BMC Microbiology. 5 (53), (2005).</li>
<li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MBEC+Assay+System%3A+Multiple+Equivalent+Bioffims+for+Antibiotic+and+Biocide+Susceptibility+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">The MBEC Assay System: Multiple Equivalent Bioffims for Antibiotic and Biocide Susceptibility Testing.</a> Methods in Enzymology. 337, 377-385 (2001).</li>
<li>Harrison, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+susceptibility+testing+of+microbes+growing+on+peg+lids%3A+a+miniaturized+biofilm+model+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening.</a> Nature Protocols. 5 (7), 1236-1254 (2010).</li>
<li>vanden Driessche, F., Rigole, P., Brackman, G., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+resazurin-based+viability+staining+for+quantification+of+microbial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of resazurin-based viability staining for quantification of microbial biofilms.</a> Journal of Microbiological Methods. 98, (2014).</li>
<li>Sabaeifard, P., Abdi-Ali, A., Gamazo, C., Irache, J. M., Soudi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+effect+of+amikacin-loaded+poly%28D%2CL-lactide-co-glycolide%29+nanoparticles+against+planktonic+and+biofilm+cells+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Improved effect of amikacin-loaded poly(D,L-lactide-co-glycolide) nanoparticles against planktonic and biofilm cells of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Medical Microbiology. 66 (2), 137-148 (2017).</li>
<li>Thieme, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MBEC+Versus+MBIC%3A+the+Lack+of+Differentiation+between+Biofilm+Reducing+and+Inhibitory+Effects+as+a+Current+Problem+in+Biofilm+Methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">MBEC Versus MBIC: the Lack of Differentiation between Biofilm Reducing and Inhibitory Effects as a Current Problem in Biofilm Methodology.</a> Biological Procedures Online. 21 (1), 18(2019).</li>
<li>Jennings, M. C., Ator, L. E., Paniak, T. J., Minbiole, K. P. C., Wuest, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-eradicating+properties+of+quaternary+ammonium+amphiphiles%3A+Simple+mimics+of+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Biofilm-eradicating properties of quaternary ammonium amphiphiles: Simple mimics of antimicrobial peptides.</a> Chembiochem. 15 (15), 2211-2215 (2014).</li>
<li>Lineback, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+and+sodium+hypochlorite+disinfectants+are+more+effective+against+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+than+quaternary+ammonium+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Resistance+%26+Infection+Control%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide and sodium hypochlorite disinfectants are more effective against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms than quaternary ammonium compounds.</a> Antimicrobial Resistance & Infection Control. 7 (1), 154(2018).</li>
<li>Minbiole, K. P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+antimicrobial+activity+to+mechanism+of+resistance%3A+The+multifaceted+role+of+simple+quaternary+ammonium+compounds+in+bacterial+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron%22%5BJournal%5D)">From antimicrobial activity to mechanism of resistance: The multifaceted role of simple quaternary ammonium compounds in bacterial eradication.</a> Tetrahedron. 72 (25), 3559-3566 (2016).</li>
<li>Mangalappalli-Illathu, A. K., Korber, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+resistance+and+differential+protein+expression+of+Salmonella+enterica+serovar+enteritidis+biofilms+exposed+to+benzalkonium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Adaptive resistance and differential protein expression of Salmonella enterica serovar enteritidis biofilms exposed to benzalkonium chloride.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3588-3596 (2006).</li>
<li>El-Banna, T., Abd El-Aziz, A., Sonbol, F., El-Ekhnawy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+Pseudomonas+aeruginosa+clinical+isolates+to+benzalkonium+chloride+retards+its+growth+and+enhances+biofilm+production%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Adaptation of Pseudomonas aeruginosa clinical isolates to benzalkonium chloride retards its growth and enhances biofilm production.</a> Molecular Biology Reports. 46, 3437-3443 (2019).</li>
<li>Ebrahimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+benzalkonium+Chloride+on+planktonic+growth+and+biofilm+formation+by+animal+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Jundishapur+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effects of benzalkonium Chloride on planktonic growth and biofilm formation by animal bacterial pathogens.</a> Jundishapur Journal of Microbiology. 8 (2), 59764(2015).</li>
<li>Reśliński, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Staphylococcus+aureus+and+Escherichia+coli+biofilm+formation+on+the+surface+of+polypropylene+mesh%5BTitle%5D)+AND+%22Medycyna+do%C5%9Bwiadczalna+i+mikrobiologia%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Staphylococcus aureus and Escherichia coli biofilm formation on the surface of polypropylene mesh.</a> Medycyna doświadczalna i mikrobiologia. 63 (1), 21-27 (2011).</li>
<li>Verhorstert, K. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+bacterial+adhesion+and+biofilm+formation+on+fully+absorbable+poly-4-hydroxybutyrate+and+nonabsorbable+polypropylene+pelvic+floor+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Cite+This%3A+ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">In vitro bacterial adhesion and biofilm formation on fully absorbable poly-4-hydroxybutyrate and nonabsorbable polypropylene pelvic floor implants.</a> Cite This: ACS Applied Materials & Interfaces. 12, 53646-53653 (2020).</li>
<li>Arkatkar, A., Juwarkar, A. A., Bhaduri, S., Uppara, P. V., Doble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Pseudomonas+and+Bacillus+biofilms+on+pretreated+polypropylene+surface%5BTitle%5D)+AND+%22International+Biodeterioration+%26+Biodegradation%22%5BJournal%5D)">Growth of Pseudomonas and Bacillus biofilms on pretreated polypropylene surface.</a> International Biodeterioration & Biodegradation. 64 (6), (2010).</li>
<li>Jones, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+adhesion+of+Escherichia+coli+to+polystyrene+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Oriented adhesion of Escherichia coli to polystyrene particles.</a> Applied and Environmental Microbiology. 69 (11), 6515-6519 (2003).</li>
<li>Zameer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+adhesive+and+anti-adhesive+properties+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+and+their+inhibition+by+herbal+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Iranian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of adhesive and anti-adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa biofilms and their inhibition by herbal plants.</a> Iranian Journal of Microbiology. 8 (2), 108-119 (2016).</li>
<li>Arkatkar, A., Juwarkar, A. A., Bhaduri, S., Uppara, P. V., Doble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Pseudomonas+and+Bacillus+biofilms+on+pretreated+polypropylene+surface%5BTitle%5D)+AND+%22International+Biodeterioration+and+Biodegradation%22%5BJournal%5D)">Growth of Pseudomonas and Bacillus biofilms on pretreated polypropylene surface.</a> International Biodeterioration and Biodegradation. 64 (6), 530-536 (2010).</li>
<li>Dieterich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implant-Based+Breast+Reconstruction+Using+a+Titanium-Coated+Polypropylene+Mesh+%28TiLOOP+Bra%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Implant-Based Breast Reconstruction Using a Titanium-Coated Polypropylene Mesh (TiLOOP Bra).</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (1), 8-19 (2013).</li>
<li>Clavé, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polypropylene+as+a+reinforcement+in+pelvic+surgery+is+not+inert%3A+comparative+analysis+of+100+explants%5BTitle%5D)+AND+%22International+Urogynecology+Journal%22%5BJournal%5D)">Polypropylene as a reinforcement in pelvic surgery is not inert: comparative analysis of 100 explants.</a> International Urogynecology Journal. 21 (3), 261-270 (2010).</li>
<li>Zameer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+adhesive+and+anti-adhesive+properties+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+and+their+inhibition+by+herbal+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Iranian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of adhesive and anti-adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa biofilms and their inhibition by herbal plants.</a> Iranian Journal of Microbiology. 8 (2), 108-119 (2016).</li>
<li>Chen, R., Liu, X., Han, L., Zhang, Z., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology%2C+thermal+behavior%2C+rheological%2C+and+mechanical+properties+of+polypropylene%2Fpolystyrene+blends+based+on+elongation+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers+for+Advanced+Technologies%22%5BJournal%5D)">Morphology, thermal behavior, rheological, and mechanical properties of polypropylene/polystyrene blends based on elongation flow.</a> Polymers for Advanced Technologies. 31 (11), 2722-2732 (2020).</li>
<li>Vial Loading Trays Polystyrene vs. polypropylene: Which tubes are best for your research. ChemTech International. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://chemtech-us.com/polystyrene-vs-polypropylene-which-tubes-are-best-for-your-research/">https://chemtech-us.com/polystyrene-vs-polypropylene-which-tubes-are-best-for-your-research/</a> (2020).</li>
<li>Bock, L. J., Hind, C. K., Sutton, J. M., Wand, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+media+and+assay+plate+material+can+impact+on+the+effectiveness+of+cationic+biocides+and+antibiotics+against+different+bacterial+species%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Growth media and assay plate material can impact on the effectiveness of cationic biocides and antibiotics against different bacterial species.</a> Letters in Applied Microbiology. 66 (5), 368-377 (2018).</li>
<li>Prahl, S. Crystal violet. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://omic.org/spectra/PhotochemCAD/html/048.html">https://omic.org/spectra/PhotochemCAD/html/048.html</a> (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do ujawnienia.

W niniejszym badaniu opisano metody stosowania 96-dołkowego, wysokoprzepustowego statycznego urządzenia do wzrostu biofilmu o większej objętości, obejmującego polipropylenową mikropłytkę głębinową wyposażoną w półosłonową pokrywę płytki PCR do tworzenia biofilmu (urządzenie do biofilmu ze studni głębinowej; Tabela materiałów). Porównaliśmy biofilmy generowane za pomocą tego urządzenia z dostępnym na rynku standardowym urządzeniem do biofilmu z polistyrenu (tabela materiałów). Metoda urządzenia do studni głębinowej wykorzystuje te same kroki metodologiczne i rozwiązania, co standardowe urządzenie17 w dostosowanych objętościach zmodyfikowanych dla urządzeń do studni głębinowych, dzięki czemu urządzenie to jest idealne do tworzenia biofilmu na dużą skalę i analiz eksperymentalnych. Wzrost E. coli BW25113 i P. aeruginosa PAO1, dwóch gatunków Gram-ujemnych, o których wiadomo, że tworzą biofilmy, zbadano pod kątem tworzenia biomasy i wartości MBEC środków dezynfekujących (BZK/wybielacz) przy użyciu na obu urządzeniach. Porównanie biomasy wybarwionej CV utworzonej na kołkach z każdego urządzenia wykazało, że zarówno E. coli, jak i P. aeruginosa tworzyły biofilmy o wyższej biomasie na urządzeniu do biofilmu ze studni głębinowej w porównaniu ze standardowym urządzeniem (ryc. 3A-B). Zwiększona biomasa biofilmu odzwierciedlała większą powierzchnię kołków do studni głębinowych w porównaniu ze standardową powierzchnią kołków do urządzeń. Kiedy uwzględniliśmy różnice w powierzchni kołków (mm2) dla obu urządzeń, zauważono różnice w tworzeniu biomasy, gdzie E. coli tworzyła znacznie więcej biomasy CV na mm2 na standardowych kołkach do polistyrenu niż w przypadku kołków z rurkami PCR urządzenia do studni głębinowych (tabela 1). P. aeruginosa wytworzyła większą biomasę zabarwioną CV / peg mm2 w porównaniu ze standardowymi urządzeniami (Tabela 1). Odkrycia te mogą uwypuklić specyficzne dla gatunku różnice w tworzeniu biomasy biofilmu na różnych urządzeniach.
Należy zauważyć, że eradykacja biofilmów E. coli i P. aeruginosa w wybielaczu na urządzeniach głębinowych nastąpiła przy 2-4 razy niższych stężeniach niż w przypadku standardowego urządzenia (ryc. 4A-B, tabela 1). Na różnice w wartościach MBEC wybielacza zidentyfikowanych dla każdego urządzenia prawdopodobnie wpływają różnice w kształtach kołków do urządzeń (kołki do studni głębokiej to rurki stożkowe, a standardowe kołki są cylindryczne), różnice w składzie tworzywa sztucznego (polipropylen kontra polistyren) oraz różnice w objętości (750 μl w porównaniu z 200 μl). Na przykład P. aeruginosa miała większą biomasę CV M/mm2 na kołkach do urządzeń do studni głębinowych w porównaniu ze standardowymi urządzeniami, ale E. coli miała mniejszą biomasę na kołkach do studni głębinowych (ryc. 3). Sugeruje to, że na stężenie środków dezynfekcyjnych wymagane do likwidacji biofilmu może mieć wpływ biomasa utworzona przez każdy gatunek, a także dostępna powierzchnia. Dodatkowo różnice w kształcie kołków do urządzeń mogą wpływać na różne warunki wzrostu dla poszczególnych gatunków. W naszym badaniu P. aeruginosa może tworzyć większą biomasę na kołkach studni głębinowych ze względu na ich większą powierzchnię i napowietrzenie, ponieważ gatunek ten jest obowiązkowym tlenowcem w przeciwieństwie do E. coli, który jest fakultatywnym beztlenowcem. Do tej pory nie zidentyfikowaliśmy żadnych opublikowanych badań, w których bezpośrednio porównano tworzenie biofilmu E. coli i P. aeruginosa zarówno na materiałach polipropylenowych 27,28,29, jak i polistyrenu30,31. Jednak doniesienia o silnym tworzeniu się biofilmu E. coli i P. aeruginosa zostały odnotowane w niezależnych badaniach dotyczących materiałów polipropylenowych lub polistyrenowych. W odniesieniu do Pseudomonad, wiele Pseudomonas spp. może wykorzystywać tworzywa sztuczne, takie jak polipropylen, jako potencjalne źródła węgla32. W związku z tym dostępność tego urządzenia do biofilmu z polipropylenu jest użytecznym postępem w badaniach nad biofilmem statycznym. Polipropylen jest chemicznie trwalszy niż polistyren i jest materiałem istotnym klinicznie, ponieważ jest często stosowany w implantach medycznych, szwach i siatkach do operacji przepuklin lub miednicy33,34.
Chociaż biomasa biofilmu została utworzona przez oba urządzenia, urządzenie do studni głębinowej miało nieco większą zmienność biomasy w oparciu o metodę barwienia CV i wartości MBEC eliminacji biofilmu OD600 nm dla wybielacza i BZK. Można to wytłumaczyć 3 głównymi czynnikami: 1) Urządzenia do studni głębinowych mają większą powierzchnię kołków niż standardowe urządzenia, które były ustawione pod kątem w porównaniu ze standardowymi kołkami do urządzeń. 2) Oba badane gatunki mogą mieć różną zdolność do przylegania do materiałów polipropylenowych i polistyrenowych każdego urządzenia. 3) Objętości pożywki wzrostowej stosowanej w każdym urządzeniu (studnia głębinowa 750 μl, standardowa 200 μl) oraz odstępy między kołkami włożonymi do bocznych ścianek studzienki różnią się. Kwestie te nie stanowią problemu, jeśli do wszystkich eksperymentów z biofilmem używany jest tylko jeden typ urządzenia, jednak jeśli oba urządzenia zostaną wybrane, należy przeprowadzić porównania, które przeprowadziliśmy w tym miejscu, aby zidentyfikować różnice36,37. Ze względu na różnice w tworzywach sztucznych stosowanych w każdym urządzeniu, wartości biomasy biofilmu zabarwionego CV i MBEC nie powinny być bezpośrednio porównywane między różnymi urządzeniami. Jeżeli jednak metody i eksperymenty są przeprowadzane na tym samym urządzeniu (studzienki głębinowej lub standardowej), wyniki uzyskane dla badanych gatunków i środków przeciwdrobnoustrojowych są porównywalne.
Protokół ten pokazuje, że samoorganizujące się urządzenia do PCR z głęboką studnią są urządzeniami do pomiaru tworzenia i eliminowania biofilmu o większej objętości, które są również opłacalne. Z punktu widzenia kosztów, standardowe urządzenia do biofilmu z 96 dobrze przymocowanymi pokrywami kosztują 29-36 USD (USD) za urządzenie (tabela materiałów). Standardowe urządzenia do biofilmu z polistyrenu nie nadają się do sterylizacji w autoklawie i są mniej tolerancyjne na rozpuszczalniki/kwasy ze względu na swoje właściwości chemiczne tworzyw sztucznych. Samodzielnie zmontowane polipropylenowe płytki głębinowe opisane w niniejszym dokumencie, wyposażone w oddzielną 96-dołkową płytkę PCR z półspódniczką (tabela materiałów) kosztują łącznie 14 USD za zmontowane urządzenie, co stanowi połowę standardowego kosztu urządzenia do biofilmu. Należy zauważyć, że ceny mogą się różnić w zależności od regionu, dystrybutora i dostępności, a nasze koszty po rabatach instytucjonalnych wyniosły 9 USD za urządzenie do studni głębinowej. Te samodzielnie montujące się urządzenia do PCR z polipropylenu do głębokiej studni mają tę dodatkową zaletę, że można je sterylizować w autoklawie i oferują 2-4 razy więcej biomasy biofilmu niż standardowe urządzenia.
Podsumowując, protokół ten i reprezentatywne wyniki porównań wzrostu biofilmu w studni głębinowej i standardowych urządzeniach do biofilmu pokazują, że oba urządzenia są zdolne do hodowli biofilmów bakteryjnych, ale urządzenia do studni głębinowych tworzą 2-4 razy więcej biofilmu. Urządzenie do biofilmu ze studni głębinowej stanowi realną i przystępną cenowo alternatywę dla eksperymentów z tworzeniem biofilmu o większej objętości i wysokiej przepustowości, takich jak badania przesiewowe wrażliwości leków. Technika ta może prowadzić do generowania biofilmów przydatnych w dalszych ekstrakcjach "-omicznych" (proteomicznych, metabolomicznych, transkryptomicznych) lub testach eksperymentalnych (enzymatycznych, fluorescencyjnych), które mogą wymagać większych ilości materiału biofilmu do analiz. Urządzenie do biofilmu ze studni głębinowej jest zalecane dla laboratoriów, które chciałyby badać biofilmy w wysokoprzepustowym teście 96-dołkowym przy użyciu tańszych, bardziej objętościowych, chemicznie trwałych materiałów z tworzyw sztucznych, które są istotne klinicznie.

Pseudomonas aeruginosa i Escherichia coli to Gram-ujemne proteobakterie, które są powszechnie badane pod kątem ich zdolności do tworzenia siedzących, przyczepionych do powierzchni społeczności komórkowych znanych jako biofilmy1. Oba gatunki, rosnąc jako biofilmy, mogą wydzielać matrycę zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS) składających się głównie z różnych polisacharydów i białek, które mogą również zawierać zewnątrzkomórkowe DNA i/lub lipidy, zapewniając dodatkową ochronę komórkową i zwiększoną przeżywalność w trudnych, ograniczonych składnikami odżywczymi środowiskach2,3. Fizjologia i tworzenie biofilmu przez oba gatunki ma znaczenie kliniczne, ponieważ reprezentują one pięć najczęściej izolowanych patogenów opornych na środki przeciwdrobnoustrojowe z zakażeń krwi, dróg moczowych i płuc pacjentów szpitalnych w Kanadzie4,5. Należy również zauważyć, że szacuje się, że biofilmy stanowią prawie 80% wszystkich przewlekłych i nawracających infekcji wywoływanych przez te gatunki bakterii6. Ze względu na wydzielane substancje EPS i wolniejszą aktywność metaboliczną7,8, istniejące biofilmy stają się trudniejsze do wyeliminowania, gdy tworzą się na powierzchniach takich jak wszczepione urządzenia medyczne, tkanki bliznowate oraz w płucach pacjentów z mukowiscydozą9,10, zwiększając ich oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe.
Oporne właściwości wzrostu biofilmów bakteryjnych często czynią je bardziej odpornymi na inhibicję i/lub eliminację środków przeciwdrobnoustrojowych2,9. W związku z tym opracowanie metod in vitro do badania eradykacji biofilmu bakteryjnego ma zasadnicze znaczenie dla wyboru skutecznych związków do zwalczania infekcji, gdy tworzą się one na medycznych tworzywach sztucznych (np. cewnikach wewnętrznych) i implantach medycznych. Najszybsze metody hodowli przeciwdrobnoustrojowej biofilmu in vitro badają wzrost biofilmu jako "statyczną" hodowlę biofilmu, a nie "ciągłe" hodowle, w których statyczny wzrost bakterii jest monitorowany we wczesnych i późnych stadiach tworzenia biofilmu w krótkim (24-96 godzin) okresie czasu w tym samym pożywce. Metody ciągłego biofilmu są kłopotliwe dla szybkiej analizy, ponieważ wymagają oceny wzrostu biofilmu w dłuższych ramach czasowych uprawianych w komorach, które pozwalają na ciągły przepływ i wymianę pożywek wzrostowych na mniejszą liczbę powtórzeń11. Ze względu na czas i wysiłek wymagany do utrzymania i tworzenia ciągłych biofilmów, najbardziej popularne są statyczne biofilmy in vitro, ponieważ można je łatwo dostosować do wysokoprzepustowych testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe na plastikowych 96-dołkowych płytkach mikromiareczkowych, a nie w skomplikowanych systemach komór przepływowych, które ograniczają liczbę jednocześnie badanych kultur 12,13. Najprostsze statyczne testy mikropłytek biofilmu "in-well" wykorzystują standardowe płytki mikromiareczkowe z polistyrenu lub winylu (o pojemności 300 μl) do pomiaru tworzenia się biofilmu po bokach i na dnie każdej studzienki, a często jako pierścienie na granicy faz powietrze-ciecz. Tworzenie się bakteryjnego biofilmu w studni mierzy się poprzez barwienie zdeponowanej biomasy przylegającej do studzienek po usunięciu cieczy pożywki wzrostowej i umyciu biofilmów12,13. Testy te są popularne z ekonomicznego punktu widzenia, ale często mają problemy z odtwarzalnością ze względu na ich naturalną konstrukcję, ponieważ osadzone biofilmy są podatne na uszkodzenia lub utratę podczas płukania w celu odzyskania komórek i procedur barwienia biomasy11,14.
Aby zmniejszyć straty biofilmu, standardowe komercyjne urządzenia do biofilmu ulepszyły projekty mikropłytek z biofilmem w studni, dodając wkładaną 96-dołkową pokrywkę z polistyrenu do standardowego projektu płytki 96-dołkowej, określanej tutaj jako "standardowe urządzenie do biofilmu". Dodanie kołkowanej pokrywy zwiększa dostępną powierzchnię w każdym dołku mikropłytki, co pozwala na lepsze przyleganie do powierzchni i tworzenie biomasy biofilmu15,16. Standardowe urządzenia z pokrywkami z biofilmem pozwalają na większe odzyskiwanie, usuwanie i płukanie biofilmu w celu późniejszego testowania wrażliwości biofilmu na środki przeciwdrobnoustrojowe i eliminacji, gdy kołkowane pokrywki są wkładane do nowych płytek mikromiareczkowych zawierających leki lub warunki wzrostu. Podobnie jak w przypadku technik mikropłytek biofilmu w studni, materiały odzyskane z usuniętych i umytych urządzeń z kołpakami pozwalają na testowanie przeżywalności komórek i barwienie biomasy biofilmu, zwykle z użyciem preparatów barwnika fioletu krystalicznego (CV) 17,18,19. Standardowe urządzenia do biofilmu są również optymalne do badania przesiewowego wrażliwości biofilmu na środki przeciwdrobnoustrojowe. Testy te monitorują hamowanie wzrostu biofilmu na dwa sposoby: 1) Gdy środki przeciwdrobnoustrojowe są dodawane do komórek na początku wzrostu, mogą określić minimalną wartość stężenia hamowania biofilmu (MBIC). 2) Gdy po 24 godzinach na kołkach utworzą się biofilmy, a następnie zostaną wystawione na działanie środków przeciwdrobnoustrojowych, może określić wartość minimalnego stężenia eliminacji biofilmu (MBEC) 17,20. Podobnie jak w przypadku urządzeń do mikropłytek do biofilmu w studni, standardowe urządzenia do biofilmu mają pewne znaczące ograniczenia, takie jak wysoki koszt urządzenia, nie można ich sterylizować w autoklawie i są mniej odporne na rozpuszczalniki chemiczne ze względu na zastosowany materiał płytek polistyrenowych. Standardowe urządzenia do biofilmu mają również niski stosunek powierzchni do kołków, co ogranicza maksymalne objętości robocze w każdym studzience do 200 μl. Czynniki te mogą sprawić, że standardowe urządzenia do biofilmu będą trudniejsze w użyciu w badaniach, które wymagają większych ilości biofilmu w formacie wysokoprzepustowym.
Tutaj opisujemy metodę statycznego biofilmu z 96-dołkową pokrywą, opracowaną w naszym laboratorium, przy użyciu dostępnych na rynku polipropylenowych półspódniczek 0,5 ml 96-dołkowych płytek PCR dopasowanych do 96-dołkowych płytek do mikromiareczkowania z dołkami głębszymi niż standardowa płytka (Tabela Materiałów). Te zmontowane urządzenia mają maksymalną objętość roboczą 750 μl, gdy są używane do hodowli biofilmu (znane tutaj jako "urządzenie do biofilmu ze studni głębinowej"). Zaletą stosowania tych urządzeń do biofilmu ze studni głębinowej jest ich niższy koszt w porównaniu ze standardowymi urządzeniami do biofilmu, można je sterylizować w autoklawie i zwiększają powierzchnię do tworzenia biofilmu na większej zewnętrznej płytce PCR "rurki/kołki". Metodą tą przedstawiono zastosowania tych urządzeń do hodowli i charakterystyki biomasy biofilmu utworzonego przez Escherichia coli BW25113 i P. aeruginosa PAO1. Metody oznaczania wartości MBEC za pomocą testów eliminacji biofilmu opisano przy użyciu czwartorzędowych środków przeciwdrobnoustrojowych zawierających związek amoniowy, chlorek benzalkoniowy (BZK) i podchloryn sodu (wybielacz). Środek antyseptyczny/dezynfekujący BZK został wybrany, ponieważ związek ten jest często używany do hamowania biofilmów z zanieczyszczonych powierzchni, ale podobno jest mniej skuteczny w eliminowaniu dobrze znanych biofilmów21. Wybielacz jest wysoce skuteczną substancją chemiczną do usuwania powstałych biofilmów i jest podstawą dezynfekcji chemicznej 22. Oba środki dezynfekujące zapewniają użyteczne porównanie wartości MBEC dla każdego urządzenia do biofilmu21. W tym artykule podsumowano protokół oceny tego urządzenia do biofilmu z wykorzystaniem testów barwienia CV i eliminacji biofilmu w celu określenia MBEC. Dołączono schemat blokowy protokołu w celu uproszczenia przeglądu przepływu pracy dla tych metod (Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>Pipety serologiczne 10 ml, indywidualny papier pakowy/plastik (200/CS)</td><td>Jednorazowe</td> pipety serologiczne Fisher Scientific <td>13-678-11F</td><td>do aseptycznego transferu pożywki/kultur</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 2 mL, indywidualny papier pakowy/plastik, 500/CS</td><td>Jednorazowe</td> pipety serologiczne Fisher Scientific <td>13-678-11C</td><td>do aseptycznego transferu pożywki/kultur</td></tr><tr><td>Końcówki filtra aerozolowego Axygen, sterylne, 5 stojaków/ PK, 1000 końcówek/stojak</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-766</td><td>sterylne końcówki pipetowe do podawania pożywki</td></tr><tr><td>Mikropłytki do przechowywania w głębokich studniach Axygen, okrągłe studzienki, nasadka 1,1 mL, 5/PK, P-DW-11-C</td><td>Mikropłytka Fisher Scientific</td><td>P-DW-11-C</td><td>do 96-dołkowego urządzenia do hodowli biofilmu</td></tr><tr><td>Axygen Końcówki filtrów, 350 i mikro; Końcówki L w stojaku, 96/stojak, 10 stojaków, końcówki barierowe o niskiej retencji</td><td>Fisher Scientific</td><td>TF-350-L-R-S</td><td>sterylne końcówki pipetorowe do porcjowania pożywek</td></tr><tr><td>Umywalka/zbiornik naturalny PS 50 mL, Sterylny, 5/worek, 40 worków, CS200</td><td>Avantor/ VWR</td><td>89094-676</td><td>sterylne miski/ zbiorniki do przygotowania mikropłytek</td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Podłoże: Agar granulowany, 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0</td><td>materiały do przygotowania agaru LB</td></tr><tr><td>Wielomodowy czytnik płytek Biotek Synergy Neo2 Czytnik płytek</td><td>regionu BITEK</td><td>NEO2MB</td> do <td>mikropłytek UV/Vis</td></tr><tr><td>Wanna ultradźwiękowa Branson M3800, 117 V</td><td>Avantor/</td><td>VWR CPX-952-316R</td><td>sonikująca kąpiel wodna</td></tr><tr><td>fiolet krystaliczny (CV), klasa ACS, 100 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>C581-100</td><td>biofilm bejca z biomasy</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO), 1 l, klasa ACS 99,9%, butelka polietylenowa, BDH</td><td>Avantor/ VWR</td><td>CABDH1115-1LP</td><td>komponenty do kriokonserwacji</td></tr><tr><td>Easypet 3, kontroler pipet</td><td>Avantor/ VWR</td><td>CA11027-980</td><td>pipeta serologiczna do aseptycznego transferu pożywek/kultur</td></tr><tr><td>Pipetor wielokanałowy Eppendorf Research Plus 8, 10-100 &mikro; L</td> Pipety wielokanałowe <td>Avantor/ VWR</td><td>CA89125-338</td><td>do aseptycznego transferu pożywek/kultur</td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus 8 pipet wielokanałowy, 30-300 i mikro; L</td><td>Avantor/ VWR</td><td>CA89125-340</td><td>pipety wielokanałowe do aseptycznego transferu pożywki/kultur</td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy, CAS 64-19-7, 2.5L, klasa ACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td>CV destain</td></tr><tr><td>Probówki szklane, 150 mm x 18 mm, 72/opakowanie, PYREX</td><td>Fisher Scientific</td><td>14957H/ 9820-18</td><td>materiały do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Glicerol, 4 L szklana butelka ACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td>składniki do kriokonserwacji</td></tr><tr><td>L-cysteina, 98%, 250 g</td><td>Avantor/ VWR</td><td>97061-204</td><td>uniwersalny roztwór neutralizujący</td></tr><tr><td>L-glutation zredukowany, 98%, 25 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ6216614</td><td>uniwersalny roztwór neutralizujący</td></tr><tr><td>L-hisytydyna, 98%, 100 g</td><td>Avantor/ VWR</td><td>CA97062-598</td><td>uniwersalny roztwór neutralizujący</td></tr><tr><td>Inokulator testowy MBEC z tacą 96-dołkową, 100/CS</td><td>Materiał Innovotech</td><td>19112</td><td>do 96-dołkowej hodowli biofilmu w urządzeniu MBEC</td></tr><tr><td>McFarland Standard, 0,5 EA</td><td>Standaryzacja hodowli komórkowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>R20410</td></tr><tr><td>McFarland Standard, 1.0 EA</td><td>Standaryzacja hodowli komórkowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>R20411</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania NUNC, z pokrywką, 50/CS</td><td>Fisher Scientific</td><td>167008</td><td>mikropłytka do 96-dołkowego urządzenia MBEC Hodowla biofilmu i pomiary OD</td></tr><tr><td>Płytka PCR, półspódniczka 96-dołkowa, szybki PCR, polipropylen, 25ea/PK</td><td>Sarstedt</td><td>72.1981.202</td><td>pokrywa kołkowa do 96-dołkowego urządzenia do uprawy biofilmu</td></tr> Szalka <tr><td>Petriego, 100 mm x 15 mm, semi-TK CS/500</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>materiały do przygotowania agaru LB</td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy, ACS 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>PBS Składnik/ bufor</td></tr><tr><td>Chlorek sodu, klasa ACS, 3 kg</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2713</td><td>składniki do bulionu LB i PBS</td></tr><tr><td>fosforan sodu jednozasadowy, 1 kg</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-1</td><td>PBS składnik/ bufor</td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe, sterylne, PES 0,45 um, 25 mm, PK50</td><td>Avantor/ VWR</td><td>28145-505</td><td>sterylizacja roztworem bez autoklawu Folia</td></tr><tr><td>aluminiowa, ciężka cło, 50 stóp</td><td>Sklep spożywczy</td><td>---</td><td>materiały do sterylizacji urządzeń do głębokich studni</td></tr><tr><td>Trypton (pepton z kazeiny), 2,2 kg/EA</td> Składniki pożywki <td>Fisher Scientific</td><td>B11922</td><td>do bulionu LB</td></tr><tr><td>Tween-20, 100 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td>roztwór podłoża regeneracyjnego</td></tr><tr><td>Ultra-deepwell, płytki głębinowe 2,5 ml (studzienka kwadratowa), z pokrywką, polipropylen, 10/CS</td><td>Avantor/ VWR</td><td>37001-520</td><td>materiały do przygotowania rozcieńczania biofilmu</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy, Fisher Bioreagents, 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>składniki podłoża do bulionu LB</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie większej biomasy biofilmu bakteryjnego za pomocą urządzeń do mikropłytek głębinowych pcr-plate

Generation of Greater Bacterial Biofilm Biomass using PCR-Plate Deep Well Microplate Devices

Biofilmy bakteryjne są trudne do usunięcia z powierzchni za pomocą konwencjonalnych interwencji przeciwdrobnoustrojowych. Wysokoprzepustowe metody mikropłytek 96-dołkowych są często stosowane do hodowli biofilmów bakteryjnych w celu szybkiego badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe w celu obliczenia wartości minimalnego stężenia eliminacji biofilmu (MBEC). Standardowe urządzenia do biofilmu składają się z polistyrenowych pokrywek przymocowanych do 96-dołkowych mikropłytek i są idealne do pomiaru biomasy biofilmu i wartości MBEC, ale urządzenia te są ograniczone dostępną powierzchnią kołków do akumulacji biomasy i kosztami. W tym miejscu przedstawiamy protokół stosowania samodzielnie zmontowanego 96-dołkowego urządzenia z polipropylenu do PCR z płytką z kołkiem do hodowli biofilmów Escherichia coli BW25113 i Pseudomonas aeruginosa PAO1. Opisano porównanie 24-godzinnych biofilmów tworzonych na urządzeniach ze studni standardowych i głębinowych przez każdy gatunek przy użyciu barwienia biomasy fioletem krystalicznym i testów oznaczania MBEC. Oczekuje się, że większa powierzchnia urządzeń głębinowych zwiększyła ogólne tworzenie biofilmu przez oba gatunki 2-4-krotnie. P. aeruginosa tworzył znacznie większą biomasę/mm2 na kołkach głębokich studni w porównaniu ze standardowym urządzeniem. E. coli miała większą biomasę/mm2 na standardowych urządzeniach polistyrenowych w porównaniu z urządzeniem ze studni głębinowych. Testy eliminacji biofilmu za pomocą środków dezynfekujących, takich jak podchloryn sodu (wybielacz) lub chlorek benzalkoniowy (BZK), wykazały, że oba związki mogą eliminować biofilmy E. coli i P. aeruginosa z obu urządzeń, ale przy różnych wartościach MBEC. Eradykacja biofilmu BZK skutkowała zmiennymi wartościami MBEC E. coli między urządzeniami, jednak wybielacz wykazał powtarzalne wartości MBEC zarówno dla gatunków, jak i urządzeń. Badanie to zapewnia wysokoprzepustową metodę studni głębinowej do hodowli większych ilości biofilmów na urządzeniach polipropylenowych do dalszych badań wymagających większych ilości biofilmu statycznego.

Celem niniejszego badania było opracowanie metody prowadzenia pomiarów w statycznym urządzeniu do hodowli biofilmu o większej objętości i wysokiej przepustowości (96 dołków) z wykorzystaniem urządzeń do biofilmu z głębokimi dołkami. W pracy porównano samoorganizującą się płytkę PCR z półobwódką, wstawioną do mikroplatek z głębokimi dołkami (znaną jako urządzenie z głębokimi dołkami), ze standardowym, powszechnie stosowanym urządzeniem z pokrywką z kołkami, aby zbadać ich zdolność do tworzenia statycznych biofilmów. W celu oceny formowania się biofilmu w obu urządzeniach wykorzystano barwienie biomasy kryształem fioletowym (CV) oraz testy eradykacji biofilmu (MBEC).
Aby porównać tworzenie biofilmu przez różne gatunki na każdym z urządzeń, oceniono biomasę biofilmu utworzoną przez E. coli BW25113 oraz P. aeruginosa PAO1, stosując protokół barwienia biofilmu kryształem fioletowym (CV)17. Choć barwienie CV jest zazwyczaj raportowane jako wartości A550nm, ze względu na różnice w objętościach hodowli w każdym urządzeniu oraz dostępne powierzchnie, przekształcono wartości A550nm barwienia CV na molowe stężenia CV w roztworze. Molowe stężenia CV uwzględniły różnice w objętości każdego urządzenia i pozwoliły na porównanie stężeń CV reprezentujących biomasy odzyskane z każdego urządzenia. Wyniki wykazały, że oba gatunki wytworzyły znacznie więcej biomasy na urządzeniach do biofilmu z głębokimi dołkami (2,1-krotnie dla E. coli; 4,1-krotnie dla P. aeruginosa) w porównaniu do standardowego urządzenia do biofilmu (Rysunek 3A-B). Wynik ten był oczekiwany, biorąc pod uwagę większą powierzchnię kołka PCR w głębokim dołku (320,4 mm2) w porównaniu do powierzchni kołka w urządzeniu standardowym (108,9 mm2). Wynik ten jest również zgodny ze zwiększonymi objętościami (750 µL) stosowanymi w urządzeniu do biofilmu z głębokimi dołkami w porównaniu do dołków w urządzeniu standardowym (200 µL). Zatem urządzenia z głębokimi dołkami zwiększyły akumulację biomasy biofilmu na kołkach w probówkach PCR w porównaniu do mniejszych kołków w standardowych urządzeniach do biofilmu.
Oba urządzenia do hodowli biofilmu utworzyły powtarzalne biofilmy podczas porównania biologicznych powtórzeń biofilmów utworzonych przez E. coli oraz P. aeruginosa (Rycina 3A-B). Pomimo zaobserwowania większej zmienności wartości A550nm w powtórzeniach technicznych barwionych kryształem fioletowym (CV) dla obu szczepów hodowanych na urządzeniu z głębokimi studzienkami, nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic przy porównaniu median wartości M dla powtórzeń biologicznych każdego gatunku na urządzeniach z głębokimi studzienkami lub standardowych, przy użyciu dwustronnej dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) lub testów t-Studenta (w obu przypadkach p &gt; 0,05). Wynik ten wskazuje, że urządzenia z głębokimi studzienkami i urządzenia standardowe pozwalają na powtarzalne tworzenie biofilmu. Jednak wyniki barwienia CV wykazały również, że po uwzględnieniu różnic w powierzchni pinu każdego urządzenia, tworzenie biomasy biofilmu przez E. coli i P. aeruginosa wykazało statystycznie istotne różnice w akumulacji biomasy (Tabela 1). Obliczenie średniej biomasy barwionej CV (M) na powierzchnię pinu w mm2 (CV M/mm2) dla E. coli wykazało, że tworzenie biofilmu było 1,5-krotnie niższe na polipropylenowych urządzeniach z głębokimi studzienkami w porównaniu do standardowego urządzenia do biofilmu (Tabela 1). Przeciwny wynik uzyskano dla P. aeruginosa, która wykazała 1,4-krotnie wyższą wartość CV M/mm2 na polipropylenowych urządzeniach z głębokimi studzienkami w porównaniu do standardowych urządzeń do biofilmu (Tabela 1). Pomimo zaobserwowanych różnic gatunkowych w akumulacji biomasy biofilmu dla każdego urządzenia, urządzenie z głębokimi studzienkami wciąż wykazało większe całkowite tworzenie biomasy biofilmu (wzrosty 2-4-krotne) dla każdego gatunku (Rycina 3).
Aby określić zastosowania urządzenia do biofilmu z głębokimi otworami w testach wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe, porównano potencjał eradykacji biofilmu dwóch powszechnie stosowanych środków dezynfekcyjnych: BZK oraz wybielacza. Obie substancje są powszechnie wykorzystywane do zapobiegania (BZK) i/lub eradykacji (wybielacz) bakteryjnych biofilmów w zastosowaniach klinicznych i przemysłowych21,22,23. Każdy związek dodawano w rosnących, dwukrotnie zwiększanych stężeniach do biofilmów tworzonych przez E. coli oraz P. aeruginosa na standardowych urządzeniach do biofilmu oraz urządzeniach z głębokimi otworami22,23(Rysunek 1, 2B). Jako wartość MBEC zdefiniowano najniższe stężenie BZK lub wybielacza, które skutkowało wartościami OD600nm nieodróżnialnymi od wartości w studniach kontrolnych negatywnych. Traktowanie biofilmów utworzonych na standardowych urządzeniach wybielaczem zaowocowało takimi samymi wartościami MBEC dla wybielacza, wynoszącymi 0.625% dla E. coli i P. aeruginosa (Tabela 1, Rysunek 4A-B). Wartości MBEC dla wybielacza określone dla biofilmu E. coli i P. aeruginosa utworzonego na urządzeniach z głębokimi otworami były 2-4 razy niższe dla obu gatunków (E. coli; 0.156%; P. aeruginosa 0.313%) w porównaniu z urządzeniami standardowymi (Tabela 1). W urządzeniu z głębokimi otworami odnotowano 2-krotną różnicę w wartościach MBEC dla wybielacza między gatunkami, przy czym P. aeruginosa wymagało 2-krotnie wyższego stężenia wybielacza do eradykacji biofilmu w porównaniu z E. coli (Rysunek 4A-B, Tabela 1). Ta 2-krotna różnica w MBEC dla wybielacza między P. aeruginosa a E. coli w urządzeniu z głębokimi otworami wydaje się korelować odwrotnie z 1,5-krotnie większą ilością biomasy barwionej CV tworzonej przez P. aeruginosa w porównaniu z E. coli (Rysunek 3A-B). Większa ilość biomasy tworzonej przez P. aeruginosa na kołkach urządzenia z głębokimi otworami może również wyjaśniać, dlaczego do eradykacji biofilmów P. aeruginosa wymagane było wyższe stężenie wybielacza w porównaniu z E. coli w głębokich otworach (Rysunek 3A-B, Tabela 1). Zatem testy eradykacji biofilmu w urządzeniu z głębokimi otworami wykazały, że oba gatunki były wrażliwe na wybielacz, ale przy niższych (2-4-krotnie) stężeniach wybielacza w porównaniu z urządzeniami standardowymi. Koreluje to odwrotnie z 3-krotnie większą powierzchnią kołków i objętością kołków płytki PCR w urządzeniu z głębokimi otworami. Sugeruje to, że w przypadku ekspozycji na wybielacz większa powierzchnia biomasy może obniżać stężenia wybielacza niezbędne do eradykacji biofilmu.
Badania nad eradykacją biofilmu za pomocą BZK wykazały większą zmienność odrastania (wartości OD600nm) i wartości MBEC dla każdego gatunku w porównaniu z wynikami dla wybielacza (Rycina 4C-D). Zmienność ta nie jest zaskakująca w świetle wcześniejszych badań, które wykazały, że BZK była bardziej skuteczna w zapobieganiu tworzeniu biofilmu niż w eradykacji dobrze rozwiniętych biofilmów24,25,26. Przy użyciu standardowego urządzenia do biofilmu tylko biofilmy P. aeruginosa traktowane BZK wykazały spójną wartość MBEC (2560 µg/mL), która była 8-krotnie niższa od wartości MBEC (20480 µg/mL) uzyskanej dla tego szczepu w urządzeniu z głębokimi dołkami (Tabela 1, Rycina 4C). Wyniki te mogą odzwierciedlać różnice w ilości biomasy P. aeruginosa tworzącej się na powierzchniach kołków w głębokich dołkach oraz w składzie tworzywa sztucznego w porównaniu do kołków w urządzeniu standardowym. Eradykacja biofilmów tworzonych przez E. coli za pomocą BZK w obu urządzeniach (z głębokimi dołkami i standardowym) była równie słaba, co skutkowało szerokim zakresem wartości MBEC dla BZK od 2560-40960 µg/mL dla urządzenia z głębokimi dołkami i 320-10240 µg/mL w urządzeniu standardowym (Rycina 4D). W przypadku E. coli zmienność tę wyjaśniano sporadycznymi przypadkami, w których 1-2 powtórzenia w dołkach wykazywały niski, ale statystycznie istotny wzrost w pożywce regeneracyjnej, co zwiększało błąd i zmniejszało dokładność wyznaczania MBEC dla BZK w obu urządzeniach (Rycina 4D, Tabela 1). Zmienność ta podkreśla nieskuteczność stosowania BZK w eradykacji biofilmów E. coli, co odnotowano we wcześniejszych badaniach24,25,26. W przeciwieństwie do tego, biofilmy P. aeruginosa mogły być niezawodnie eradykowane przez BZK przy określonym stężeniu w obu urządzeniach, jednak z 8-krotną różnicą w stężeniu BZK (Rycina 4C). Podsumowując, wartości MBEC dla eradykacji biofilmów tworzonych przez P. aeruginosa za pomocą BZK wykazują odmienne wartości dla każdego urządzenia, jednak oba urządzenia są równie nieskuteczne w rozróżnianiu precyzyjnych fenotypów eradykacji E. coli przez BZK.
Zatem opisana w niniejszym opracowaniu metoda z wykorzystaniem urządzenia do biofilmu w głębokich dołkach jest równie skuteczna w tworzeniu powtarzalnych biofilmów w porównaniu do standardowego urządzenia do biofilmu.
<img alt="Analiza biofilmu mikrobiologicznego; schemat procesu; przedstawia izolację kolonii, inokulację biofilmu, barwienie, analizę MBEC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63069/63069fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczny przegląd eksperymentu. Dzień 0: izolacja pojedynczych kolonii z zapasów kriokonserwowanych; dzień 1: inokulacja pożywek wzrostowych pojedynczymi koloniami; dzień 2: inokulacja płytki do biofilmu; dzień 3: barwienie CV lub próba z zastosowaniem środków przeciwdrobnoustrojowych; dzień 4: sonikacja biofilmu do pożywek regeneracyjnych; oraz dzień 5: pomiar OD600nm płytki regeneracyjnej w celu określenia wartości MBEC. Niektóre obrazy na rycinie zostały udostępnione przez Servier Medical Art (smart.servier.com). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63069/63069fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układy płytek dla wzrostu biofilmu i wyzwania przeciwmikrobowego; schemat eksperymentu; analiza mikrobiologiczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63069/63069fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przykładowe układy płytek przedstawione dla różnych etapów protokołu. A) Końcowy układ płytek dla początkowego 24-godzinnego wzrostu biofilmu przy użyciu kultur bakteryjnych z dnia 1 dla dwóch szczepów bakterii (E. coli i P. aeruginosa), z trzema powtórzeniami biologicznymi dla każdego z nich. Studzienki kontrolne ujemne (szare) służą jako kontrole sterylności (bez dodanych bakterii). B) Układ płytek dla wyzwania przeciwmikrobowego biofilmów. Ciemniejsze kolory wskazują na zwiększające się stężenie środka przeciwmikrobowego. Kontrole ujemne to studzienki bez dodanych bakterii (szare), a kontrole dodatnie to biofilmy bez ekspozycji na środek przeciwmikrobowy (pomarańczowe). Pokrywy z kołkami z biofilmem pobrane z panelu A są przeniesione na tę głęboką płytkę wielodołkową w celu ekspozycji na środek przeciwmikrobowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63069/63069fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie biologicznych powtórzeń stężenia molowego CV w standardowych oraz głębokich dołkach; analiza wykresu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63069/63069fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3Stężenie molowe (M) barwionych CV *E. coli* BW25113. (A) i P. aeruginosa PAO1 (B) biomasa biofilmu odzyskana z urządzeń standardowych (koła) i głębokich studzienek (trójkąty). Barwienie CV mierzono, odczytując absorbancję CV przy 550 nm (A550 nm), oraz głęboką studzienkę A550 nm odczyty skorygowano o współczynnik 3,809 (800 µL/ 210 µL) aby uwzględnić różnice w objętości pomiędzy urządzeniami. Stężenie molarne (M) CV wyznaczono zgodnie z prawem Beera-Lamberta (stężenie CV = A550 nm/εl); gdzie długość drogi optycznej (l) 210 µL w 96-dołkowej płytce mikrotitracyjnej z płaskim dnem określono na 0,56 cm, a współczynnik ekstynkcji (ε) CV w wodzie przy A550 nm wynoszącej 251 500 cm-1M-1 39Wyniki reprezentują 9 powtórzeń technicznych z trzech powtórzeń biologicznych dla każdego szczepu hodowanego w formie biofilmu, a wartość mediany dla każdego powtórzenia biologicznego przedstawiono jako poziomy pasek na każdym wykresie. Statystycznie istotne różnice w biomasie pomiędzy urządzeniami określono dla wartości median powtórzeń biologicznych przy użyciu dwustronnego testu t dla prób zależnych (E. coli p= 0,008-0,018 (*); P. aeruginosa p= 0,002-0,009 (**)) przedstawione jako słupki z gwiazdkami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63069/63069fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wykres słupkowy hamowania wzrostu bakterii; wpływ stężenia wybielacza i BZK; OD600; szczepy PAO1 i BW25113." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63069/63069fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4Wyznaczenie stężenia MBEC środka przeciwdrobnoustrojowego. Wyznaczenie przeciwdrobnoustrojowego stężenia MBEC dla wybielacza (A, B) oraz BZK (C, D) dla P. aeruginosa PAO1 (A, C) oraz E. coli BW25113 (B,D) hodowany na standardowych (białe słupki) oraz głębokich (szare słupki) urządzeniach z kołkami do biofilmu. Wyniki określono poprzez pomiar gęstości optycznej (OD)600 nm biofilmu odzyskanego po sonikacji w medium regeneracyjnym i inkubacji przez noc. OD w płytce z głębokimi dołkami600 nm skorygowano o współczynnik 3,75 (750 µL /210 µL) aby uwzględnić różnice w objętości między urządzeniami. Wyniki są reprezentatywne dla trzech powtórzeń biologicznych, a słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe między powtórzeniami dla każdego stężenia środka przeciwdrobnoustrojowego39Gwiazdki (*) nad każdym wykresem słupkowym wskazują statystycznie istotne różnice w OD600 nm wartości z kontroli ślepych wraz z wartościami p &lt; 0,05 przy użyciu obliczeń dwustronnego testu t Studenta. Symbole okręgów (o) nad każdym wykresem słupkowym wskazują pomiary, w których tylko 1 lub 2 powtórzenia wykazały statystycznie istotną wartość OD600 nm wartości z kontroli ślepych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63069/63069fig4v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">BZK MBEC (minimalna biomasa eradykacyjna)µg/mL)</td>
			<td colspan="2">Wybielacz MBEC (% v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Badany szczep</td>
			<td>Urządzenie do głębokich studzienek</td>
			<td>Urządzenie standardowe</td>
			<td>Urządzenie do głębokich studzienek</td>
			<td>Urządzenie standardowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BW25113</td>
			<td>2560-40960</td>
			<td>320-10240</td>
			<td>0.156</td>
			<td>0.625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P. aeruginosa PAO1</td>
			<td>20480</td>
			<td>2560</td>
			<td>0.313</td>
			<td>0.625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Urządzenie z głębokimi studzienkami</td>
			<td>Urządzenie standardowe</td>
			<td rowspan="2">pwartość p**</td>
			<td rowspan="2">Krotność zmiany (Deep well/ Standard)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Badany szczep</td>
			<td>Średni współczynnik zmienności M*/mm2 ± SD</td>
			<td>Średnie CV M*/mm2 ± SD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BW25113</td>
			<td>1,99 x 10-8 ± 3,25 x 10⁻⁹</td>
			<td>3,03 x 10-8 ± 3,31 x 10-9</td>
			<td>0.0176</td>
			<td>-1.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P. aeruginosa PAO1</td>
			<td>8,01 x 10-8 ± 9,42 x 10-9</td>
			<td>5,72 x 10-8 ± 9,42 x 10-9</td>
			<td>0.034</td>
			<td>1.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Podsumowanie E. coli BW25113 oraz P. aeruginosa średnia biomasa PAO1 barwiona CV M/mm2 wartości oraz wartości MBEC dla usuwania biofilmu w przypadku BZK i wybielacza na różnych urządzeniach. 
Średnie wartości CV M/mm2 obliczone przy użyciu medianowych wartości CV M dla biologicznych powtórzeń (Rysunek 3). 
wartości p wyznaczone za pomocą dwustronnego testu t Studenta.

Ten protokół przedstawia metodologię wykonywania pomiarów wzrostu biofilmu i biomasy przy użyciu samodzielnie zmontowanych urządzeń do płytek PCR z głębokiej studni do wysokoprzepustowego 96-dołkowego statycznego przesiewania biofilmu z pokrywą potwierdzoną.

Wytwarzanie większej biomasy biofilmu bakteryjnego za pomocą urządzeń do mikropłytek głębinowych PCR-Plate

Bacterial biofilms are difficult to eradicate from surfaces using conventional antimicrobial interventions. High-throughput 96-well microplate methods are ...

Celem tej procedury jest porównanie standardowego urządzenia do biofilmu z pokrywką kołkową z urządzeniem do biofilmu z polipropylenu poprzez barwienie fioletem krystalicznym i testowanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe. Standardowe urządzenie do biofilmu z pokrywką kołkową ma 96 kołków i mieści się na standardowej 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania, co pozwala na eksperymenty z biofilmem o wysokiej przepustowości. Pokrywka kołka zapewnia powierzchnię do wzrostu biofilmu, a biofilmy wyhodowane na kołkach mogą być dalej analizowane w dalszych eksperymentach.Jednak płytki wykorzystują maksymalną objętość 200 mikrolitrów, co utrudnia badanie tworzenia biofilmu i biomasy przy użyciu eksperymentów, które wymagają większych ilości biofilmu. W tym miejscu opisujemy urządzenie do biofilmu ze studni głębinowej do hodowli biofilmów statycznych. Urządzenie do biofilmu z głębokiej studni wykorzystuje 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania z 96 dołkami wyposażoną w półspódniczkę 96-dołkową płytkę PCR jako pokrywkę kołka.Ta metoda pozwala na uzyskanie maksymalnej objętości płytki wynoszącej 750 mikrolitrów, zapewnia większą powierzchnię kołków do wzrostu biofilmu i jest tańsza w porównaniu ze standardowym urządzeniem do biofilmu. Opiszemy i porównamy protokoły barwienia biofilmów fioletem krystalicznym w celu określenia biomasy biofilmu, a także wyznaczenia minimalnego stężenia eliminacji biofilmu, znanego również jako MBEC. Pokazany jest schematyczny przegląd eksperymentu, który zostanie opisany.Smugi pożądanych szczepów bakteryjnych z kriokonserwowanego wywaru bezpośrednio na pożywną płytkę agarową. Inkubuj płytki agarowe przez noc w optymalnych warunkach szczepu. Następnego dnia zaszczep pojedynczą kolonię w pięciu mililitrach pożywki wzrostowej i hoduj kultury w inkubatorze przez noc.Płytki biofilmu zostaną wypełnione, jak pokazano. Napełnij zewnętrzne studzienki 750 mikrolitrami sterylnej wody, a studzienki kontroli ujemnej 750 mikrolitrami sterylnych pożywek wzrostowych. Napełnij pozostałe studzienki 675 mikrolitrami sterylnej pożywki wzrostowej.Standaryzacja kultur nocnych do gęstości optycznej 1,0 przy 600 nanometrach. Utwórz dziesięciokrotną serię rozcieńczeń, aż do osiągnięcia rozcieńczenia od 10 do minus trzech. Zaszczepić studzienki z pożywką rozcieńczoną kulturą w proporcjach od 10 do minus trzy, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie bakteryjne od 10 do minus czterech i końcową całkowitą objętość w studzience wynoszącą 750 mikrolitrów.Ostrożnie włóż pokrywkę kołka do płytki biofilmu. Inkubować płytki w optymalnych warunkach odkształcania z maksymalnym wytrząsaniem 160 obr./min przez 24 godziny. Ostrożnie zdejmij pokrywkę kołka z płytki wzrostu biofilmu i wypłucz biofilmy w nowej płytce z głęboką studzienką wypełnioną 800 mikrolitrami sterylnego PBS na studzienkę.Przenieś pokrywki kołków na nową płytkę z głębokim dołkiem zawierającą 800 mikrolitrów na studzienkę o zawartości fioletu krystalicznego 0,1% wagowo i pozostaw do barwienia przez pięć minut. Ponownie opłucz pokrywki na świeżej płytce z głęboką studzienką wypełnioną PBS, aby usunąć nadmiar plamy. Po pozostawieniu pokrywek do wyschnięcia przez 10 minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego, odbarwić kołki w głębokiej płytce wypełnionej 800 mikrolitrami 30% kwasu ascetycznego na studzienkę przez pięć minut.Zdejmij pokrywkę kołka i dokładnie wymieszaj, aby równomiernie rozprowadzić plamę. Przenieś 200 mikrolitrów z urządzenia do biofilmu z głębokiej studni do standardowej 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej i odczytaj gęstość optyczną przy 550 nanometrach. Przeciwbakteryjne płytki prowokacyjne zostaną przygotowane tak, jak pokazano.Napełnij zewnętrzne studzienki 750 mikrolitrami sterylnej wody, a studzienki kontroli dodatniej i ujemnej 750 mikrolitrami pożywki wzrostowej. Napełnij pozostałe studzienki 750 mikrolitrami żądanej serii rozcieńczeń przeciwdrobnoustrojowych. Ostrożnie zdejmij pokrywkę kołka z urządzenia i spłucz w sterylnej płytce z głęboką studzienką o objętości 800 mikrolitrów na studzienkę PBS.Przenieś pokrywkę kołka na przeciwbakteryjną płytkę prowokacyjną i inkubuj przez żądany czas ekspozycji. W asepcie zdejmij pokrywki kołków z płytki do ekspozycji na środki przeciwdrobnoustrojowe i wypłucz w sterylnej płytce wypełnionej PBS. Zdjąć pokrywkę kołka z PBS i przenieść do nowej płytki głębinowej zawierającej 750 mikrolitrów pożywki regeneracyjnej na studzienkę.Sonikować płytkę w sonikującej łaźni wodnej przez 30 minut. Zdejmij pokrywkę kołka i zastąp ją standardową, niekołkowaną, płaską pokrywką płytki do mikromiareczkowania, aby uniknąć zanieczyszczenia. Inkubować przez noc w optymalnych warunkach szczepu.Następnego dnia przenieś 200 mikrolitrów z płytki głębokiej studzienki na standardową płytkę do mikromiareczkowania i odczytaj gęstość optyczną przy 600 nanometrach. Barwienie fioletem krystalicznym jest skuteczną i szeroko stosowaną metodą przybliżania biomasy biofilmów bakteryjnych. Barwienie fioletem krystalicznym urządzeń ze studnią standardową i głębinową wykazało, że oba gatunki bakterii wyhodowały znacznie więcej biomasy na urządzeniu do studni głębinowej w porównaniu ze standardowym urządzeniem, przy czym Escherichia coli tworzy 2,1-krotnie więcej biomasy w porównaniu ze standardowym urządzeniem do biofilmu, a Pseudomonas aeruginosa tworzy 4,1-krotnie więcej biomasy.Wyniki te były zgodne z naszą hipotezą, że zwiększona powierzchnia urządzenia do biofilmu ze studni głębinowej pozwoliłaby na zwiększoną akumulację biomasy. Pomimo większej zmienności w technicznych wartościach replik wybarwionych CV dla obu szczepów rosnących na urządzeniu do studni głębinowej, nie zaobserwowano statystycznie istotnych różnic dla kontrprób biologicznych żadnego z gatunków przy użyciu dwukierunkowej ANOVA parami lub testu T studenta, w którym wartości P były większe niż 0,05. Odkrycie to pokazuje, że tworzenie biofilmu przez urządzenia głębinowe tworzy powtarzalne biofilmy podobne do tych, które występują w standardowych urządzeniach.Nasze wyniki po standaryzacji biomasy biofilmu pod względem objętości i powierzchni kołków między urządzeniami standardowymi i głębinowymi wskazały na niewielką, ale znaczącą preferencję materiałową między dwoma badanymi gatunkami bakterii. Na urządzeniu do studni głębinowej z polipropylenu Pseudomonas aeruginosa wykazała 1,4-krotny względny wzrost tworzenia biomasy, a Escherichia coli wykazała 1,52-krotny względny spadek tworzenia biomasy z odwrotnym efektem obserwowanym na wzorcowym urządzeniu z polistyrenu. Ta różnica w preferencjach gatunków bakterii dla materiału kołków do biofilmu wskazuje, że wyników nie można porównywać między urządzeniami do biofilmu.Wyzwanie przeciwdrobnoustrojowe 24-godzinnych biofilmów przetestowano przy użyciu czwartorzędowego związku amoniowego chlorku benzalkoniowego, o którym wiadomo, że jest skutecznym inhibitorem tworzenia biofilmu bakteryjnego, ale jest mniej skutecznym środkiem przeciwbakteryjnym do eliminacji biofilmu. Nasze wyniki wykazały, że wartości BMEC BZK uzyskane z urządzenia do biofilmu ze studni głębinowej wzrosły średnio sześciokrotnie w przypadku Escherichia coli i ośmiokrotnie w przypadku Pseudomonas aeruginosa w porównaniu ze wzrostem na standardowym urządzeniu do biofilmu. Wyniki BZK MBEC były bardziej zróżnicowane zgodnie z oczekiwaniami, ponieważ jest to mniej skuteczny środek przeciwdrobnoustrojowy do eliminacji biofilmu i spowodowały zakres wartości MBEC Escherichia coli na obu urządzeniach ze względu na kilka odstających kołków biofilmu, które przetrwały w wyższych stężeniach.Porównaliśmy również wybielacz dezynfekujący, o którym wiadomo, że jest bardzo skutecznym środkiem przeciwbakteryjnym do usuwania biofilmu bakteryjnego. Wybielacz wykazał nieco wyższą wartość MBEC podczas testowania w standardowym urządzeniu w porównaniu z urządzeniem do studni głębinowej dla obu gatunków, co doprowadziło do czterokrotnego wzrostu Escherichia coli i dwukrotnego wzrostu Pseudomonas aeruginosa. Różnice te mieściły się jednak w zakresie powtarzalnego błędu między urządzeniami i wykazywały znacznie mniejszą zmienność niż BZK, co potwierdza, że wybielacz jest skuteczniejszym środkiem przeciwdrobnoustrojowym do usuwania biofilmu.Głównym ograniczeniem każdego urządzenia do biofilmu byłby różny skład plastyczny kołków i wynikająca z tego zmienność w przyleganiu i tworzeniu biomasy różnych gatunków bakterii do tych powierzchni. Ponadto przed wykonaniem opisanego protokołu należy wziąć pod uwagę interakcje chemiczne i kompatybilność między różnymi środkami przeciwdrobnoustrojowymi a materiałem kołków z tworzywa sztucznego. Podsumowując, protokół ten i wyniki naszych porównań biomasy na studni głębinowej i standardowych urządzeniach do biofilmu pokazują, że oba są w stanie hodować wytrzymałe biofilmy Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa, przy czym urządzenie do studni głębinowej zapewnia znacznie więcej biomasy na powierzchnię kołka niż standardowe urządzenie.Urządzenie do biofilmu ze studni głębinowej stanowi realną, przystępną cenowo alternatywę dla statycznej, wysokowydajnej hodowli biofilmu i badań przesiewowych, które wymagają większych ilości biofilmu do dalszej analizy. Ze względu na różnice w składzie tworzyw sztucznych między poszczególnymi urządzeniami, wartości biomasy biofilmu zabarwionego CV i MBEC nie mogą być bezpośrednio porównywane między urządzeniami. Jeśli jednak eksperymenty są konsekwentnie przeprowadzane na tym samym urządzeniu, wyniki uzyskane między izolatami a środkami przeciwdrobnoustrojowymi są porównywalne.Urządzenie do biofilmu ze studni głębinowej jest zalecane dla laboratoriów, które chciałyby badać biofilmy w testach o wysokiej przepustowości przy użyciu tanich materiałów.

generation-greater-bacterial-biofilm-biomass-using-pcr-plate-deep

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Analiza opisuje szybką metodę pomiaru wczesnego tworzenia się biofilmu przez bakterie i grzyby. Metoda ta wykorzystuje płytkę mikrotitracyjną jako podłoże do tworzenia biofilmu mikrobiologicznego, a sam biofilm jest wizualizowany przy użyciu fioletu krystalicznego. Analiza ta pozwala na jakościowe lub ilościowe oznaczenie wczesnego etapu tworzenia biofilmu.

Analiza tworzenia biofilmu w płytkach mikrotitrowych

Źródło: Sutlief, A. L. i in. Analiza naprężeń ścinających na żywych komórkach na Pseudomonas aeruginosa z wykorzystaniem zautomatyzowanego systemu mikrofluidycznego o wyższej przepustowości. J. Vis. Exp. (2019).Ten film prezentuje przygotowanie płytki mikrofluidycznej do badań naprężeń ścinających w kulturach bakteryjnych. Po przygotowaniu kanałów podłożem, komórki bakteryjne są wprowadzane do kanału eksperymentalnego i inkubowane do przyczepienia. Pozostałe nośniki i hodowla są usuwane, aby...

Przygotowanie płytki mikrofluidycznej z komórkami bakteryjnymi

Źródło: Hemmerich, J. i in. Protokół optymalizacji heterologicznego wytwarzania białek z wykorzystaniem zautomatyzowanej technologii mikrobioreaktorów. J. Vis. Exp. (2017).Ten film pokazuje użycie zautomatyzowanego mikrobioreaktora do monitorowania wzrostu bakterii i wydzielania białek fluorescencyjnej w odpowiedzi na różne formuły mediów. Genetycznie zmodyfikowana bakteria ekspresyjna wydzielniowa fluorescencja jest hodowana pod antybiotykowym selekcją i zaszczepiana w dołkach o zróżnicowanych...

Monitorowanie wzrostu bakterii w różnych formułach ośrodka za pomocą zautomatyzowanego mikrobioreaktora

Ten film demonstruje test do badania przesiewowego związków przeciwdrobnoustrojowych, które skutecznie eliminują biofilmy za pomocą płytki kołkowej. Metodologia ta monitoruje stan metaboliczny biofilmu po poddaniu działaniu związków przeciwdrobnoustrojowych, ułatwiając określenie minimalnego stężenia eradykacji biofilmu.

Test biofilmu na płytce kołkowej do badań przesiewowych środków przeciwbakteryjnych

Celem tego artykułu jest opisanie użycia systemu mikroprzepływowego do tworzenia wielogatunkowych biofilmów, które zawierają gatunki typowo identyfikowane w ludzkiej naddziąsłowej płytce nazębnej. Podkreślono metody opisu architektury biofilmu, żywotności biofilmu oraz podejścia do zbierania biofilmu do analiz zależnych od kultury lub niezależnych od kultury.

Zastosowanie wysokowydajnego systemu mikroprzepływowego in vitro do tworzenia wielogatunkowych biofilmów w jamie ustnej

Ilościowa ocena wzrostu bakterii jest niezbędna do zrozumienia fizjologii drobnoustrojów jako zjawiska na poziomie systemu. Wprowadzono protokół manipulacji eksperymentalnej i podejście analityczne, pozwalające na precyzyjną, wysokoprzepustową analizę wzrostu bakterii, który jest kluczowym przedmiotem zainteresowania biologii systemów.

Precyzyjna, wysokoprzepustowa analiza wzrostu bakterii

Pokazujemy metodę osadzania biofilmów bakteryjnych Escherichia coli w dowolnych wzorach przestrzennych z wysoką rozdzielczością, wykorzystując stymulację optyczną genetycznie kodowanego konstruktu adhezji powierzchniowej.

Osadzanie biofilmu we wzorze w wysokiej rozdzielczości przy użyciu pDawn-Ag43

Szybka i ustandaryzowana procedura tworzenia synergicznych wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu z różnych gleb ryzosfery jest przedstawiona tutaj. Jest to unikalny protokół przeznaczony do badania i symulacji złożonej mikrobioty glebowej ryzosfery.

Podejście do konstruowania wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu z gleby ryzosfery

Niniejszy artykuł opisuje procedurę tworzenia i wizualizacji biofilmu bakteryjnego hodowanego w szkiełku przedmiotowym z komorą...

In vitro tworzenie biofilmu w szkiełku przedmiotowym z 8-komorowym układem

Opisano wydajną metodę oceny ekspozycji powierzchniowej białek leptospir. Metoda ta została zaprojektowana specjalnie w celu uniknięcia uszkodzenia delikatnej błony zewnętrznej komórek leptospir. Technika ta wymaga zastosowania kilku kontroli negatywnych w celu oceny integralności błony zewnętrznej oraz specyficzności reakcji przeciwciał.

Analiza immunofluorescencyjna białek powierzchniowych leptospir**

Poznaj metodę wytwarzania większej biomasy biofilmu bakteryjnego za pomocą urządzeń do mikropłytek głębinowych PCR-Plate. Technika umożliwia wysokoprzepustowe badania biofilmów z użyciem barwienia krystalicznej fioletowej i testowania wrażliwości na antybiotyki.

Wytwarzanie większej biomasy biofilmu bakteryjnego za pomocą urządzeń do mikropłytek głębinowych PCR-Plate

Przeglądaj więcej filmów