Wytwarzanie większej biomasy biofilmu bakteryjnego za pomocą urządzeń do mikropłytek głębinowych PCR-Plate

Celem tej procedury jest porównanie standardowego urządzenia do biofilmu z pokrywką kołkową z urządzeniem do biofilmu z polipropylenu poprzez barwienie fioletem krystalicznym i testowanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe. Standardowe urządzenie do biofilmu z pokrywką kołkową ma 96 kołków i mieści się na standardowej 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania, co pozwala na eksperymenty z biofilmem o wysokiej przepustowości. Pokrywka kołka zapewnia powierzchnię do wzrostu biofilmu, a biofilmy wyhodowane na kołkach mogą być dalej analizowane w dalszych eksperymentach.

Jednak płytki wykorzystują maksymalną objętość 200 mikrolitrów, co utrudnia badanie tworzenia biofilmu i biomasy przy użyciu eksperymentów, które wymagają większych ilości biofilmu. W tym miejscu opisujemy urządzenie do biofilmu ze studni głębinowej do hodowli biofilmów statycznych. Urządzenie do biofilmu z głębokiej studni wykorzystuje 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania z 96 dołkami wyposażoną w półspódniczkę 96-dołkową płytkę PCR jako pokrywkę kołka.

Ta metoda pozwala na uzyskanie maksymalnej objętości płytki wynoszącej 750 mikrolitrów, zapewnia większą powierzchnię kołków do wzrostu biofilmu i jest tańsza w porównaniu ze standardowym urządzeniem do biofilmu. Opiszemy i porównamy protokoły barwienia biofilmów fioletem krystalicznym w celu określenia biomasy biofilmu, a także wyznaczenia minimalnego stężenia eliminacji biofilmu, znanego również jako MBEC. Pokazany jest schematyczny przegląd eksperymentu, który zostanie opisany.

Smugi pożądanych szczepów bakteryjnych z kriokonserwowanego wywaru bezpośrednio na pożywną płytkę agarową. Inkubuj płytki agarowe przez noc w optymalnych warunkach szczepu. Następnego dnia zaszczep pojedynczą kolonię w pięciu mililitrach pożywki wzrostowej i hoduj kultury w inkubatorze przez noc.

Płytki biofilmu zostaną wypełnione, jak pokazano. Napełnij zewnętrzne studzienki 750 mikrolitrami sterylnej wody, a studzienki kontroli ujemnej 750 mikrolitrami sterylnych pożywek wzrostowych. Napełnij pozostałe studzienki 675 mikrolitrami sterylnej pożywki wzrostowej.

Standaryzacja kultur nocnych do gęstości optycznej 1,0 przy 600 nanometrach. Utwórz dziesięciokrotną serię rozcieńczeń, aż do osiągnięcia rozcieńczenia od 10 do minus trzech. Zaszczepić studzienki z pożywką rozcieńczoną kulturą w proporcjach od 10 do minus trzy, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie bakteryjne od 10 do minus czterech i końcową całkowitą objętość w studzience wynoszącą 750 mikrolitrów.

Ostrożnie włóż pokrywkę kołka do płytki biofilmu. Inkubować płytki w optymalnych warunkach odkształcania z maksymalnym wytrząsaniem 160 obr./min przez 24 godziny. Ostrożnie zdejmij pokrywkę kołka z płytki wzrostu biofilmu i wypłucz biofilmy w nowej płytce z głęboką studzienką wypełnioną 800 mikrolitrami sterylnego PBS na studzienkę.

Przenieś pokrywki kołków na nową płytkę z głębokim dołkiem zawierającą 800 mikrolitrów na studzienkę o zawartości fioletu krystalicznego 0,1% wagowo i pozostaw do barwienia przez pięć minut. Ponownie opłucz pokrywki na świeżej płytce z głęboką studzienką wypełnioną PBS, aby usunąć nadmiar plamy. Po pozostawieniu pokrywek do wyschnięcia przez 10 minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego, odbarwić kołki w głębokiej płytce wypełnionej 800 mikrolitrami 30% kwasu ascetycznego na studzienkę przez pięć minut.

Zdejmij pokrywkę kołka i dokładnie wymieszaj, aby równomiernie rozprowadzić plamę. Przenieś 200 mikrolitrów z urządzenia do biofilmu z głębokiej studni do standardowej 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej i odczytaj gęstość optyczną przy 550 nanometrach. Przeciwbakteryjne płytki prowokacyjne zostaną przygotowane tak, jak pokazano.

Napełnij zewnętrzne studzienki 750 mikrolitrami sterylnej wody, a studzienki kontroli dodatniej i ujemnej 750 mikrolitrami pożywki wzrostowej. Napełnij pozostałe studzienki 750 mikrolitrami żądanej serii rozcieńczeń przeciwdrobnoustrojowych. Ostrożnie zdejmij pokrywkę kołka z urządzenia i spłucz w sterylnej płytce z głęboką studzienką o objętości 800 mikrolitrów na studzienkę PBS.

Przenieś pokrywkę kołka na przeciwbakteryjną płytkę prowokacyjną i inkubuj przez żądany czas ekspozycji. W asepcie zdejmij pokrywki kołków z płytki do ekspozycji na środki przeciwdrobnoustrojowe i wypłucz w sterylnej płytce wypełnionej PBS. Zdjąć pokrywkę kołka z PBS i przenieść do nowej płytki głębinowej zawierającej 750 mikrolitrów pożywki regeneracyjnej na studzienkę.

Sonikować płytkę w sonikującej łaźni wodnej przez 30 minut. Zdejmij pokrywkę kołka i zastąp ją standardową, niekołkowaną, płaską pokrywką płytki do mikromiareczkowania, aby uniknąć zanieczyszczenia. Inkubować przez noc w optymalnych warunkach szczepu.

Następnego dnia przenieś 200 mikrolitrów z płytki głębokiej studzienki na standardową płytkę do mikromiareczkowania i odczytaj gęstość optyczną przy 600 nanometrach. Barwienie fioletem krystalicznym jest skuteczną i szeroko stosowaną metodą przybliżania biomasy biofilmów bakteryjnych. Barwienie fioletem krystalicznym urządzeń ze studnią standardową i głębinową wykazało, że oba gatunki bakterii wyhodowały znacznie więcej biomasy na urządzeniu do studni głębinowej w porównaniu ze standardowym urządzeniem, przy czym Escherichia coli tworzy 2,1-krotnie więcej biomasy w porównaniu ze standardowym urządzeniem do biofilmu, a Pseudomonas aeruginosa tworzy 4,1-krotnie więcej biomasy.

Wyniki te były zgodne z naszą hipotezą, że zwiększona powierzchnia urządzenia do biofilmu ze studni głębinowej pozwoliłaby na zwiększoną akumulację biomasy. Pomimo większej zmienności w technicznych wartościach replik wybarwionych CV dla obu szczepów rosnących na urządzeniu do studni głębinowej, nie zaobserwowano statystycznie istotnych różnic dla kontrprób biologicznych żadnego z gatunków przy użyciu dwukierunkowej ANOVA parami lub testu T studenta, w którym wartości P były większe niż 0,05. Odkrycie to pokazuje, że tworzenie biofilmu przez urządzenia głębinowe tworzy powtarzalne biofilmy podobne do tych, które występują w standardowych urządzeniach.

Nasze wyniki po standaryzacji biomasy biofilmu pod względem objętości i powierzchni kołków między urządzeniami standardowymi i głębinowymi wskazały na niewielką, ale znaczącą preferencję materiałową między dwoma badanymi gatunkami bakterii. Na urządzeniu do studni głębinowej z polipropylenu Pseudomonas aeruginosa wykazała 1,4-krotny względny wzrost tworzenia biomasy, a Escherichia coli wykazała 1,52-krotny względny spadek tworzenia biomasy z odwrotnym efektem obserwowanym na wzorcowym urządzeniu z polistyrenu. Ta różnica w preferencjach gatunków bakterii dla materiału kołków do biofilmu wskazuje, że wyników nie można porównywać między urządzeniami do biofilmu.

Wyzwanie przeciwdrobnoustrojowe 24-godzinnych biofilmów przetestowano przy użyciu czwartorzędowego związku amoniowego chlorku benzalkoniowego, o którym wiadomo, że jest skutecznym inhibitorem tworzenia biofilmu bakteryjnego, ale jest mniej skutecznym środkiem przeciwbakteryjnym do eliminacji biofilmu. Nasze wyniki wykazały, że wartości BMEC BZK uzyskane z urządzenia do biofilmu ze studni głębinowej wzrosły średnio sześciokrotnie w przypadku Escherichia coli i ośmiokrotnie w przypadku Pseudomonas aeruginosa w porównaniu ze wzrostem na standardowym urządzeniu do biofilmu. Wyniki BZK MBEC były bardziej zróżnicowane zgodnie z oczekiwaniami, ponieważ jest to mniej skuteczny środek przeciwdrobnoustrojowy do eliminacji biofilmu i spowodowały zakres wartości MBEC Escherichia coli na obu urządzeniach ze względu na kilka odstających kołków biofilmu, które przetrwały w wyższych stężeniach.

Porównaliśmy również wybielacz dezynfekujący, o którym wiadomo, że jest bardzo skutecznym środkiem przeciwbakteryjnym do usuwania biofilmu bakteryjnego. Wybielacz wykazał nieco wyższą wartość MBEC podczas testowania w standardowym urządzeniu w porównaniu z urządzeniem do studni głębinowej dla obu gatunków, co doprowadziło do czterokrotnego wzrostu Escherichia coli i dwukrotnego wzrostu Pseudomonas aeruginosa. Różnice te mieściły się jednak w zakresie powtarzalnego błędu między urządzeniami i wykazywały znacznie mniejszą zmienność niż BZK, co potwierdza, że wybielacz jest skuteczniejszym środkiem przeciwdrobnoustrojowym do usuwania biofilmu.

Głównym ograniczeniem każdego urządzenia do biofilmu byłby różny skład plastyczny kołków i wynikająca z tego zmienność w przyleganiu i tworzeniu biomasy różnych gatunków bakterii do tych powierzchni. Ponadto przed wykonaniem opisanego protokołu należy wziąć pod uwagę interakcje chemiczne i kompatybilność między różnymi środkami przeciwdrobnoustrojowymi a materiałem kołków z tworzywa sztucznego. Podsumowując, protokół ten i wyniki naszych porównań biomasy na studni głębinowej i standardowych urządzeniach do biofilmu pokazują, że oba są w stanie hodować wytrzymałe biofilmy Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa, przy czym urządzenie do studni głębinowej zapewnia znacznie więcej biomasy na powierzchnię kołka niż standardowe urządzenie.

Urządzenie do biofilmu ze studni głębinowej stanowi realną, przystępną cenowo alternatywę dla statycznej, wysokowydajnej hodowli biofilmu i badań przesiewowych, które wymagają większych ilości biofilmu do dalszej analizy. Ze względu na różnice w składzie tworzyw sztucznych między poszczególnymi urządzeniami, wartości biomasy biofilmu zabarwionego CV i MBEC nie mogą być bezpośrednio porównywane między urządzeniami. Jeśli jednak eksperymenty są konsekwentnie przeprowadzane na tym samym urządzeniu, wyniki uzyskane między izolatami a środkami przeciwdrobnoustrojowymi są porównywalne.

Urządzenie do biofilmu ze studni głębinowej jest zalecane dla laboratoriów, które chciałyby badać biofilmy w testach o wysokiej przepustowości przy użyciu tanich materiałów.