Name: Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo mitochondrialnego stanu redoks w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego. Ta technika umożliwia ocenę strategii ochrony mitochondriów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; DLA 2289: BA 3679/4-2). A.K. jest wspierany przez stypendium ERASMUS+. Dziękujemy Iris Bünzli-Ehret, Ricie Rosner i Andrei Schlicksupp za przygotowanie neuronów pierwotnych. Dziękujemy dr Tobiasowi Dickowi za dostarczenie pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Eksperymenty pokazane w <silnej klasie="xfig">Rysunek 4 zostały przeprowadzone w Centrum Obrazowania Nikona na Uniwersytecie w Heidelbergu. Rysunek 2 został przygotowany za pomocą BioRender.com.

<ol><li>Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+equivalents+and+mitochondrial+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).</li>
<li>Turrens, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+formation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial formation of reactive oxygen species.</a> Journal of Physiology. 552, Pt 2 335-344 (2003).</li>
<li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li>
<li>Manfredi, G., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).</li>
<li>Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+glutathione%2C+a+key+survival+antioxidant%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+thiols+in+antioxidant+protection+and+redox+signaling%3A+distinct+roles+for+glutathionylation+and+other+thiol+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).</li>
<li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li>
<li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li>
<li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+the+intracellular+glutathione+redox+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential.</a> Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).</li>
<li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+E%28GSH%29+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology & Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li>
<li>Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+in+primary+cultured+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transfection in primary cultured neuronal cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).</li>
<li>Kohrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((convenient%2C+and+effective+method+to+transiently+transfect+primary+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons.</a> Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).</li>
<li>Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+protects+neurons+against+calcium-mediated+oxidation+and+contraction+of+mitochondria+during+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).</li>
<li>Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>Zhang, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+calcium+signaling+controls+expression+of+a+large+gene+pool%3A+identification+of+a+gene+program+for+acquired+neuroprotection+induced+by+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity.</a> PLoS Genetics. 5 (8), 1000604(2009).</li>
<li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+of+using+fluorescent+probes+to+detect+and+quantify+specific+reactive+oxygen+species+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).</li>
<li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%3A+a+concept+in+redox+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li>
<li>Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+redox+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent redox sensors.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).</li>
<li>Nietzel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-mediated+kick-start+of+mitochondrial+energy+metabolism+drives+resource-efficient+seed+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).</li>
<li>Albrecht, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesign+of+genetically+encoded+biosensors+for+monitoring+mitochondrial+redox+status+in+a+broad+range+of+model+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).</li>
<li>Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+mapping+of+hydrogen+peroxide+and+oxidized+glutathione+reveals+chemical+and+regional+specificity+of+redox+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis.</a> Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).</li>
<li>Breckwoldt, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optical+analysis+of+mitochondrial+redox+signals+during+neuronal+physiology+and+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).</li>
<li>Ricke, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+combined+with+high+calcium+load+leads+to+impaired+antioxidant+defense+underlying+the+selective+loss+of+nigral+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).</li>
<li>Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insight+provided+by+glutaredoxin+within+a+fusion+to+redox-sensitive+yellow+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein.</a> Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).</li>
<li>Shokhina, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+fluorescent+redox-sensitive+biosensor+Grx1-roCherry%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry.</a> Redox Biology. 21, 101071(2019).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Ilościowe i dynamiczne pomiary mitochondrialnego stanu redoks dostarczają ważnych informacji na temat fizjologii mitochondriów i komórek. Dostępnych jest kilka fluorogenicznych sond chemicznych, które wykrywają reaktywne formy tlenu, "stres redoks" lub "stres oksydacyjny". Jednak te ostatnie terminy nie są dobrze zdefiniowane i często brakuje im specyficzności 9,17,18. W porównaniu z barwnikami chemicznymi, Grx1-roGFP2 ma kilka ...

Kilka ważnych enzymów mitochondrialnych i cząsteczek sygnałowych podlega regulacji tiolowej redoks1. Co więcej, mitochondria są głównym komórkowym źródłem reaktywnych form tlenu i są selektywnie podatne na uszkodzenia oksydacyjne2. W związku z tym mitochondrialny potencjał redoks bezpośrednio wpływa na bioenergetykę, sygnalizację komórkową, funkcję mitochondriów i ostatecznie żywotność komórki3,4. Macierz mitochondrialna zawiera duże ilości (1-15 mM) buforu redoks disiarczku tiolu glutationu (GSH) w celu utrzymania homeostazy redoks i wzmocnienia obrony antyoksydacyjnej5,6. GSH może być kowalencyjnie przyłączany do białek docelowych (S-glutationylacja) w celu kontrolowania ich statusu i aktywności redoks i jest wykorzystywany przez szereg enzymów detoksykujących, które redukują utlenione białka. Dlatego potencjał redoks mitochondriów glutationu jest parametrem wysoce informacyjnym podczas badania funkcji i patofizjologii mitochondriów.
roGFP2 to wariant GFP, który stał się wrażliwy na redoks poprzez dodanie dwóch powierzchniowo wystawionych cystein, które tworzą sztuczną parę ditiol-dwusiarczek7,8. Ma pojedynczy pik emisyjny przy ~510 nm i dwa piki wzbudzenia przy ~400 nm i 490 nm. Co ważne, względne amplitudy dwóch pików wzbudzenia zależą od stanu redoks roGFP2 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), co czyni to białko czujnikiem ratiometrycznym. W czujniku Grx1-roGFP2 ludzka glutaredoksyna-1 (Grx1) została połączona z N-końcem roGFP29,10. Kowalencyjne przyłączenie enzymu Grx1 do roGFP2 zapewnia dwie główne ulepszenia czujnika: sprawia, że odpowiedź czujnika jest specyficzna dla pary redoks glutationu GSH/GSSG (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) i przyspiesza równowagę między GSSG i roGFP2 o współczynnik co najmniej 100 0009. Dlatego Grx1-roGFP2 umożliwia specyficzne i dynamiczne obrazowanie komórkowego potencjału redoks glutationu.
Obrazowanie Grx1-roGFP2 można wykonać na szerokiej gamie mikroskopów, w tym na mikroskopach fluorescencyjnych o szerokim polu, mikroskopach konfokalnych z wirującym dyskiem i laserowych skaningowych mikroskopach konfokalnych. Ekspresję czujnika w neuronach pierwotnych można osiągnąć za pomocą różnych metod, które obejmują lipofekcję11, koprecypitację DNA/fosforanu wapnia12, transfer genów za pośrednictwem wirusa lub wykorzystanie zwierząt transgenicznych jako źródła komórek (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). W eksperymentach w tym artykule użyto pseudotypowanych rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusem (rAAV) zawierających 1:1 proporcji białek kapsydu AAV1 i AAV2 13,14. W przypadku tego wektora maksymalna ekspresja czujnika jest zwykle osiągana 4-5 dni po zakażeniu i pozostaje stabilna przez co najmniej dwa tygodnie. Z powodzeniem zastosowaliśmy Grx1-roGFP2 w pierwotnych neuronach hipokampa i kory mózgowej myszy i szczurów.
W tym artykule, ekspresja Grx1-roGFP2 ukierunkowanego na mitochondria w pierwotnych neuronach hipokampa i kory mózgowej szczura jest używana do oceny podstawowego mitochondrialnego stanu redoks glutationu i jego ostrego zaburzenia za pośrednictwem rAAV. Dostępny jest protokół konfokalnego obrazowania na żywo ze szczegółowymi instrukcjami, jak (i) zoptymalizować ustawienia laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, (ii) przeprowadzić eksperyment z obrazowaniem na żywo oraz (iii) analizować dane za pomocą FIJI.

<table><tbody><tr><td><silne>odczynniki</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>chlorek wapnia (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Diamid (DA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3648</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6908.1</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza (roztwór podstawowy 2,5 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>neoFroxx GmbH</td><td>LC-4522.2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (roztwór podstawowy 1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2&middot; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442611-M</td><td></td></tr><tr><td>N-metylo-D-asparaginian (NMDA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>neoFroxx GmbH</td><td>LC-5932.1</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (0,1 M roztwór podstawowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8574</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Nadchloran estru etylowego tetrametylorodaminy (TMRE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87917</td><td></td></tr><tr><td>equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>komora obrazowania</td><td>Life Imaging Services (Bazylea, Szwajcaria)</td><td>10920</td><td>Komora Ludin Typ 3 dla & Oslash; </td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td> 12 mm, mikroskop <td>Leica</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>laserowy skaningowy mikroskop konfokalny, jednostka skanująca</td><td>Pompa</td> perystaltyczna Leica <td>SP8</td><td></td></tr> Mikroskop konfokalny <tr><td></td><td>VWR</td><td>PP1080 181-4001</td><td></td></tr><tr><td>, kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-02 EMCCD</td><td></td></tr> mikroskop <tr><td>konfokalny z wirującym dyskiem, system inkubacji</td><td>TokaiHit</td><td>INU-ZILCF-F1</td><td></td></tr> mikroskop <tr><td>konfokalny z wirującą tarczą, mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Ti</td><td></td></tr> mikroskop <tr><td>konfokalny z wirującą tarczą, jednostka skanująca</td><td>Yokagawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td>https://fiji.sc</td><td></td></tr><tr><td>wtyczka StackReg</td><td></td><td></td><td></td>https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java</tr><tr><td>https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java</td><td></td> wtyczki <td></td><td>TurboReg</td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Homeostaza mitochondriów redoks jest ważna dla żywotności i funkcji neuronów. Chociaż mitochondria zawierają kilka systemów redoks, bardzo obfity bufor redoks disiarczku tiolu, glutation, jest uważany za głównego gracza w obronie przeciwutleniającej. Dlatego pomiar potencjału redoks mitochondriów glutationu dostarcza przydatnych informacji na temat statusu redoks mitochondriów i stresu oksydacyjnego. Glutaredoksyna1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) jest genetycznie kodowanym, opartym na zielonym białku fluorescencyjnym (GFP) wskaźnikiem ratiometrycznym potencjału redoks glutationu, który ma dwa wrażliwe na stan redoks piki wzbudzenia przy 400 nm i 490 nm z pojedynczym pikiem emisji przy 510 nm. W tym artykule opisano, jak przeprowadzić konfokalną mikroskopię na żywo Grx1-roGFP2 ukierunkowanego na mitochondria w pierwotnych neuronach hipokampa i kory mózgowej. Opisano, jak ocenić potencjał redoks mitochondrialnego glutationu w stanie stacjonarnym (np. w celu porównania stanów chorobowych lub długotrwałego leczenia) oraz jak zmierzyć zmiany redoks po ostrym leczeniu (na przykładzie leku ekscytotoksycznego N-metylo-D-asparaginianu (NMDA)). Ponadto w artykule przedstawiono współobrazowanie Grx1-roGFP2 i wskaźnika potencjału błony mitochondrialnej, tetrametylorodaminy, estru etylowego (TMRE), w celu zademonstrowania, w jaki sposób Grx1-roGPF2 może być multipleksowany z dodatkowymi wskaźnikami do analiz wieloparametrycznych. Protokół ten zawiera szczegółowy opis sposobu (i) optymalizacji ustawień konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego, (ii) stosowania leków do stymulacji, a następnie kalibracji czujnika za pomocą diamidu i ditiotreitolu oraz (iii) analizowania danych za pomocą ImageJ/FIJI.

Ilościowe określenie różnic w stacjonarnym stanie redoks mitochondriów po wycofaniu czynników wzrostu 
Aby zademonstrować ilościowe określenie różnic w stacjonarnym stanie redoks mitochondriów, porównano pierwotne neurony hodowane w standardowej pożywce z neuronami hodowanymi bez czynników wzrostu przez 48 h przed obrazowaniem. Wycofanie czynników wzrostu prowadzi do apoptycznej śmierci komórek neuronalnych po 72 h16. Komórki obrazowano po 48 h, aby sprawdzić, czy proces ten ...

Ten artykuł opisuje protokół do określania różnic w podstawowym stanie redoks i redoks odpowiedzi na ostre perturbacje w pierwotnych neuronach hipokampa i kory mózgowej za pomocą konfokalnej mikroskopii na żywo. Protokół może być stosowany do innych typów komórek i mikroskopów przy minimalnych modyfikacjach.

Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

Metoda ta pozwala na zbadanie, w jaki sposób stan redoks mitochondriów wpływa na stany patofizjologiczne. Może być również stosowany do oceny skuteczności strategii leczenia, które mają na celu ochronę mitochondriów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na ocenę narządów i specyficznych zmian dynamicznych i śledzących w stanie redoks mitochondriów w czasie rzeczywistym.Metodę tę można połączyć z dodatkowymi wskaźnikami, aby jednocześnie rejestrować np. potencjał błony mitochondrialnej lub stężenie wapnia oprócz stanu redoks. Protokół ten można zastosować do komórek hodowlanych, eksplantatów tkankowych i kultur warstwowych. Zacznij od optymalizacji ustawień skaningowego mikroskopu konfokalnego.Aby to zrobić, ustaw detektor na 12 bitów lub 16 bitów, aktywuj tryb skanowania sekwencyjnego i dodaj drugą sekwencję/ścieżkę. Dla obu kanałów wybierz tabelę wyszukiwania pseudokolorów, która wskazuje prześwietlone i niedoświetlone piksele, a następnie wybierz obiektyw odpowiedni dla interesującego Cię obiektu. Zamontuj szkiełko nakrywkowe z komórkami w komorze obrazowania.Dodaj jeden mililitr buforu do obrazowania i umieść komorę na mikroskopie. Użyj okularu i przechodzącego światła, aby ustawić ostrość komórek. Nagrywaj obrazy w różnych formatach pikseli i rozmiarach otworków.Następnie rejestruj obrazy o różnej intensywności lasera i odpowiednio dostosuj wzmocnienie i próg detektora. Na koniec nagrywaj obrazy z różnymi prędkościami skanowania i różną liczbą średnich klatek. W przypadku obrazowania na żywo ustaw interwał timelapse na 30 sekund, a czas trwania na 25 minut.Następnie zamontuj komórki, umieść komorę na mikroskopie i ustaw ostrość komórek, jak pokazano wcześniej. Przełącz się w tryb skanowania i użyj kanału 488 nanometrów w podglądzie na żywo, aby ustawić ostrość i zlokalizować komórki do obrazowania. Opcjonalnie, aby zwiększyć liczbę rejestrowanych komórek w przebiegu, należy użyć funkcji wielopunktowej, aby zobrazować od dwóch do trzech pól widzenia na szkiełko nakrywkowe.Rozpocznij akwizycję poklatkową i nagraj pięć obrazów jako dwuminutowe nagranie bazowe. Dodaj 500 mikrolitrów roztworu 3X NMDA do komory, aby osiągnąć końcowe stężenie 30 mikromolów i zarejestruj dodatkowe 20 obrazów jako 10-minutową odpowiedź NMDA. Następnie dodaj 500 mikrolitrów roztworu 4X DA do komory i nagraj sześć kolejnych obrazów.Odessać bufor z komory obrazowania i zastąpić go jednym mililitrem roztworu DTT. Po nagraniu kolejnych 10 obrazów zakończ nagrywanie i zapisz serię obrazów. Aby zaimportować dane w oprogramowaniu do analizy obrazu, kliknij wtyczki, wybierz formaty bio, a następnie importer formatów bio.W oknie dialogowym wybierz pozycję hyperstack w stosie widoków z, ustaw tryb kolorów jako domyślny i wybierz opcję automatycznego skalowania. Zmień format obrazu na 32-bitowy, klikając obraz, wybierając typ, a następnie z opcji wybierz 32-bitowy. Aby podzielić kanały kolorów na osobne okna, kliknij obraz, przejdź do koloru i wybierz podziel kanały.Dostosuj próg, aby wybrać mitochondria do analizy, klikając obraz, wybierając dostosuj i próg. W oknie dialogowym wybierz domyślne czerwone ciemne tło i histogram stosu. Gdy wybrane piksele zmienią kolor na czerwony, kliknij Zastosuj.Następnie wybierz ustaw piksele tła na NAN, przetwarzaj wszystkie obrazy i wykonaj tę samą procedurę dla kanału drugiego. Aby zobrazować stosunek nanometra od 405 do 488 nanometrów, utwórz obraz proporcji, klikając kalkulator procesu i obrazu. W oknie dialogowym wybierz kanał pierwszy na obrazie jeden podział w kanale operacyjnym dwa na obrazie drugim.Następnie wybierz utwórz nowe okno i przetwórz wszystkie obrazy. Zmień tabelę przeglądową obrazu o stosunku do pseudokoloru, klikając obraz, wybierając tabele przeglądowe, a następnie uruchom go. Aby przeanalizować obraz, narysuj ROI wokół poszczególnych komórek lub mitochondriów na obrazie proporcji.Aby dodać ROI do menedżera ROI, przejdź do analizy, kliknij narzędzia, wybierz Menedżer ROI, kliknij dodaj i wybierz pokaż wszystko. Aby zmierzyć proporcje 405 do 488 nanometrów poszczególnych komórek, kliknij Menedżer ROI, wybierz wszystkie ROI, naciskając Control A, przejdź do więcej i wybierz wiele miar. W oknie dialogowym wybierz opcję zmierz wszystkie plasterki i po jednym wierszu na plasterek.Po wyeksportowaniu pomiarów do oprogramowania arkusza kalkulacyjnego wybierz obraz 405 nanometrów, zmierz intensywność wszystkich zwrotów z inwestycji i ponownie wyeksportuj pomiary do oprogramowania arkusza kalkulacyjnego. Podobnie zmierz intensywność ROI obrazu 488 nanometrów. Aby zapisać ROI do wykorzystania w przyszłości, wybierz wszystkie ROI, naciskając Control A, przejdź do więcej i wybierz Zapisz.Te reprezentatywne migawki z nagrania poklatkowego pokazują obrazy proporcji neuronów przed i po leczeniu NMDA oraz po kalibracji max/min za pomocą DA i DTT. Leczenie neuronów 30 mikromolowym NMDA wywołało utlenianie mitochondriów w ciągu kilku minut. Analiza poszczególnych kanałów fluorescencyjnych wykazała, że kwasica mitochondrialna wywołana przez NMDA spowodowała spadek fluorescencji GFP zarówno przy wzbudzeniu 405, jak i 488 nanometrów.W eksperymencie kontrolnym wstępne traktowanie DA wykluczyło dalsze utlenianie mitochondriów przez NMDA. W związku z tym stosunek 405 do 488 nie zmienił się pomimo znacznego wygaszenia intensywności fluorescencji GFP2 wrażliwej na redoks. Eksperyment ten potwierdził, że zmiany pH nie mają wpływu na stosunek 405 do 488 nanometrów.W oddzielnym eksperymencie oceniano równolegle potencjał błony mitochondrialnej, stan redoks i morfologię. Leczenie neuronów 60 mikromolowym NMDA spowodowało utratę sygnału tetrametylorodaminy lub TMRE i wzrost stosunku GFP rho od 405 do 488 nanometrów, po którym nastąpiło pewne opóźnione zaokrąglenie mitochondriów. Kiedy zaczynasz korzystać z tej metody, bardzo ważne jest, aby poświęcić trochę czasu na staranną optymalizację ustawień mikroskopowych.Pomoże to utrzymać neurony w zdrowiu podczas eksperymentów. Bardzo ważne jest również, aby zawsze przestrzegać zasad bezpieczeństwa lasera. Upewnij się, że nie jesteś narażony na promieniowanie laserowe, gdy dodajesz narkotyki w celu manipulacji podczas nagrań na żywo.

live-imaging-mitochondrial-glutathione-redox-state-primary-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy protokół umożliwiający obrazowanie mitochondriów w żywych neuronach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przez dłuższy czas. Obrazowanie w wydłużonych przedziałach czasowych osiągnięto dzięki ekspresji białka fluorescencyjnego skierowanego do mitochondriów za pomocą lentiwirusa oraz zastosowaniu niedrogiego inkubatora nakładanego na stolik mikroskopu, który został zaprojektowany i zbudowany w naszym laboratorium.

Neuromodulacja i transport mitochondriów: obrazowanie żywych neuronów hipokampa w długich odstępach czasu

Prezentujemy zastosowanie wskaźnika fluorescencyjnego TMRM w neuronach kory mózgu w celu określenia względnych zmian natężenia fluorescencji TMRM przed i po zastosowaniu specyficznego bodźca. Przedstawiamy również zastosowanie sondy fluorescencyjnej H2DCF-DA do oceny względnego poziomu reaktywnych form tlenu w neuronach kory mózgu.

Oznaczanie potencjału błony mitochondrialnej i reaktywnych form tlenu w żywych neuronach korowych szczura

Źródło: Katsalifis, A., et al. Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje obrazowanie mitochondrialnego stanu redoks w neuronach pierwotnych przy użyciu ratiometrycznego wskaźnika fluorescencyjnego. Stosując dwie długości fal wzbudzenia pod mikroskopem fluorescencyjnym, mierzy się współczynnik intensywności fluorescencji w celu oceny utleniania mitochondriów. Protokół obejmuje...

Obrazowanie mitochondrialnego stanu redoks w neuronach pierwotnych za pomocą wskaźnika ratiometrycznego

Opisujemy użycie dwóch ratiometrycznych, genetycznie kodowanych biosensorów, które są oparte na GFP, do monitorowania mitochondrialnego stanu redoks i poziomów ATP w rozdzielczości subkomórkowej w żywych komórkach drożdży.

Biosensory ratiometryczne, które mierzą mitochondrialny stan redoks i ATP w żywych komórkach drożdży

Konfokalna mikroskopia skaningowa jest stosowana do obrazowania pojedynczych zdarzeń mitochondrialnych w perfundowanych mięśniach serca lub szkieletowych u żywych zwierząt. Monitorowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych procesów mitochondrialnych, takich jak błyski ponadtlenkowe i wahania potencjału błonowego, umożliwia ocenę funkcji mitochondriów w fizjologicznie istotnym kontekście i podczas patologicznych perturbacji.

Obrazowanie konfokalne pojedynczych mitochondrialnych błysków ponadtlenkowych w nienaruszonym sercu lub in vivo

Upośledzony transport i morfologia mitochondriów są zaangażowane w różne choroby neurodegeneracyjne. Prezentowany protokół wykorzystuje indukowane pluripotencjalne neurony przodomózgowia pochodzące z komórek macierzystych do oceny transportu mitochondrialnego i morfologii w dziedzicznej paraplegii spastycznej. Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie transportu mitochondrialnego wzdłuż aksonów i analizę ich morfologii, co ułatwi badanie chorób neurodegeneracyjnych.

Analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej

Ten proctocol ma na celu dostarczenie metody obrazowania in vitro i in vivo mitochondrialnego Ca2+ w astrocytach i neuronach.

Obrazowanie mitochondrialnego wychwytu Ca2+ w astrocytach i neuronach przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2+ (GECI)

Ten artykuł opisuje metodę mitochondrialnego obrazowania poklatkowego kultur astrocytów wyposażonych w biosensor MitoTimer i wynikową wieloparametryczną analizę dynamiki mitochondriów, mobilności, morfologii, biogenezy, stanu redoks i obrotu.

Obrazowanie na żywo układu mitochondrialnego w hodowanych astrocytach

Ta technika opisuje efektywny przepływ pracy do wizualizacji i ilościowego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych w komórkach HeLa za pomocą obrazowania na żywo opartego na fluorescencji.

Kwantyfikacja potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych na podstawie fluorescencji przy użyciu obrazowania na żywo w komórkach HeLa

W tym filmie demonstrujemy wizualizację translokacji PKC w żywych komórkach z wykorzystaniem PKC znakowanych fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo translokacji PKC w komórkach Sf9 oraz w neuronach sensorycznych Aplysia

Poznaj metodę obrazowania na żywo mitochondrialnego stanu redoks w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego. Ta technika umożliwia ocenę strategii ochrony mitochondriów w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego

Przeglądaj więcej filmów