Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego

Ten artykuł opisuje protokół do określania różnic w podstawowym stanie redoks i redoks odpowiedzi na ostre perturbacje w pierwotnych neuronach hipokampa i kory mózgowej za pomocą konfokalnej mikroskopii na żywo. Protokół może być stosowany do innych typów komórek i mikroskopów przy minimalnych modyfikacjach.

Metoda ta pozwala na zbadanie, w jaki sposób stan redoks mitochondriów wpływa na stany patofizjologiczne. Może być również stosowany do oceny skuteczności strategii leczenia, które mają na celu ochronę mitochondriów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na ocenę narządów i specyficznych zmian dynamicznych i śledzących w stanie redoks mitochondriów w czasie rzeczywistym.

Metodę tę można połączyć z dodatkowymi wskaźnikami, aby jednocześnie rejestrować np. potencjał błony mitochondrialnej lub stężenie wapnia oprócz stanu redoks. Protokół ten można zastosować do komórek hodowlanych, eksplantatów tkankowych i kultur warstwowych. Zacznij od optymalizacji ustawień skaningowego mikroskopu konfokalnego.

Aby to zrobić, ustaw detektor na 12 bitów lub 16 bitów, aktywuj tryb skanowania sekwencyjnego i dodaj drugą sekwencję/ścieżkę. Dla obu kanałów wybierz tabelę wyszukiwania pseudokolorów, która wskazuje prześwietlone i niedoświetlone piksele, a następnie wybierz obiektyw odpowiedni dla interesującego Cię obiektu. Zamontuj szkiełko nakrywkowe z komórkami w komorze obrazowania.

Dodaj jeden mililitr buforu do obrazowania i umieść komorę na mikroskopie. Użyj okularu i przechodzącego światła, aby ustawić ostrość komórek. Nagrywaj obrazy w różnych formatach pikseli i rozmiarach otworków.

Następnie rejestruj obrazy o różnej intensywności lasera i odpowiednio dostosuj wzmocnienie i próg detektora. Na koniec nagrywaj obrazy z różnymi prędkościami skanowania i różną liczbą średnich klatek. W przypadku obrazowania na żywo ustaw interwał timelapse na 30 sekund, a czas trwania na 25 minut.

Następnie zamontuj komórki, umieść komorę na mikroskopie i ustaw ostrość komórek, jak pokazano wcześniej. Przełącz się w tryb skanowania i użyj kanału 488 nanometrów w podglądzie na żywo, aby ustawić ostrość i zlokalizować komórki do obrazowania. Opcjonalnie, aby zwiększyć liczbę rejestrowanych komórek w przebiegu, należy użyć funkcji wielopunktowej, aby zobrazować od dwóch do trzech pól widzenia na szkiełko nakrywkowe.

Rozpocznij akwizycję poklatkową i nagraj pięć obrazów jako dwuminutowe nagranie bazowe. Dodaj 500 mikrolitrów roztworu 3X NMDA do komory, aby osiągnąć końcowe stężenie 30 mikromolów i zarejestruj dodatkowe 20 obrazów jako 10-minutową odpowiedź NMDA. Następnie dodaj 500 mikrolitrów roztworu 4X DA do komory i nagraj sześć kolejnych obrazów.

Odessać bufor z komory obrazowania i zastąpić go jednym mililitrem roztworu DTT. Po nagraniu kolejnych 10 obrazów zakończ nagrywanie i zapisz serię obrazów. Aby zaimportować dane w oprogramowaniu do analizy obrazu, kliknij wtyczki, wybierz formaty bio, a następnie importer formatów bio.

W oknie dialogowym wybierz pozycję hyperstack w stosie widoków z, ustaw tryb kolorów jako domyślny i wybierz opcję automatycznego skalowania. Zmień format obrazu na 32-bitowy, klikając obraz, wybierając typ, a następnie z opcji wybierz 32-bitowy. Aby podzielić kanały kolorów na osobne okna, kliknij obraz, przejdź do koloru i wybierz podziel kanały.

Dostosuj próg, aby wybrać mitochondria do analizy, klikając obraz, wybierając dostosuj i próg. W oknie dialogowym wybierz domyślne czerwone ciemne tło i histogram stosu. Gdy wybrane piksele zmienią kolor na czerwony, kliknij Zastosuj.

Następnie wybierz ustaw piksele tła na NAN, przetwarzaj wszystkie obrazy i wykonaj tę samą procedurę dla kanału drugiego. Aby zobrazować stosunek nanometra od 405 do 488 nanometrów, utwórz obraz proporcji, klikając kalkulator procesu i obrazu. W oknie dialogowym wybierz kanał pierwszy na obrazie jeden podział w kanale operacyjnym dwa na obrazie drugim.

Następnie wybierz utwórz nowe okno i przetwórz wszystkie obrazy. Zmień tabelę przeglądową obrazu o stosunku do pseudokoloru, klikając obraz, wybierając tabele przeglądowe, a następnie uruchom go. Aby przeanalizować obraz, narysuj ROI wokół poszczególnych komórek lub mitochondriów na obrazie proporcji.

Aby dodać ROI do menedżera ROI, przejdź do analizy, kliknij narzędzia, wybierz Menedżer ROI, kliknij dodaj i wybierz pokaż wszystko. Aby zmierzyć proporcje 405 do 488 nanometrów poszczególnych komórek, kliknij Menedżer ROI, wybierz wszystkie ROI, naciskając Control A, przejdź do więcej i wybierz wiele miar. W oknie dialogowym wybierz opcję zmierz wszystkie plasterki i po jednym wierszu na plasterek.

Po wyeksportowaniu pomiarów do oprogramowania arkusza kalkulacyjnego wybierz obraz 405 nanometrów, zmierz intensywność wszystkich zwrotów z inwestycji i ponownie wyeksportuj pomiary do oprogramowania arkusza kalkulacyjnego. Podobnie zmierz intensywność ROI obrazu 488 nanometrów. Aby zapisać ROI do wykorzystania w przyszłości, wybierz wszystkie ROI, naciskając Control A, przejdź do więcej i wybierz Zapisz.

Te reprezentatywne migawki z nagrania poklatkowego pokazują obrazy proporcji neuronów przed i po leczeniu NMDA oraz po kalibracji max/min za pomocą DA i DTT. Leczenie neuronów 30 mikromolowym NMDA wywołało utlenianie mitochondriów w ciągu kilku minut. Analiza poszczególnych kanałów fluorescencyjnych wykazała, że kwasica mitochondrialna wywołana przez NMDA spowodowała spadek fluorescencji GFP zarówno przy wzbudzeniu 405, jak i 488 nanometrów.

W eksperymencie kontrolnym wstępne traktowanie DA wykluczyło dalsze utlenianie mitochondriów przez NMDA. W związku z tym stosunek 405 do 488 nie zmienił się pomimo znacznego wygaszenia intensywności fluorescencji GFP2 wrażliwej na redoks. Eksperyment ten potwierdził, że zmiany pH nie mają wpływu na stosunek 405 do 488 nanometrów.

W oddzielnym eksperymencie oceniano równolegle potencjał błony mitochondrialnej, stan redoks i morfologię. Leczenie neuronów 60 mikromolowym NMDA spowodowało utratę sygnału tetrametylorodaminy lub TMRE i wzrost stosunku GFP rho od 405 do 488 nanometrów, po którym nastąpiło pewne opóźnione zaokrąglenie mitochondriów. Kiedy zaczynasz korzystać z tej metody, bardzo ważne jest, aby poświęcić trochę czasu na staranną optymalizację ustawień mikroskopowych.

Pomoże to utrzymać neurony w zdrowiu podczas eksperymentów. Bardzo ważne jest również, aby zawsze przestrzegać zasad bezpieczeństwa lasera. Upewnij się, że nie jesteś narażony na promieniowanie laserowe, gdy dodajesz narkotyki w celu manipulacji podczas nagrań na żywo.