Fluorescencja międzyfazowa in situ Hybrydyzacja rozmazów szpiku kostnego szpiczaka mnogiego
15 kwietnia 2022
Tutaj prezentujemy protokół poprawy skuteczności wykrywania hybrydyzacji fluorescencji międzyfazowej in situ na rozmazach szpiku kostnego od pacjentów ze szpiczakiem mnogim.
Zastosowanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ zwanej FISH do genetycznej stratyfikacji ryzyka w szpiczaku mnogim jest niezbędne. Krytyczną częścią raportów FISH nie są wszystkie komórki jądrzaste, ale klonalne komórki plazmatyczne specyficznie oczyszczone lub zidentyfikowane przez sortowanie za pomocą kulek magnetycznych anty-CD138 lub znakowanie za pomocą cytoplazmatycznej kappy lub immunoglobuliny łańcucha lekkiego Lambda za pomocą testów FISH zwanych cIg FISH. Interphase FISH po sortowaniu komórek plazmatycznych lub cIg FISH okazuje się być istotna w diagnostyce szpiczaka mnogiego, ze względu na stosunkowo mniejszy odsetek komórek plazmatycznych w szpiku kostnym.
Metody te mają jednak pewne wady, w tym złożone procesy, wysokie wymagania dotyczące próbek i wysokie koszty eksperymentalne. Komórki plazmatyczne można szybko zlokalizować w rozmazie szpiku kostnego. Na tej podstawie używamy rozmazu szpiku kostnego FISH do wykrywania komórek szpiczaka mnogiego.
Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej i zatwierdzone przez Komisję Etyczną Szpitala Zhongnan Uniwersytetu Wuhan. Próbki pobrano od pacjenta ze szpiczakiem mnogim na Wydziale Hematologii Szpitala Zhongnan Uniwersytetu Wuhan w Chinach. Umieść pierwsze 0,2 mililitra roztworu szpiku kostnego na czystym jednorazowym szkiełku szkiełkowym, rozprowadź rozmazy szpiku kostnego do jednolitej grubości i ostrych ogonów, szybko usuwając szpik kostny, a następnie wysusz go naturalnie.
Przykryj błony szpiku kostnego jednym mililitrem roztworu Wrighta-Giemsa przez około 10 sekund w temperaturze pokojowej. Dodaj jeden mililitr buforu fosforanowego do szkiełek, należało uważać, aby roztwór barwnika nie wysychał ani nie spływał ze szkiełek. Delikatnie wymieszaj roztwór barwnika i utrzymuj go przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
Opłucz szkiełka czystą wodą i wysusz je na powietrzu w temperaturze pokojowej. Użyj mikroskopii światła do przodu, aby wykryć złośliwe komórki plazmatyczne, komórki plazmatyczne powinny być dobrze rozproszone. To, co widzimy w terenie, to komórki plazmatyczne, które są dość rozproszone.
Jest to typowa dwujądrowa komórka plazmy jądrowej. Przykryj hybrydyzowany obszar roztworem utrwalającym przez 10 minut, aby odbarwić i utrwalić komórki plazmatyczne. Opłucz szkiełko wodą dejonizowaną i wysusz je na powietrzu w temperaturze pokojowej.
Rozgrzej słoik zawierający dwukrotny bufor SSC do 56 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Przemyć przygotowany rozmaz szpiku kostnego w podgrzanym dwukrotnie buforze SSC przez 10 minut, a następnie zanurzyć w dejonizowanej wodzie o temperaturze pokojowej. Odwodnić rozmaz w gradiencie etanolu 70%85% i 100% etanolu każdy przez jedną minutę.
Wysuszyć rozmaz na powietrzu przez 10 minut. Najpierw dodaj TP53 na centromer mieszaniny sondy chromosomu 17 do obszaru hybrydyzacji i przykryj go szkiełkiem nakrywkowym, delikatnie dociśnij drobno spiczastą pęsetę, aby usunąć pęcherzyki powietrza od spodu. Uszczelnij wszystkie boki szkiełka nakrywkowego cementem gumowym, aby zapewnić dobrą szczelność.
Po zestaleniu się cementu kauczukowego szkiełko umieszczono na automatycznej maszynie FISH, przeprowadzono denaturację w temperaturze 78 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie hybrydyzację w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Podnieś zjeżdżalnię z automatu FISH. Użyj cienkiej spiczastej pęsety, aby delikatnie usunąć cement kauczukowy.
Zanurz szkiełko w dwukrotnie SSC w temperaturze pokojowej na około jedną lub dwie minuty, aby zmyć szkiełko nakrywkowe. Umyj szkiełko w buforze do podgrzewania o temperaturze 68 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez dwie minuty. Myć szkiełka dwukrotnym SSC w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę.
Ustawić w ciemności, aby dokładnie wyschnąć przez 10 minut w 10 mikrolitrach DAPI do hybrydyzowanego obszaru, przykryć szkiełkiem nakrywkowym. Obejrzyj zhybrydyzowany szkiełko za pomocą odpowiedniego zestawu filtrów na mikroskopie fluorescencyjnym, użyj monochromatycznego niebieskiego filtra optycznego fluoroforowego do obserwacji intensywności fluorescencji jądra komórkowego. Wykonaj obrazy jądra komórkowego pod zestawem filtrów DAPI.
CEP17 oznaczono zieloną fluorescencją. Użyj filtra optycznego z zielonym fluoroforem, aby obserwować lokalizację CEP17. Weź obraz sygnałów CEP17 pod zielonym zestawem filtrów.
Gen TP53 został oznaczony pomarańczową fluorescencją. Użyj pomarańczowego filtra optycznego fluoroforowego do obserwacji TP53, weź obraz sygnałów TP53 pod zestawem, połącz te trzy obrazy w całość i sprawdź, czy nie ma nieprawidłowości numerycznych. W normalnej komórce interfazowej obserwuje się dwa pomarańczowe i dwa zielone sygnały wewnątrz jądra z niebieską fluorescencją wskazującą na jedną parę normalnych chromosomów 17.
Wyniki pokazały morfologię i genetykę szpiku kostnego u pacjenta ze szpiczakiem mnogim. Rycina A wykazała, że 15% komórek plazmatycznych w rozmazie szpiku kostnego ma większe i ciemniejsze jądra wraz z dużymi ilościami cytoplazmy niż normalnie. Rycina B przedstawiała obraz w skali szarości reprezentatywny dla jądrzastej komórki plazmatycznej w rozmazie szpiku kostnego.
Rycina C pokazała cztery pomarańczowe i cztery zielone sygnały w jednym jądrze interfazowym komórki plazmatycznej, co sugeruje, że cztery kopie chromosomu 17 były zlokalizowane w jądrze. Rycina D wykazała, że nieprawidłowy kariogram chromosomowy tego pacjenta potwierdził dwie pary chromosomów 17 w jednym jądrze. Rozmazy szpiku kostnego są znacznie łatwiejsze do uzyskania niż próbki szpiku kostnego antykoagulant, ponieważ uzyskanie antykoagulowanego szpiku kostnego wymaga skomplikowanych procedur w celu uzyskania jądra.
W związku z tym opracowaliśmy przekonującą metodę rozmazu szpiku kostnego FISH do wykrywania komórek szpiczaka mnogiego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono protokół zwiększający skuteczność detekcji metodą hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej (FISH) w interfazie na rozmazach szpiku kostnego pobranych od pacjentów z szpiczakiem mnogim. Badanie podkreśla znaczenie dokładnej identyfikacji klonalnych komórek plazmatycznych dla skutecznego rozpoznania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Onkologia
- Genetyka
Wprowadzenie
- Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) ma kluczowe znaczenie dla stratyfikacji ryzyka genetycznego w szpiczaku mnogim.
- W celu dokładnego raportowania wyników FISH konieczna jest specyficzna identyfikacja klonalnych komórek plazmatycznych.
- Obecne metody mają swoje ograniczenia, w tym wysoką złożoność oraz wysokie koszty.
- Rozmazy szpiku kostnego mogą ułatwić szybszą identyfikację komórek plazmatycznych.
Cel badania
- Usprawnienie wykrywania komórek szpiczaka mnogiego przy użyciu metody FISH w rozmazach szpiku kostnego.
- Wyeliminowanie niedoskonałości istniejących metod FISH.
- Optymalizacja procesu identyfikacji klonalnych komórek plazmatycznych.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie magnetycznych kulek anty-CD138 do sortowania komórek plazmatycznych.
- Wdrożenie znakowania cytoplazmatycznych łańcuchów lekkich immunoglobulin kappa lub lambda.
- Zastosowanie metody FISH w interfazie po sortowaniu komórek plazmatycznych.
- Wykorzystanie metody FISH na rozmazach szpiku kostnego w celu efektywnej detekcji.
Główne wyniki
- Metoda FISH w rozmazach szpiku kostnego skutecznie identyfikuje komórki szpiczaka mnogiego.
- Poprawa dokładności diagnostyki szpiczaka mnogiego dzięki ukierunkowanej detekcji komórek plazmatycznych.
- Zmniejszenie zapotrzebowania na materiał biologiczny oraz kosztów eksperymentalnych w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Udoskonalony protokół umożliwia szybszą diagnostykę i planowanie leczenia.
Wnioski
- Badanie przedstawia skuteczną alternatywę dla wykrywania komórek szpiczaka mnogiego.
- Metoda FISH w rozmazach szpiku kostnego pozwala przełamać ograniczenia istniejących technik FISH.
- Dalsze badania mogą skupić się na optymalizacji tej metody pod kątem zastosowań klinicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Niniejsza metoda eliminuje kluczowy problem w diagnostyce szpiczaka mnogiego, umożliwiając analizę FISH na powszechnie dostępnych rozmazach szpiku kostnego, co zmniejsza zależność od świeżych aspiratów heparynowanych. Wspiera ona szybszą i bardziej dostępną stratyfikację ryzyka genetycznego w procesach hematologii onkologicznej, szczególnie w sytuacjach, gdy pobranie próbek jest utrudnione. Podejście to zwiększa ciągłość translacyjną poprzez poprawę wykonalności badania materiału bez utraty specyficzności w odniesieniu do klonalnych komórek plazmatycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia analizę nieprawidłowości chromosomowych w klonalnych komórkach plazmatycznych bezpośrednio z rozmazów, co wspiera mechanistyczną ocenę ryzyka w odniesieniu do celów genomowych.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza złożoność przetwarzania próbek poprzez wyeliminowanie konieczności sortowania lub wzbogacania komórek przed przeprowadzeniem procedury FISH.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Zapewnia standaryzowaną platformę do badania FISH w interfazie opartą na rozmazach, co poprawia gotowość do analizy w próbkach o niskiej wydajności lub trudnych do pozyskania.
- Wartość operacyjna: Zwiększa powtarzalność poprzez minimalizację zmiennych przedanalitycznych związanych z obchodzeniem się ze świeżym aspiratem i jego przetwarzaniem.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera badania ukierunkowane na biomarkery poprzez zachowanie kontekstu przestrzennego plazmocytów w rozmazach, co umożliwia korelację morfologii z aberracjami genetycznymi.
- Wartość operacyjna: Ułatwia monitorowanie podłużne w modelach przedklinicznych, w których wielokrotna aspiracja szpiku kostnego jest niepraktyczna.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrycia do translacji, zapewniając wykonalny schemat pracy FISH w sytuacjach, gdy ilość próbek pierwotnych jest ograniczona, co umożliwia późniejszą analizę genetyczną bez opóźniania identyfikacji wiodących związków lub walidacji przedklinicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących klonalnych zmian genomicznych, umożliwiając wykonanie badania FISH na archiwalnych lub trudnych w obróbce rozmazach szpiku.
- Przesiewanie: Poprawia standaryzację analizy poprzez wykorzystanie rozmazów jako spójnego podłoża do hybrydyzacji i detekcji sygnałów.
- Analityka: Umożliwia ilościową ocenę zmian liczby kopii chromosomów (np. TP53, CEP17) w jądrach w fazie interfazy, co dostarcza informacji niezbędnych do stratyfikacji ryzyka.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej, umożliwiając wielokrotne pobieranie próbek poprzez rozmazy w badaniach podłużnych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny protokół przygotowania rozmazów do badania FISH, który można zastosować w różnych modelach szpiczaka mnogiego i typach próbek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Poprawia wiarygodność prognostyczną w ocenie ryzyka genomicznego, umożliwiając wykonanie analizy FISH na próbkach, które w innym przypadku nie nadawałyby się do badania.
- Wartość operacyjna: Zwiększa przepustowość laboratorium i skraca czas oczekiwania na wynik poprzez uproszczenie przygotowania preparatów.
- Wartość strategiczna: Zmniejsza ryzyko biologiczne i techniczne w procesie wczesnego podejmowania decyzji dzięki rozszerzeniu dostępu do krytycznych danych cytogenetycznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera rozwój korygowany o ryzyko, umożliwiając stratyfikację opartą na FISH w warunkach ograniczeń zasobowych lub w środowiskach klinicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie projektowania sond FISH, hybrydyzacji oraz mikroskopii fluorescencyjnej w celu dokładnej interpretacji sygnału.
- Zależy od dostępu do standardowego sprzętu do FISH, w tym komór hybrydyzacyjnych, buforów płuczących oraz zestawów filtrów dla DAPI, spectrum green i spectrum orange.
- Wymaga standaryzacji przygotowania rozmazów i protokołów barwienia w celu zapewnienia spójnej morfologii i retencji komórek plazmatycznych.
- Należy uwzględnić zmienność gęstości komórek plazmatycznych w rozmazach podczas określania głębokości próbkowania i progów kwantyfikacji sygnału.
- Ograniczona do analizy interfazy; nie umożliwia kariotypowania metafazowego ani wykrywania rearanżacji strukturalnych bez zastosowania dodatkowych metod.
