Name: Fluorescencja międzyfazowa in situ Hybrydyzacja rozmazów szpiku kostnego szpiczaka mnogiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Poznaj metodę FISH na rozmazach szpiku kostnego do wykrywania szpiczaka mnogiego. Technika ta poprawia identyfikację komórek plazmatycznych i zmniejsza koszty diagnostyczne w porównaniu do tradycyjnych metod.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt był wspierany przez Fundusz Innowacji WNLO 2018WNLOKF023.

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej i zatwierdzone przez Komisję Etyki Szpitala Zhongnan Uniwersytetu Wuhan (nr 2019065). Próbki pobrano od pacjenta z MM w Klinice Hematologii Szpitala Zhongnan Uniwersytetu Wuhan (Chiny).
1. Przygotowanie rozmazów BM
<ol>
	<li>Umieść pierwsze 0,2 ml roztworu BM na czystym jednorazowym szkiełku podstawowym.</li>
	<li>Rozprowadź smugi BM na jednolitą grubość z ostrymi ogonami, szybko usuwając BM. Następnie wysuszyć naturalnie.</li>
	<li>Przykryj folie BM 1 ml roztworu Wrighta-Giemsy przez około 10 s w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu fosforanowego do szkiełek. 
	UWAGA: Uważaj, aby roztwór barwnika nie wysychał ani nie spływał ze szkiełek.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj roztwór barwnika i utrzymuj go przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Opłucz szkiełka czystą wodą i wysusz je na powietrzu w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Użyj mikroskopii światła do przodu, aby wykryć złośliwe komputery. BG powinny być dobrze rozproszone.</li>
</ol>
2. Wstępne przetwarzanie rozmazów BM FISH
<ol>
	<li>Przykryj hybrydyzowany obszar roztworem utrwalającym przez 10 minut, aby odbarwić i utrwalić komputery.
	<ol>
		<li>Aby przygotować świeży roztwór utrwalający, zmieszaj metanol z lodowatym kwasem octowym w stosunku objętościowym 3:1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opłukać szkiełko wodą dejonizowaną (dH2O) i wysuszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Podgrzej słoik zawierający 2x bufor SSC do 56 °C w łaźni wodnej. Przed użyciem świeżo rozcieńczyć bufor do 20x SSC.
	<ol>
		<li>Aby przygotować 20x SSC, dokładnie wymieszaj 176 g chlorku sodu i 88 g cytrynianu sodu z 800 mldH2O. Zmierz pH i dostosuj do pH 5,3 ± 0,2. Następnie dodać dH2O, aby doprowadzić ostateczną objętość do 1 L.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowany rozmaz BM przemyć w podgrzanym buforze 2x SSC przez 10 minut, a następnie zanurzyć go w dejonizowanej wodzie o temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwodnić rozmaz w gradiencie etanolu (70%, 85% i 100% etanolu, każdy przez 1 minutę). Suszyć rozmaz na powietrzu przez 10 minut.</li>
</ol>
3. BM rozmazuje RYBY i mycie
UWAGA: Wszystkie kroki zostały wykonane w ciemnym pomieszczeniu, aby zapobiec wygaszaniu fluorescencji.
<ol>
	<li>Dodaj mieszaninę sondy TP53/centromer chromosomu 17 (CEP17) do obszaru hybrydyzacji i przykryj ją szkiełkiem nakrywkowym. Delikatnie dociśnij drobno spiczastą pęsetą, aby usunąć pęcherzyki powietrza spod spodu.</li>
	<li>Uszczelnij wszystkie boki szkiełka nakrywkowego cementem gumowym, aby zapewnić dobrą szczelność.</li>
	<li>Po zestaleniu się cementu gumowego umieść szkiełko na automatycznej maszynie FISH. Przeprowadzić denaturację w temperaturze 78 °C przez 5 minut, a następnie hybrydyzację w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Podnieś zjeżdżalnię z automatu FISH. Użyj drobno zakończonej pęsety, aby delikatnie usunąć cement kauczukowy.</li>
	<li>Zanurz szkiełko w 2x SSC w temperaturze pokojowej na około 1 lub 2 minuty, aby zmyć szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Szkiełko myć w 68 °C nagrzanym buforze 0,4x SSC/0,3% NP-40 w łaźni wodnej przez 2 minuty.
	<ol>
		<li>Przygotować 0,4 x SSC/0,3% roztwór NP-40, dokładnie mieszając 20 ml 20 x SSC (pH 5,3) z 950 ml dH2O. Następnie dodaj 3 ml NP-40 i dokładnie wymieszaj, aż do całkowitego rozpuszczenia. Zmierz pH i dostosuj do 7,0-7,5 za pomocą NaOH. Następnie dodaćdH 2O, aby doprowadzić końcową objętość całkowitego roztworu do 1 l.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Myć szkiełka z 2x SSC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 min. Ustawić pionowo w ciemności do całkowitego wyschnięcia przez 10 min.</li>
	<li>Dodaj 10 μl DAPI do hybrydyzowanego obszaru i przykryj szkiełkiem nakrywkowym.</li>
</ol>
4. Analiza i obrazowanie FISH
<ol>
	<li>Obejrzyj hybrydyzowany szkiełko za pomocą odpowiedniego zestawu filtrów w mikroskopie fluorescencyjnym.</li>
	<li>Użyj monochromatycznego niebieskiego filtra optycznego fluoroforowego, aby obserwować intensywność fluorescencji jądra komórkowego. Wykonaj obrazy jądra komórkowego pod zestawem filtrów DAPI.</li>
	<li>Użyj sondy centromerów chromosomowych, aby pokazać, ile chromosomów zawiera komórka. Oznaczenie CEP17 z zieloną fluorescencją. Użyj filtra optycznego z zielonym fluoroforem, aby obserwować lokalizację CEP17. Wykonaj obraz sygnałów CEP17 pod zielonym zestawem filtrów.</li>
	<li>Oznacz gen TP53 pomarańczową fluorescencją. Użyj pomarańczowego filtra optycznego fluoroforowego o widmie, aby obserwować TP53. Zrób obraz sygnałów TP53 pod tym zestawem.</li>
	<li>Scal te trzy obrazy i sprawdź je pod kątem nieprawidłowości numerycznych. 
	UWAGA: W normalnej komórce interfazowej dwa pomarańczowe i dwa zielone sygnały są obserwowane wewnątrz jądra o niebieskiej fluorescencji, co wskazuje na jedną parę normalnego chromosomu 17 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1).</li>
</ol>

<ol><li>Sonneveld, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+multiple+myeloma+with+high-risk+cytogenetics%3A+a+consensus+of+the+International+Myeloma+Working+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group.</a> Blood. 127, 2955-2962 (2016).</li>
<li>Radbruch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competence+and+competition%3A+the+challenge+of+becoming+a+long-lived+plasma+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell.</a> Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).</li>
<li>Lai, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+cytogenetics+in+multiple+myeloma%3A+a+study+of+151+patients+including+117+patients+at+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis.</a> Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).</li>
<li>Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+myeloma%3A+increasing+evidence+for+a+multistep+transformation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process.</a> Blood. 91, 3-21 (1998).</li>
<li>Munsh, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+recommendations+for+risk+stratification+in+multiple+myeloma%3A+report+of+the+International+Myeloma+Workshop+Consensus+Panel+2%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2.</a> Blood. 117, 4696-4700 (2011).</li>
<li>Gole, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cIg-FISH+On+Patients+with+Multiple+Myeloma+-+A+Modified+and+Simple+Technique+Easily+Incorporated+Into+Routine+Clinical+Service%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service.</a> Blood. 120, 4792-4792 (2012).</li>
<li>Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematology%2C+ICSH+guidelines+for+the+standardization+of+bone+marrow+specimens+and+reports%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Laboratory+Hematology%22%5BJournal%5D)">Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports.</a> International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).</li>
<li>Štifter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+evaluation+of+bone+marrow+aspirate+and+biopsy+is+superior+in+the+prognosis+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma.</a> Diagnostic Pathology. 5, 30(2010).</li>
<li>Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+on+direct+hematological+bone+marrow+smears%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears.</a> Pathology. 27, 86-90 (1995).</li>
<li>Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+morphology%2C+esterase+cytochemistry%2C+and+interphase+cytogenetics+of+peripheral+blood+and+bone+marrow+smears%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).</li>
<li>Dunning, K., Safo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultimate+Wright-Giemsa+stain%3A+60+years+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making.</a> Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).</li>
<li>Woronzoff-Dashkoff, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wright-giemsa+stain.+Secrets+revealed%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The wright-giemsa stain. Secrets revealed.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).</li>
<li>McPherson, R. A., Pincus, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Henry%27s+Clinical+diagnosis+and+Management+by+Laboratory+Methods+E-book%5BTitle%5D)+AND+%22Elsevier+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book.</a> Elsevier Health Sciences. , (2017).</li>
<li>Ross, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+from+the+European+Myeloma+Network+on+interphase+FISH+in+multiple+myeloma+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders.</a> Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zastosowanie FISH do stratyfikacji ryzyka genetycznego w MM ma zasadnicze znaczenie. Krytyczną częścią raportów FISH nie są wszystkie komórki jądrzaste, ale klonalne PC specjalnie oczyszczone lub zidentyfikowane przez sortowanie za pomocą kulek magnetycznych anty-CD138 lub znakowanie cytoplazmatycznym łańcuchem lekkim immunoglobuliny κ lub λ. Stwierdzono, że interphase FISH po sortowaniu PC lub cIg-FISH jest istotny w diagnostyce MM ze względu na stosunkowo niższy odsetek PC w BM. Metody te mają jednak pewne wady, w tym ...

Szpiczak mnogi (MM) jest złośliwą chorobą komórek plazmatycznych (PC) o silnej biologicznej heterogeniczności i dużych indywidualnych różnicach w skuteczności klinicznej, z okresami przeżycia od miesięcy do dziesięcioleci. Cechy cytogenetyczne są ważnymi wskaźnikami prognostycznymi szpiczaka mnogiego. System stratyfikacji ryzyka i zindywidualizowane terapie oparte na cechach genetycznych stały się tematami intensywnego zainteresowania w badaniach klinicznych nad MM1. Aberracje PC badane w panelu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) szpiku kostnego (BM) obejmują del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4; 14) (IGH/FGFR3), t(11; 14) (IGH/MYEOV), t(14; 16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), wzmocnienie/wzmocnienie 1q21 (CKS1B) i delecja 1p (CDKN2C).
Standardowa cytogenetyka metafazowa powinna być uwzględniona we wstępnej ocenie pacjentów z MM. Chociaż konwencjonalne kariotypowanie z pasmem G oferuje korzyści z analizy całego chromosomu, niska wydajność tej metody prowadzi do wielu fałszywie ujemnych wyników2. Tradycyjnie, PC były postrzegane jako w dużej mierze niezdolne do podziału, ponieważ są końcowymi produktami różnicowania limfocytów B. Utrudnia to uzyskanie podzielonych obrazów. Ulepszona analiza cytogenetyczna w MM z długoterminowymi posiewami (6 dni) i stymulacja kultur przez cytokiny może być obiecującą metodą identyfikacji nieprawidłowości cytogenetycznych u nowo zdiagnozowanych pacjentów z MM3. Jednak nawet gdy czas posiewu został wydłużony do 6 dni, nieprawidłowości cytogenetyczne zostały dokładnie opisane u 30%-50% pacjentów z MM4. Ponadto szpic szpiczakowa charakteryzuje się złożonymi aberracjami cytogenetycznymi, które odzwierciedlają jego niejednorodność prognostyczną. Jednak rozdzielczość tradycyjnej technologii prążkowania chromosomów jest niska, co może łatwo doprowadzić do pominięcia wykrycia nieprawidłowości chromosomowych w MM.
Interphase FISH, najlepiej po sortowaniu lub znakowaniu PC za pomocą CD138-dodatniego magnetycznego granulatu za pomocą cytoplazmatycznego łańcucha lekkiego immunoglobuliny κ/λ, jest niezbędny w analizie MM5,6. Zdecydowanie zaleca się wyselekcjonowaną próbkę CD138-dodatnią w celu uzyskania optymalnej wydajności komórek nowotworowych. Jednak dokładne ilościowe określenie aberracji cytogenetycznych wymaga co najmniej 4 ml antykoagulowanego BM do sortowania PC. Dodatkowo, kombinacje sortowania immunomagnetycznych kulek CD138 z FISH lub cytoplazmatycznej immunoglobuliny łańcucha lekkiego κ/λ z testem FISH (cIg-FISH) zwiększają liczne koszty eksperymentalne i są czasochłonne.
Zazwyczaj, stosunek PC jest najpierw oceniany na podstawie badania morfologicznego barwionych rozmazów BM lub biopsji BM7,8. Do badań morfologicznych wykorzystuje się próbki BM najwyższej jakości (próbki aspiratu do szpiku pierwotnego), natomiast te wysyłane do FISH lub innego wykrywania są często wtórnymi próbkami aspiracyjnymi o wysokim współczynniku rozcieńczenia z krwią obwodową.
Już w latach dziewięćdziesiątych liczne badania wykazały, że rozmazy BM mogą być bezpośrednio używane do śródmiąższowych badań FISH, co okazało się niezawodną i powtarzalną metodą9. Eleganckie badanie oparte na morfologii komórek i cytochemii esterazy w połączeniu z FISH krwi obwodowej i rozmazami BM potwierdziło jego ogromne znaczenie kliniczne w wyjaśnianiu nieprawidłowości chromosomalnych u pacjentów z białaczką granulocytarną i limfocytową10.
Niniejszym przedstawiamy nowatorską metodę poprawy skuteczności wykrywania interfazowego FISH u pacjentów z MM.

<table><tbody><tr><td>automatyczna maszyna FISH</td><td>Leica&nbsp; Korporacja</td><td>S500-24</td><td>FINAL Assy Thermobrite 240V</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abbott Molecular Inc.</td><td>06J49-001</td><td>Oprogramowanie do analizy ryb DAPI Counterstain</td></tr><tr><td>IMSTAR</td><td>&nbsp; Korporacja</td><td>IMSTAR</td><td>Oprogramowanie do analizy ryb</td></tr><tr><td>Sonda FISH</td><td>Abbott Molecular Inc.</td><td>05N56-020</td><td>Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / 17 Zestaw sond FISH</td></tr><tr><td>Pipeta o stałej objętości</td><td>Eppendorf China Ltd.</td><td>M33768H</td><td>10&nbsp; mikrolitrowy</td></tr><tr><td>mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX53</td><td>Forward Fluorescencyjny</td></tr><tr><td>mikroskop Oprogramowanie do analizy kariotypu</td><td>IMSTAR&nbsp; Korporacja</td><td>IMSTAR</td><td>Oprogramowanie do analizy kariotypu</td></tr><tr>Mikroskop<td>świetlny</td><td>Olympus&nbsp; Corporation</td><td>BX41</td><td>Mikroskop światła do przodu</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Abbott Molecular Inc.</td><td>07J05-001</td><td>NP-40</td></tr><tr><td>Plastikowy stojak do barwienia</td><td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td><td>Złącze RSJ-501</td><td>&nbsp; 24 slajdy</td></tr><tr><td>Plastikowy zbiornik do barwienia</td><td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td><td>Złącze RSJ-516</td><td>&nbsp; 24 slajdy</td></tr><tr><td>Cement gumowy</td><td>Marabu&nbsp; Sp. z o.o. & Co. KG</td><td>FixoGum&nbsp;</td><td>Cement kauczukowy</td></tr><tr><td>SSC</td><td>Abbott Molecular Inc.</td><td>02J10-032</td><td>20 razy; SSC</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Szanghaj Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd.</td><td>DK-8D</td><td>Łaźnia wodna o wielu temperaturach</td></tr></tbody></table>

fluorescencja międzyfazowa in situ hybrydyzacja rozmazów szpiku kostnego szpiczaka mnogiego

Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

Wykrywanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) jest nieodzowną metodą w genetycznej stratyfikacji ryzyka w szpiczaku mnogim (MM), który jest jednym z najczęstszych nowotworów hematologicznych. Cechą charakterystyczną szpiczaka mnogiego są nagromadzone złośliwe komórki plazmatyczne w szpiku kostnym. Raporty FISH dotyczące MM koncentrują się głównie na oczyszczonych lub zidentyfikowanych klonalnych komórkach plazmatycznych, a nie na wszystkich komórkach jądrzastych, poprzez sortowanie za pomocą kulek magnetycznych anty-CD138 lub znakowanie cytoplazmatycznym łańcuchem lekkim immunoglobuliny κ lub λ. Jądra interfazowe szpiku kostnego są zwykle pozyskiwane ze świeżych komórek szpiku kostnego. Jednak zadowalające wzbogacenie próbek komórek plazmatycznych wymaga dużych ilości świeżego szpiku kostnego antykoagulowanego heparyną, którego nie można uzyskać w przypadku trudnego pobrania szpiku kostnego lub osuszenia szpiku kostnego. W tym artykule opracowujemy nowatorską metodę poprawy skuteczności wykrywania FISH w barwionych lub niebarwionych rozmazach szpiku kostnego. Rozmaz szpiku kostnego jest łatwiejszy do uzyskania niż próbki szpiku kostnego poddane antykoagulacji.

W wstępnej ocenie morfologicznej pacjenta z nowo zdiagnozowanym MM stwierdzono, że 15% PC w rozmazie BM posiadało większe i ciemniejsze jądra oraz większą ilość cytoplazmy niż prawidłowe PC (Rysunek 2A). Pierwsza probówka z BM przeciwkrzepliwą heparyną analizowana techniką immunofenotypową wykazała jedynie 2,3% monoklonalnych aberrantnych PC. Sortowanie za pomocą kulek immunomagnetycznych CD138 w połączeniu z FISH lub techniką cIg-FISH jest niezbędne do uzyskania dokładnego wyniku FISH. Jedn...

Tutaj prezentujemy protokół poprawy skuteczności wykrywania hybrydyzacji fluorescencji międzyfazowej in situ na rozmazach szpiku kostnego od pacjentów ze szpiczakiem mnogim.

Fluorescencja międzyfazowa in situ Hybrydyzacja rozmazów szpiku kostnego szpiczaka mnogiego

Fluorescence in situ hybridization (FISH) detection is an indispensable method in genetic risk stratification in multiple myeloma (MM), which is one of ...

Zastosowanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ zwanej FISH do genetycznej stratyfikacji ryzyka w szpiczaku mnogim jest niezbędne. Krytyczną częścią raportów FISH nie są wszystkie komórki jądrzaste, ale klonalne komórki plazmatyczne specyficznie oczyszczone lub zidentyfikowane przez sortowanie za pomocą kulek magnetycznych anty-CD138 lub znakowanie za pomocą cytoplazmatycznej kappy lub immunoglobuliny łańcucha lekkiego Lambda za pomocą testów FISH zwanych cIg FISH. Interphase FISH po sortowaniu komórek plazmatycznych lub cIg FISH okazuje się być istotna w diagnostyce szpiczaka mnogiego, ze względu na stosunkowo mniejszy odsetek komórek plazmatycznych w szpiku kostnym.Metody te mają jednak pewne wady, w tym złożone procesy, wysokie wymagania dotyczące próbek i wysokie koszty eksperymentalne. Komórki plazmatyczne można szybko zlokalizować w rozmazie szpiku kostnego. Na tej podstawie używamy rozmazu szpiku kostnego FISH do wykrywania komórek szpiczaka mnogiego.Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej i zatwierdzone przez Komisję Etyczną Szpitala Zhongnan Uniwersytetu Wuhan. Próbki pobrano od pacjenta ze szpiczakiem mnogim na Wydziale Hematologii Szpitala Zhongnan Uniwersytetu Wuhan w Chinach. Umieść pierwsze 0,2 mililitra roztworu szpiku kostnego na czystym jednorazowym szkiełku szkiełkowym, rozprowadź rozmazy szpiku kostnego do jednolitej grubości i ostrych ogonów, szybko usuwając szpik kostny, a następnie wysusz go naturalnie.Przykryj błony szpiku kostnego jednym mililitrem roztworu Wrighta-Giemsa przez około 10 sekund w temperaturze pokojowej. Dodaj jeden mililitr buforu fosforanowego do szkiełek, należało uważać, aby roztwór barwnika nie wysychał ani nie spływał ze szkiełek. Delikatnie wymieszaj roztwór barwnika i utrzymuj go przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Opłucz szkiełka czystą wodą i wysusz je na powietrzu w temperaturze pokojowej. Użyj mikroskopii światła do przodu, aby wykryć złośliwe komórki plazmatyczne, komórki plazmatyczne powinny być dobrze rozproszone. To, co widzimy w terenie, to komórki plazmatyczne, które są dość rozproszone.Jest to typowa dwujądrowa komórka plazmy jądrowej. Przykryj hybrydyzowany obszar roztworem utrwalającym przez 10 minut, aby odbarwić i utrwalić komórki plazmatyczne. Opłucz szkiełko wodą dejonizowaną i wysusz je na powietrzu w temperaturze pokojowej.Rozgrzej słoik zawierający dwukrotny bufor SSC do 56 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Przemyć przygotowany rozmaz szpiku kostnego w podgrzanym dwukrotnie buforze SSC przez 10 minut, a następnie zanurzyć w dejonizowanej wodzie o temperaturze pokojowej. Odwodnić rozmaz w gradiencie etanolu 70%85% i 100% etanolu każdy przez jedną minutę.Wysuszyć rozmaz na powietrzu przez 10 minut. Najpierw dodaj TP53 na centromer mieszaniny sondy chromosomu 17 do obszaru hybrydyzacji i przykryj go szkiełkiem nakrywkowym, delikatnie dociśnij drobno spiczastą pęsetę, aby usunąć pęcherzyki powietrza od spodu. Uszczelnij wszystkie boki szkiełka nakrywkowego cementem gumowym, aby zapewnić dobrą szczelność.Po zestaleniu się cementu kauczukowego szkiełko umieszczono na automatycznej maszynie FISH, przeprowadzono denaturację w temperaturze 78 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie hybrydyzację w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Podnieś zjeżdżalnię z automatu FISH. Użyj cienkiej spiczastej pęsety, aby delikatnie usunąć cement kauczukowy.Zanurz szkiełko w dwukrotnie SSC w temperaturze pokojowej na około jedną lub dwie minuty, aby zmyć szkiełko nakrywkowe. Umyj szkiełko w buforze do podgrzewania o temperaturze 68 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez dwie minuty. Myć szkiełka dwukrotnym SSC w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę.Ustawić w ciemności, aby dokładnie wyschnąć przez 10 minut w 10 mikrolitrach DAPI do hybrydyzowanego obszaru, przykryć szkiełkiem nakrywkowym. Obejrzyj zhybrydyzowany szkiełko za pomocą odpowiedniego zestawu filtrów na mikroskopie fluorescencyjnym, użyj monochromatycznego niebieskiego filtra optycznego fluoroforowego do obserwacji intensywności fluorescencji jądra komórkowego. Wykonaj obrazy jądra komórkowego pod zestawem filtrów DAPI.CEP17 oznaczono zieloną fluorescencją. Użyj filtra optycznego z zielonym fluoroforem, aby obserwować lokalizację CEP17. Weź obraz sygnałów CEP17 pod zielonym zestawem filtrów.Gen TP53 został oznaczony pomarańczową fluorescencją. Użyj pomarańczowego filtra optycznego fluoroforowego do obserwacji TP53, weź obraz sygnałów TP53 pod zestawem, połącz te trzy obrazy w całość i sprawdź, czy nie ma nieprawidłowości numerycznych. W normalnej komórce interfazowej obserwuje się dwa pomarańczowe i dwa zielone sygnały wewnątrz jądra z niebieską fluorescencją wskazującą na jedną parę normalnych chromosomów 17.Wyniki pokazały morfologię i genetykę szpiku kostnego u pacjenta ze szpiczakiem mnogim. Rycina A wykazała, że 15% komórek plazmatycznych w rozmazie szpiku kostnego ma większe i ciemniejsze jądra wraz z dużymi ilościami cytoplazmy niż normalnie. Rycina B przedstawiała obraz w skali szarości reprezentatywny dla jądrzastej komórki plazmatycznej w rozmazie szpiku kostnego.Rycina C pokazała cztery pomarańczowe i cztery zielone sygnały w jednym jądrze interfazowym komórki plazmatycznej, co sugeruje, że cztery kopie chromosomu 17 były zlokalizowane w jądrze. Rycina D wykazała, że nieprawidłowy kariogram chromosomowy tego pacjenta potwierdził dwie pary chromosomów 17 w jednym jądrze. Rozmazy szpiku kostnego są znacznie łatwiejsze do uzyskania niż próbki szpiku kostnego antykoagulant, ponieważ uzyskanie antykoagulowanego szpiku kostnego wymaga skomplikowanych procedur w celu uzyskania jądra.W związku z tym opracowaliśmy przekonującą metodę rozmazu szpiku kostnego FISH do wykrywania komórek szpiczaka mnogiego.

interphase-fluorescence-situ-hybridization-bone-marrow-smears

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film opisuje technikę pobierania szpiku kostnego z kręgosłupa biodrowego i przygotowania wymazu do biopsji. W tym przykładzie przeprowadzamy aspirację szpiku kostnego od pacjenta z ostrą białaczką szpikową (AML) i badamy komórki, aby sprawdzić, czy nie ma mierzalnej choroby resztkowej (MRD), ważnego biomarkera prognostycznego.

Aspiracja szpiku kostnego: metoda pozyskiwania szpiku kostnego w celu zbadania morfologii komórek

Złożone masy tkankowe, od organów po guzy, składają się z różnych elementów komórkowych. Wyjaśniliśmy udział fenotypów komórkowych w tkance przy użyciu wieloznakowanych fluorescencyjnych myszy transgenicznych w połączeniu z wieloparametrowym barwieniem immunofluorescencyjnym, a następnie rozmieszaniem widmowym w celu rozszyfrowania pochodzenia komórek, a także cech komórek na podstawie ekspresji białka.

Ilościowa analiza wielospektralna po przeszczepie tkanki fluorescencyjnej w celu wizualizacji pochodzenia, typów i interakcji komórek

Przedstawiono strategię ilościowej analizy danych histologicznych w szpiku kostnym. Mikroskopia konfokalna znakowanych fluorescencyjnie komórek w skrawkach tkanek daje 2-wymiarowe obrazy, które są automatycznie analizowane. Analizy kolokalizacyjne różnych typów komórek są porównywane z danymi z symulowanych obrazów, dostarczając ilościowych informacji o interakcjach komórkowych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja interakcji komórek krwiotwórczych – komórek zrębu w obrazach histologicznych kości nieodwapnionej

Opisujemy wysokoprzepustowy test wrażliwości na leki dla pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego. Polega ona na rekonstrukcji mikrośrodowiska szpiku kostnego (w tym macierzy zewnątrzkomórkowej i zrębu) na płytkach wielodołkowych oraz nieinwazyjnej metodzie podłużnego oznaczania żywotności komórek.

Organotypowy wysokoprzepustowy system do charakteryzowania wrażliwości pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego na leki

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej (IVFM) calvarium jest stosowana w połączeniu z genetycznymi modelami zwierzęcymi do badania naprowadzania i wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego (BM).

Połączenie przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej (IVFM) z modelami genetycznymi w celu zbadania dynamiki wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego

Niniejszy protokół opisuje przydatność wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) w identyfikacji stabilnych międzychromosomowych aberracji w komórkach szpiku kostnego myszy po ekspozycji na promieniowanie całego ciała.

Wykrywanie stabilnych aberracji międzychromosomowych za pomocą wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) u napromieniowanych myszy

Wykrywanie minimalnej lub mierzalnej choroby resztkowej (MRD) jest ważnym biomarkerem prognostycznym do udoskonalania oceny ryzyka i przewidywania nawrotu ostrej białaczki szpikowej (AML). Te kompleksowe wytyczne i zalecenia wraz z najlepszymi praktykami w zakresie spójnej i dokładnej identyfikacji i wykrywania MRD mogą pomóc w podejmowaniu skutecznych decyzji dotyczących leczenia AML.

Kompleksowy protokół pobierania i przetwarzania szpiku kostnego do pomiaru mierzalnej choroby resztkowej i białaczkowych komórek macierzystych w ostrej białaczce szpikowej

Tutaj opisujemy protokół barwienia immunohistochemicznego multipleksu fluorescencyjnego i obrazowania dla jednoczesnej lokalizacji wielu antygenów związanych z rakiem w chłoniaku. Protokół ten można rozszerzyć o analizę kolokalizacji biomarkerów we wszystkich sekcjach tkanki.

Multipleksowane fluorescencyjne barwienie immunohistochemiczne, obrazowanie i analiza w próbkach histologicznych chłoniaka

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego z mysich modeli zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Technika ta identyfikuje zmiany w niekrwiotwórczej niszy szpiku kostnego, w tym w komórkach śródbłonka i mezenchymalnych komórek zrębu, wraz z postępem choroby.

Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej

W tym miejscu opisano metodę opartą na cytometrii fosfoprzepływowej do analizy sygnalizacji za szlakami mTORC1, JAK / STAT5 i MAPK w ostrych ludzkich komórkach białaczki szpikowej ksenoprzeszczepowanych myszom i uzyskanych z aspiratów szpiku kostnego. Poziomy p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 i p-ERK1/2 są jednocześnie mierzone za pomocą spektralnego cytometru przepływowego nowej generacji o wysokiej czułości.

Wewnątrzkomórkowa cytometria fosfoflowa ostrej białaczki szpikowej Ksenotransplantacje pochodzące od pacjentów

Poznaj metodę FISH na rozmazach szpiku kostnego do wykrywania szpiczaka mnogiego. Technika ta poprawia identyfikację komórek plazmatycznych i zmniejsza koszty diagnostyczne w porównaniu do tradycyjnych metod.

Fluorescencja międzyfazowa in situ Hybrydyzacja rozmazów szpiku kostnego szpiczaka mnogiego

Przeglądaj więcej filmów