Name: Test oparty na mikroskopii do badania i analizy endosomów recyklingu przy użyciu transportu SNARE (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj metodę mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki endosomów recyklingu w melanocytach myszy przy użyciu markera GFP-STX13. Technika ta pozwala analizować biogenezę melanosomów i mechanizmy pigmentacji skóry.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Departament Biotechnologii (BT/PR32489/BRB/10/1786/2019 do SRGS); Rada ds. Badań Naukowych i Inżynieryjnych (CRG/2019/000281 do SRGS); DBT-NBACD (BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20 do SRGS) oraz program partnerski IISc-DBT (do SRGS). Infrastruktura w dziale była wspierana przez DST-FIST, DBT i UGC. AMB był wspierany przez DBT-JRF (DBT/2015/IISc/NJ-02).

Protokół obejmuje wysiewanie melanocytów, a następnie transfekcję plazmidów. Dalsze kroki obejmują utrwalanie, barwienie immunologiczne, obrazowanie i analizę komórek w celu zmierzenia długości i liczby RE. Szczegółowy opis protokołu znajduje się poniżej.
1. Wysiewanie mysich melanocytów na wstępnie przygotowanych szkiełkach nakrywkowych
<ol>
	<li>Szklane szkiełka nakrywkowe należy umieścić na szalce Petriego (tj. 4 - 5 sztuk w szalce o średnicy 35 mm) pożywką z matrycą błony podstawnej (1:20 w pełnej pożywce RPMI: RPMI + 10% inaktywowanego termicznie FBS + 1x Glutamina + 1x Mieszanka antybiotyków) i suszyć w kapturze do hodowli tkankowych przez 15 minut. Przed użyciem umyj szkiełka nakrywkowe raz 1x PBS.</li>
	<li>Utrzymuj melanocyty myszy typu dzikiego (melan-Ink4a-Arf-1 z myszy C57BL/6J, a/a, Ink4a-Arf-/-, opisane w20 i dostępne w The Welcome Trust Functional Genomics Cell Bank) na szalce Petriego (tj. szalce 35 lub 60 mm) uzupełnionej kompletną pożywką RPMI.
	<ol>
		<li>Umyj komórki dwukrotnie 1x PBS i dodaj 0,5 lub 1 ml roztworu Trypsyna-EDTA (0,25%) do trypsynizacji komórek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2-5 minut do momentu oderwania od płytki Petriego.</li>
		<li>Dodać 1 - 2 ml kompletnej pożywki RPMI, zawiesić, a następnie przenieść komórki do probówki wirówkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 4 °C, 376 x g przez 5 minut, a następnie ponownie zawiesić osad w 1x PBS.</li>
	<li>Powtórzyć etap wirowania i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pełnej pożywki RPMI.</li>
	<li>Wysiewaj komórki na średnio pokrytych szkiełkach nakrywkowych błony podstawnej przy 50-60% zbiegu (około 6 x 10,5 komórek na 35-milimetrowym naczyniu do hodowli komórkowej zawierającym 4 - 5 szkiełek nakrywkowych). Zawsze dodawać 200 nM PMA (dodać 5 μL zapasu roboczego, 40 μM 12-mirystynianu 13-octanu) do platerowanej zawiesiny komórek w pełnym pożywce RPMI.</li>
	<li>Po wysianiu inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 12-24 godzin.</li>
</ol>
2. Transfekcja komórek za pomocą plazmidów STX13
<ol>
	<li>Użyj następujących odczynników: pEGFP-C1-STX13WT i pEGFP-C1-STX13Δ129 (opisane w12). mCherry-Rab11, był miłym prezentem od Graça Raposo, Institut Curie, Paryż (opisanym w reference19). Przeciwciało anty-TYRP1 firmy ATCC (TA99).</li>
	<li>Po 12 - 24 godzinach wysiewu należy przetransfekować komórki plazmidami za pomocą odczynnika do transfekcji na bazie lipidów. W przypadku szalki o średnicy 35 mm należy pobrać 5 μl odczynnika do transfekcji w 250 μl pożywki OPTI-MEM w probówce mikrowirówki i pobrać około 200 ng każdego plazmidu w 250 μl OPTI-MEM.</li>
	<li>Inkubować probówki zawierające DNA i odczynnik do transfekcji przez 5 minut. Mieszać bez wielokrotnego pipetowania (całkowita objętość wyniesie około 500 μl). Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Wykonuj ręczne stukanie w rurkę co 10 minut przez 30 minut przy suchym toarze.</li>
	<li>Podczas inkubacji przemyć komórki dwukrotnie 1x PBS, raz OPTI-MEM, a następnie dodać 1 ml OPTI-MEM do komórek.</li>
	<li>Po 30 minutach inkubacji dodać do komórek mieszaninę odczynnika do transfekcji i DNA w sposób kroplowy, przykrywając naczynie.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 6 godzin. Odessać pożywkę OPTI-MEM za pomocą odczynnika do transfekcji i dodać pełną pożywkę RPMI uzupełnioną 200 nM PMA.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.</li>
</ol>
3. Utrwalenie komórek
UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana poza kapturem do hodowli tkankowej.
<ol>
	<li>Po 48 godzinach transfekcji przemyć komórki dwukrotnie 1x PBS, a następnie utrwalić komórki 3% formaldehydem (świeżo przygotowanym w 1x PBS) przez 30 min.</li>
	<li>Po utrwaleniu przemyj komórki dwukrotnie 1x PBS i przechowuj szkiełka nakrywkowe w 1x PBS do dalszego użycia. Alternatywnie ogniwa mogą być montowane na szkiełkach podstawowych (patrz poniżej) lub przechowywane w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Barwienie immunologiczne komórek
<ol>
	<li>Przygotuj wilgotną komorę: umieść wycięty kawałek folii parafinowej na wilgotnej bibule filtracyjnej na szalce Petriego, przykrytej folią aluminiową.</li>
	<li>Przygotuj 25 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (0,2% saponiny w 1x PBS, 0,1% BSA w 1x PBS i 0,02% azydku sodu w 1x PBS). Dodać przeciwciało w rozcieńczeniu 1:200. Dodaj ten roztwór jako kroplę na folię parafinową w wilgotnej komorze.</li>
	<li>Ostrożnie podnieś szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy, odwróć je na tej kropli roztworu barwiącego przeciwciała pierwotne, a następnie przykryj pokrywę wilgotnej komory. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Podobnie przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciała w rozcieńczeniu 1:500 i umieścić go na folii parafinowej obok szkiełka nakrywkowego w wilgotnej komorze. Aby zabarwić jądro, dodaj DAPI (1:20 000 do 1:30 000) do roztworu.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie podnieś szkiełko nakrywkowe z pierwotnego roztworu przeciwciała i zanurz je trzykrotnie w 1x PBS (w szklanej zlewce).</li>
	<li>Postukaj w szkiełko nakrywkowe na bibułce, aby usunąć nadmiar PBS z szkiełka nakrywkowego. Umieść go na wtórnym roztworze barwiącym przeciwciała w wilgotnej komorze i nie wystawiaj go na działanie światła ze względu na obecność fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał w roztworze.</li>
	<li>Ponownie inkubować szkiełko nakrywkowe przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zawsze zanotuj stronę szkiełka nakrywkowego, na której znajdują się komórki podczas tych kroków.</li>
	<li>Po inkubacji ostrożnie pobrać szkiełko nakrywkowe z roztworu przeciwciał drugorzędowych, a następnie zanurzyć je trzykrotnie w 1x PBS. Następnie postukaj w szkiełko nakrywkowe na bibułce, aby usunąć nadmiar PBS z szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Umieść 12 μl odczynnika montażowego Fluoromount-G na szkiełku podstawowym i ostrożnie umieść poplamione szkiełko nakrywkowe (skierowane w stronę szkła) na odczynniku montażowym. Odwróć szkiełko na bibułce, a następnie delikatnie dociśnij.</li>
</ol>
5. Mikroskopia fluorescencyjna komórek
<ol>
	<li>Zobrazuj wybarwione komórki pod filtrami jasnego pola (BF) i fluorescencji (IF) za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę CCD przy użyciu 60-krotnego (olejowego) obiektywu apochromatycznego lub dowolnego innego mikroskopu o podobnej konfiguracji.</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja nakładania się białek zlokalizowanych RE i melanosomów:
UWAGA: Następujące kroki są wykonywane w celu ilościowego określenia współczynnika nakładania się białek Mandera za pomocą oprogramowania Fiji (do pobrania za darmo z linku: https://imagej.net/software/fiji/). Obrazu TIFF można używać z wieloma kanałami.
<ol>
	<li>Otwórz obraz raw. Przejdź do opcji Obraz, wybierz Kolor | Podziel kanały i użyj dwóch kanałów do analizy.</li>
	<li>Otwórz wtyczkę JACoP w opcji Wtyczka.</li>
	<li>Ustaw próg dla obu kanałów w taki sposób, aby wszystkie jasne punkty były zaznaczone, a tło wyeliminowane.</li>
	<li>Przejdź do opcji Analiza, wybierz współczynniki M1 i M2, aby uzyskać współczynnik nakładania się Mandera.</li>
	<li>Naciśnij opcję Analizuj we wtyczce JACoP i zobacz wynik, który wyświetla współczynnik nakładania się Mandera.</li>
</ol>
7. Kwantyfikacja liczby i długości rurkowych endosomów recyklingu:
UWAGA: Następujące kroki są wykonywane w celu ilościowego określenia liczby i długości kanalików za pomocą oprogramowania Fidżi.
<ol>
	<li>Otwórz surowy obraz Przejdź do opcji Obraz, wybierz Kolor | Podziel kanały i użyj żądanego kanału do analizy.</li>
	<li>Ponownie przejdź do opcji Obraz, wybierz pozycję Typ | Konwertuj na obraz 8-bitowy.</li>
	<li>Następnie przejdź do Wtyczki, wybierz Analizuj | Rurkowość. Ustaw wartość sigma na 0,1075 . Naciśnij przycisk OK.</li>
	<li>Ponownie przejdź do opcji Obraz, wybierz pozycję Typ | Konwertuj na obraz 8-bitowy.</li>
	<li>Przejdź do obrazu | Dostosuj | Próg (Użyj tych samych wartości progowych dla wszystkich obrazów. Obrazy powinny mieć w przybliżeniu równą intensywność).</li>
	<li>Przejdź do punktu menu Proces | Binarny | Konwertuj na maskę.</li>
	<li>Przejdź do pozycji Proces, wybierz pozycję Binarny, a następnie wybierz pozycję Szkieletuj.</li>
	<li>Przejdź do pozycji Analizuj, wybierz pozycję Szkielet i wybierz pozycję Analizuj szkielet. W wyniku i na wyjściu | wybierz (a) Oblicz największą najkrótszą drogę | (b) pokaż szczegółowe informacje | (c) wyświetl oznaczony szkielet. Naciśnij przycisk Ok. 
	UWAGA: Wynik otworzy się w formacie tabelarycznym. Kolumna Średnia długość gałęzi pokazuje długość wszystkich różnych kanalików w wybranej komórce (ustaw skalę do uzyskiwania wartości w mikrometrach).</li>
	<li>Aby uzyskać liczbę kanalików w komórce, przejdź do Analizuj i wybierz opcję Analizuj cząstki. Naciśnij przycisk Ok. 
	UWAGA: W uzyskanych wynikach kolumna liczba pokazuje liczbę kanalików w tej konkretnej komórce.</li>
	<li>Zapisz dane i przeanalizuj.</li>
</ol>

<ol><li>Dell'Angelica, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+building+BLOC%28k%29s+of+lysosomes+and+related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The building BLOC(k)s of lysosomes and related organelles.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (4), 458-464 (2004).</li>
<li>Raposo, G., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanosomes--dark+organelles+enlighten+endosomal+membrane+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Melanosomes--dark organelles enlighten endosomal membrane transport.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (10), 786-797 (2007).</li>
<li>Ohbayashi, N., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+understanding+the+molecular+basis+of+melanogenesis+in+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Recent advances in understanding the molecular basis of melanogenesis in melanocytes.</a> F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-608 (2020).</li>
<li>Theos, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+adaptor+protein+%28AP%29-3+and+AP-1+in+tyrosinase+sorting+from+endosomes+to+melanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Functions of adaptor protein (AP)-3 and AP-1 in tyrosinase sorting from endosomes to melanosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (11), 5356-5372 (2005).</li>
<li>Di Pietro, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLOC-1+interacts+with+BLOC-2+and+the+AP-3+complex+to+facilitate+protein+trafficking+on+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">BLOC-1 interacts with BLOC-2 and the AP-3 complex to facilitate protein trafficking on endosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (9), 4027-4038 (2006).</li>
<li>Setty, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLOC-1+is+required+for+cargo-specific+sorting+from+vacuolar+early+endosomes+toward+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">BLOC-1 is required for cargo-specific sorting from vacuolar early endosomes toward lysosome-related organelles.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (3), 768-780 (2007).</li>
<li>Delevoye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AP-1+and+KIF13A+coordinate+endosomal+sorting+and+positioning+during+melanosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">AP-1 and KIF13A coordinate endosomal sorting and positioning during melanosome biogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 187 (2), 247-264 (2009).</li>
<li>Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Burek, C. L., Di Pietro, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLOC-2%2C+AP-3%2C+and+AP-1+proteins+function+in+concert+with+Rab38+and+Rab32+proteins+to+mediate+protein+trafficking+to+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">BLOC-2, AP-3, and AP-1 proteins function in concert with Rab38 and Rab32 proteins to mediate protein trafficking to lysosome-related organelles.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19550-19563 (2012).</li>
<li>Sitaram, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recognition+of+a+dileucine-based+sorting+signal+by+AP-1+and+AP-3+reveals+a+requirement+for+both+BLOC-1+and+AP-3+in+delivery+of+OCA2+to+melanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential recognition of a dileucine-based sorting signal by AP-1 and AP-3 reveals a requirement for both BLOC-1 and AP-3 in delivery of OCA2 to melanosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3178-3192 (2012).</li>
<li>Nag, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab4A+organizes+endosomal+domains+for+sorting+cargo+to+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Rab4A organizes endosomal domains for sorting cargo to lysosome-related organelles.</a> Journal of Cell Science. 131 (18), (2018).</li>
<li>Dennis, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLOC-2+targets+recycling+endosomal+tubules+to+melanosomes+for+cargo+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">BLOC-2 targets recycling endosomal tubules to melanosomes for cargo delivery.</a> Journal of Cell Biology. 209 (4), 563-577 (2015).</li>
<li>Jani, R. A., Purushothaman, L. K., Rani, S., Bergam, P., Setty, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STX13+regulates+cargo+delivery+from+recycling+endosomes+during+melanosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">STX13 regulates cargo delivery from recycling endosomes during melanosome biogenesis.</a> Journal Cell Science. 128 (17), 3263-3276 (2015).</li>
<li>Shakya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab22A+recruits+BLOC-1+and+BLOC-2+to+promote+the+biogenesis+of+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Rab22A recruits BLOC-1 and BLOC-2 to promote the biogenesis of recycling endosomes.</a> EMBO Reports. 19 (12), 45918(2018).</li>
<li>Bowman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BLOC-1-AP-3+super-complex+sorts+a+cis-SNARE+complex+into+endosome-derived+tubular+transport+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A BLOC-1-AP-3 super-complex sorts a cis-SNARE complex into endosome-derived tubular transport carriers.</a> Journal of Cell Biology. 220 (7), 202005173(2021).</li>
<li>Wei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hermansky-Pudlak+syndrome%3A+a+disease+of+protein+trafficking+and+organelle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hermansky-Pudlak syndrome: a disease of protein trafficking and organelle function.</a> Pigment Cell Research. 19 (1), 19-42 (2006).</li>
<li>Bowman, S. L., Bi-Karchin, J., Le, L., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+to+lysosome-related+organelles%3A+Insights+from+Hermansky-Pudlak+syndrome+and+other+rare+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The road to lysosome-related organelles: Insights from Hermansky-Pudlak syndrome and other rare diseases.</a> Traffic. 20 (6), 404-435 (2019).</li>
<li>Prekeris, R., Klumperman, J., Chen, Y. A., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin+13+mediates+cycling+of+plasma+membrane+proteins+via+tubulovesicular+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Syntaxin 13 mediates cycling of plasma membrane proteins via tubulovesicular recycling endosomes.</a> Journal of Cell Biology. 143 (4), 957-971 (1998).</li>
<li>Mahanty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab9A+is+required+for+delivery+of+cargo+from+recycling+endosomes+to+melanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Rab9A is required for delivery of cargo from recycling endosomes to melanosomes.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 29 (1), 43-59 (2016).</li>
<li>Delevoye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recycling+endosome+tubule+morphogenesis+from+sorting+endosomes+requires+the+kinesin+motor+KIF13A%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Recycling endosome tubule morphogenesis from sorting endosomes requires the kinesin motor KIF13A.</a> Cell Reports. 6 (3), 445-454 (2014).</li>
<li>Ha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF+functions+as+a+melanoma+tumor+suppressor+by+inducing+p53-independent+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">ARF functions as a melanoma tumor suppressor by inducing p53-independent senescence.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (26), 10968-10973 (2007).</li>
<li>Soldati, T., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Powering+membrane+traffic+in+endocytosis+and+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Powering membrane traffic in endocytosis and recycling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (12), 897-908 (2006).</li>
<li>Grant, B. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+and+mechanisms+of+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways and mechanisms of endocytic recycling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).</li>
<li>Hsu, V. W., Prekeris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+at+the+recycling+endosome%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Transport at the recycling endosome.</a> Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 528-534 (2010).</li>
<li>Taguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of recycling endosomes.</a> Journal of Biochemistry. 153 (6), 505-510 (2013).</li>
<li>Goldenring, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recycling endosomes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 117-122 (2015).</li>
<li>Delevoye, C., Marks, M. S., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-related+organelles+as+functional+adaptations+of+the+endolysosomal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lysosome-related organelles as functional adaptations of the endolysosomal system.</a> Current Opinion in Cell Biology. 59, 147-158 (2019).</li>
<li>Hsu, V. W., Bai, M., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+active%3A+protein+sorting+in+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting active: protein sorting in endocytic recycling.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 13 (5), 323-328 (2012).</li>
<li>Desfougeres, Y., D'Agostino, M., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+tethering+complex+for+endosomal+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A modular tethering complex for endosomal recycling.</a> Nature Cell Biology. 17 (5), 540-541 (2015).</li>
<li>Le, L., Sires-Campos, J., Raposo, G., Delevoye, C., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanosome+biogenesis+in+the+pigmentation+of+mammalian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Integrated+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Melanosome biogenesis in the pigmentation of mammalian skin.</a> Integrated Computational Biology. 61 (4), 1517-1545 (2021).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Endosomy recyklingowe są kohortą organelli endocytarnych i pośredniczą w recyklingu ładunku na powierzchnię komórki we wszystkich typach komórek 21,22,23,24,25. W wyspecjalizowanych typach komórek, takich jak melanocyty, organelle te częściowo przekierowują swoją trasę transportu w kierunku melanosomów w celu ich biogenezy <s...

Biosynteza barwników melaniny zachodzi w melanosomach, specyficznych dla melanocytów organellach związanych z lizosomami (LRO), które współistnieją z konwencjonalnymi lizosomami. Układ endocytarny odgrywa kluczową rolę w biogenezie melanosomów, niezbędnej do zmiany koloru skóry i fotoochrony przed promieniowaniem jonizującym1,2,3. Podczas tego procesu enzymy syntetyzujące melaninę są sortowane na endosomy wczesne/sortujące, a następnie transportowane do przedwczesnych melanosomów przez endosomy kanalikowe lub pęcherzykowe zwane endosomami recyklingowymi (RE)4,5,6,7,8,9,10. Ukierunkowanie i fuzja tych organelli regulują dojrzewanie w pełni funkcjonalnych pigmentowanych melanosomów7,11,12,13,14. Wady w tworzeniu tych organelli lub sortowaniu ładunków do tych organelli powodują albinizm oczno-skórny i inne fenotypy kliniczne, obserwowane w zespole Hermansky'ego-Pudlaka15,16.
Tutaj opisujemy prostą technikę opartą na mikroskopii do badania i analizy RE. W tej metodzie wykorzystaliśmy białko transbłonowe, składnię Qa-SNARE (STX)13, które znajduje się w recyklingu endosomów17 i przełącza się między sortowaniem endosomów i melanosomów w melanocytach12,18. Co więcej, usunięcie N-końcowej nieustrukturyzowanej domeny regulatorowej (a mianowicie SynN lub STX13Δ129) pozwala SNARE utknąć w melanosomach, które mierzą szlak transportu do przodu w kierunku melanosomu12. W naszych badaniach użyliśmy znanego markera endosomalnego recyklingu Rab GTPase (Rab)11 w naszych badaniach14,19. Obrazowanie fluorescencyjne białek GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 i TYRP1 w melanocytach typu dzikiego, a następnie kwantyfikacja ich względnej lokalizacji, zapewni charakter i dynamikę RE oprócz ich ukierunkowania na melanosomy. Jest to zatem prosta technika, którą można wykorzystać do wizualizacji i pomiaru dynamiki RE w melanocytach.

przeciwciało <table><tbody><tr><td>anty-TYRP1 (TA99)ATCC</td><td></td> <td>HB-8704</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668-500</td><td></td></tr><tr><td>Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>022600-050</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12- 13-octan mirystynianu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31800-022</td><td></td></tr></tbody></table>

test oparty na mikroskopii do badania i analizy endosomów recyklingu przy użyciu transportu snare

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

Endosomy recyklingowe (RE) to organelle rurkowo-pęcherzykowe generowane z wczesnych/sortujących endosomów we wszystkich typach komórek. Organelle te odgrywają kluczową rolę w biogenezie melanosomów, organelli związanych z lizosomami wytwarzanych przez melanocyty. RE dostarczają ładunek specyficzny dla melanocytów do przedwczesnych melanosomów podczas ich powstawania. Blokada w wytwarzaniu RE, obserwowana u kilku mutantów zespołu Hermansky'ego-Pudlaka, powoduje hipopigmentację skóry, włosów i oczu. Dlatego badanie dynamiki (odnosi się do liczby i długości) RE jest przydatne do zrozumienia funkcji tych organelli w warunkach normalnych i chorobowych. W tym badaniu staramy się zmierzyć dynamikę RE za pomocą rezydentnego SNARE STX13.

Ilościowe określenie lokalizacji mutantu STX13Δ129 w melanosomach 
Mikroskopia immunofluorescencyjna STX13 w melanocytach myszy typu dzikiego wykazała, że GFP-STX13WT lokalizuje się w postaci struktur pęcherzykowych i cewkowatych, natomiast GFP-STX13Δ129 lokalizuje się w postaci struktur pierścieniowatych oraz na powierzchni komórki (Rycina 1A). Ponadto wewnątrzkomórkowy, pierścieniowaty GFP-STX13Δ129...

Endosomy recyklingowe są częścią endosomalnej sieci kanalikowej. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania dynamiki recyklingu endosomów przy użyciu GFP-STX13 jako markera organelli.

Test oparty na mikroskopii do badania i analizy endosomów recyklingu przy użyciu transportu SNARE

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

Test oparty na mikroskopii do badania i analizy endosomów recyklingu za pomocą transportu SNARE. Są to melanocyty skóry. Czarne organelle, które widzisz wewnątrz komórek, nazywane są melanosomami.Melanosomy są znane jako klasa organelli zwanych organellami związanymi z lizozomem lub LRO. Endosomy recyklingowe to rurkowate organelle pęcherzykowe pochodzące z endosomów wczesnych lub sortujących we wszystkich typach komórek. Organelle te odgrywają kluczową rolę w biogenezie melanosomów, organelli związanych z lizozomem wytwarzanych przez melanocyty.Endosomy recyklingowe dostarczają ładunek specyficzny dla melanocytów do przedwczesnych melanosomów podczas ich powstawania. Wytwarzanie endosomów recyklingowych obserwowane w kilku zespołach to komórki w przebarwieniach skóry, włosów i oczu. Dlatego badanie dynamiki recyklingu endosomów jest przydatne do zrozumienia funkcji tych organelli w warunkach normalnych i chorobowych.Badanie to ma na celu zmierzenie dynamiki endosomów recyklingowych przy użyciu zatrzymującej składni-13 SNARE. Pierwszym krokiem jest wysiew mysich melanocytów na wstępnie obrobionych szkiełkach nakrywkowych. Pokryj szklane szkiełka nakrywkowe na szalce Petriego w podłożu z matrycą błony podstawnej.I suszyć w kapturze do hodowli tkankowych przez 15 minut. Przed użyciem umyj szkiełka nakrywkowe raz za pomocą 1X PBS. Wysiewaj komórki na podłożach pokrytych szkiełkami nakrywkowymi z membraną podstawną przy 50 do 60% kompetencji.Zawsze dodawaj 200 nanomolowców PMA do platerowanej zawiesiny komórek w kompletnych pożywkach RPMI. Po wysianiu komórek inkubować naczynie zawierające komórki w inkubatorze CO2 przez 12 do 24 godzin. Drugim krokiem jest transfekcja komórek plazmidami syntaksyny-13.Inkubować końcówki zawierające DNA i odczynnik do transfekcji, mieszać przez pięć minut i mieszać bez wielokrotnego pipetowania. Stukaj w rurkę ręką co dziesięć minut przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji przemyć komórki dwukrotnie 1X PBS, raz OPTI-MEM, a następnie dodać 1 mil OPTI-MEM do komórek.Po 30 minutach inkubacji dodaj do komórek mieszaninę odczynnika do transfekcji DNA w sposób kroplowy, przykrywając naczynie. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin. Odessać pożywkę OPTI-MEM za pomocą odczynnika do transfekcji i dodać pełną pożywkę RPMI uzupełnioną 200 nanomolami PMA.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Trzecim krokiem jest utrwalenie komórek. Należy pamiętać, że poniższa procedura jest wykonywana na zewnątrz kaptura do hodowli tkankowej.Po 48 godzinach od transfekcji umyj komórki dwukrotnie 1X PBS, a następnie utrwal komórki 3% formaldehydem przez 30 minut. Po utrwaleniu przemyj komórki dwukrotnie 1X PBS i przechowuj szkiełka nakrywkowe w 1X PBS do dalszego użycia. Alternatywnie ogniwa mogą być montowane na szklanych płytkach lub przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Czwartym krokiem jest barwienie immunologiczne komórek. Przygotuj wilgotną komorę. Umieść wycięty kawałek parafilmu na mysiej bibule filtracyjnej na szalce Petriego.Przykryj folią aluminiową. Przygotuj 25 mikrolitrów roztworu przeciwciał pierwszorzędowych. Dodać przeciwciało w rozcieńczeniu od 1 do 200.Dodaj ten roztwór jako kroplę na parafilm w wilgotnej komorze. Ostrożnie podnieś szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy. Odwróć go na kropli roztworu barwiącego przeciwciała pierwotne, a następnie przykryj pokrywę wilgotnej komory.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Podobnie, należy przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciała w rozcieńczeniu od 1 do 500 i umieścić go na parafilmie obok szkiełka nakrywkowego w wilgotnej komorze. W celu barwienia jądra dodać DAPI w rozcieńczeniu od 120 000 do 130 000 do roztworu.Za pomocą kleszczy ostrożnie podnieś szkiełko nakrywkowe z pierwotnego roztworu przeciwciała i zanurz je dwukrotnie w 1X PBS. Postukaj w szkiełko nakrywkowe na bibułce, aby usunąć nadmiar PBS z szkiełka nakrywkowego. Umieść go na wtórnym roztworze barwiącym przeciwciała w wilgotnej komorze i nie wystawiaj go na działanie światła, ze względu na obecność w roztworze przeciwciał barwionych fluorescencyjnie.Po inkubacji ostrożnie pobrać szkiełko nakrywkowe z roztworu przeciwciał drugorzędowych, a następnie zanurzyć je dwukrotnie w 1X PBS. Następnie postukaj w szkiełko nakrywkowe na bibułce, aby usunąć nadmiar PBS z szkiełka nakrywkowego. Umieść 12 mikrolitrów odczynnika do obrazowania na szkiełku podstawowym i ostrożnie umieść poplamione szkiełko nakrywkowe na odczynniku montażowym.Odwróć szkiełko na bibułce, a następnie delikatnie dociśnij. Następnie zobrazuj szkiełko nakrywkowe za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i przeanalizuj obrazy za pomocą ImageJ. Szóstym krokiem jest kwantyfikacja nakładania się na siebie białek zlokalizowanych w recyklingu endosomu i melanosomów.Kwantyfikacja kolokalizacji syntaksyny-13 delta-129 z melanosomami. Mikroskopia immunofluorescencyjna syntaksyny-13 w mysich melanocytach typu dzikiego wykazała GFP-syntaksynę-13 typu dzikiego zlokalizowaną jako struktury pęcherzykowe i kanalikowate. A GFP-syntaksyna-13 delta-129 lokalizuje struktury przypominające pierścienie oprócz powierzchni komórki.Co więcej, wewnątrzkomórkowa, przypominająca pierścień GFP-syntaksyna-13 delta-129 wykazywała kolokalizację z białkiem melanosomu TYRP1 w jasnych melanosomach obrazowanych w polu. Jak wykazano wcześniej, w melanosomach obserwuje się kohortę nadekspresji GFP-syntaksyny-13 typu dzikiego. Aby zmierzyć względną lokalizację GFP-syntaksyny-13 typu dzikiego i GFP-syntaksyny-13 delta-129 do melanosomów, użyto oprogramowania Fidżi i przeprowadzono analizę za pomocą wtyczki JACOP.Zmierzony współczynnik nakładania się Mandera, czyli MOC, między GFP-syntaksyną-13 delta-129 a TYRP1 jest około 1,5 raza wyższy w porównaniu z GFP-syntaksyną-13 typu dzikiego z TYRP1. Co ciekawe, TYRP1 wykazał 2,9 razy wyższe wartości MOC z GFP-syntaksyną-13 delta-129 w porównaniu z GFP-syntaksyną-13 typu dzikiego. Dane te wskazują, że lokalizacja melanosomów GFP-syntaksyny-13 delta-129 jest stosunkowo wyższa w porównaniu z dzikim typem GFP-syntaksyny-13 w stanie ustalonym.Kwantyfikacja lokalizacji typu dzikiego syntaksyny-13 endosomów recyklingu. Mikroskopia immunofluorescencyjna GFP-syntaksyny-13 typu dzikiego wykazała kolokalizację ze znanym recyklingiem białka endosomalnego Rab11. MOC między typem dzikim GFP-syntaksyna-13 a mCherry-Rab11 jest około 1,4 razy wyższa w porównaniu do mCherry-Rab11 z typem dzikim GFP-syntaksyna-13.Do zmierzenia liczby i długości kanalików endosomalnych typu dzikiego GFP-syntaksyna-13 wykorzystano oprogramowanie Fidżi, jak opisano w sekcji protokołu. mCherry-Rab11 stosuje się jako kontrolę pozytywną w eksperymentach. Melanocyty transfekowane GFP-syntaksyną-13 typu dzikiego wykazywały większą liczbę kanalików na komórkę w porównaniu z komórkami wykazującymi ekspresję mCherry-Rab11.Jednak kanaliki ulegają redukcji po koekspresji zarówno GFP-syntaksyny-13 typu dzikiego, jak i mCherry-Rab11 w komórkach. Siódmym krokiem jest kwantyfikacja liczby i długości rurkowych endosomów recyklingu. Kanaliki ulegają redukcji po koekspresji zarówno GFP-syntaksyny-13 typu dzikiego, jak i mCherry-Rab11 w komórkach.Co ciekawe, średnia długość kanalików zarówno z GFP-syntaksyny-13 typu dzikiego, jak i mCherry-Rab11 jest porównywalna ze sobą w komórkach wykazujących ekspresję pojedynczo lub razem. Łącznie dane te sugerują, że GFP-syntaksyna-13 typu dzikiego lokalizuje się w endosomy recyklingu podobnie jak Rab11. Badanie to wykazało, że N-końcowe dostarczanie mutanta syntaksyny-13, czyli GFP-syntaksyna-13 delta-129, lokalizuje się w melanosomach GFP-syntaksyna-13 delta-129 może być prawdopodobnie wykorzystana jako reporter do transportu pęcherzykowego z recyklingu endosomów na powierzchnię komórki i LRO.W przeciwieństwie do tego, GFP-syntaksyna-13 typ dziki lokalizuje się w recyklingu endosomów podobnie jak Rab11. Badanie to wykazało, że GFP-syntaksyna-13 typu dzikiego może być również stosowana do oznaczania endosomów recyklingowych w melanocytach. GFP-syntaksyna-13 typu dzikiego może być lepszym markerem endosomalnym recyklingu niż Rab11, ponieważ Rab11 zmienia dynamikę endosomalną.Ogólnie rzecz biorąc, GFP-syntaksyna-13 typu dzikiego działa jako potencjalny marker endosomalny recyklingu do badania dynamiki w warunkach stanu ustalonego.

the-microscopy-based-assay-to-study-analyze-recycling-endosomes-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opracowaliśmy test fuzji komórek, który pozwala na ilościowe określenie zdarzeń fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE poprzez aktywowaną ekspresję β-galaktozydazy.

Analiza fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE z wykorzystaniem enzymatycznego testu fuzji komórek

Transportowanie błony polega na transporcie białek z błony plazmatycznej do wnętrza komórki (np. endocytoza), a następnie transporcie do lizosomów w celu degradacji lub do błony plazmatycznej w celu recyklingu. Metody opisane w tym artykule mają na celu badanie endocytozy i recyklingu białek błony komórkowej.

Komórkowe testy ochrony L-glutationu do badania endocytozy i recyklingu białek błony komórkowej

Ruch receptorów moduluje sygnalizację i reakcję komórki na ligandy i sam reaguje na warunki komórkowe, w tym sygnalizację indukowaną przez ligand. W tym miejscu opisujemy potężną i elastyczną technikę ilościowej oceny transportu receptorów indukowanego przez lek za pomocą znakowania immunologicznego i analizy kolokalizacyjnej.

Śledzenie zmian wywołanych przez leki w transporcie receptorów po internalizacji za pomocą analizy kolokalizacyjnej

Badanie transportu błonowego jest kluczowe dla zrozumienia funkcji neuronalnych. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków w neuronach. Jest to wygodna metoda, którą można dostosować do ilościowego oznaczania transportu błonowego w układzie nerwowym.

Kwantyfikacja ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych

Endocytoza pęcherzyków synaptycznych jest wykrywana za pomocą mikroskopii świetlnej pHluoryny połączonej z białkiem pęcherzyków synaptycznych oraz za pomocą mikroskopii elektronowej wychwytu pęcherzyków.

Pomiar endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa

Ten protokół opisuje nową metodę pozwalającą na ilościową wizualizację złożonego tworzenia białek SNARE, opartą na transferze energii rezonansu Förstera i mikroskopii obrazowania życia fluorescencji.

Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Opisujemy optyczny test do recyklingu pęcherzyków synaptycznych (SV) w hodowanych neuronach. Połączenie tego protokołu z podwójną transfekcją w celu ekspresji markera presynaptycznego i białka będącego przedmiotem zainteresowania pozwala nam zlokalizować miejsca presynaptyczne, ich zdolność do recyklingu pęcherzyków synaptycznych i określić rolę białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Test optyczny do recyklingu pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach z nadekspresją białek presynaptycznych

Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Pobudliwość neuronów może być modulowana poprzez dynamiczny proces endo- i egzocytozy pobudzających jonotropowych receptorów glutaminianu. Opisany tutaj jest dostępny test o wysokiej zawartości do ilościowego określania puli populacji receptorów powierzchniowych i wewnętrznych.

Test o wysokiej zawartości do monitorowania transportu receptora AMPA

Endocytowy i retrogradacyjny transport białek z błony plazmatycznej do sieci trans-Golgiego jest niezbędny do utrzymania homeostazy błony i regulacji sygnalizacji. Tutaj opisujemy metodę obrazowania i ilościowego transportu endocytarnego białek transbłonowych za pomocą mikroskopii komórek żywych, wykorzystując deriwatyzowane nanociała anty-GFP w komórkach HeLa.

Obrazowanie transportu endocytarnego na żywych komórkach z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach

Poznaj metodę mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki endosomów recyklingu w melanocytach myszy przy użyciu markera GFP-STX13. Technika ta pozwala analizować biogenezę melanosomów i mechanizmy pigmentacji skóry.

Test oparty na mikroskopii do badania i analizy endosomów recyklingu przy użyciu transportu SNARE

Przeglądaj więcej filmów