Test oparty na mikroskopii do badania i analizy endosomów recyklingu przy użyciu transportu SNARE

Test oparty na mikroskopii do badania i analizy endosomów recyklingu za pomocą transportu SNARE. Są to melanocyty skóry. Czarne organelle, które widzisz wewnątrz komórek, nazywane są melanosomami.

Melanosomy są znane jako klasa organelli zwanych organellami związanymi z lizozomem lub LRO. Endosomy recyklingowe to rurkowate organelle pęcherzykowe pochodzące z endosomów wczesnych lub sortujących we wszystkich typach komórek. Organelle te odgrywają kluczową rolę w biogenezie melanosomów, organelli związanych z lizozomem wytwarzanych przez melanocyty.

Endosomy recyklingowe dostarczają ładunek specyficzny dla melanocytów do przedwczesnych melanosomów podczas ich powstawania. Wytwarzanie endosomów recyklingowych obserwowane w kilku zespołach to komórki w przebarwieniach skóry, włosów i oczu. Dlatego badanie dynamiki recyklingu endosomów jest przydatne do zrozumienia funkcji tych organelli w warunkach normalnych i chorobowych.

Badanie to ma na celu zmierzenie dynamiki endosomów recyklingowych przy użyciu zatrzymującej składni-13 SNARE. Pierwszym krokiem jest wysiew mysich melanocytów na wstępnie obrobionych szkiełkach nakrywkowych. Pokryj szklane szkiełka nakrywkowe na szalce Petriego w podłożu z matrycą błony podstawnej.

I suszyć w kapturze do hodowli tkankowych przez 15 minut. Przed użyciem umyj szkiełka nakrywkowe raz za pomocą 1X PBS. Wysiewaj komórki na podłożach pokrytych szkiełkami nakrywkowymi z membraną podstawną przy 50 do 60% kompetencji.

Zawsze dodawaj 200 nanomolowców PMA do platerowanej zawiesiny komórek w kompletnych pożywkach RPMI. Po wysianiu komórek inkubować naczynie zawierające komórki w inkubatorze CO2 przez 12 do 24 godzin. Drugim krokiem jest transfekcja komórek plazmidami syntaksyny-13.

Inkubować końcówki zawierające DNA i odczynnik do transfekcji, mieszać przez pięć minut i mieszać bez wielokrotnego pipetowania. Stukaj w rurkę ręką co dziesięć minut przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji przemyć komórki dwukrotnie 1X PBS, raz OPTI-MEM, a następnie dodać 1 mil OPTI-MEM do komórek.

Po 30 minutach inkubacji dodaj do komórek mieszaninę odczynnika do transfekcji DNA w sposób kroplowy, przykrywając naczynie. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin. Odessać pożywkę OPTI-MEM za pomocą odczynnika do transfekcji i dodać pełną pożywkę RPMI uzupełnioną 200 nanomolami PMA.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Trzecim krokiem jest utrwalenie komórek. Należy pamiętać, że poniższa procedura jest wykonywana na zewnątrz kaptura do hodowli tkankowej.

Po 48 godzinach od transfekcji umyj komórki dwukrotnie 1X PBS, a następnie utrwal komórki 3% formaldehydem przez 30 minut. Po utrwaleniu przemyj komórki dwukrotnie 1X PBS i przechowuj szkiełka nakrywkowe w 1X PBS do dalszego użycia. Alternatywnie ogniwa mogą być montowane na szklanych płytkach lub przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Czwartym krokiem jest barwienie immunologiczne komórek. Przygotuj wilgotną komorę. Umieść wycięty kawałek parafilmu na mysiej bibule filtracyjnej na szalce Petriego.

Przykryj folią aluminiową. Przygotuj 25 mikrolitrów roztworu przeciwciał pierwszorzędowych. Dodać przeciwciało w rozcieńczeniu od 1 do 200.

Dodaj ten roztwór jako kroplę na parafilm w wilgotnej komorze. Ostrożnie podnieś szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy. Odwróć go na kropli roztworu barwiącego przeciwciała pierwotne, a następnie przykryj pokrywę wilgotnej komory.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Podobnie, należy przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciała w rozcieńczeniu od 1 do 500 i umieścić go na parafilmie obok szkiełka nakrywkowego w wilgotnej komorze. W celu barwienia jądra dodać DAPI w rozcieńczeniu od 120 000 do 130 000 do roztworu.

Za pomocą kleszczy ostrożnie podnieś szkiełko nakrywkowe z pierwotnego roztworu przeciwciała i zanurz je dwukrotnie w 1X PBS. Postukaj w szkiełko nakrywkowe na bibułce, aby usunąć nadmiar PBS z szkiełka nakrywkowego. Umieść go na wtórnym roztworze barwiącym przeciwciała w wilgotnej komorze i nie wystawiaj go na działanie światła, ze względu na obecność w roztworze przeciwciał barwionych fluorescencyjnie.

Po inkubacji ostrożnie pobrać szkiełko nakrywkowe z roztworu przeciwciał drugorzędowych, a następnie zanurzyć je dwukrotnie w 1X PBS. Następnie postukaj w szkiełko nakrywkowe na bibułce, aby usunąć nadmiar PBS z szkiełka nakrywkowego. Umieść 12 mikrolitrów odczynnika do obrazowania na szkiełku podstawowym i ostrożnie umieść poplamione szkiełko nakrywkowe na odczynniku montażowym.

Odwróć szkiełko na bibułce, a następnie delikatnie dociśnij. Następnie zobrazuj szkiełko nakrywkowe za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i przeanalizuj obrazy za pomocą ImageJ. Szóstym krokiem jest kwantyfikacja nakładania się na siebie białek zlokalizowanych w recyklingu endosomu i melanosomów.

Kwantyfikacja kolokalizacji syntaksyny-13 delta-129 z melanosomami. Mikroskopia immunofluorescencyjna syntaksyny-13 w mysich melanocytach typu dzikiego wykazała GFP-syntaksynę-13 typu dzikiego zlokalizowaną jako struktury pęcherzykowe i kanalikowate. A GFP-syntaksyna-13 delta-129 lokalizuje struktury przypominające pierścienie oprócz powierzchni komórki.

Co więcej, wewnątrzkomórkowa, przypominająca pierścień GFP-syntaksyna-13 delta-129 wykazywała kolokalizację z białkiem melanosomu TYRP1 w jasnych melanosomach obrazowanych w polu. Jak wykazano wcześniej, w melanosomach obserwuje się kohortę nadekspresji GFP-syntaksyny-13 typu dzikiego. Aby zmierzyć względną lokalizację GFP-syntaksyny-13 typu dzikiego i GFP-syntaksyny-13 delta-129 do melanosomów, użyto oprogramowania Fidżi i przeprowadzono analizę za pomocą wtyczki JACOP.

Zmierzony współczynnik nakładania się Mandera, czyli MOC, między GFP-syntaksyną-13 delta-129 a TYRP1 jest około 1,5 raza wyższy w porównaniu z GFP-syntaksyną-13 typu dzikiego z TYRP1. Co ciekawe, TYRP1 wykazał 2,9 razy wyższe wartości MOC z GFP-syntaksyną-13 delta-129 w porównaniu z GFP-syntaksyną-13 typu dzikiego. Dane te wskazują, że lokalizacja melanosomów GFP-syntaksyny-13 delta-129 jest stosunkowo wyższa w porównaniu z dzikim typem GFP-syntaksyny-13 w stanie ustalonym.

Kwantyfikacja lokalizacji typu dzikiego syntaksyny-13 endosomów recyklingu. Mikroskopia immunofluorescencyjna GFP-syntaksyny-13 typu dzikiego wykazała kolokalizację ze znanym recyklingiem białka endosomalnego Rab11. MOC między typem dzikim GFP-syntaksyna-13 a mCherry-Rab11 jest około 1,4 razy wyższa w porównaniu do mCherry-Rab11 z typem dzikim GFP-syntaksyna-13.

Do zmierzenia liczby i długości kanalików endosomalnych typu dzikiego GFP-syntaksyna-13 wykorzystano oprogramowanie Fidżi, jak opisano w sekcji protokołu. mCherry-Rab11 stosuje się jako kontrolę pozytywną w eksperymentach. Melanocyty transfekowane GFP-syntaksyną-13 typu dzikiego wykazywały większą liczbę kanalików na komórkę w porównaniu z komórkami wykazującymi ekspresję mCherry-Rab11.

Jednak kanaliki ulegają redukcji po koekspresji zarówno GFP-syntaksyny-13 typu dzikiego, jak i mCherry-Rab11 w komórkach. Siódmym krokiem jest kwantyfikacja liczby i długości rurkowych endosomów recyklingu. Kanaliki ulegają redukcji po koekspresji zarówno GFP-syntaksyny-13 typu dzikiego, jak i mCherry-Rab11 w komórkach.

Co ciekawe, średnia długość kanalików zarówno z GFP-syntaksyny-13 typu dzikiego, jak i mCherry-Rab11 jest porównywalna ze sobą w komórkach wykazujących ekspresję pojedynczo lub razem. Łącznie dane te sugerują, że GFP-syntaksyna-13 typu dzikiego lokalizuje się w endosomy recyklingu podobnie jak Rab11. Badanie to wykazało, że N-końcowe dostarczanie mutanta syntaksyny-13, czyli GFP-syntaksyna-13 delta-129, lokalizuje się w melanosomach GFP-syntaksyna-13 delta-129 może być prawdopodobnie wykorzystana jako reporter do transportu pęcherzykowego z recyklingu endosomów na powierzchnię komórki i LRO.

W przeciwieństwie do tego, GFP-syntaksyna-13 typ dziki lokalizuje się w recyklingu endosomów podobnie jak Rab11. Badanie to wykazało, że GFP-syntaksyna-13 typu dzikiego może być również stosowana do oznaczania endosomów recyklingowych w melanocytach. GFP-syntaksyna-13 typu dzikiego może być lepszym markerem endosomalnym recyklingu niż Rab11, ponieważ Rab11 zmienia dynamikę endosomalną.

Ogólnie rzecz biorąc, GFP-syntaksyna-13 typu dzikiego działa jako potencjalny marker endosomalny recyklingu do badania dynamiki w warunkach stanu ustalonego.