Zastosowanie pasywnego ruchu głowy do generowania zdefiniowanych przyspieszeń na głowach gryzoni
July 21st, 2022
Obecny protokół opisuje specjalnie zaprojektowany system ''pasywnego ruchu głowy'', który odtwarza mechaniczne przyspieszenia na głowach gryzoni generowane podczas ich bieżni biegnącej z umiarkowanymi prędkościami. Pozwala na wypreparowanie czynników/elementów mechanicznych z dobroczynnego wpływu wysiłku fizycznego.
Nasz protokół pomaga odpowiedzieć na pytania, w jaki sposób ćwiczenia fizyczne wspierają homeostazę organizmu. Systemy te pozwoliły nam przeanalizować bezpośrednie mechaniczne skutki dla mózgu wynikające ze złożonych konsekwencji aktywności fizycznej, takiej jak chodzenie i jogging. Aby rozpocząć, przymocuj akcelerometr do głowy szczura za pomocą taśmy chirurgicznej.
Po całkowitym wyzdrowieniu ze znieczulenia umieść szczura w maszynie do bieżni. Dostosuj bieżnię do umiarkowanej prędkości 20 metrów na minutę. Użyj aplikacji, aby zmierzyć wielkość przyspieszeń pionowych wzdłuż osi X, Y i Z, gdy szczur biegnie na bieżni.
Dopasuj wartości uzyskane z oprogramowania do wielkości częstotliwości przyspieszenia pionowego w systemie PHM. Ustaw amplitudę oscylacji platformy i prędkość obrotową krzywki w kształcie śmigła. Następnie umieść mysz w pozycji leżącej z głową umieszczoną na oscylatorze, a resztą ciała na platformach statycznych.
Włącz silnik, aby oscylować platformą w pionie i nałóż PHM na mysz. W przezroczystej plastikowej obudowie ustaw kamerę wideo na częstotliwość odświeżania 24 kl./s, aby nagrywać całą przestrzeń. Następnie dootrzewnowo podaj myszowi pięć hydroksytryptofanów.
Umieść mysz w przezroczystej klatce i rozpocznij nagrywanie przez 30 minut. Przejrzyj nagrane wideo z prędkością 0,5x i ręcznie policz drgania głowy. Pobierz kriosekcje mózgu myszy z pudełka ze szkiełkami.
Pozostaw szkiełka na czystych chusteczkach w temperaturze pokojowej, aż próbki całkowicie się odwodnią. Użyj pisaka blokującego płyny, aby narysować okrąg wokół kriowyciętej tkanki. Następnie dodaj roztwór TBS-T.
Na dnie tacy umieść zwilżone chusteczki, aby stworzyć wilgotne środowisko dla szkiełek. Po permeablacji TBS-T dodać 4% surowicy osła do blokowania i inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę. Szkiełka należy opłukać jeden raz, zanurzając je w TBS-T na pięć minut.
Następnie nałóż 100 mikrolitrów odpowiednio rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego i mieszanki dappy na każde szkiełko. Przykryj tacę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez noc. Po inkubacji płukać TBS-T trzykrotnie przez pięć minut każdy.
Zastosuj 100 mikrolitrów odpowiednio rozcieńczonych gatunków dopasowanych fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę. Płukać końcowo TBS-T trzykrotnie przez pięć minut każde, zamontować szkiełka z medium montażowym i przykryć szkiełka nakrywkowe. Po zamontowaniu obejrzyj próbkę pod mikroskopem fluorescencyjnym.
System PHM został dostosowany tak, aby wytwarzać pionowe szczyty przyspieszenia przy około 1,0 razy G, co było równoważne głowom szczurów podczas biegania na bieżni. Zastosowanie PHM u myszy znacznie osłabiło ich reakcję drgania głowy w porównaniu z myszami kontrolnymi, które reprezentowały supresyjny wpływ PHM na sygnalizację receptora 5-HT2A w neuronach kory przedczołowej. Bieganie na bieżni w PHM znacznie poprawiło internalizację receptora 5-HT2A i neurony kory przedczołowej myszy.
Kwantyfikacja zinternalizowanych i związanych z błoną obszarów dodatnich receptora 5-HT2A w stosunku do nowego i dodatniego obszaru potwierdziła tę obserwację. Barwienie immunologiczne i kwantyfikacja ekspresji c-Fos w neuronach z dodatnim receptorem 5-HT2A wykazało, że bieżnia biegająca w PHM obniżyła ekspresję c-Fos indukowaną przez 5-HTP. Jest to dalsze zdarzenie komórkowe aktywacji receptora 5-HT2A i mysich neuronów PFC.
Interwencja mechaniczna może być zastosowana do części ciała innych niż głowa w celu zbadania mechanicznych aspektów efektów ćwiczeń.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie bada, jak aktywność fizyczna, w szczególności bieganie na bieżni, wpływa na homeostazę organizmu poprzez nowo opracowany pasywny system ruchu głowy (PHM). Symulując mechaniczne przyspieszenia doświadczane przez szczury, protokół skutecznie izoluje czynniki mechaniczne i ich szczególne wpływy na funkcjonowanie mózgu.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Aktywność fizyczna i homeostaza
- Neuronauka mechanotransdukcji
- Wpływ czynników mechanicznych na szlaki sygnalizacyjne mózgu
Tło
- Rola aktywności fizycznej w regulacji fizjologicznej
- Mechaniczne wpływy na reakcje neuronów
- Znaczenie zrozumienia reakcji mózgu na ćwiczenia
Zastosowane metody
- Niestandardowy system pasywnego ruchu głowy (PHM)
- Gryzonie (szczury i myszy) jako modele biologiczne
- Barwienie fluorescencyjne i immunohistologia do analizy mózgu
Główne wyniki
- PHM znacząco zmniejszyło reakcje migotania głowy u myszy
- Wzmocnione internalizowanie receptorów 5-HT2A w neuronach kory przedczołowej
- Zmniejszenie ekspresji c-Fos po interwencji mechanicznej
Wnioski
- Badanie pokazuje walidną metodę badania wpływów mechanicznych na mózg.
- Wyniki przyczyniają się do głębszego zrozumienia fizjologii ćwiczeń i sygnalizacji neuronowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Dissecting the direct mechanical effects of exercise on brain signaling is critical for de-risking neurobiological targets and clarifying mechanistic hypotheses in early discovery. The passive head motion (PHM) system enables controlled, reproducible delivery of defined mechanical accelerations to rodent heads, supporting predictive confidence in mechanotransduction studies. This capability informs target validation and translational continuity for neuropsychiatric and exercise-related therapeutic programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mechanotransduction pathways implicated in exercise-induced brain homeostasis.
- Supports functional validation of serotonin receptor signaling in defined neuronal populations.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating mechanical from systemic exercise effects.
- Provides quantitative benchmarks for pathway activation and receptor internalization.
Screening & Assay Development
- Prepares validated rodent models for downstream neuropharmacological screening.
- Standardizes mechanical stimulation parameters for reproducible assay development.
- Generates quantitative outputs such as head acceleration profiles and receptor localization metrics.
- Enables reliable evaluation of compound effects on mechanosensitive pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant mechanical stimuli observed in human exercise.
- Supports continuity from mechanistic discovery to biomarker-driven preclinical validation.
- Informs risk-adjusted advancement of neuropsychiatric and exercise-mimetic candidates.
- Provides a platform for evaluating translational biomarkers of mechanotransduction.
Pipeline & Workflow Integration
The PHM system integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of mechanical signaling in rodent models, supporting both target validation and translational biomarker development.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for mechanical activation of brain signaling pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative mechanical stimulation for assay standardization.
- Analytics: Provides measurable outputs such as acceleration profiles, receptor internalization, and c-Fos expression.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to preclinical models relevant for exercise and neuropsychiatric research.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse mechanotransduction and neurobiology studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mechanistic hypotheses and target validation.
- Operational Value: Enables standardized, scalable, and reproducible mechanical stimulation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by clarifying direct mechanical effects on brain targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neuropsychiatric and exercise-mimetic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent handling, neurobiology, and quantitative imaging.
- Needs instrumentation for controlled mechanical stimulation and high-resolution fluorescence microscopy.
- Demands cross-team standardization of stimulation parameters and analytical endpoints.
- Adaptation across rodent species and exercise paradigms may require protocol optimization.
- Mechanical intervention is limited to accessible body regions and may not fully recapitulate systemic exercise effects.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Measurement of Magnitudes of Accelerations and Adjustment of the PHM System
1:33
Quantification of Mouse Head-Twitch Response
2:03
Immunohistochemical Analysis of Prefrontal Cortex (PFC) Collected from Euthanized Mouse Brain
3:22
Results: Effect of Treadmill Running and PHM Application in Mouse PFC Neurons
4:37
Conclusion
