Name: Zastosowanie pasywnego ruchu głowy do generowania zdefiniowanych przyspieszeń na głowach gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 4 s
Description: Poznaj system pasywnego ruchu głowy do badania wpływu ćwiczeń fizycznych na homeostazę organizmu u gryzoni. Ta metoda pozwala izolować czynniki mechaniczne i analizować ich efekty na funkcje mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez Fundusz Badań Wewnętrznych z japońskiego Ministerstwa Zdrowia, Pracy i Opieki Społecznej; Dotacje na badania naukowe przyznawane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (KAKENHI 15H01820, 15H04966, 18H04088, 20K21778, 21H04866, 21K11330, 20K19367); Program wspierany przez MEXT dla Fundacji Badań Strategicznych na Uniwersytetach Prywatnych, 2015-2019 z japońskiego Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (S1511017); Fundacja Nauki i Inżynierii Naito. Badania te otrzymały również finansowanie z Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T), które jest wspierane przez Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) oraz National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer P2CHD086843.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Narodowego Centrum Rehabilitacji dla Osób Niepełnosprawnych. 8-9 tygodniowe samce szczurów Sprague-Dawley zostały użyte do pomiaru przyspieszenia na głowie podczas biegania na bieżni i PHM. 9-10 tygodniowe samce myszy C57BL/6 zostały użyte do testów zachowania i analiz histologicznych PFC. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródeł komercyjnych (patrz Tabela Materiałów).
1. Pomiar wielkości przyspieszeń wzdłuż osi x, y i z podczas biegania na bieżni
<ol>
	<li>Znieczulić szczura inhalacją 1,5% izofluranu. 
	UWAGA: Szczury wykorzystano po co najmniej 1 tygodniu aklimatyzacji do środowiska laboratoryjnego. Upewnij się, że szczur nie reaguje na szczypanie palca tylnej kończyny.</li>
	<li>Zamocuj akcelerometr (patrz Tabela materiałów) na czubku głowy szczura za pomocą taśmy chirurgicznej.</li>
	<li>Po całkowitym wyzdrowieniu ze znieczulenia umieść szczura w bieżni (patrz Tabela materiałów) i ustaw bieżnię na umiarkowaną prędkość (20 m/min)12 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
	UWAGA: Zajęło co najmniej 20 minut, aby potwierdzić pełne wyzdrowienie szczura ze znieczulenia po zakończeniu inhalacji izofluranu i rozpocząć eksperyment na bieżni. Upewnij się, że szczur reaguje na szczypanie palca tylnej kończyny, będąc w stanie chodzić lub biegać bez widocznego zataczania się.</li>
	<li>Zmierz wielkość przyspieszeń pionowych podczas biegania na bieżni dla szczurów za pomocą oprogramowania użytkowego, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Wyodrębnij 10 fal szeregowych i indywidualnie oblicz średnie przyspieszenia wzdłuż osi 3-wymiarowych (osie x, y i z, <silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Maksymalne wielkości określono ilościowo, definiując fale zsynchronizowane krokowo (częstotliwość ~2 Hz) jako przyspieszenia wywołane bieganiem na bieżni (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C). Do tego badania wykorzystano szczury, ponieważ ich większy rozmiar ciała był odpowiedni do wiarygodnego pomiaru przyspieszenia pionowego na głowie, co nie było możliwe u myszy. Jednak myszy wykorzystano do dalszych badań ze względu na łatwość i wiarygodność analizy ilościowej reakcji skurczu głowy.</li>
</ol>
2. Dostosowanie systemu PHM i zastosowanie PHM u myszy
<ol>
	<li>Wstępnie ustaw amplitudę oscylacji platformy i prędkość obrotową krzywki w kształcie śmigła w systemie PHM (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D), tak aby wielkość i częstotliwość przyspieszenia pionowego odpowiadały wartościom uzyskanym w kroku 1.4. 
	UWAGA: System PHM składa się z metalowej ramy i drewnianej platformy. Prędkość silnika można zmieniać i kontrolować, regulując pokrętło podłączone do wbudowanego sterownika (patrz Tabela materiałów). Skala tarczy 600 odpowiada 2 Hz, <silna klasa="xfig">Rysunek 1E. Krzywka w kształcie śmigła ma cztery łopatki o wysokości skoku 5 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F).</li>
	<li>Znieczulić mysz poprzez inhalację 1,2% izofluranu. 
	UWAGA: Myszy wykorzystano po co najmniej 1 tygodniu aklimatyzacji do środowiska laboratoryjnego. Upewnij się, że mysz nie reaguje na uszczypnięcie palca tylnej kończyny.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej, tak aby głowa i reszta ciała znajdowały się odpowiednio na platformie oscylacyjnej i statycznej. 
	UWAGA: Utrzymuj mysz w znieczuleniu (1,2% izofluranu).</li>
	<li>Włącz silnik, aby oscylować platformą w pionie, i zastosuj PHM do myszy. 
	UWAGA: Prędkość silnika została dostosowana do oscylacji platformy z częstotliwością 2 Hz (patrz krok 2.1). Znieczul i umieść mysz sterującą na platformie PHM podobnie, ale pozostaw silnik wyłączony.</li>
</ol>
3. Bieganie myszką na bieżni
<ol>
	<li>Umieść mysz na bieżni i ustaw bieżnię na umiarkowaną prędkość (10 m/min)13.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja reakcji myszy na drganie głowy (HTR)
<ol>
	<li>Ustaw kamerę wideo (liczba klatek na sekundę: 24 kl./s), aby nagrywać całą przestrzeń w przezroczystej plastikowej obudowie. 
	UWAGA: Plastikowa klatka służyła do utrzymywania myszy w polu nagrywania wideo.</li>
	<li>Dootrzewnowo podawać myszom 5-hydroksytryptofan (5-HTP) (100 mg/kg) (patrz tabela materiałów), prekursor 5-HT.</li>
	<li>Umieść mysz w przezroczystej klatce i rozpocznij nagrywanie przez 30 minut.</li>
	<li>Przejrzyj nagrane wideo (prędkość 1/2x lub 1/3x), ręcznie licząc drgania głowy. 
	UWAGA: Analitycy nie byli ślepi na procedurę eksperymentalną. Charakterystyczny "tikopodobny" gwałtowny ruch myszy (patrz film uzupełniający 1) został zaliczony jako drganie głowy, które rzadko występuje w normalnym środowisku hodowlanym.</li>
</ol>
5. Analiza immunohistochemiczna PFC myszy
<ol>
	<li>Po zakończeniu testów HTR znieczulij mysz, podając mieszaninę midazolamu (4,0 mg/kg), butorfanolu (4,0 mg/kg) i medetomidyny (0,3 mg/kg), perfuzuj z 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS, a następnie wytnij mózg zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami14,15.</li>
	<li>Po utrwaleniu mózgów w 4% PFA w PBS przez dodatkowe 24 godziny w temperaturze 4 °C i przechowywać w 30% sacharozy/PBS, aż opadną. Zamrozić osadzony związek o optymalnej temperaturze skrawania (związek OCT, patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Pobrać kriosekcje mózgu myszy z pudełka ze szkiełkami (patrz Tabela materiałów). Pozostawić szkiełka na czystych chusteczkach w temperaturze pokojowej, aż próbki całkowicie się odwodnią. 
	UWAGA: Przekroje strzałkowe o grubości dwudziestu mikrometrów (boczne +0,5–1,5 mm) przygotowano z zamrożonych próbek zanurzonych w związku OCT za pomocą kriostatu (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Za pomocą pisaka blokującego płyny (patrz Tabela materiałów) narysować okrąg wokół tkanki poddanej kriosekcji na szkiełku, aby ograniczyć obszar rozprowadzania roztworu (0,1% Tween-20 w soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS-T).</li>
	<li>Umieść zwilżone chusteczki na dnie tacki z szkiełkami, aby stworzyć wilgotne środowisko.</li>
	<li>Po przesiąknięciu TBS-T blokować 4% surowicą osła (patrz Tabela Materiałów) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Opłucz szkiełka raz przez 5 minut zanurzenia w TBS-T.</li>
	<li>Na każde szkiełko nanieść 100 μl odpowiednio rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego i mieszanki DAPI (patrz tabela materiałów), przykryć tackę, aby uniknąć wysuszenia próbki, i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Spłukać TBS-T trzy razy (po 5 minut inkubacji).</li>
	<li>Na każde szkiełko nanieść 100 μl odpowiednio rozcieńczonego, dopasowanego gatunkowo fluorescencyjnego przeciwciała drugorzędowego (sprzężonego z Alexa Fluor 488, 568 lub 645) (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Spłukać TBS-T trzy razy (po 5 minut inkubacji).</li>
	<li>Zamontuj prowadnice za pomocą medium montażowego (patrz Tabela materiałów). Przykryj szkiełka szkiełkami nakrywkowymi.</li>
	<li>Zobacz próbkę pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>

<ol><li>Lackland, D. T., Voeks, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+syndrome+and+hypertension%3A+regular+exercise+as+part+of+lifestyle+management%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Hypertension+Reports%22%5BJournal%5D)">Metabolic syndrome and hypertension: regular exercise as part of lifestyle management.</a> Current Hypertension Reports. 16 (11), 1-7 (2014).</li>
<li>Heyn, P., Abreu, B. C., Ottenbacher, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+exercise+training+on+elderly+persons+with+cognitive+impairment+and+dementia%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Physical+Medicine+and+Rehabilitation%22%5BJournal%5D)">The effects of exercise training on elderly persons with cognitive impairment and dementia: a meta-analysis.</a> Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 85 (10), 1694-1704 (2004).</li>
<li>Saitou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+cyclical+compression+modulates+macrophage+function+in+situ+and+alleviates+immobilization-induced+muscle+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">Local cyclical compression modulates macrophage function in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy.</a> Clinical Science. 132 (19), 2147-2161 (2018).</li>
<li>Sakitani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+consistent+massage-like+perturbations+on+mouse+calves+and+monitoring+the+resulting+intramuscular+pressure+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Application of consistent massage-like perturbations on mouse calves and monitoring the resulting intramuscular pressure changes.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59475(2019).</li>
<li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+bone+homeostasis+through+p130Cas-mediated+alleviation+of+NF-%CE%BAB+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Advances%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of bone homeostasis through p130Cas-mediated alleviation of NF-κB activity.</a> Scientific Advances. 5 (9), (2019).</li>
<li>Berger, M., Gray, J. A., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expanded+biology+of+serotonin%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The expanded biology of serotonin.</a> Annual Review of Medicine. 60 (1), 355-366 (2009).</li>
<li>Canli, T., Lesch, K. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+story+short%3A+the+serotonin+transporter+in+emotion+regulation+and+social+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Long story short: the serotonin transporter in emotion regulation and social cognition.</a> Nature Neuroscience. 10 (9), 1103-1109 (2007).</li>
<li>Roth, B., Hanizavareh, S. M., Blum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+receptors+represent+highly+favorable+molecular+targets+for+cognitive+enhancement+in+schizophrenia+and+other+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Serotonin receptors represent highly favorable molecular targets for cognitive enhancement in schizophrenia and other disorders.</a> Psychopharmacology. 174 (1), 17-24 (2003).</li>
<li>Bhattacharyya, S., Puri, S., Miledi, R., Panicker, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization+and+recycling+of+5-HT2A+receptors+activated+by+serotonin+and+protein+kinase+C-mediated+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Internalization and recycling of 5-HT2A receptors activated by serotonin and protein kinase C-mediated mechanisms.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14470-14475 (2002).</li>
<li>Canal, C. E., Morgan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Head-twitch+response+in+rodents+induced+by+the+hallucinogen+2%2C5-dimethoxy-4-iodoamphetamine%3A+a+comprehensive+history%2C+a+re-evaluation+of+mechanisms%2C+and+its+utility+as+a+model%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Testing+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">Head-twitch response in rodents induced by the hallucinogen 2,5-dimethoxy-4-iodoamphetamine: a comprehensive history, a re-evaluation of mechanisms, and its utility as a model.</a> Drug Testing and Analysis. 4 (7-8), 556-576 (2012).</li>
<li>Halberstadt, A. L., Geyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+head-twitch+response+induced+by+hallucinogens+in+mice%3A+detection+of+the+behavior+based+on+the+dynamics+of+head+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Characterization of the head-twitch response induced by hallucinogens in mice: detection of the behavior based on the dynamics of head movement.</a> Psychopharmacology (Berl). 227 (4), 727-739 (2013).</li>
<li>Kim, S. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treadmill+exercise+prevents+aging-induced+failure+of+memory+through+an+increase+in+neurogenesis+and+suppression+of+apoptosis+in+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Treadmill exercise prevents aging-induced failure of memory through an increase in neurogenesis and suppression of apoptosis in rat hippocampus.</a> Experimental Gerontology. 45 (5), 357-365 (2010).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+treadmill+running+improves+spatial+learning+and+memory+performance+in+young+mice+through+increased+hippocampal+neurogenesis+and+decreased+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Regular treadmill running improves spatial learning and memory performance in young mice through increased hippocampal neurogenesis and decreased stress.</a> Brain Research. 1531, 1-8 (2013).</li>
<li>González-Maeso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallucinogens+recruit+specific+cortical+5-HT2A+receptor-mediated+signaling+pathways+to+affect+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT2A receptor-mediated signaling pathways to affect behavior.</a> Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).</li>
<li>Ryu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+underlies+effects+of+exercise+on+serotonin-induced+signaling+in+the+prefrontal+cortex+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation underlies effects of exercise on serotonin-induced signaling in the prefrontal cortex neurons.</a> iScience. 23 (2), 100874(2020).</li>
<li>Shefer, G., Rauner, G., Stuelsatz, P., Benayahu, D., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate-intensity+treadmill+running+promotes+expansion+of+the+satellite+cell+pool+in+young+and+old+mice%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Moderate-intensity treadmill running promotes expansion of the satellite cell pool in young and old mice.</a> FEBS Journal. 280 (17), 4063-4073 (2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+exercise+has+beneficial+effects+on+mouse+ischemic+stroke+by+enhancing+the+functions+of+circulating+endothelial+progenitor+cell-derived+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Moderate exercise has beneficial effects on mouse ischemic stroke by enhancing the functions of circulating endothelial progenitor cell-derived exosomes.</a> Experimental Neurology. 330, 113325(2020).</li>
<li>Pacák, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressor-specific+activation+of+the+hypothalamic-pituitary-adrenocortical+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Research%22%5BJournal%5D)">Stressor-specific activation of the hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis.</a> Physiological Research. 49, 11-17 (2000).</li>
<li>Okamoto, M., Soya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+exercise+model+for+enhancement+of+hippocampal+neurogenesis%3A+A+possible+candidate+for+promotion+of+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Fitness+and+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mild exercise model for enhancement of hippocampal neurogenesis: A possible candidate for promotion of neurogenesis.</a> The Journal of Physical Fitness and Sports Medicine. 1 (4), 585-594 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma konkurencyjnych interesów związanych z pracą opisaną w niniejszym artykule.

Korzystając z opracowanego systemu aplikacji PHM, wykazaliśmy, że sygnalizacja 5-HT w neuronach PFC jest regulowana mechanicznie. Ze względu na złożoność efektów ćwiczeń trudno było precyzyjnie przeanalizować konsekwencje ćwiczeń w kontekście promocji zdrowia. Nacisk kładziony jest na aspekty mechaniczne, aby wykluczyć udział lub udział zdarzeń metabolicznych, które mogą wystąpić wraz z czynnościami fizycznymi lub później, takich jak zużycie energii. Oczekuje się, że opisana tutaj metoda będzie szerzej przydatna w badani...

Ćwiczenia są korzystne w leczeniu lub zapobieganiu wielu zaburzeniom fizycznym, w tym chorobom związanym ze stylem życia, takim jak cukrzyca i nadciśnienie tętnicze1. W związku z tym zgromadzono również dowody dotyczące pozytywnego wpływu ćwiczeń na funkcje mózgu2. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw korzyści płynących z ćwiczeń dla mózgu pozostają przede wszystkim niewyjaśnione. Większość aktywności fizycznych i treningów generuje mechaniczne przyspieszenia przy głowie, przynajmniej w pewnym stopniu. Podczas gdy różne zjawiska fizjologiczne są regulowane mechanicznie, znaczenie obciążenia mechanicznego zostało w większości przypadków udokumentowane w układzie mięśniowo-szkieletowym3,4,5. Chociaż mózg jest również poddawany działaniu sił mechanicznych podczas aktywności fizycznej, w szczególności tak zwanych ćwiczeń uderzeniowych, mechaniczna regulacja fizjologicznych funkcji mózgu jest rzadko badana. Ponieważ generowanie mechanicznych przyspieszeń w głowie jest stosunkowo powszechne w treningach fizycznych, spekuluje się, że mechaniczna regulacja może być związana z korzyściami płynącymi z ćwiczeń dla funkcji mózgu.
5-HTSygnalizacja receptora 2A jest niezbędna w regulacji emocji i zachowań wśród różnych sygnałów biochemicznych, które funkcjonują w układzie nerwowym. Bierze udział w wielu chorobach psychicznych6,7,8, w przypadku których udowodniono, że ćwiczenia są skuteczne terapeutycznie. Receptor 5-HT2A jest podtypem receptora 5-HT2, który należy do rodziny serotoniny, a także jest członkiem rodziny receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), której sygnalizacja jest modulowana przez jego internalizację, zależną od ligandu lub -niezależną9. Drganie głowy jest charakterystycznym zachowaniem gryzoni, którego ilość (częstotliwość) wyraźnie reprezentuje intensywność sygnalizacji receptora 5-HT2A w neuronach kory przedczołowej (PFC) 10,11. Wykorzystując ścisłą specyficzność tej halucynogennej odpowiedzi na podawane 5-HT (reakcja skurczu głowy, zwana dalej HTR; patrz film uzupełniający 1), przetestowano wspomnianą powyżej hipotezę dotyczącą mechanicznych implikacji wpływu ćwiczeń na funkcje mózgu. W związku z tym przeanalizowaliśmy i porównaliśmy HTR myszy poddanych wymuszonym ćwiczeniom (bieganie na bieżni) lub mechanicznej interwencji naśladującej ćwiczenia (PHM).

<table><tbody><tr><td>5-hydroksytryptofan (5-HTP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9772</td><td>Prekursor serotoniny (5-HT)</td></tr><tr><td>Bezszczotkowy sterownik silnika</td><td>Silnik orientalny</td><td>BMUD30-A2</td><td>Zmieniacz prędkości wbudowany sterownik silnika</td></tr><tr><td>C57BL/6 myszy</td><td>Drożdże orientalne firmy</td><td>C57BL/6J</td><td>Myszy użyte w tym badaniu</td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica</td><td>CM33050S</td><td>Mikrotom do cięcia zamrożonych próbek</td></tr><tr><td>Silnik prądu stałego</td><td>Silnik orientalny</td><td>BLM230-GFV2</td><td>Silnik</td></tr><tr><td>przeciw kozom osioł Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A-11057</td><td>Przeciwciało wtórne stosowane do barwienia immunohistochemicznego</td></tr><tr><td>Osioł anty-mysz Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Przeciwciało wtórne stosowane do barwienia immunohistochemicznego</td></tr><tr><td>Osioł anty-królik Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>Przeciwciało drugorzędowe stosowane do barwienia immunohistochemicznego</td></tr><tr><td>Surowica osła</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S30-100ML</td><td>Bloker niespecyficznego wiązania przeciwciał w barwieniu immunohistochemicznym</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Keyence</td><td>BZ-9000</td><td>Mikroskop fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Kozioł poliklonalny receptor anty-5-HT2A</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-15073</td><td>Przeciwciało pierwotne stosowane do barwienia immunohistochemicznego</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pfizer</td><td>v002139</td><td>Znieczulenie wziewne</td></tr><tr><td>KimWipe</td><td>NIPPON PAPER CRECIA</td><td>S-200</td><td>Ściereczka papierowa do czyszczenia powierzchni, części, narzędzi w laboratorium</td></tr><tr><td>Bloker płynów</td><td>Daido Sangyo</td><td>PAP-S</td><td>Marker używany do nadania powierzchni szkiełka wodoodporności</td></tr><tr><td>Mysz monoklonalna anty-NeuN (klon A60)</td><td>EMD Millipore (Merck)</td><td>MAB377</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane do barwienia immunohistochemicznego</td></tr><tr><td>NinjaScan-Light</td><td>Switchscience</td><td>SSCI-023641</td><td>Akcelerometr do pomiaru przyspieszeń</td></tr><tr><td>OCT związek Sakura</td><td>Finetek</td><td>45833</td><td>Środek do zatapiania do przygotowania zamrożonych skrawków tkanek</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td>Podłoże montażowe zapobiegające blaknięcie mąki</td></tr><tr><td>Królik poliklonalny anty-c-Fos</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-52</td><td>Przeciwciało pierwotne stosowane do barwienia immunohistochemicznego</td></tr><tr><td>Pudełko na suwaki</td><td>AS ONE</td><td>03-448-1</td><td>Nieprzezroczyste pudełko do przechowywania szkiełek</td></tr><tr><td>Spike2</td><td>Cambridge electronic design limited (CED)</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie aplikacyjne używane do analizy przyspieszenia</td></tr><tr><td>Szczury Sprague-Dawley</td><td>Japonia SLC</td><td>Slc:SD</td><td>Szczury użyte w tym badaniu</td></tr><tr><td>Bieżnia</td><td>Muromachi</td><td>MK-680</td><td>System używany w eksperymentach wymuszonego biegania szczurów i myszy</td></tr></tbody></table>

zastosowanie pasywnego ruchu głowy do generowania zdefiniowanych przyspieszeń na głowach gryzoni

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Ćwiczenia są powszechnie uznawane za skuteczne w przypadku różnych chorób i zaburzeń fizycznych, w tym tych związanych z dysfunkcją mózgu. Jednak mechanizmy molekularne stojące za korzystnymi efektami ćwiczeń są słabo poznane. Wiele treningów fizycznych, szczególnie tych klasyfikowanych jako ćwiczenia aerobowe, takie jak jogging i chodzenie, wytwarza siły impulsywne w momencie kontaktu stopy z podłożem. Dlatego spekulowano, że wpływ mechaniczny może być związany z tym, jak ćwiczenia przyczyniają się do homeostazy organizmu. W celu przetestowania tej hipotezy na mózgu, opracowano specjalnie zaprojektowany system "pasywnego ruchu głowy" (dalej określany jako PHM), który może generować przyspieszenia pionowe o kontrolowanych i zdefiniowanych wielkościach i trybach oraz odtwarzać mechaniczną stymulację, która może być stosowana do głów gryzoni podczas bieżni biegnącej z umiarkowaną prędkością, co jest typową interwencją w celu przetestowania efektów ćwiczeń u zwierząt. Korzystając z tego systemu, wykazano, że PHM rekapituluje sygnalizację receptora serotoniny (5-hydroksytryptaminy, zwanej dalej 5-HT) podtypu 2A (5-HT2A) w neuronach kory przedczołowej (PFC) myszy. Praca ta dostarcza szczegółowych protokołów stosowania PHM i pomiaru jego wynikowych przyspieszeń mechanicznych na głowach gryzoni.

Maksymalna wartość przyspieszeń pionowych w obrębie głów szczurów podczas biegu na bieżni z umiarkowaną prędkością (20 m/min) wynosiła około 1,0 × g (Rysunek 1C). System PHM (Rysunek 1D) został skonfigurowany tak, aby generować szczytowe przyspieszenia pionowe o wartości 1,0 × g w obrębie głów gryzoni.
Zastosowanie PHM (2 Hz, 30 min/dobę przez 7 dni) u myszy znacząco osłabiło ich HTR w porównaniu z myszami kontrolnym...

Obecny protokół opisuje specjalnie zaprojektowany system ''pasywnego ruchu głowy'', który odtwarza mechaniczne przyspieszenia na głowach gryzoni generowane podczas ich bieżni biegnącej z umiarkowanymi prędkościami. Pozwala na wypreparowanie czynników/elementów mechanicznych z dobroczynnego wpływu wysiłku fizycznego.

Zastosowanie pasywnego ruchu głowy do generowania zdefiniowanych przyspieszeń na głowach gryzoni

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Nasz protokół pomaga odpowiedzieć na pytania, w jaki sposób ćwiczenia fizyczne wspierają homeostazę organizmu. Systemy te pozwoliły nam przeanalizować bezpośrednie mechaniczne skutki dla mózgu wynikające ze złożonych konsekwencji aktywności fizycznej, takiej jak chodzenie i jogging. Aby rozpocząć, przymocuj akcelerometr do głowy szczura za pomocą taśmy chirurgicznej.Po całkowitym wyzdrowieniu ze znieczulenia umieść szczura w maszynie do bieżni. Dostosuj bieżnię do umiarkowanej prędkości 20 metrów na minutę. Użyj aplikacji, aby zmierzyć wielkość przyspieszeń pionowych wzdłuż osi X, Y i Z, gdy szczur biegnie na bieżni.Dopasuj wartości uzyskane z oprogramowania do wielkości częstotliwości przyspieszenia pionowego w systemie PHM. Ustaw amplitudę oscylacji platformy i prędkość obrotową krzywki w kształcie śmigła. Następnie umieść mysz w pozycji leżącej z głową umieszczoną na oscylatorze, a resztą ciała na platformach statycznych.Włącz silnik, aby oscylować platformą w pionie i nałóż PHM na mysz. W przezroczystej plastikowej obudowie ustaw kamerę wideo na częstotliwość odświeżania 24 kl./s, aby nagrywać całą przestrzeń. Następnie dootrzewnowo podaj myszowi pięć hydroksytryptofanów.Umieść mysz w przezroczystej klatce i rozpocznij nagrywanie przez 30 minut. Przejrzyj nagrane wideo z prędkością 0,5x i ręcznie policz drgania głowy. Pobierz kriosekcje mózgu myszy z pudełka ze szkiełkami.Pozostaw szkiełka na czystych chusteczkach w temperaturze pokojowej, aż próbki całkowicie się odwodnią. Użyj pisaka blokującego płyny, aby narysować okrąg wokół kriowyciętej tkanki. Następnie dodaj roztwór TBS-T.Na dnie tacy umieść zwilżone chusteczki, aby stworzyć wilgotne środowisko dla szkiełek. Po permeablacji TBS-T dodać 4% surowicy osła do blokowania i inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę. Szkiełka należy opłukać jeden raz, zanurzając je w TBS-T na pięć minut.Następnie nałóż 100 mikrolitrów odpowiednio rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego i mieszanki dappy na każde szkiełko. Przykryj tacę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez noc. Po inkubacji płukać TBS-T trzykrotnie przez pięć minut każdy.Zastosuj 100 mikrolitrów odpowiednio rozcieńczonych gatunków dopasowanych fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę. Płukać końcowo TBS-T trzykrotnie przez pięć minut każde, zamontować szkiełka z medium montażowym i przykryć szkiełka nakrywkowe. Po zamontowaniu obejrzyj próbkę pod mikroskopem fluorescencyjnym.System PHM został dostosowany tak, aby wytwarzać pionowe szczyty przyspieszenia przy około 1,0 razy G, co było równoważne głowom szczurów podczas biegania na bieżni. Zastosowanie PHM u myszy znacznie osłabiło ich reakcję drgania głowy w porównaniu z myszami kontrolnymi, które reprezentowały supresyjny wpływ PHM na sygnalizację receptora 5-HT2A w neuronach kory przedczołowej. Bieganie na bieżni w PHM znacznie poprawiło internalizację receptora 5-HT2A i neurony kory przedczołowej myszy.Kwantyfikacja zinternalizowanych i związanych z błoną obszarów dodatnich receptora 5-HT2A w stosunku do nowego i dodatniego obszaru potwierdziła tę obserwację. Barwienie immunologiczne i kwantyfikacja ekspresji c-Fos w neuronach z dodatnim receptorem 5-HT2A wykazało, że bieżnia biegająca w PHM obniżyła ekspresję c-Fos indukowaną przez 5-HTP. Jest to dalsze zdarzenie komórkowe aktywacji receptora 5-HT2A i mysich neuronów PFC.Interwencja mechaniczna może być zastosowana do części ciała innych niż głowa w celu zbadania mechanicznych aspektów efektów ćwiczeń.

application-passive-head-motion-to-generate-defined-accelerations-at

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film pokazuje operację wszczepienia sztyftu głowy na modelu mysim. Słupek główny służy nie tylko do mocowania głowy, a tym samym przytrzymywania myszy podczas eksperymentów, ale także do bezpiecznego mocowania urządzenia na głowę u swobodnie poruszających się zwierząt.

Implantacja sztyfty myszy: metoda mocowania głowy u gryzoni

Ta metoda tworzy namacalne, znajome środowisko dla myszy do nawigacji i eksploracji podczas obrazowania mikroskopowego lub jednokomórkowych zapisów elektrofizjologicznych, które wymagają mocnego unieruchomienia głowy zwierzęcia.

Płaska podłoga podniesiona powietrznie: nowa metoda łączenia zachowania z mikroskopią lub elektrofizjologią na obudzonych, swobodnie poruszających się gryzoniach

Tradycyjne techniki mocowania głowy wykorzystywały metalowe ramki przymocowane do czaszki jako interfejs dla aparatu do mocowania głowy. Protokół ten demonstruje bezramkową, opartą na żywicy akrylowej technikę mocowania głowy do zadań behawioralnych u gryzoni.

Technika mocowania głowy oparta na żywicy akrylowej u gryzoni

Prezentowany tutaj jest protokół do zbierania i analizy trójwymiarowej kinematyki poruszania się czworonożnych u gryzoni do badań przedklinicznych.

Analiza kinematyczna chodu 3D do badań przedklinicznych na gryzoniach

Przedstawiono protokoły oceny autonomicznych i behawioralnych efektów pasywnego ruchu u gryzoni za pomocą pionowego ruchu windy i obrotu diabelskiego młyna.

Ocena autonomicznych i behawioralnych skutków ruchu biernego u szczurów za pomocą pionowego ruchu windy i obrotu diabelskiego młyna

Umiejętne sięganie gryzoni jest powszechnie używane do nauki zręczności, ale wymaga znacznego czasu i wysiłku do wykonania zadania i przeanalizowania zachowania. Opisujemy zautomatyzowaną wersję umiejętnego docierania ze śledzeniem ruchu i trójwymiarową rekonstrukcją trajektorii zasięgu.

Zautomatyzowane sięganie pojedynczych śruin szczura z 3-wymiarową rekonstrukcją trajektorii łap i palców

Szczegółowo opisana jest nowa procedura funkcjonalnego obrazowania u szczurów obudzonych z głową.

Implanty głowy do neuroobrazowania u przytomnych, nieruchomych szczurów

Ten protokół opisuje metodę uzyskiwania in vivo, wysokiej gęstości nagrań pojedynczych neuronów z pnia mózgu myszy z unieruchomioną głową. Podejście to jest stosowane do pomiaru potencjału czynnościowego neuronów w brzuszno-bocznej szarości okołowodociągowej - regionie pnia mózgu nieaktywnym podczas snu z szybkimi ruchami gałek ocznych (REM) - przed i podczas znieczulenia ogólnego.

Ostre jednojednostkowe nagrania wieloelektrodowe z pnia mózgu myszy z unieruchomioną głową

Metodologia badała wkład wzrokowy i przedsionkowy w stabilizację spojrzenia podczas rotacji optokinetycznej i całego ciała. Stymulacje przeprowadzono poprzez badania wzrokowe, przedsionkowe i wizuo-przedwostykowe. Wzmocnienie ruchu oczu skrętne i częstotliwości oczopląsów służyły jako wskaźniki podkorowego przekazywania informacji o ruchu specyficznym dla sensorycznych do odruchowej odpowiedzi pnia mózgu w każdym badaniu.

Wykorzystanie śledzenia oczu do oceny względnego znaczenia bodźców wzrokowych i przedsionkowych dla przetwarzania ruchu podkorowego w płaszczyźnie przechylania

Protokół ten ustanawia pipeline oceny kinematyki tylnej kończyny szczura za pomocą testu na bieżni bez markerów z automatycznym oznaczaniem trajektorii wielostawowych opartym na głębokim uczeniu, co umożliwia powtarzalną ilościową ilościową identyfikację ruchu.

Wielostawowe synchroniczne śledzenie oparte na uczeniu głębokim do obiektywnej ilościowej kinematyki ruchowej kończyn tylnych u szczurów

Poznaj system pasywnego ruchu głowy do badania wpływu ćwiczeń fizycznych na homeostazę organizmu u gryzoni. Ta metoda pozwala izolować czynniki mechaniczne i analizować ich efekty na funkcje mózgu.

Zastosowanie pasywnego ruchu głowy do generowania zdefiniowanych przyspieszeń na głowach gryzoni

Przeglądaj więcej filmów