Name: Izolacja, rozmnażanie i identyfikacja gatunków bakterii o właściwościach metabolizowania węglowodorów z siedlisk wodnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Poznaj metodę izolacji i identyfikacji bakterii rozkładających węglowodory ze środowisk wodnych przy użyciu technik mikrobiologicznych i sekwencjonowania 16S rRNA. Protokół ten umożliwia badanie bioróżnorodności mikroorganizmów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Karthikowi Krishnanowi i członkom laboratorium RP za ich pomocne komentarze i sugestie. DS jest wspierany przez stypendium doktoranckie SNU i stypendium Earthwatch Institute India. Laboratorium RP jest wspierane przez grant CSIR-EMR oraz fundusze na rozpoczęcie działalności z Shiv Nadar University.

1. Pobieranie, przetwarzanie i analiza próbek
UWAGA: Tutaj prezentujemy protokół izolacji bakterii z siedlisk wodnych. Niektóre z izolatów mogą być chorobotwórcze, dlatego należy nosić rękawice i dezynfekować miejsce pracy przed i po użyciu.
<ol>
	<li>Zbierz 500 ml próbki wody w pięciu sterylnych szklanych butelkach z różnych miejsc zbiornika wodnego. Zmierz pH i temperaturę każdej próbki za pomocą odpowiednio pH-metru i termometru. 
	UWAGA: Protokół nie jest specyficzny dla danego miejsca i można go łatwo dostosować do izolowania organizmów z zbiorników wodnych skażonych węglowodorami.</li>
	<li>Przefiltrować próbkę w partii 100 ml przez arkusze filtracyjne o wielkości porów 0,22 μm, w warunkach aseptycznych. 
	UWAGA: Średnica bibuły filtracyjnej nie powinna przekraczać średnicy szalki Petriego. Na przykład bibuła filtracyjna o średnicy nieprzekraczającej 85 mm jest optymalna dla szalki Petriego o średnicy 100-120 mm.</li>
	<li>Trzymaj bibuły filtracyjne na różnych płytkach z pożywkami (PYE19, R2A20, M9, LB, NB, TSB, M6321 i M2G22). Różne rodzaje pożywek hodowlanych umożliwiają selekcję i wzbogacanie różnych mikroorganizmów. Składy różnych pożywek wzrostowych wymieniono w tabeli 1. Użyj jednego papieru na każdą płytkę z podłożem i odklej po 2 godzinach za pomocą sterylnych kleszczyków.</li>
	<li>Próbki wody niefiltrowanej (rozcieńczenie 10:6) należy rozcieńczyć seryjnie w sterylnej wodzie podwójnie destylowanej, dodając 100 μl pobranej próbki wody do 900 μl sterylnej wody. Powoduje to rozcieńczenie 1:10. Z tej próbki pobrać 100 μl i dodać 900 μl sterylnej wody, aby uzyskać rozcieńczenie 1:100. Powtarzać rozcieńczenie, aż wielkość zawijania rozcieńczenia wyniesie 1:1 000 000. Wymieszać pipetując. Ostateczna objętość każdego rozcieńczenia wynosi 1 ml.</li>
	<li>Rozprowadzić 100 μl rozcieńczonej próbki wody pojedynczo na wszystkich płytkach z podłożami wzrostowymi wymienionymi w kroku 3 w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 24 do 48 godzin, w zależności od wzrostu kolonii. 
	UWAGA: Większość izolatów środowiskowych rośnie w optymalnej temperaturze 30 °C. W przypadku izolowania próbek ze środowiska o ekstremalnych temperaturach, należy inkubować płytki w tej samej temperaturze, co temperatura w miejscu pobierania.</li>
	<li>Następnie zbierz kolonie za pomocą sterylnej wykałaczki lub końcówki pipety i wykonaj smugi kwadrantowe, aby uzyskać izolowane kolonie.</li>
	<li>Inkubuj płytki przez noc. Następnego dnia przesiewaj kolonie na podstawie ich cech morfologicznych, takich jak kolor, tekstura, kształt, rozmiar, margines, wysokość itp. Uzupełnij kolonie, aby uzyskać czyste kultury.</li>
	<li>Wykonaj barwienie metodą Grama każdej czystej kultury23 i przystąp do przygotowania surowca glicerolowego.</li>
	<li>Aby przygotować zapasy glicerolu, należy zaszczepić pojedynczą kolonię w 3 ml odpowiedniej pożywki wzrostowej i inkubować w temperaturze 30 °C. Z nocnej hodowli weź 700 μL i dodaj 300 μL 100% glicerolu (sterylizowanego w autoklawie) w cryovials24. Zamrozić fiolki w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
2. Degradacja węglowodorów
UWAGA: Poniższy przykład służy do przesiewania izolatów, które mogą rozkładać styren. Jest to niewielka modyfikacja metody zaadaptowanej w poprzednim raporcie25. Postępuj zgodnie z instrukcjami w warunkach aseptycznych.
<ol>
	<li>Ze świeżo udekorowanego talerza wybierz kolonię i zaszczep ją w 5 ml bulionu sojowego tryptycznego (TSB)/bulionu odżywczego (NB). Hodować kulturę przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min, aż absorpcja osiągnie ~2, 
	UWAGA: Inne niż TSB/NB można wybrać dowolną pożywkę wzrostową, w której bakterie osiągają wysoką gęstość komórek.</li>
	<li>Następnego dnia zagnieździć komórki w temperaturze 2862 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Przepłukać granulki dwukrotnie 2 ml autoklawizowanego roztworu soli fizjologicznej (0,9% NaCl) i wirować w temperaturze 2862 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Sól fizjologiczna jest izotoniczna, dzięki czemu utrzymuje ciśnienie osmotyczne wewnątrz komórek bakteryjnych.</li>
	<li>Zawiesić osad w 2 ml ciekłego, bezwęglowego podłoża podstawowego (LCFBM). Zmierzyć absorbancję (OD600).</li>
	<li>Weź dwie sterylne kolby Erlenmeyera o pojemności 150 ml do kontroli i grupy doświadczalnej. Oznacz je jako A i B.</li>
	<li>W grupie nieinokulowanej/kontrolnej (kolba A) dodać 40 ml LCFBM i styrenu (5 mM).</li>
	<li>Do kolby B dodać 35 ml LCFBM i styrenu (dostosować końcowe stężenie styrenu do 5 mM). Dodać zawiesinę komórek z końcowym OD600 komórek ≈ 0,1 i uzupełnić pozostałą objętość za pomocą LCFBM do 40 ml. Inkubować kolby w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 30 dni><.
	UWAGA: Nadmiar węglowodorów może być toksyczny dla drobnoustrojów, dlatego zacznij od niskiego stężenia i stopniowo je zwiększaj.</li>
	<li>Powtórzyć powyższe czynności dla każdego dodatkowego szczepu, który musi zostać oceniony pod kątem degradacji węglowodorów.</li>
	<li>Mierzyć średnicę zewnętrzną600 każdej kolby co 5 dni i wykreślać krzywą wzrostu. Wydłuż inkubację do 45 dni, jeśli bakterie mogą wykorzystywać styren. Wzrost OD600 wskazuje, że bakteria może metabolizować styren.</li>
</ol>
3. Badania przesiewowe degradacji katecholi przez izolaty bakteryjne
UWAGA: Degradacja węglowodorów aromatycznych, takich jak styren, benzen, ksylen, naftalen, fenole, itp., wytwarza katechole jako produkty pośrednie reakcji. Katechole są dalej metabolizowane przez bakterie za pomocą enzymów 1,2-dioksygenazy katecholowej i dioksygenazy katecholu 2,3-katecholu odpowiednio przez szlaki orto- i meta-rozszczepienia26. Enzymy te biorą również udział w degradacji innych węglowodorów, takich jak chlorobenzen27. Wspomniany poniżej protokół wykorzystuje lizat całych komórek do testu enzymatycznego katecholu 2, 3-dioksygenazy<klasa sup = "xref">28. Ta sama metoda lizy może być stosowana do badania przesiewowego aktywności katecholu 1, 2-dioksygenazy. Jednak skład mieszaniny reakcyjnej będzie się różnił. Oba enzymy są z natury indukowane i mogą być indukowane przez dodanie fenolu do pożywki wzrostowej.
<ol>
	<li>Za pomocą sterylnej pętli zaszczepij kolonię bakteryjną ze świeżo prążkowanej płytki do pożywki z soli mineralnych (MSM) uzupełnionej 1-4 mM fenolu. Inkubować kulturę w temperaturze 30 °C i 200 obr./min. Zebrać kulturę w temperaturze 4 °C, gdy OD600 osiągnie wartość 1,4-1,6 (tj. w późnej fazie wykładniczej), wirując w temperaturze 4500 x g przez 20 minut.</li>
	<li>Przemyć osad komórkowy buforem fosforanowym (0,5 M, pH 7,5).</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w wyżej wymienionym buforze fosforanowym i dostosować końcowy OD600 ≈ 1,0.</li>
	<li>Lizować komórki za pomocą pulsacyjnej sonikacji przez 1,5 minuty, przy czym czas trwania każdego impulsu wynosi 15 s. Po tym kroku zawiesina musi być czysta lub mniej mętna. Jeśli nie, zwiększ liczbę impulsów i sprawdź, czy zawieszenie jest czyste. Po każdym impulsie należy przechowywać próbkę na lodzie, aby uniknąć degradacji białka.</li>
	<li>Usunąć resztki komórek i nieuszkodzone komórki przez odwirowanie przy 9 000 x g przez 30 minut, utrzymując niską temperaturę (4 °C).</li>
	<li>Ostrożnie odpipetować klarowny supernatant. Ta frakcja zawiera surowy ekstrakt do oznaczania enzymów.</li>
	<li>Określ stężenie białka w surowym ekstrakcie metodą Bradforda lub Lowry'ego29,30.</li>
	<li>Aby określić aktywność 2,3-dioksygenazy katecholowej, należy zmierzyć tworzenie się końcowego produktu reakcji (semialdehydu 2-hydroksymukonowego) za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną, dodając 20 μl katecholu (50 mM), 960 μl buforu fosforanowego (50 mM, pH 7,5) i 20 μl surowego ekstraktu.</li>
	<li>W celu kontroli ujemnej zastąpić surowy ekstrakt buforem fosforanowym i dostosować końcową objętość do 1 ml.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę reakcyjną przez 30 minut. W ustalonych odstępach czasu mierzyć absorbancję przy 375 nm. Wzrost absorbancji wskazuje na powstawanie końcowego produktu reakcji, semialdehydu kwasu 2-hydroksymukonowego (2-HMS). Wykonaj eksperyment w trzech egzemplarzach. 
	UWAGA: Catechol jest wrażliwy na światło i tlen. Mieszaninę reakcyjną należy przechowywać w ciemności i szczelnie zamykać probówki, aby zapobiec naturalnemu rozkładowi katecholu.</li>
</ol>
4. Izolacja genomowego DNA czystej kultury
UWAGA: To jest ogólny protokół izolacji genomowego DNA. Barwienie metodą Grama przeprowadzono na etapie pobierania, przetwarzania i analizy próbki. Ze względu na różnice w grubości ścianki komórkowej bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, metoda lizy komórek jest odpowiednio modyfikowana. Podczas izolowania należy nosić rękawiczki i dezynfekować stół warsztatowy 70% etanolem, aby uniknąć degradacji DNA przez nukleazy. Niektóre z wymienionych poniżej chemikaliów mogą powodować poważne oparzenia skóry i należy zachować odpowiednią ostrożność podczas obchodzenia się z nimi.
<ol>
	<li>Izolacja genomowego DNA z bakterii Gram-ujemnych31.
	<ol>
		<li>Wybierz pojedynczą kolonię i zaszczep ją w świeżej pożywce wzrostowej w sterylnych probówkach.</li>
		<li>Umieścić probówki w wytrząsarce inkubatora z prędkością 200 obr./min i pozostawić bakterie do wzrostu przez noc w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Następnego dnia zasyp 1,5 ml wyhodowanej przez noc kultury w temperaturze 12 400 x g przez 3 minuty.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl buforu do lizy (40 mM tris-octanu, pH 7,8, 20 mM octanu sodu, 1 mM EDTA, 1% SDS).</li>
		<li>Dodać 66 μl roztworu NaCl (5 M) i dobrze wymieszać.</li>
		<li>Otrzymaną mieszaninę osadzać w temperaturze 12 400 x g przez 10 minut (4 °C).</li>
		<li>Odpipetować klarowny sklarent sklarowany do probówki do mikrowirówki i dodać równą objętość chloroformu.</li>
		<li>Odwrócić roztwór kilkakrotnie mieszać, aż do uzyskania mlecznego roztworu.</li>
		<li>Wirować w temperaturze 12 400 x g przez 3 minuty i przenieść supernatant do czystej fiolki.</li>
		<li>Dodaj 1 ml lodowatego 100% etanolu; mieszaj przez odwrócenie, aż wytrącą się białe nici DNA.</li>
		<li>Odwirować wytrącone DNA w temperaturze 2 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Umyj osad DNA 1 ml 70% etanolu i pozostaw osad DNA do wyschnięcia na 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Po wysuszeniu zawiesić osad w 100 μl 1x buforu Tris-EDTA(TE) i przechowywać DNA w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Zmierz stężenie (A260/280) za pomocą spektrofotometru i uruchom DNA na żelu agarozowym (1%), aby ocenić jakość DNA24.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja genomowego DNA ze szczepu Gram-dodatniego32
	<ol>
		<li>Wybierz pojedynczą kolonię i zaszczep ją w świeżej pożywce wzrostowej w sterylnych probówkach.</li>
		<li>Umieść probówki w wytrząsarce inkubatora z prędkością 200 obr./min i pozwól bakteriom rosnąć przez noc w odpowiedniej temperaturze wzrostu.</li>
		<li>Następnego dnia weź 1,5 ml wyhodowanej kultury i odwiruj przy 8 600 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze TE.</li>
		<li>Wyreguluj OD600 = 1,0 za pomocą buforu TE i przenieś 740 μl zawiesiny komórek do czystej probówki do mikrofuge.</li>
		<li>Dodać 20 μl lizozymu (100 mg/ml bulionu) i dobrze wymieszać pipetując. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut (w suchej kąpieli).</li>
		<li>Dodaj 40 μl 10% SDS i dobrze wymieszaj.</li>
		<li>Dodać 8 μl proteinazy K (10 mg/ml). Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 56 °C przez 1-3 godziny (w suchej kąpieli). Zawiesina powinna teraz stać się klarowna o zwiększonej lepkości, co oznacza efektywną lizę komórek. 
		UWAGA: Zawiesinę można pozostawić na noc, jeśli komórki nie są prawidłowo zlizowane.</li>
		<li>Podgrzej mieszaninę CTAB/NaCl w temperaturze 65 °C (w suchej kąpieli) i dodaj 100 μl tej mieszaniny do zawiesiny komórek. Dobrze wymieszaj.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 65 °C przez 10 minut (w suchej kąpieli).</li>
		<li>Dodać 500 μl chloroformu: alkoholu izoamylowego (24:1) i dobrze wymieszać. Wirować w temperaturze 16 900 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C.</li>
		<li>Przenieść fazę wodną do świeżej probówki do mikrowirówki, unikając fazy organicznej (faza lepka na dole).</li>
		<li>Ostrożnie dodać 500 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1) i dobrze wymieszać. Wirować w temperaturze 16 900 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C.</li>
		<li>Pobrać fazę wodną do świeżej probówki do mikrowirówki. Dodać 500 μl chloroformu: alkoholu izoamylowego (24:1) i dobrze wymieszać.</li>
		<li>Przenieść fazę wodną i dodać 0,6 objętości izopropanolu (wstępnie schłodzonego w temperaturze -20 °C).</li>
		<li>Wytrącone nici DNA muszą być widoczne w formie nitkowatej. Inkubować w temperaturze -20 °C przez 2 godziny lub przez noc.</li>
		<li>Wirować przy 16 900 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia DNA.</li>
		<li>Ostrożnie zdekantować izopropanol i umyć granulat 1 ml zimnego 70% etanolu (wstępnie schłodzonego w temperaturze -20 °C) w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń.</li>
		<li>Wirować przy 16 900 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Pozostaw granulat do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 20 minut lub utrzymuj probówkę w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że granulat nie jest przesuszony.</li>
		<li>Zawiesić w 100 μl 1x buforu TE i przechowywać DNA w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Jeśli osad zostanie nadmiernie przesuszony i trudno go ponownie zawiesić, należy inkubować probówkę do mikrowirówki z osadem DNA i wodą wolną od nukleaz w temperaturze 37 °C przez 15-20 minut i ponownie zawiesić przez pipetowanie.</li>
		<li>Zmierz stężenie (A260/280) za pomocą spektrofotometru po rozcieńczeniu 1:100 w buforze 1x TE i uruchom DNA na żelu agarozowym (1%), aby ocenić jakość DNA24.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Sekwencjonowanie 16S rRNA
UWAGA: Protokół opisany poniżej służy do amplifikacji i sekwencjonowania 16S rRNA do identyfikacji bakterii. Informacje pochodzące z sekwencji 16S rRNA są wykorzystywane do identyfikacji nieznanego organizmu i znalezienia pokrewieństwa między różnymi organizmami.
<ol>
	<li>Aby zidentyfikować szczepy, amplifikuj DNA wyizolowane z czystych kultur bakteryjnych metodą PCR z uniwersalnymi starterami ukierunkowanymi na sekwencję 16S rRNA dla bakterii: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') i 1492R (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')33.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę PCR (25 μl reakcji) na lodzie z 18 μl wody autoklawowanej/wolnej od nukleaz, 2,5 μl 10x buforu, 0,5 μl starterów do przodu i do tyłu (zapas 100 μM), 2 μl mieszanki dNTPs (zapas 100 μM), 1 μl matrycy DNA (2-15 ng / μL) i 1 U polimerazy Taq.</li>
	<li>Do amplifikacji genu 16S rRNA należy zastosować następujące warunki cykliczne: początkowa denaturacja w temperaturze 94 °C przez 10 minut (końcowa denaturacja w temperaturze 94 °C przez 40 s, wyżarzanie startera w temperaturze 56 °C przez 1 minutę, przedłużenie w temperaturze 74 °C przez 2 minuty) x 30 cykli, końcowe przedłużenie w temperaturze 74 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Po zakończeniu cyklu wymieszaj 5 μl próbki i 1 μl 5x barwnika ładującego DNA. Uruchom na 1% żelu agarozowym, aby sprawdzić amplifikację. Produkty PCR należy przechowywać przez krótki czas w temperaturze 4 °C lub zamrażać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	<li>W przypadku sekwencjonowania genu 16S rRNA należy przeprowadzić tę samą reakcję, jak wspomniano powyżej, dla większej objętości (100 μl).</li>
	<li>Oczyść amplikony do sekwencjonowania Sangera 24,34 za pomocą zestawu do oczyszczania produktu PCR lub wymieszaj całą próbkę z barwnikiem ładującym DNA i załaduj żel agarozowy, aby wykonać metodę ekstrakcji żelu.</li>
	<li>Po zakończeniu sekwencjonowania przekonwertuj plik wyników w formacie FASTA i sprawdź podobieństwo sekwencji za pomocą podstawowego narzędzia do wyszukiwania wyrównania lokalnego (BLAST) na NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)35.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Powszechnie wiadomo, że tylko około 1% bakterii na Ziemi może być łatwo hodowanych w laboratorium6. Nawet wśród bakterii hodowlanych wiele pozostaje niescharakteryzowanych. Udoskonalenia w metodach molekularnych nadały nowy wymiar analizie i ocenie społeczności bakteryjnych. Takie techniki mają jednak ograniczenia, ale nie sprawiają, że analizy kultur są zbędne. Techniki czystej hodowli w celu wyizolowania poszczególnych gatunków bakterii pozostają podstawowym mechanizmem charakterystyki właściwoś...

Węglowodory (HC) są szeroko stosowane zarówno jako paliwa, jak i w zastosowaniach chemicznych. Węglowodory aromatyczne, takie jak benzen, toluen i ksylen, są szeroko stosowane jako rozpuszczalniki1. Alkeny, takie jak etylen i propylen, służą jako prekursory w syntezie odpowiednio polimerów polietylenu i polipropylenu. Polimeryzacja innego węglowodoru, styrenu, tworzy polistyren. Działania antropogeniczne wprowadzają węglowodory do środowiska podczas ich produkcji i transportu. Zanieczyszczenie gleby i wody węglowodorami stanowi poważne zagrożenie dla środowiska i zdrowia ludzkiego. Mikroorganizmy odgrywają ważną rolę w utrzymaniu ekosystemu, regulując cykle biogeochemiczne i wykorzystując szeroką gamę substratów, w tym zanieczyszczenia i ksenobiotyki, przekształcając je w węgiel i źródło energii. Ten proces detoksykacji zanieczyszczeń środowiska przez mikroorganizmy jest znany jako bioremediacja3,4,5,6,7.
Mikroorganizmy zdolne do rozkładu węglowodorów znajdują się w siedliskach wodnych i glebowych8,9,10. Zidentyfikowano wiele bakterii o potencjale degradacji alkanów i aromatycznych HC, takich jak Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter i Oleibacter11. Rozwój zaawansowanych technologicznie podejść niezależnych od kultur pomógł odkryć nowe społeczności mikrobiologiczne rozkładające HC12. Materiał genomowy wyizolowany bezpośrednio z próbek źródłowych jest amplifikowany i sekwencjonowany za pomocą metod o wysokiej przepustowości, takich jak sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), po którym następuje analiza, eliminując potrzebę hodowli mikroorganizmów. Metody NGS, takie jak analiza metagenomu, są drogie i mają wady związane z procesem amplifikacji13. Techniki uprawy, takie jak selektywna hodowla wzbogacająca14, które mają na celu izolację mikroorganizmów rozkładających węglowodory, są nadal użyteczne, ponieważ pozwalają naukowcom badać i manipulować szlakami metabolicznymi w izolatach bakteryjnych.
Izolacja genomowego DNA i późniejsze sekwencjonowanie materiału genomowego ujawnia cenne informacje o każdym organizmie. Sekwencjonowanie całego genomu pomaga w identyfikacji genów kodujących oporność na antybiotyki, potencjalnych celów leków, czynników wirulencji, transporterów, enzymów metabolizujących ksenobiotyki itp15,16,17. Udowodniono, że sekwencjonowanie genu kodującego 16SrRNA jest solidną techniką identyfikacji filogenezy bakteryjnej. Zachowanie sekwencji i funkcji genu na przestrzeni lat sprawia, że jest to niezawodne narzędzie do identyfikacji nieznanych bakterii i porównywania izolatu z najbliższymi gatunkami. Ponadto długość tego genu jest optymalna dla analizy bioinformatycznej18. Wszystkie te cechy, wraz z łatwością amplifikacji genów za pomocą uniwersalnych starterów i ulepszeniem technologii sekwencjonowania genów, sprawiają, że jest to złoty standard w identyfikacji drobnoustrojów.
Tutaj opisujemy procedurę odzyskiwania mikroorganizmów hodowlanych z potencjałem degradacji HC z próbek środowiskowych. Opisana poniżej metoda przedstawia pobieranie i identyfikację bakterii rozkładających HC i jest podzielona na pięć sekcji: (1) pobieranie bakterii z próbek wody, (2) izolacja czystych kultur, (3) badanie zdolności izolatów bakteryjnych do rozkładu HC, (4) izolacja genomowego DNA oraz (5) identyfikacja na podstawie sekwencjonowania genu 16S rRNA i analizy BLAST. Procedura ta może być dostosowana do izolowania bakterii do wielu różnych zastosowań biotechnologicznych.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4718</td><td>Elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>Chlorek amonu (NH4Cl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td>Składnik podłoża wzrostowego</td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Millipore</td><td>1016141000</td><td>Przygotowanie pożywki stałej</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>MERCK</td><td>C4901-500G</td><td>Składnik pożywki wzrostowej</td></tr><tr><td>Catechol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>135011</td><td>Test degradacji węglowodorów</td></tr><tr><td>Bromek cetyltrimetyloamoniowy, CTAB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6269</td><td>Izolacja genomowego DNA</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>HIMEDIA</td><td>MB109</td><td>Izolacja genomowego DNA</td></tr><tr><td>Fosforan disodowy (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td>Składnik pożywki wzrostowej</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>składnik buforowy gDNA</td></tr><tr><td>Siarczan żelazawy, siedmiowodny (FeSO4.7H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215422</td><td>Składnik pożywki wzrostowej</td></tr><tr><td></td><td>Glukoza Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>składnik Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Składnik pożywki wzrostowej; Zapasy glicerolu</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>HIMEDIA</td><td>MB063</td><td>Izolacja genomowego DNA</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Difco</td><td>244520</td><td>Pożywka</td></tr><tr><td>wzrostowa Luria-Bertani (LB)</td><td>Difco</td><td>244620</td><td>Pożywka</td></tr><tr><td>wzrostowa Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>MERCK</td><td>M2643</td><td>Składnik pożywki wzrostowej</td></tr><tr><td>Jednowodny siarczan manganu (II) (MnSO4. H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221287</td><td>Składnik podłoża wzrostowego</td></tr><tr><td>Bulion odżywczy (NB)</td><td>Merck (Millipore)</td><td>03856-500G</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Merck</td><td>91249-500G</td><td>Składnik podłoża wzrostowego</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1037</td><td>Izolacja genomowego DNA</td></tr><tr><td>Fosforan potasu, dwuzasadowy (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>składnik Fosforan potasu, monozasadowy (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Składnik pożywki wzrostowej</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2546</td><td>Izolacja genomowego DNA</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Zestaw do ekstrakcji</td><td>QIAGEN</td><td>160016235</td><td>DNA oczyszczanie</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Zestaw do oczyszczania</td><td>QIAGEN</td><td>163038783</td><td>Oczyszczanie DNA</td></tr><tr><td>R2A Agar</td><td>Millipore</td><td>1004160500</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spektrofotometr</td><td>BIO-RAD</td><td>4006221</td><td>Pomiar absorbancji</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>Izolacja genomowego DNA</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Składnik pożywki wzrostowej</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>Izolacja genomowego DNA</td></tr><tr><td>Styren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4972</td><td>Biodegradacja styrenu</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Taq NEB</td><td></td><td>M0273X</td><td>16s rRNA PCR</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93283</td><td>Zawieszenie genomowego DNA</td></tr><tr><td>Tryptyczny bulion sojowy (TSB)</td><td>Merck</td><td>22092-500G</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625-1KG</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr> składnik <tr><td>Siarczan siedmiowodny (ZnSO4.7H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221376</td><td>Składnik podłoża wzrostowego</td></tr></tbody></table>

izolacja, rozmnażanie i identyfikacja gatunków bakterii o właściwościach metabolizowania węglowodorów z siedlisk wodnych

Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats

Zanieczyszczenia węglowodorowe są odporne na degradację, a ich akumulacja w środowisku jest toksyczna dla wszystkich form życia. Bakterie kodują liczne enzymy katalityczne i są naturalnie zdolne do metabolizowania węglowodorów. Naukowcy wykorzystują różnorodność biologiczną w ekosystemach wodnych do izolowania bakterii o potencjale biodegradacji i bioremediacji. Takie izolaty ze środowiska zapewniają bogaty zestaw szlaków metabolicznych i enzymów, które można dalej wykorzystać do zwiększenia skali procesu degradacji na skalę przemysłową. W tym artykule nakreśliliśmy ogólny proces izolacji, rozmnażania i identyfikacji gatunków bakterii z siedlisk wodnych oraz badamy ich zdolność do wykorzystania węglowodorów jako jedynego źródła węgla in vitro przy użyciu prostych technik. Niniejszy protokół opisuje izolację różnych gatunków bakterii i ich późniejszą identyfikację za pomocą analizy 16S rRNA. W protokole przedstawiono również etapy charakterystyki potencjału degradacji węglowodorów izolatów bakteryjnych. Protokół ten będzie przydatny dla naukowców próbujących wyizolować gatunki bakterii z siedlisk środowiskowych do ich zastosowań biotechnologicznych.

Schemat przedstawiający całą procedurę izolacji i przesiewania bakterii ze środowisk wodnych oraz ich późniejszą identyfikację za pomocą analizy 16S rRNA przedstawiono na Rysunku 1. Próbki wody z terenu podmokłego w Dadri w Indiach pobrano do sterylnych szklanych butelek i niezwłocznie dostarczono do laboratorium w celu ich przetworzenia. Próbki przepuszczono przez arkusze filtracyjne o rozmiarze porów 0,22 µm, a następnie papiery filtracyjne pozostawiono w kontakcie z różn...

Przedstawiamy proces izolacji, rozmnażania i charakteryzowania bakterii rozkładających węglowodory z siedlisk wodnych. W protokole opisano izolację bakterii, identyfikację metodą 16S rRNA oraz badanie ich potencjału degradacji węglowodorów. Ten artykuł pomoże naukowcom w scharakteryzowaniu różnorodności biologicznej drobnoustrojów w próbkach środowiskowych, a w szczególności w badaniach przesiewowych pod kątem drobnoustrojów o potencjale bioremediacji.

Izolacja, rozmnażanie i identyfikacja gatunków bakterii o właściwościach metabolizowania węglowodorów z siedlisk wodnych

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous ...

Protokół ten określa izolację, hodowlę i identyfikację mikroorganizmów rozkładających węglowodory z siedlisk ekologicznych. Ta metoda nie wymaga skomplikowanych instrumentów i może być łatwo wykonana w standardowej konfiguracji laboratoryjnej. Można go również łatwo dostosować do badania innych podłoży.Technikę tę można łatwo przełożyć na różne nisze ekologiczne, a degradację różnych substratów można ocenić. Procedurę zademonstruje Deepa Sethi, doktorantka z laboratorium dr Richy Priyadarshini. Na początek zbierz 500 mililitrów próbki wody w pięciu sterylnych szklanych butelkach z różnych miejsc w zbiornikach wodnych i zmierz pH i temperaturę każdej próbki.Następnie przefiltruj próbkę w warunkach aseptycznych w partiach po 100 mililitrów przez arkusze filtracyjne o wielkości porów 0,22 mikrona. I umieść arkusze na różnych płytkach z pożywkami, umieszczając po jednym papierze na talerzu. Po dwóch godzinach odklej papier za pomocą sterylnych kleszczy.Następnie rozcieńczyć niefiltrowane próbki wody, dodając 100 mikrolitrów pobranej próbki wody do 900 mikrolitrów sterylnej podwójnie destylowanej wody. Kontynuować dziesięciokrotne rozcieńczenia, aż do osiągnięcia stosunku rozcieńczenia 1 do 1 000 000. Wymieszać pipetując i upewnić się, że końcowa objętość każdego rozcieńczenia wynosi jeden mililitr.Rozprowadzić 100 mikrolitrów rozcieńczonych próbek wody pojedynczo na wszystkich płytkach pożywki wzrostowej, w trzech egzemplarzach. Inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 do 48 godzin, w zależności od wzrostu kolonii. Aby uzyskać izolowane kolonie, wybierz kolonię za pomocą sterylnej wykałaczki lub końcówki pipety.Wykonaj smugi kwadrantowe i inkubuj płytkę przez noc. Następnego dnia przesiewaj kolonie na podstawie ich cech morfologicznych, takich jak kolor, tekstura, kształt, rozmiar, margines i wysokość. Ponownie rozsiewaj kolonie, aby uzyskać czyste kultury.Po wykonaniu barwienia metodą Grama każdej czystej kultury, przygotuj zapasy glicerolu, zaszczepiając pojedynczą kolonię w trzech mililitrach odpowiedniej pożywki wzrostowej i inkubując w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnego dnia dodaj 700 mikrolitrów nocnej kultury i 300 mikrolitrów 100% glicerolu w kriofiolkach. Zamrozić fiolki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania.Ze świeżo posmarowanego talerza wybierz kolonię i zaszczep ją w pięciu mililitrach bulionu sojowego triptyc lub bulionu odżywczego. Hoduj kulturę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wytrząsając przy 200 obr./min, aż absorpcja osiągnie około dwóch. Następnego dnia wypelnij komórki.Odrzucić supernatant i przemyć osad dwukrotnie dwoma mililitrami autoklawizowanego roztworu soli fizjologicznej. Ponownie odkręć komórki, a następnie ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach płynnego, bezwęglowego podłoża podstawowego lub LCFBM i zmierz absorbancję. Następnie oznacz dwie sterylne 150-mililitrowe kolby Erlenmeyera jako A i B, odpowiednio dla grupy kontrolnej i eksperymentalnej.W kolbie A dodać 40 mililitrów LCFBM, a następnie styren o końcowym stężeniu pięciu milimolów. Do kolby B dodać 35 mililitrów LCFBM i styrenu. Następnie dodać zawiesinę komórkową o końcowej absorbancji około 0,1.Po zwiększeniu objętości w kolbie B do 40 mililitrów za pomocą LCFBM, inkubować obie kolby w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 30 dni. Mierzyć absorbancję każdej kolby co pięć dni i sporządzać wykres krzywej wzrostu. Wydłuż inkubację nawet o 45 dni, jeśli bakterie mogą wykorzystywać styren.Wzrost absorbancji wskazuje, że bakteria może metabolizować styren. Aby wyizolować genomowe DNA z bakterii Gram-ujemnych, wybierz pojedynczą kolonię i zaszczep ją w świeżej pożywce wzrostowej w sterylnej probówce. Po całonocnej inkubacji w inkubatorze z wytrząsaniem osadzaj 1,5 mililitra wyhodowanej kultury.Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach buforu do lizy. Następnie dodaj 66 mikrolitrów pięciomolowego roztworu chlorku sodu i dobrze wymieszaj. Po odwirowaniu powstałej mieszaniny odpipetować klarowny supinat w świeżej probówce do mikrowirówki i dodać równą objętość chloroformu.Wymieszaj roztwór, odwracając go wiele razy, aż do uzyskania mlecznego roztworu. Ponownie zakręcić probówką i przenieść supernatant do czystej fiolki. Następnie dodaj jeden mililitr lodowatego 100% etanolu i mieszaj przez odwrócenie, aż wytrącą się białe nici DNA.Odwirować wytrącone DNA. Odrzucić supernatant. I umyj granulat jednym mililitrem 70% etanolu.Po wyrzuceniu prania pozostaw osad DNA do wyschnięcia przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po wysuszeniu ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu Tris-EDTA. Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru i uruchom DNA na 1% żelu agarozowym, aby ocenić jego jakość.Aby zidentyfikować szczepy, należy amplifikować DNA wyizolowane z czystych kultur bakteryjnych metodą PCR, z uniwersalnymi starterami ukierunkowanymi na sekwencję rybosomalnego RNA 16S dla bakterii. Przygotuj 25 mikrolitrów mieszanki PCR na lodzie, dodaj jeden mikrolitr matrycy DNA i ustaw warunki cykliczne dla amplifikacji genu. Po PCR wymieszaj pięć mikrolitrów próbki z jednym mikrolitrem pięciokrotnego barwnika ładującego DNA.I uruchom go na 1% żelu agarozowym, aby zweryfikować amplifikację. W przypadku rybosomalnego 16S sekwencjonowania genu rNA należy wywołać tę samą reakcję, jak opisano wcześniej, ale w większej objętości. Następnie, aby oczyścić amplikony do sekwencjonowania Sangera, wymieszaj całą próbkę z barwnikiem ładującym DNA i załaduj ją na żel agarozowy, aby wykonać metodę ekstrakcji żelu.Po zakończeniu sekwencjonowania przekonwertuj plik wyników na szybszy format i sprawdź podobieństwo sekwencji za pomocą narzędzia BLAST w NCBI. Kolonie bakterii wyizolowane z próbek wody z mokradeł w Dadri w Indiach pokazano tutaj. Wyizolowane bakterie hodowano indywidualnie w odpowiednich pożywkach, z ciekłym styrenem jako jedynym źródłem węgla.Potencjał degradacji węglowodorów izolatów bakteryjnych oceniono za pomocą testu degradacji katecholi. Reprezentatywny test dla jednego z izolatów pokazano tutaj. Integralność genomowego DNA została potwierdzona poprzez wizualizację małej próbki DNA na żelu agarozowym.A rybosomalny gen rNA 16S amplifikowano przy użyciu uniwersalnych starterów. Drzewo filogenetyczne zostało skonstruowane w celu zobrazowania pokrewieństwa między szczepami exiguobacterium wyizolowanymi z terenów podmokłych ze znanymi gatunkami exiguobacterium. Krytycznym etapem protokołu jest sprawdzenie wykorzystania testowanego podłoża.W zależności od charakterystyki wzrostu, mikroorganizm może nie przystosować się natychmiast do wykorzystania badanego podłoża i może wymagać procesu wzbogacania. Metoda ta koncentruje się na populacji bakterii nadających się do hodowli w próbkach środowiskowych. Naukowcy mogą dalej przeprowadzać eksperymenty, takie jak sekwencjonowanie całego genomu bakterii i profilowanie metaboliczne, które mogą dostarczyć cennych informacji na temat genów i szlaków zaangażowanych w degradację węglowodorów.

isolation-propagation-identification-bacterial-species-with

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Środowiskowy bakterioplankton inkubuje się z modelowym związkiem rozpuszczonego węgla organicznego (DOC) oraz odczynnikiem do znakowania DNA, bromodeoksyurydyną (BrdU). Następnie komórki degradujące DOC oddziela się od całej populacji na podstawie zwiększonego wbudowania BrdU przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Komórki te są następnie identyfikowane za pomocą późniejszych analiz molekularnych.

Znakowanie bromodeoksyurydyną (BrdU) oraz następujące po nim sortowanie komórek metodą fluorescencji w celu niezależnej od hodowli identyfikacji bakterioplanktonu degradującego rozpuszczony węgiel organiczny

Źródło: Ghadigaonkar, D. i Rath, A. Izolacja i identyfikacja bakterii opornych na antybiotyki na bazie wody oraz charakterystyka molekularna ich genów oporności na antybiotyki. J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje izolację i przygotowanie bakterii opornych na antybiotyki z próbki wody przy użyciu selektywnych pożywek. DNA jest ekstrahowane z bakterii opornych na antybiotyki i amplifikowane w celu identyfikacji genów oporności bakterii na antybiotyki.

Izolacja bakterii opornych na antybiotyki z próbki wody do analizy molekularnej

Źródło: Villela, H. D. M. i in. Poszukiwanie szczepów mikroorganizmów do bioremediacji oraz rozwój probiotyków do badań i ochrony metaorganizmów. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje izolację bakterii morskich degradujących zanieczyszczenia poprzez seryjne rozcieńczanie, selekcję kolonii oraz wzrost w medium zawierającym EE2. Wykorzystując EE2 jako jedyne źródło węgla, protokół identyfikuje szczepy bakterii zdolne do metabolizowania tego zanieczyszczenia środowiska.

Przesiewowe bakterie morskie pod kątem izolacji szczepów degradujących zanieczyszczenia

Źródło: Villela, H. D. M. i in. Poszukiwanie szczepów mikroorganizmów do bioremediacji oraz rozwój probiotyków do badań i ochrony metaorganizmów. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje selektywną izolację bakterii morskich degradujących ropę poprzez wzbogacanie próbek wody morskiej na nośnikach olejowych, co umożliwia odzyskiwanie czystych szczepów z potencjalnymi zastosowaniami w bioremediacji ropy naftowej i oczyszczaniu środowiska.

Selektywne wzbogacanie i izolacja bakterii morskich degradujących ropę z próbek wody morskiej

Zanieczyszczenie wpływa na wszystkie biomy. Szczególnie ucierpiały środowiska morskie, zwłaszcza rafy koralowe, jeden z najbardziej wrażliwych ekosystemów na Ziemi. Bioremediacja to zdolność organizmów do rozkładu zanieczyszczeń. W tym miejscu opisujemy metodologie izolowania i testowania drobnoustrojów prezentujących zdolność bioremediacji i potencjalne cechy probiotyczne dla koralowców.

Poszukiwanie szczepów drobnoustrojów do bioremediacji i rozwoju probiotyków do badań i ochrony metaorganizmów

Izolacja odpornych na metale ciężkie mikroorganizmów ze źródeł geotermalnych jest gorącym tematem dla rozwoju biosystemów bioremediacji i monitorowania środowiska. Badanie to zapewnia metodologiczne podejście do izolowania i identyfikacji bakterii tolerujących metale ciężkie z gorących źródeł.

Bioprospekcja mikroorganizmów ekstremofilnych w celu rozwiązania problemu zanieczyszczenia środowiska

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji i identyfikacji bakterii opornych na antybiotyki z wody oraz molekularną charakterystykę ich genów oporności na antybiotyki (ARG). Zastosowanie technik opartych na kulturach i nieopartych na kulturach (analiza metagenomiczna) dostarcza pełnych informacji na temat całkowitej różnorodności bakterii i całkowitej puli różnych ARG obecnych w wodach słodkich z Bombaju w Indiach.

Izolacja i identyfikacja wodnych bakterii opornych na antybiotyki oraz charakterystyka molekularna ich genów oporności na antybiotyki

To jest metoda pobierania próbek i izolowania bakterii hodowlanych z mikrobioty skórnej europejskich salamander pletodontycznych (rodzaj Speleomantes). W tym miejscu przedstawiamy protokół pobierania próbek skóry salamandry za pomocą wymazów i przetwarzania ich przy użyciu metod hodowlanych. Opisujemy pobieranie próbek, izolację i założenie hodowli aksenicznej z charakterystyką szczepu bakteryjnego.

Izolacja i identyfikacja szczepów bakteryjnych ze skóry lądowych

W tym miejscu opisano metody pobierania próbek ze stref eufotowych ekosystemów morskich i słodkowodnych w celu wyizolowania cyjanofagów (i ich gospodarzy) oraz procesy po pobraniu próbek, które wzbogacają pojedyncze genotypy i charakteryzują dynamikę interakcji wirus-gospodarz.

Pobieranie próbek środowiskowych mikroorganizmów fotosyntetycznych i ich wirusów: od terenu do laboratorium

Dzikie zwierzęta są często pasożytowane przez szeroki zakres robaków. Cztery główne typy robaków to "glisty" (nicienie), "robaki o kolczastych głowach" (acanthocephalans), "przywry" (przywry) i "tasiemce" (tasiemce). Tutaj opisujemy, w jaki sposób robaki są zbierane od kręgowców oraz jak są one zachowywane i identyfikowane taksonomicznie.

Zbieranie i identyfikacja robaków od dzikich zwierząt

Poznaj metodę izolacji i identyfikacji bakterii rozkładających węglowodory ze środowisk wodnych przy użyciu technik mikrobiologicznych i sekwencjonowania 16S rRNA. Protokół ten umożliwia badanie bioróżnorodności mikroorganizmów.

Izolacja, rozmnażanie i identyfikacja gatunków bakterii o właściwościach metabolizowania węglowodorów z siedlisk wodnych

Przeglądaj więcej filmów