Izolacja, rozmnażanie i identyfikacja gatunków bakterii o właściwościach metabolizowania węglowodorów z siedlisk wodnych

Protokół ten określa izolację, hodowlę i identyfikację mikroorganizmów rozkładających węglowodory z siedlisk ekologicznych. Ta metoda nie wymaga skomplikowanych instrumentów i może być łatwo wykonana w standardowej konfiguracji laboratoryjnej. Można go również łatwo dostosować do badania innych podłoży.

Technikę tę można łatwo przełożyć na różne nisze ekologiczne, a degradację różnych substratów można ocenić. Procedurę zademonstruje Deepa Sethi, doktorantka z laboratorium dr Richy Priyadarshini. Na początek zbierz 500 mililitrów próbki wody w pięciu sterylnych szklanych butelkach z różnych miejsc w zbiornikach wodnych i zmierz pH i temperaturę każdej próbki.

Następnie przefiltruj próbkę w warunkach aseptycznych w partiach po 100 mililitrów przez arkusze filtracyjne o wielkości porów 0,22 mikrona. I umieść arkusze na różnych płytkach z pożywkami, umieszczając po jednym papierze na talerzu. Po dwóch godzinach odklej papier za pomocą sterylnych kleszczy.

Następnie rozcieńczyć niefiltrowane próbki wody, dodając 100 mikrolitrów pobranej próbki wody do 900 mikrolitrów sterylnej podwójnie destylowanej wody. Kontynuować dziesięciokrotne rozcieńczenia, aż do osiągnięcia stosunku rozcieńczenia 1 do 1 000 000. Wymieszać pipetując i upewnić się, że końcowa objętość każdego rozcieńczenia wynosi jeden mililitr.

Rozprowadzić 100 mikrolitrów rozcieńczonych próbek wody pojedynczo na wszystkich płytkach pożywki wzrostowej, w trzech egzemplarzach. Inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 do 48 godzin, w zależności od wzrostu kolonii. Aby uzyskać izolowane kolonie, wybierz kolonię za pomocą sterylnej wykałaczki lub końcówki pipety.

Wykonaj smugi kwadrantowe i inkubuj płytkę przez noc. Następnego dnia przesiewaj kolonie na podstawie ich cech morfologicznych, takich jak kolor, tekstura, kształt, rozmiar, margines i wysokość. Ponownie rozsiewaj kolonie, aby uzyskać czyste kultury.

Po wykonaniu barwienia metodą Grama każdej czystej kultury, przygotuj zapasy glicerolu, zaszczepiając pojedynczą kolonię w trzech mililitrach odpowiedniej pożywki wzrostowej i inkubując w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnego dnia dodaj 700 mikrolitrów nocnej kultury i 300 mikrolitrów 100% glicerolu w kriofiolkach. Zamrozić fiolki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania.

Ze świeżo posmarowanego talerza wybierz kolonię i zaszczep ją w pięciu mililitrach bulionu sojowego triptyc lub bulionu odżywczego. Hoduj kulturę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wytrząsając przy 200 obr./min, aż absorpcja osiągnie około dwóch. Następnego dnia wypelnij komórki.

Odrzucić supernatant i przemyć osad dwukrotnie dwoma mililitrami autoklawizowanego roztworu soli fizjologicznej. Ponownie odkręć komórki, a następnie ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach płynnego, bezwęglowego podłoża podstawowego lub LCFBM i zmierz absorbancję. Następnie oznacz dwie sterylne 150-mililitrowe kolby Erlenmeyera jako A i B, odpowiednio dla grupy kontrolnej i eksperymentalnej.

W kolbie A dodać 40 mililitrów LCFBM, a następnie styren o końcowym stężeniu pięciu milimolów. Do kolby B dodać 35 mililitrów LCFBM i styrenu. Następnie dodać zawiesinę komórkową o końcowej absorbancji około 0,1.

Po zwiększeniu objętości w kolbie B do 40 mililitrów za pomocą LCFBM, inkubować obie kolby w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 30 dni. Mierzyć absorbancję każdej kolby co pięć dni i sporządzać wykres krzywej wzrostu. Wydłuż inkubację nawet o 45 dni, jeśli bakterie mogą wykorzystywać styren

Wzrost absorbancji wskazuje, że bakteria może metabolizować styren. Aby wyizolować genomowe DNA z bakterii Gram-ujemnych, wybierz pojedynczą kolonię i zaszczep ją w świeżej pożywce wzrostowej w sterylnej probówce. Po całonocnej inkubacji w inkubatorze z wytrząsaniem osadzaj 1,5 mililitra wyhodowanej kultury.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach buforu do lizy. Następnie dodaj 66 mikrolitrów pięciomolowego roztworu chlorku sodu i dobrze wymieszaj. Po odwirowaniu powstałej mieszaniny odpipetować klarowny supinat w świeżej probówce do mikrowirówki i dodać równą objętość chloroformu.

Wymieszaj roztwór, odwracając go wiele razy, aż do uzyskania mlecznego roztworu. Ponownie zakręcić probówką i przenieść supernatant do czystej fiolki. Następnie dodaj jeden mililitr lodowatego 100% etanolu i mieszaj przez odwrócenie, aż wytrącą się białe nici DNA.

Odwirować wytrącone DNA. Odrzucić supernatant. I umyj granulat jednym mililitrem 70% etanolu.

Po wyrzuceniu prania pozostaw osad DNA do wyschnięcia przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po wysuszeniu ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu Tris-EDTA. Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru i uruchom DNA na 1% żelu agarozowym, aby ocenić jego jakość.

Aby zidentyfikować szczepy, należy amplifikować DNA wyizolowane z czystych kultur bakteryjnych metodą PCR, z uniwersalnymi starterami ukierunkowanymi na sekwencję rybosomalnego RNA 16S dla bakterii. Przygotuj 25 mikrolitrów mieszanki PCR na lodzie, dodaj jeden mikrolitr matrycy DNA i ustaw warunki cykliczne dla amplifikacji genu. Po PCR wymieszaj pięć mikrolitrów próbki z jednym mikrolitrem pięciokrotnego barwnika ładującego DNA.

I uruchom go na 1% żelu agarozowym, aby zweryfikować amplifikację. W przypadku rybosomalnego 16S sekwencjonowania genu rNA należy wywołać tę samą reakcję, jak opisano wcześniej, ale w większej objętości. Następnie, aby oczyścić amplikony do sekwencjonowania Sangera, wymieszaj całą próbkę z barwnikiem ładującym DNA i załaduj ją na żel agarozowy, aby wykonać metodę ekstrakcji żelu.

Po zakończeniu sekwencjonowania przekonwertuj plik wyników na szybszy format i sprawdź podobieństwo sekwencji za pomocą narzędzia BLAST w NCBI. Kolonie bakterii wyizolowane z próbek wody z mokradeł w Dadri w Indiach pokazano tutaj. Wyizolowane bakterie hodowano indywidualnie w odpowiednich pożywkach, z ciekłym styrenem jako jedynym źródłem węgla.

Potencjał degradacji węglowodorów izolatów bakteryjnych oceniono za pomocą testu degradacji katecholi. Reprezentatywny test dla jednego z izolatów pokazano tutaj. Integralność genomowego DNA została potwierdzona poprzez wizualizację małej próbki DNA na żelu agarozowym.

A rybosomalny gen rNA 16S amplifikowano przy użyciu uniwersalnych starterów. Drzewo filogenetyczne zostało skonstruowane w celu zobrazowania pokrewieństwa między szczepami exiguobacterium wyizolowanymi z terenów podmokłych ze znanymi gatunkami exiguobacterium. Krytycznym etapem protokołu jest sprawdzenie wykorzystania testowanego podłoża.

W zależności od charakterystyki wzrostu, mikroorganizm może nie przystosować się natychmiast do wykorzystania badanego podłoża i może wymagać procesu wzbogacania. Metoda ta koncentruje się na populacji bakterii nadających się do hodowli w próbkach środowiskowych. Naukowcy mogą dalej przeprowadzać eksperymenty, takie jak sekwencjonowanie całego genomu bakterii i profilowanie metaboliczne, które mogą dostarczyć cennych informacji na temat genów i szlaków zaangażowanych w degradację węglowodorów.