Name: Wytwarzanie i działanie systemu mikroelektroporacji o ciągłym przepływie z detekcją przepuszczalności (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Poznaj mikroelektroporację z detekcją przepuszczalności w czasie rzeczywistym. Ta metoda umożliwia kontrolowane transfekcje pojedynczych komórek i optymalizację parametrów impulsowania dla różnych typów komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie finansowe ze strony Narodowej Fundacji Nauki (NSF, CBET 0967598, DBI, IDBR 1353918) oraz U.S. Department of Education's Graduate Training in Emerging Areas of Precision and Personalized Medicine (P200A150131) za sfinansowanie stypendium dla doktoranta J.J.S.

<ol><li>Gao, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+CRISPR%2FCas9+gene+editing+in+engineered+T-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of CRISPR/Cas9 gene editing in engineered T-cell therapy.</a> Cancer Medicine. 8 (9), 4254-4264 (2019).</li>
<li>Aijaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomanufacturing+for+clinically+advanced+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Biomanufacturing for clinically advanced cell therapies.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 362-376 (2018).</li>
<li>Milone, M. C., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+use+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Clinical use of lentiviral vectors.</a> Leukemia. 32 (7), 1529-1541 (2018).</li>
<li>Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+electroporation%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry+and+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Theory of electroporation: A review.</a> Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41 (2), 135-160 (1996).</li>
<li>Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electroporation+and+electropermeabilization%3A+mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Membrane electroporation and electropermeabilization: mechanisms and models.</a> Annual Review of Biophysics. 48, 63-91 (2019).</li>
<li>Rosazza, C., Meglic, S. H., Zumbusch, A., Rols, M. P., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+electrotransfer%3A+A+mechanistic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene electrotransfer: A mechanistic perspective.</a> Current Gene Therapy. 16 (2), 98-129 (2016).</li>
<li>Clauss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+non-viral+T-cell+engineering+by+sleeping+beauty+minicircles+diminishing+DNA+toxicity+and+miRNAs+silencing+the+endogenous+T-cell+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient non-viral T-cell engineering by sleeping beauty minicircles diminishing DNA toxicity and miRNAs silencing the endogenous T-cell receptors.</a> Human Gene Therapy. 29 (5), 569-584 (2018).</li>
<li>Sherba, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+electroporation+buffer+composition+on+cell+viability+and+electro-transfection+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The effects of electroporation buffer composition on cell viability and electro-transfection efficiency.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3053(2020).</li>
<li>Lu, H., Schmidt, M. A., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+electroporation+device+for+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic electroporation device for cell lysis.</a> Lab on a Chip. 5 (1), 23-29 (2005).</li>
<li>Kar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation%3A+current+trends%2C+applications+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation: current trends, applications and future prospects.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 28 (12), (2018).</li>
<li>Shi, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+electroporation-based+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A review on electroporation-based intracellular delivery.</a> Molecules. 23 (11), (2018).</li>
<li>Wang, S. N., Zhang, X. L., Wang, W. X., Lee, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semicontinuous+flow+electroporation+chip+for+high-throughput+transfection+on+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Semicontinuous flow electroporation chip for high-throughput transfection on mammalian cells.</a> Analytical Chemistry. 81 (11), 4414-4421 (2009).</li>
<li>Wei, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+implantable+microelectrode+array+for+simultaneous+L-glutamate+and+electrophysiological+recordings+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystems+%26+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">An implantable microelectrode array for simultaneous L-glutamate and electrophysiological recordings in vivo.</a> Microsystems & Nanoengineering. 1, (2015).</li>
<li>Maschietto, M., Dal Maschio, M., Girardi, S., Vassanelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+mammalian+cells+through+SiO2+thin+film+capacitive+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of mammalian cells through SiO2 thin film capacitive microelectrodes.</a> Scientific Reports. 11 (1), (2021).</li>
<li>Wu, Q. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-a-chip%3A+recent+breakthroughs+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Organ-on-a-chip: recent breakthroughs and future prospects.</a> Biomedical Engineering Online. 19 (1), (2020).</li>
<li>Pandey, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+Based+Point-of-Care+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Microfluidics Based Point-of-Care Diagnostics.</a> Biotechnology Journal. 13 (1), (2018).</li>
<li>Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+biosensor+technology+for+potential+applications+-+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in biosensor technology for potential applications - An overview.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, (2016).</li>
<li>Nuxoll, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioMEMS+in+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">BioMEMS in drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1611-1625 (2013).</li>
<li>Kang, S., Kim, K. H., Kim, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+electroporation+system+for+efficient+molecular+delivery+into+Chlamydomonas+reinhardtii+with+a+3-dimensional+microelectrode%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel electroporation system for efficient molecular delivery into Chlamydomonas reinhardtii with a 3-dimensional microelectrode.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li>
<li>Zheng, M. D., Shan, J. W., Lin, H., Shreiber, D. I., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamically+controlled+cell+rotation+in+an+electroporation+microchip+to+circumferentially+deliver+molecules+into+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamically controlled cell rotation in an electroporation microchip to circumferentially deliver molecules into single cells.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 20 (1), (2016).</li>
<li>Santra, T. S., Kar, S., Chang, H. Y., Tseng, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-localized+single-cell+nano-electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Nano-localized single-cell nano-electroporation.</a> Lab on a Chip. 20 (22), 4194-4204 (2020).</li>
<li>Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+electroporation%3A+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integrative Biology. 1 (3), 242-251 (2009).</li>
<li>Santra, T. S., Chang, H. Y., Wang, P. C., Tseng, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+pulse+duration+on+localized+single-cell+nano-electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Impact of pulse duration on localized single-cell nano-electroporation.</a> Analyst. 139 (23), 6249-6258 (2014).</li>
<li>Geng, T., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+electroporation+for+cellular+analysis+and+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery.</a> Lab on a Chip. 13 (19), 3803-3821 (2013).</li>
<li>Hsi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustophoretic+rapid+media+exchange+and+continuous-flow+electrotransfection+of+primary+human+T+cells+for+applications+in+automated+cellular+therapy+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Acoustophoretic rapid media exchange and continuous-flow electrotransfection of primary human T cells for applications in automated cellular therapy manufacturing.</a> Lab on a Chip. 19 (18), 2978-2992 (2019).</li>
<li>Khine, M., Ionescu-Zanetti, C., Blatz, A., Wang, L. P., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+arrays+with+real-time+monitoring+and+feedback+control%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation arrays with real-time monitoring and feedback control.</a> Lab on a Chip. 7 (4), 457-462 (2007).</li>
<li>Ye, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+and+real-time+electrical+monitoring+on+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%222020+33rd+Ieee+International+Conference+on+Micro+Electro+Mechanical+Systems+%28Mems+2020%29%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation and real-time electrical monitoring on a microfluidic chip.</a> 2020 33rd Ieee International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (Mems 2020). , 1040-1043 (2020).</li>
<li>Huang, Y., Rubinsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+electroporation+chip+for+single+cell+membrane+permeabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+a-Physical%22%5BJournal%5D)">Microfabricated electroporation chip for single cell membrane permeabilization.</a> Sensors and Actuators a-Physical. 89 (3), 242-249 (2001).</li>
<li>Guo, X. L., Zhu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controllable+in-situ+cell+electroporation+with+cell+positioning+and+impedance+monitoring+using+micro+electrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Controllable in-situ cell electroporation with cell positioning and impedance monitoring using micro electrode array.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Punjiya, M., Nejad, H. R., Mathews, J., Levin, M., Sonkusale, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+through+device+for+simultaneous+dielectrophoretic+cell+trapping+and+AC+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A flow through device for simultaneous dielectrophoretic cell trapping and AC electroporation.</a> Scientific Reports. 9, (2019).</li>
<li>Wang, H. Y., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+electroporation+for+delivery+of+small+molecules+and+genes+into+cells+using+a+common+DC+power+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Microfluidic electroporation for delivery of small molecules and genes into cells using a common DC power supply.</a> Biotechnology and Bioengineering. 100 (3), 579-586 (2008).</li>
<li>Zheng, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous-flow%2C+electrically-triggered%2C+single+cell-level+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">Continuous-flow, electrically-triggered, single cell-level electroporation.</a> Technology. 5 (1), 31-41 (2017).</li>
<li>Batista Napotnik, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+electroporation+detection+methods+-+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro electroporation detection methods - An overview.</a> Bioelectrochemistry. 120, 166-182 (2018).</li>
<li>MICROPOSIT™ S1800® G2 Series Photoresists. KAYAKU. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/S1800-G2.pdf">https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/S1800-G2.pdf</a> (2021).</li>
<li>SU-8 2000 Permanent Negative Epoxy Photoresist. KAYAKU. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf">https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf</a> (2001).</li>
<li>Substrate Preparation. MicroChemicals. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf">https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf</a> (2021).</li>
<li>Lisinenkova, M., Hahn, L., Schulz, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLisinenkova%2C+M+%224M+2006+-+Second+International+Conference+on+Multi-Material+Micro+Manufacture%22">4M 2006 - Second International Conference on Multi-Material Micro Manufacture</a>. , Elsevier. 91-94 (2006).</li>
<li>Beh, C. W., Zhou, W. Z., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS-glass+bonding+using+grafted+polymeric+adhesive+-+alternative+process+flow+for+compatibility+with+patterned+biological+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS-glass bonding using grafted polymeric adhesive - alternative process flow for compatibility with patterned biological molecules.</a> Lab on a Chip. 12 (20), 4120-4127 (2012).</li>
<li>PA90 High Voltage Power Operational Amplifiers. APEX. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf">https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf</a> (2021).</li>
<li>Lissandrello, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+continuous-flow+microfluidic+electroporation+of+mRNA+into+primary+human+T+cells+for+applications+in+cellular+therapy+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput continuous-flow microfluidic electroporation of mRNA into primary human T cells for applications in cellular therapy manufacturing.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18045(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metodologia przedstawiona w tym protokole koncentruje się przede wszystkim na mikrowytwarzaniu urządzenia mikroprzepływowego, które jest następnie integrowane ze specjalistycznym układem eksperymentalnym do elektroporacji. Termin "receptura", który jest często używany do opisywania specyfiki procesu mikrowytwarzania, wskazuje na znaczenie przestrzegania/optymalizacji każdego kroku w celu pomyślnego wytworzenia działającego urządzenia. Jednak niektóre krytyczne etapy procesu, jeśli nie są zoptymalizowane, takie jak czas/e...

Obecne innowacje terapeutyczne w badaniach biomedycznych, takie jak terapia komórkami CAR-T (limfocyty T z chimerycznym receptorem antygenowym) oraz edycja genetyczna z użyciem CRISPR (skumulowane regularnie rozmieszczone krótkie palindromiczne powtórzenia)/Cas9, w ogromnym stopniu opierają się na możliwości skutecznego i wydajnego dostarczania materiałów egzogennych do przestrzeni wewnątrzkomórkowej1. W terapii CAR-T złotym standardem etapu dostarczania genów podczas wytwarzania terapii komórkowej jest stosowanie wektorów wirusowych2. Chociaż dostarczanie genów za pośrednictwem wirusów jest wydajną metodą, wiąże się ono również z kilkoma wadami. Należą do nich koszty produkcji, cytotoksyczność, immunogenność, potencjał do mutagenezy/tumorogenezy oraz ograniczenia rozmiaru dostarczanych genów3. Ograniczenia te doprowadziły do badań i rozwoju alternatywnych, niewirusowych technologii dostarczania.
Elektroporacja, będąca alternatywą dla dostarczania genów za pomocą wektorów wirusowych, polega na zastosowaniu optymalnego kształtu impulsu elektrycznego w celu przeprowadzenia transfekcji komórek DNA, RNA oraz białek. Po przyłożeniu zewnętrznego pola elektrycznego błona komórkowa zostaje chwilowo naruszona, co czyni komórkę podatną na wewnątrzkomórkowe dostarczenie egzogennych materiałów, które w przeciwnym razie byłyby nieprzepuszczalne4. W porównaniu do dostarczania za pomocą wirusów, elektroporacja jest korzystna, ponieważ jest ogólnie bezpieczna, łatwa w obsłudze i charakteryzuje się niskimi kosztami operacyjnymi. Elektroporacja pozwala na dostarczanie zarówno małych, jak i dużych ładunków molekularnych i może być efektywna w transfekcji komórek niezależnie od ich linii5. Aby uzyskać pożądane rezultaty po elektroporacji, tzn. dobrą żywotność i wysoką wydajność elektrotansfekcji, konieczna jest współoptymalizacja wielu parametrów eksperymentalnych. Należą do nich typ komórek6, gęstość komórek, stężenie cząsteczek7, właściwości buforu do elektroporacji (np. skład molekularny, przewodność i osmolarność)8, rozmiar i geometria elektrod9 oraz kształt impulsu elektrycznego (forma, polaryzacja, liczba impulsów)10 (ilustracja znajduje się na Rysunku 1). Chociaż każdy z tych parametrów może mieć znaczący wpływ na wyniki eksperymentów z elektroporacją, kształt impulsu był szczególnie szczegółowo badany, ponieważ energia elektryczna przyłożonego impulsu (lub impulsów) leży u podstawy wewnętrznego kompromisu między wynikową żywotnością komórek a wydajnością elektrotansfekcji8.
Typowo eksperymenty z elektroporacji przeprowadza się w skali makroskopowej, w której komórki zawieszone są w setkach mikrolitrów buforu pomiędzy zestawem dużych, równoległych elektrod płytkowych w kuwecie do elektroporacji. Elektrody te są zazwyczaj wykonane z aluminium, a odległość między nimi wynosi od 1 do 4 mm. Po ręcznym naniesieniu komórek za pomocą pipety, kuwetę podłącza się elektrycznie do dużego generatora impulsów elektrycznych, za pomocą którego użytkownik może ustawić i zastosować parametry kształtu impulsu w celu przeprowadzenia elektroporacji zawiesiny komórkowej. Chociaż elektroporacja w skali makroskopowej lub masowa pozwala na przetwarzanie gęstości komórkowych &gt;106 komórek/ml, cecha ta może prowadzić do strat podczas optymalizacji ustawień kształtu impulsu elektrycznego. Jest to szczególnie istotne w przypadku elektroporacji pierwotnych typów komórek, w których liczba komórek w populacji może być ograniczona. Ponadto, ze względu na dużą odległość między elektrodami, generator impulsów musi być w stanie dostarczać wysokie napięcia w celu osiągnięcia odpowiedniej natężenia pola elektrycznego &gt;1 kV/cm11Wysokie napięcia te powodują rezystancywną dyssypację mocy w buforze elektrolitycznym, co prowadzi do wydzielania ciepła Joule'a, które może negatywnie wpływać na żywotność komórek.12Wreszcie, przeprowadzanie elektroporacji gęstej zawiesiny komórek będzie nieustannie obciążone immanentną zmiennością wynikającej efektywności elektrotransfekcji oraz żywotności komórek. Każda komórka w zawiesinie może być poddana różnej natężeniu pola elektrycznego ze względu na obecność komórek sąsiadujących. W zależności od tego, czy natężenie oddziałującego pola elektrycznego ulegnie zwiększeniu, czy zmniejszeniu, żywotność komórek lub efektywność elektrotransfekcji mogą zostać odpowiednio negatywnie dotknięte.11Wspomniane wady elektroporacji w skali makro doprowadziły do poszukiwań i rozwoju alternatywnych technologii działających w skali mikro, które umożliwiają lepszą kontrolę na poziomie pojedynczych komórek.
Dziedzina BioMEMS, czyli biomedycznych mikro-elektro-mechanicznych systemów, wywodzi się z postępu technologicznego dokonanego w przemyśle mikroelektronicznym. W szczególności opiera się ona na wykorzystaniu procesów mikrofabrykacji do opracowywania mikrourządzeń służących rozwojowi badań biomedycznych. Postępy te obejmują opracowanie macierzy mikroelektrod do monitorowania elektrycznego in vivo13, pojemnościowych mikroelektrod do elektroporacji in situ14, zminiaturyzowanych urządzeń typu organ-on-a-chip15, mikrofluidycznych systemów diagnostyki w punkcie opieki (point-of-care)16, biosensorów17 oraz systemów dostarczania leków18, w tym urządzeń do nano- i mikroelektroporacji19,20,21. Dzięki możliwości projektowania i wytwarzania urządzeń w tej samej skali rozmiarów co komórki biologiczne, technologie nano- i mikroelektroporacji wykazują przewagę nad ich odpowiednikami w skali makro22,23. Urządzenia te do elektroporacji eliminują konieczność stosowania impulsów o wysokim napięciu, ponieważ zazwyczaj integruje się w nich zestawy elektrod z odstępami rzędu od 10 do 100 µm. Cecha ta drastycznie zmniejsza natężenie prądu przepływającego przez elektrolit, co z kolei redukuje akumulację toksycznych produktów elektrolizy oraz efekty wydzielania ciepła Joule'a w tych systemach. Kanały w mikro skali zapewniają również niezawodne przyłożenie znacznie bardziej jednorodnego pola elektrycznego do komórek podczas aplikacji impulsu, co prowadzi do bardziej powtarzalnych wyników24. Ponadto powszechnym jest integrowanie urządzeń do mikroelektroporacji z platformą mikrofluidyczną, co umożliwia przyszłą integrację z w pełni zautomatyzowaną technologią – jest to niezwykle pożądana zdolność w produkcji terapii komórkowych25. Wreszcie, elektroporacja w mikro skali pozwala na elektryczne badanie zdarzeń elektroporacyjnych. Na przykład stopień permeabilizacji błony komórkowej może być monitorowany w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczej komórki26,27. Celem niniejszej metody jest opis mikrofabrykacji, działania systemu oraz analizy mikrofluidycznego urządzenia do mikroelektroporacji pojedynczych komórek, zdolnego do pomiaru stopnia permeabilizacji błony komórkowej w celu optymalizacji protokołów elektroporacji przy jednoczesnym zwiększeniu wydajności w stosunku do dotychczasowych rozwiązań.
Przeprowadzanie elektroporacji na poziomie pojedynczych komórek nie jest już nową techniką, ponieważ po raz pierwszy została ona zademonstrowana przez Rubinsky'ego i współpracowników w 2001 roku wraz z opracowaniem technologii statycznej elektroporacji komórkowej28. Ich mikro urządzenie było innowacyjne, gdyż jako pierwsi wykazali oni zdolność do elektrycznego monitorowania procesu elektroporacji. Doprowadziło to do dalszego rozwoju technologii statycznej elektroporacji pojedynczych komórek, zdolnych do elektrycznego wykrywania stopnia permeabilizacji błony komórkowej w sposób zrównoleglony, aby zwiększyć przepustowość urządzeń. Jednakże, nawet przy zastosowaniu paralelizacji i przetwarzania wsadowego, urządzenia te wykazują znaczny niedobór w całkowitej liczbie komórek, które mogą przetworzyć w jednostce czasu29,30. Ograniczenie to doprowadziło do opracowania urządzeń przepływowych, zdolnych do przeprowadzania mikro-elektroporacji na poziomie pojedynczych komórek przy znacznie większych przepustowościach31. Ta zmiana konstrukcyjna, z środowiska statycznego na przepływowe, ogranicza możliwość elektrycznego monitorowania stopnia permeabilizacji błony komórkowej po zastosowaniu impulsu elektroporacyjnego. Metoda opisana w niniejszej pracy wypełnia lukę między tymi dwiema technologiami; jest to technologia mikro-elektroporacji zdolna do elektrycznego wykrywania, impulsowania i monitorowania stopnia permeabilizacji błony komórkowej pojedynczych komórek w sposób seryjny, w przepływie ciągłym.
Technologia ta została niedawno opisana przez Zheng i wsp. W tamtej pracy przedstawiono możliwości tej technologii poprzez przeprowadzenie badania parametrycznego, w którym zmieniano zarówno amplitudę, jak i czas trwania impulsu elektroporacyjnego, a następnie analizowano wynikający z tego sygnał elektryczny, wskazujący na permeabilizację błony komórkowej32. Wyniki wykazały, że zwiększenie intensywności impulsu elektroporacyjnego (tj. zwiększenie przyłożonego pola elektrycznego lub wydłużenie czasu trwania impulsu) powodowało wzrost mierzonej permeabilizacji błony komórkowej. Aby dalej zwalidować system, do zawiesiny komórkowej dodano jodek propidyny33, powszechnie stosowany fluorescencyjny wskaźnik skutecznej elektroporacji, a bezpośrednio po przyłożeniu impulsu elektrycznego wykonano obraz fluorescencyjny. Sygnał optyczny, czyli intensywność fluorescencji jodku propidyny wewnątrz komórki, był silnie skorelowany z elektrycznym pomiarem stopnia permeabilizacji błony komórkowej, co potwierdziło niezawodność tego pomiaru elektrycznego. Jednak w tej pracy rozważano jedynie dostarczanie małej cząsteczki jodku propidyny, co ma niewielkie lub żadne znaczenie translacyjne.
W niniejszej pracy przedstawiono nowe zastosowanie tej technologii w celu zwiększenia przepustowości systemu przy jednoczesnym dostarczaniu biologicznie aktywnego wektora plazmidowego DNA (pDNA) oraz ocenie wydajności elektrotransfekcji komórek przesianych i hodowanych po elektroporacji. Chociaż poprzednie prace wykazały wyższą skuteczność niż istniejące technologie mikro-elektroporacji zdolne do elektrycznego pomiaru zdarzenia elektroporacji, obecny stan urządzenia wciąż wymaga długiego czasu przejścia komórek między zestawem elektrod (~250 ms) w celu wykrycia komórki, przyłożenia impulsu i pomiaru permeabilizacji błony komórkowej. W przypadku pojedynczego kanału ogranicza to przepustowość do 4 komórek/s. Aby wyeliminować to ograniczenie, wprowadzono nową koncepcję elektroporacji sterowanej sprzężeniem zwrotnym w oparciu o populację komórek w celu przeprowadzenia elektrotransfekcji pDNA. Dzięki zastosowaniu buforu do elektroporacji o przewodnictwie hipofizjologicznym system ten umożliwia elektryczną analizę pojedynczych komórek podczas wielu aplikacji impulsów elektroporacyjnych. Na podstawie odpowiedzi elektrycznej wyznaczany jest następnie „optymalny” impuls elektroporacyjny. Następnie wdrożono tryb „wysokiej przepustowości”, w którym pomiar permeabilizacji błony komórkowej zostaje pominięty, zwiększono szybkość przepływu, a cykl pracy impulsu elektroporacyjnego dostosowano do czasu przejścia komórek, aby zapewnić jeden impuls na komórkę przemieszczającą się między elektrodami. Praca ta dostarczy szczegółowych informacji na temat etapów mikrofabrykacji urządzenia, materiałów i sprzętu oraz ich konfiguracji niezbędnej do przeprowadzenia eksperymentów, a także obsługi i analizy urządzenia oraz jego wydajności elektrotransfekcji (eTE).
<img alt="Schemat procesu elektroporacji z przebiegiem impulsu, wpływem buforu i etapami regeneracji komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63103/63103fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Czynniki eksperymentalne wpływające na wyniki elektroporacji. (Lewo) Zawiesina komórkowa – istotne czynniki do rozważenia przed rozpoczęciem elektroporacji obejmują: ładunek (w tym przypadku pDNA), stężenie, gęstość komórek oraz właściwości buforu do elektroporacji. Właściwości buforu do elektroporacji, które należy uwzględnić, to przewodność, osmolarność oraz dokładny skład cząsteczkowy wpływający na te wartości. (Środek) Aplikacja impulsu – dokładny typ impulsu (fala prostokątna vs. spadek wykładniczy) oraz przebieg impulsu (impuls pojedynczy vs. seria impulsów) muszą zostać zoptymalizowane, aby zmaksymalizować zarówno przeżywalność komórek, jak i wydajność elektrotransfekcji. Powszechnie stosowane serie impulsów w procesach elektroporacji zazwyczaj składają się z ciągu impulsów wysokiego napięcia (HV) lub serii impulsów przeplatanych wysokim (HV) i niskim (LV) napięciem. (Prawo) Regeneracja komórek – należy zoptymalizować etapy przetwarzania końcowego, w szczególności podłoże do hodowli komórek, do którego przenoszone są komórki w celu regeneracji. Nie przedstawiono (skrajna lewa), dodatkowe etapy wstępnego przetwarzania komórek, które można wdrożyć w celu ogólnej optymalizacji procesu elektroporacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63103/63103fig1v3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Szalki Petriego o średnicy 150 mm</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td>krok 6.1.1 do zabezpieczania</td></tr><tr><td>24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych</td><td>wafli VWR</td><td>10062-896</td><td>krok 10.3.6 do płytki ogniw elektroporowanych</td></tr><tr><td>33220A Generator przebiegów/funkcji</td><td>Agilent</td><td></td><td>krok 9.2.3 generator impulsów elektroporacyjnych</td></tr><tr><td>4'' wafle krzemowe</td><td>Wafel</td><td></td> <td>uniwersyteckiPodsekcja 2.1 dotycząca wytwarzania kanałów mikroprzepływowych</td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td>krok 8.1.8 do płytki komórek</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-4</td><td>krok 2.1.2 do czyszczenia i&nbsp; krok 5.1 Photoresist lift-off</td></tr><tr><td>Wirówka Allegra X-22R</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>kroki 8.1.4 , 8.3.2. i 8.3.3. do obracania komórek</td></tr><tr><td>AutoCAD 2018</td><td>Autodesk</td><td></td><td>podsekcja 1.1. do projektowania masek przezroczystości</td></tr><tr><td>Buforowany wytrawiacz tlenkowy 10:1</td><td>VWR</td><td>901621-1L</td><td>podsekcja 3.1 do trawienia HF</td></tr><tr><td>CCD Monochromatyczna kamera mikroskopowa</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca 285 C4742-96-12G04</td><td>krok 11.2.3. do obrazowania</td></tr><tr><td>kamery CMOS - Sensicam QE 1.4MP</td><td>PCO</td><td></td><td>podsekcja 9.3 część konfiguracji eksperymentalnej</td></tr><tr><td>Przewodząca żywica epoksydowa</td><td>CircuitWorks</td><td>CW2400</td><td>podrozdział 7.6. do mocowania</td></tr><tr><td>drutu Stożkowe probówki wirówkowe, 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td>krok 8.1.4. do wirowania komórek</td></tr><tr><td>Profilometr powierzchniowy Dektak 3ST</td><td>Veeco (Sloan/Dektak)</td><td></td> <td>krok 2.1.15 i 5.4 do profilometrii powierzchni</td></tr><tr><td>Jednorazowy dziurkacz do biopsji, 0,75 mm</td><td>Robbins Instruments</td><td>RBP075</td><td>krok 6.2.3 dla dostępu do wlotu</td></tr><tr><td>Jednorazowy dziurkacz do biopsji, 3 mm</td><td>Robbins Instruments</td><td>RBP30P</td><td>krok 6.2.3 dla dostępu do ujścia</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>abcam</td><td>ab108410</td><td>krok 11.2.2. do barwienia żywych komórek</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium</td><td>ThermoFisher Scientific 11885084</td><td></td><td>krok 8.1.2. część składu mediów</td></tr><tr><td>E3631A Bipolarny zasilacz Triple DC</td><td>Agilent</td><td></td><td>krok 9.2.1.-9.2.2.część zestawu eksperymentalnego</td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-U Odwrócony&nbsp; Mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>&nbsp; podsekcja 9.3. część eksperymentalnej konfiguracji</td></tr><tr><td>EVG620 UV Lithium System</td><td>EVG</td><td></td><td>&nbsp; Krok 2.1.9. oraz 2.2.7. do ekspozycji na promieniowanie UV</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Neuromics</td><td>FBS001</td><td>krok 8.1.2. część kompozycji pożywki</td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa FS20</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>podrozdział 5.1. do podnoszenia fotorezystu</td></tr><tr><td>Szklana butelka z nakrętką, 100 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB800100</td><td>krok 8.2.1. do przechowywania buforowego</td></tr><tr><td>Szklana butelka z nakrętką, 500 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB800500</td><td>kroku 8.1.2. do przechowywania nośników</td></tr><tr><td>Linia komórkowa HEK-293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>podsekcja 8.1 dla roztworu</td></tr><tr><td>buforowego HEPES</td> do hodowli komórkowych <td>Sigma Aldrich</td><td>83264-100ML-F</td><td>krok 8.2.1 część kompozycji buforu elektroporacyjnego</td></tr><tr><td>Heksametyldisilazan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>379212-25ML</td><td>krok 2.2.3 promotor przyczepności</td></tr><tr><td>HF2LI Wzmacniacz blokujący</td><td>Zurych Przyrządy</td><td></td><td>podrozdział 9.2 część konfiguracji eksperymentalnej</td></tr><tr><td>Wzmacniacz prądowy HF2TA</td><td>Zurich Instruments</td><td></td><td>podsekcja 9.2 część zestawu eksperymentalnego</td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A459-1</td><td>krok 2.1.2 do czyszczenia, krok 2.1.14 do płukania płytki po wywołaniu SU-8 i krok 6.3.1 do czyszczenia mikroskopu</td></tr><tr><td>fluorescencyjnego PDMS IX81</td><td>Olympus</td><td></td><td>krok 11.2.3 do obrazowania</td></tr><tr><td>roztworu L-glutaminy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513-20ML</td><td>krok 8.1.2. część składu pożywki</td></tr><tr><td>Drut o średnicy 22 M16878 / 1BFA</td><td>AWC</td><td>B22-1</td><td>podsekcja 7.5 do produkcji urządzeń</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208337-100G</td><td>Krok 8.1.2 część składu bufora do elektroporacji</td></tr><tr><td>MF 319 Deweloper</td><td>Kayaku Advanced Materials</td><td>10018042</td><td>kroku 2.2.9. wywoływacz fotorezystu</td></tr><tr><td>Microposit S1818 fotorezystor</td><td>Kayaku Advanced Materials</td><td>1136925</td><td>Krok 2.2.4 dodatni fotorezystor do modelowania elektrod</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe, 75 x 25 mm</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td>krok 2.2.1 elektroda podłoże ze szkła sodowo-wapiennego</td></tr><tr><td>Model 2350 Wzmacniacz wysokiego napięcia</td><td>TEGAM</td><td>2350</td><td>krok 9.2.5. Część układu eksperymentalnego</td></tr><tr><td>National Instruments LabVIEW</td> Igła <td>do akwizycji danych</td><td>National Instruments</td><td></td></tr><tr><td>, 30G x 1 w</td><td>BD Scientific</td><td>305128</td><td>Krok 10.1.1. Część systemu Zalewanie</td></tr><tr><td>PA90 IC OPAMP Obwód zasilania</td><td>Digi-key</td><td>598-1330-ND</td><td>Część niestandardowego obwodu</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4458-20ML</td><td>Krok 8.1.2. Część kompozycji podłoża</td></tr><tr><td>Plazmid pMAX-GFP</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>krok 8.3.4. do dostarczania wewnątrzkomórkowego</td></tr><tr><td>Rurka plastikowa, 0,010'' x 0,030"</td> <td>VWR</td><td>89404-300</td><td>krok 10.1.2. do gruntowania systemu</td></tr><tr><td>Cele platynowe</td><td>Kurt J. Lesker</td><td></td><td>podrozdział 4.2. do fizycznego osadzania z fazy gazowej</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td>krok 8.2.1. część kompozycji buforowej do elektroporacji</td></tr><tr><td>Pompa 11 Mikroprzepływowa pompa strzykawkowa PicoPlus</td><td>Aparatura</td><td>Harvarda MA1 70-2213</td><td>krok 10.1.4. do zalewania systemu</td></tr><tr><td>PVD75 System fizycznego osadzania z fazy gazowej</td><td>Kurt J. Lesker</td><td></td><td>podrozdział 4.1. do fizycznego osadzania z fazy gazowej</td></tr><tr><td>PWM32 Spinner System</td><td>Headway</td> Etapy badań <td></td><td>2.1.6 i 2.2.2. do powlekania podłoża fotorezystem</td></tr><tr><td>PX-250 System obróbki plazmowej</td><td>March Instruments</td><td></td><td>podrozdział 7.2 do klejenia PDMS i podłoża szklanego</td></tr><tr><td>SDG1025 Generator funkcji/przebiegów</td><td>Siglent</td><td></td><td>krok 9.2.2. część układu doświadczalnego</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td>Krok 8.2.1. Część składu buforu elektroporacyjnego</td></tr><tr><td>SU-8 2010 ujemny fotorezystor</td><td>Kayaku Advanced Materials</td><td>Y111053</td><td>kroku 2.1.7. do tworzenia wzorców kanałów mikroprzepływowych</td></tr><tr><td>SU-8 Developer</td><td>Microchem</td><td>Y010200</td><td>kroku 2.1.12. do wywoływania fotorezystu</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td>krok 8.2.1. część kompozycji buforu elektroporacyjnego</td></tr><tr><td>Zestaw elastomerów Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>krok 6.2.1&nbsp; 10 : 1 mieszanina polimeru PDMS i utwardzacza</td></tr><tr><td>Strzykawka, 1 ml Strzykawka</td><td>309628 BD Scientific</td><td></td><td>krok 8.3.4. Część systemu zalewania</td></tr><tr><td>System stereomikroskopu SZ61</td><td>Olympus</td><td></td><td>podrozdział 7.3. do wyrównania kanałów i elektrod</td></tr><tr><td>Kolby T25 poddane działaniu kultur tkankowych</td><td>Falcon</td><td>353108</td><td>etap 8.1.2 dla hodowli komórek</td></tr><tr><td>Tarcze tytanowe</td><td>Kurt J. Lesker</td><td></td><td>podrozdział 4.2. do fizycznego osadzania z fazy gazowej</td></tr><tr><td>Maski przezroczystości</td> Usługi <td></td><td>CAD/ART</td><td>kroki 2.1.9. i 2.2.7. dla fotolitografii</td></tr><tr><td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td>krok 6.1.2. do silanizacji wafli</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td>kroki 8.1.3. i 8.3.1. do pobierania komórek</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie i działanie systemu mikroelektroporacji o ciągłym przepływie z detekcją przepuszczalności

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

Obecne innowacje terapeutyczne, takie jak terapia komórkowa CAR-T, są w dużym stopniu uzależnione od dostarczania genów za pośrednictwem wirusa. Technika ta, choć wydajna, wiąże się z wysokimi kosztami produkcji, co spowodowało zainteresowanie stosowaniem alternatywnych metod dostarczania genów. Elektroporacja to elektrofizyczne, niewirusowe podejście do wewnątrzkomórkowego dostarczania genów i innych materiałów egzogennych. Po zastosowaniu pola elektrycznego błona komórkowa tymczasowo umożliwia dostarczanie molekularne do komórki. Zazwyczaj elektroporacja jest wykonywana w makroskali w celu przetworzenia dużej liczby komórek. Podejście to wymaga jednak szeroko zakrojonego opracowania protokołu empirycznego, co jest kosztowne w przypadku pracy z pierwotnymi i trudnymi do transfekcji typami komórek. Długotrwały rozwój protokołu, w połączeniu z wymogiem dużych napięć w celu osiągnięcia wystarczających natężeń pola elektrycznego do przenikania ogniw, doprowadził do opracowania urządzeń do elektroporacji w mikroskali. Te urządzenia do mikroelektroporacji są produkowane przy użyciu popularnych technik mikrowytwarzania i pozwalają na większą kontrolę eksperymentalną z potencjałem utrzymania wysokiej przepustowości. Prace te opierają się na technologii elektroporacji mikroprzepływowej, która jest w stanie wykryć poziom przenikania błony komórkowej na poziomie pojedynczej komórki przy ciągłym przepływie. Technologia ta została jednak ograniczona do 4 komórek przetwarzanych na sekundę, a co za tym idzie, zaproponowano i przedstawiono tutaj nowe podejście do zwiększania przepustowości systemu. Ta nowa technika, oznaczona jako kontrola sprzężenia zwrotnego oparta na populacji komórek, uwzględnia reakcję przepuszczalności komórek na różne warunki pulsacji elektroporacji i określa najlepiej dopasowane warunki impulsu elektroporacyjnego dla badanego typu ogniwa. Następnie stosuje się tryb o wyższej przepustowości, w którym ten "optymalny" impuls jest podawany do zawiesiny ogniw podczas transportu. Szczegółowo przedstawiono etapy wytwarzania urządzenia, konfiguracji i przeprowadzania eksperymentów mikroprzepływowych oraz analizy wyników. Wreszcie, ta technologia mikroelektroporacji została zademonstrowana poprzez dostarczenie plazmidu DNA kodującego białko zielonej fluorescencji (GFP) do komórek HEK293.

Rysunek 4 przedstawia zasady działania detekcji permeabilizacji błony na poziomie pojedynczych komórek dla pojedynczej amplitudy impulsu. Po rozpoczęciu eksperymentu z elektroporacji algorytm detekcji komórek określa optymalny próg wykrywania komórek za pomocą punktowej metody detekcji opartej na nachyleniu. Następnie system w sposób ciągły monitoruje: (1) wystąpienie znaczącej ujemnej zmiany zmierzonego prądu elektrycznego, co wskazuje na wniknięcie komórki. Wynika to z izolacyjnego charakt...

Ten protokół opisuje techniki mikrofabrykacji wymagane do zbudowania urządzenia do elektroporacji mikroprzepływowej typu lab-on-a-chip. Konfiguracja eksperymentalna wykonuje kontrolowane transfekcje na poziomie pojedynczej komórki w ciągłym przepływie i może być rozszerzona do wyższych przepustowości dzięki kontroli populacyjnej. Przedstawiono analizę pokazującą możliwość elektrycznego monitorowania stopnia przepuszczalności błony komórkowej w czasie rzeczywistym.

Wytwarzanie i działanie systemu mikroelektroporacji o ciągłym przepływie z detekcją przepuszczalności

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...

Metoda ta pozwala naukowcom określić optymalne warunki pulsacji elektroporacji dla pożądanego typu ogniwa, jednocześnie minimalizując potrzebę tradycyjnego empirycznego podejścia eksperymentalnego. Metoda ta wykorzystuje techniki mikroelektroporacji do wytworzenia skalowalnego urządzenia uruchamiającego mikroprzepływowego, które jest w stanie elektrycznie monitorować stopień przenikania błony komórkowej w całym procesie elektroporacji. Procedurę zademonstruje Kishankumar Busha, student studiów magisterskich z mojego laboratorium.Aby rozpocząć, przymocuj płytkę krzemową do uchwytu wirownicy wafli za pomocą systemu próżniowego powlekarki wirowej. Następnie zaprogramuj pokrętło. Następnie nałóż cztery mililitry fotorezystu SU-8 2010 na środek płytki krzemowej i uruchom program.Gdy system się zatrzyma, wyłącz próżnię. Następnie przymocuj maskę fotograficzną za pomocą kanałów mikroprzepływowych 2D do uchwytu maski i włóż płytkę silikonową z powłoką SU-8 skierowaną do góry na uchwyt wafla. Ustaw ustawienia ekspozycji na 150 milidżuli na centymetr kwadratowy i uruchom maszynę.Po ekspozycji na promieniowanie UV zanurz płytkę krzemową w roztworze wywoływacza SU-8, delikatnie mieszając przez trzy do czterech minut. Następnie wyjmij wafel z roztworu i spłucz powierzchnię izopropanolem. Następnie umieść wafel silikonowy w piekarniku o temperaturze 150 stopni Celsjusza na 30 minut, aby upiec go na twardo.Następnie pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej przed użyciem profilometrii rysika do zmierzenia dokładnej wysokości i nachylenia bocznych ścianek kanału. Następnie nałóż jeden mililitr fotorezystu na powierzchnię szkiełka i ponownie uruchom program. Gdy system się zatrzyma, wyłącz odkurzacz i wyjmij szklaną szkiełko.Po zabezpieczeniu maski fotograficznej za pomocą wzorów elektrod 2D na uchwycie maski, włóż i wyrównaj szklaną płytkę z powłoką S-1818 skierowaną do góry na uchwyt wafla. Ustaw ustawienia ekspozycji na 215 milidżuli na centymetr kwadratowy i uruchom maszynę. Po naświetleniu zanurz szkiełko w roztworze wywoływacza MF-319 na dwie minuty, delikatnie mieszając.Następnie wyjmij szklaną płytkę i spłucz jej powierzchnię wodą dejonizowaną. Na koniec umieść szklane szkiełko w piekarniku o temperaturze 150 stopni Celsjusza, aby upiec na twardo, upewniając się, że powierzchnia podłoża jest skierowana do góry. Po 30 minutach wyjmij szkiełko z piekarnika i chroń je przed światłem.Aby wytrawić szkiełko, zanurz je w buforowanym roztworze kwasu fluorowodorowego w proporcji 10 do 1 na jedną minutę w pojemniku z politetrafluoroetylenu. Następnie przenieś i umyj szkiełka w wodzie dejonizowanej trzy razy. Następnie, za pomocą systemu fizycznego osadzania z fazy gazowej, napylaj tytan przez osiem minut z prędkością 100 angstremów na minutę i platynę przez 10 minut z prędkością 200 angstremów na minutę.Następnie, aby zdjąć fotorezystor, zanurz szkiełka ze szkła pokrytego metalem w kąpieli acetonowej na 10 minut i poddaj kąpieli sonikacji w celu wprowadzenia mieszania. W razie potrzeby użyj chusteczki nasączonej acetonem, aby usunąć wszelkie pozostałości. Następnie formowanie replik polidimetylosiloksanu sprawia, że baza elastomerowa PDMS z utwardzaczem w stosunku wagowym 10 do 1 w jednorazowym pojemniku umieszczonym na wadze elektronicznej.Następnie wlej roztwór PDMS na płytkę krzemową i umieść mieszaninę w próżni, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Po utwardzeniu mieszaniny w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny, za pomocą czubka żyletki wytnij uformowany PDMS i oderwij go od płytki silikonowej. Następnie za pomocą zaostrzonego stempla do biopsji wyjmij PDMS z wlotu i wylotu urządzenia.Następnie zaprogramuj generator plazmy do klejenia PDMS. Następnie umieść PDMS i szklaną elektrodę w systemie z funkcjami skierowanymi do góry i uruchom program. Po zakończeniu programu wyjmij urządzenia i użyj stereoskopu, aby szybko wyrównać cechy kanału do elektrod.Mocno dociśnij od środka PDMS w kierunku boków, aby usunąć wszelkie niechciane pęcherzyki powietrza na styku. Zbierz komórki HEK293, odwiruj je i ponownie zawieś osad w buforze do elektroporacji przy około pięciu milionach ogniw na mililitr. Następnie dodać DNA osocza kodujące GFP do końcowego stężenia 20 mikrogramów na mililitr i delikatnie wymieszać.Następnie przenieś zawiesinę komórek plazmotycznego DNA do strzykawki o pojemności jednego centymetra sześciennego w celu przeprowadzenia eksperymentów. Umieść mikrourządzenie na stoliku mikroskopu za pomocą uchwytu na szkiełko. Następnie włącz naładowane sprzężone urządzenie, kamerę CCD i ustaw ostrość kanału mikroprzepływowego.Następnie w przypadku elektroporacji pojedynczej komórki ustaw natężenie przepływu pompy strzykawkowej na 0,1 do 0,3 mikrolitra na minutę, aby zapewnić przepływ pojedynczych komórek przez zestaw elektrod. Następnie ustaw parametry impulsu dla początkowego i najniższego impulsu elektroporacyjnego energii elektrycznej. Postępuj zgodnie z ustaloną liczbą wykryć komórek na aplikację impulsową.Pod koniec każdego badanego stanu odessać komórki z wylotu mikrourządzenia i uzupełnić wylot pożywką regeneracyjną. Iteruj do następnego warunku impulsu elektroporacyjnego i powtarzaj, aż wszystkie warunki impulsu elektroporacji zostaną przetestowane. Następnie określ parametry impulsu elektroporacyjnego dla populacyjnego sprzężenia zwrotnego o wysokiej przepustowości.W przypadku elektroporacji sterowanej populacyjnym ze sprzężeniem zwrotnym należy ustawić natężenie przepływu pompy strzykawkowej na jeden do trzech mikrolitrów na minutę i ustawić amplitudę impulsu na optymalny stan. Następnie wyłącz tryb wyzwalania i ustaw szerokość impulsu tak, aby odpowiadała czasowi przejścia komórki. Po elektroporowaniu żądanej liczby ogniw należy wyłączyć zarówno pompę strzykawkową, jak i generator funkcyjny.Następnie przenieść komórki ze zbiornika wylotowego do kolby lub płytki do hodowli komórkowej o odpowiedniej wielkości, wypełnionej wstępnie podgrzaną pożywką odzysku i przenieść kolbę lub płytkę hodowlaną do inkubatora. W celu analizy danych załaduj dane do oprogramowania analitycznego i wygeneruj wykres prądu w funkcji czasu dla każdego stanu pulsacji. Następnie określ stopień przepuszczalności błony komórkowej, wygeneruj mapę przepuszczalności błony komórkowej we wszystkich badanych warunkach impulsu i zweryfikuj optymalne warunki pulsacji.Po inkubacji uchwyć obrazy epi-fluorescencji za pomocą filtrów FITC i dalekiej czerwieni, a następnie przeanalizuj zestawy obrazów ręcznie lub za pomocą algorytmu. Poniżej przedstawiono zasady działania stojące za wykrywaniem przepuszczalności na poziomie pojedynczej komórki dla pojedynczej amplitudy impulsu. Po każdym parametrze impulsu elektroporacyjnego testowany jest następny impuls elektroporacyjny o najwyższej energii.Mapa przenikania błony komórkowej dla komórek HEK293 wykazała wyraźną korelację między zastosowaną energią elektryczną a stopniem przepuszczalności błony komórkowej. W tym eksperymencie jako optymalne określono natężenie pola elektrycznego 1,8 kilowolta na centymetr i impuls 670 mikrosekund. Przy tych wartościach osiągnięto 70% sprawność elektrotransfekcji.W przeciwieństwie do natężenia pola elektrycznego wynoszącego 0,4 kilowolta na centymetr i czasu trwania impulsu wynoszącego trzy milisekundy, wydajność elektrotransfekcji po 24 godzinach wynosiła mniej niż 5%Termin receptura, który jest często używany przy opisywaniu specyfiki procesu mikroprodukcji, podkreśla znaczenie śledzenia lub optymalizacji każdego kroku w celu pomyślnego wytworzenia działającego urządzenia. Ta technologia elektroporacji może być wykorzystana w dodatkowych biomedycznych projektach badawczych, takich jak generowanie i testowanie limfocytów T CAR lub optymalizacja i testowanie technik edycji genów CRISPR-Cas9. Ta technologia mikroelektroporacji pozwala na elektryczne badanie reakcji różnych typów komórek w celu zastosowania warunków impulsów elektrycznych i skorelowania tych informacji z dostarczeniem klinicznie istotnego ładunku molekularnego.

the-fabrication-operation-continuous-flow-micro-electroporation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Bezkontaktowa dielektroforeza (cDEP) umożliwia sortowanie i wzbogacanie cząstek dzięki ich wewnętrznym właściwościom dielektrycznym. Kanały elektrod przepływowych zastępują elektrody metalowe tradycyjne dla DEP, dostosowując cDEP do nieuszkadzającego sterylnego charakteryzowania i sortowania cząstek biologicznych. Pokazujemy, jak przygotować mikrourządzenie cDEP oraz przeprowadzić eksperymenty z charakterystyką i sortowaniem komórek.

Bezznacznikowa izolacja i wzbogacanie komórek poprzez bezdotykową dielektroforezę

Platforma elektroporacji wspomagana wirami mikroprzepływowymi została opracowana do sekwencyjnego dostarczania wielu cząsteczek do identycznych populacji komórek z precyzyjną i niezależną kontrolą dawkowania. Etap oczyszczania komórek docelowych w oparciu o rozmiar, poprzedzający elektroporację, przyczynił się do zwiększenia wydajności dostarczania molekularnego i żywotności komórek przetworzonych.

Mikroskalowy elektroporator wspomagany wirami do sekwencyjnego dostarczania molekularnego

Prezentujemy platformę mikroprzepływową ze zintegrowaną siecią elektrod powierzchniowych, która łączy rezystancyjne wykrywanie impulsów (RPS) z wielokrotnym dostępem z podziałem kodu (CDMA), do wielokrotnego wykrywania i wymiarowania cząstek w wielu kanałach mikroprzepływowych.

Platforma mikroprzepływowa z multipleksowaną detekcją elektroniczną do przestrzennego śledzenia cząstek

Opisano protokół dla nowatorskiej platformy polaryzacji stężenia jonów (ICP), która może zatrzymać rozprzestrzenianie się strefy ICP, niezależnie od warunków pracy. Ta unikalna zdolność platformy polega na wykorzystaniu łączącego się zubożenia i wzbogacania jonów, które są dwiema biegunowościami zjawiska ICP.

Łączenie polaryzacji stężenia jonów między zestawionymi membranami jonowymiennymi w celu zablokowania propagacji strefy polaryzacji

Platforma mikroprzepływowego biosensoru została zaprojektowana i wykonana przy użyciu taniej technologii fotorezystu z suchą folią do szybkiej i czułej kwantyfikacji różnych analitów. Ten jednorazowy system pozwala na elektrochemiczny odczyt testów enzymatycznych immobilizowanych na chipie za pomocą techniki stop-flow.

Elektrochemiczna platforma biosensorów mikroprzepływowych oparta na suchym filmie fotorezystu: produkcja urządzenia, przygotowanie testu na chipie i obsługa systemu

Ten protokół opisuje, jak zbudować system łańcucha polimerazy o ciągłym przepływie oparty na mikroprzepływowym chipie i jak zbudować system elektroforezy kapilarnej w laboratorium. Przedstawiono w nim prostą metodę analizy kwasów nukleinowych w laboratorium.

Amplifikacja Escherichia coli w chipie mikroprzepływowym Continuous-Flow-PCR i jego wykrywanie za pomocą systemu elektroforezy kapilarnej

Elektroporacja porowatego podłoża (PSEP) łączy spójne, wysokowydajne dostarczanie z wysoką żywotnością ogniw. Wprowadzenie pomiarów transnabłonkowej impedancji elektrycznej (TEEI) zapewnia wgląd w pośrednie procesy PSEP i pozwala na dostarczanie bez etykietowania. W tym artykule omówiono metodę jednoczesnego przeprowadzania eksperymentów z dostarczaniem PSEP i analizy pomiarów TEEI.

Elektroporacja na bazie porowatego podłoża z monitorowaniem transepitelalnej impedancji elektrycznej

Elektroporacja to użycie impulsowych pól elektrycznych (PEF) do tworzenia przejściowych porów w hodowlach komórkowych w celu wprowadzenia ładunku molekularnego. Technika ta stała się ostatnio szeroko stosowana w warunkach badawczych i klinicznych. W tym miejscu opisujemy techniki elektroporacji z wykorzystaniem niedawno opracowanego "systemu cytometrii elektroporacyjnej" do wykonywania mikroskopii fluorescencyjnej na żywych komórkach.

Protokół cytometrii elektroporacyjnej do mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek z wykorzystaniem hodowli komórkowej U2 OS

Czujniki „e-DNA”, czyli bezodczynnikowe biosensory elektrochemiczne, które wykazują wysoką skuteczność nawet podczas bezpośredniej analizy krwi i innych złożonych matryc, zostały zaadaptowane do wykrywania szerokiego zakresu analitów w postaci kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek. W niniejszej pracy przedstawiamy ogólną procedurę wytwarzania i stosowania takich czujników.

Wytwarzanie elektrochemicznych biosensorów DNA do bezodczynnikowej detekcji kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek

Opisujemy metodę poddawania przylegających komórek naprężeniom ścinającym w przepływie laminarnym w sterylnym obwodzie przepływu ciągłego. Poprzez przezroczystą komorę można badać adhezję i morfologię komórek, a z obwodu można pobierać próbki do analizy metabolitów oraz zbierać komórki po ekspozycji na siły ścinające do dalszych eksperymentów lub hodowli.

Komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego w przepływie laminarnym

Poznaj mikroelektroporację z detekcją przepuszczalności w czasie rzeczywistym. Ta metoda umożliwia kontrolowane transfekcje pojedynczych komórek i optymalizację parametrów impulsowania dla różnych typów komórek.

Wytwarzanie i działanie systemu mikroelektroporacji o ciągłym przepływie z detekcją przepuszczalności

Przeglądaj więcej filmów