Wytwarzanie i działanie systemu mikroelektroporacji o ciągłym przepływie z detekcją przepuszczalności
7 stycznia 2022
Ten protokół opisuje techniki mikrofabrykacji wymagane do zbudowania urządzenia do elektroporacji mikroprzepływowej typu lab-on-a-chip. Konfiguracja eksperymentalna wykonuje kontrolowane transfekcje na poziomie pojedynczej komórki w ciągłym przepływie i może być rozszerzona do wyższych przepustowości dzięki kontroli populacyjnej. Przedstawiono analizę pokazującą możliwość elektrycznego monitorowania stopnia przepuszczalności błony komórkowej w czasie rzeczywistym.
Metoda ta pozwala naukowcom określić optymalne warunki pulsacji elektroporacji dla pożądanego typu ogniwa, jednocześnie minimalizując potrzebę tradycyjnego empirycznego podejścia eksperymentalnego. Metoda ta wykorzystuje techniki mikroelektroporacji do wytworzenia skalowalnego urządzenia uruchamiającego mikroprzepływowego, które jest w stanie elektrycznie monitorować stopień przenikania błony komórkowej w całym procesie elektroporacji. Procedurę zademonstruje Kishankumar Busha, student studiów magisterskich z mojego laboratorium.
Aby rozpocząć, przymocuj płytkę krzemową do uchwytu wirownicy wafli za pomocą systemu próżniowego powlekarki wirowej. Następnie zaprogramuj pokrętło. Następnie nałóż cztery mililitry fotorezystu SU-8 2010 na środek płytki krzemowej i uruchom program.
Gdy system się zatrzyma, wyłącz próżnię. Następnie przymocuj maskę fotograficzną za pomocą kanałów mikroprzepływowych 2D do uchwytu maski i włóż płytkę silikonową z powłoką SU-8 skierowaną do góry na uchwyt wafla. Ustaw ustawienia ekspozycji na 150 milidżuli na centymetr kwadratowy i uruchom maszynę.
Po ekspozycji na promieniowanie UV zanurz płytkę krzemową w roztworze wywoływacza SU-8, delikatnie mieszając przez trzy do czterech minut. Następnie wyjmij wafel z roztworu i spłucz powierzchnię izopropanolem. Następnie umieść wafel silikonowy w piekarniku o temperaturze 150 stopni Celsjusza na 30 minut, aby upiec go na twardo.
Następnie pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej przed użyciem profilometrii rysika do zmierzenia dokładnej wysokości i nachylenia bocznych ścianek kanału. Następnie nałóż jeden mililitr fotorezystu na powierzchnię szkiełka i ponownie uruchom program. Gdy system się zatrzyma, wyłącz odkurzacz i wyjmij szklaną szkiełko.
Po zabezpieczeniu maski fotograficznej za pomocą wzorów elektrod 2D na uchwycie maski, włóż i wyrównaj szklaną płytkę z powłoką S-1818 skierowaną do góry na uchwyt wafla. Ustaw ustawienia ekspozycji na 215 milidżuli na centymetr kwadratowy i uruchom maszynę. Po naświetleniu zanurz szkiełko w roztworze wywoływacza MF-319 na dwie minuty, delikatnie mieszając.
Następnie wyjmij szklaną płytkę i spłucz jej powierzchnię wodą dejonizowaną. Na koniec umieść szklane szkiełko w piekarniku o temperaturze 150 stopni Celsjusza, aby upiec na twardo, upewniając się, że powierzchnia podłoża jest skierowana do góry. Po 30 minutach wyjmij szkiełko z piekarnika i chroń je przed światłem.
Aby wytrawić szkiełko, zanurz je w buforowanym roztworze kwasu fluorowodorowego w proporcji 10 do 1 na jedną minutę w pojemniku z politetrafluoroetylenu. Następnie przenieś i umyj szkiełka w wodzie dejonizowanej trzy razy. Następnie, za pomocą systemu fizycznego osadzania z fazy gazowej, napylaj tytan przez osiem minut z prędkością 100 angstremów na minutę i platynę przez 10 minut z prędkością 200 angstremów na minutę.
Następnie, aby zdjąć fotorezystor, zanurz szkiełka ze szkła pokrytego metalem w kąpieli acetonowej na 10 minut i poddaj kąpieli sonikacji w celu wprowadzenia mieszania. W razie potrzeby użyj chusteczki nasączonej acetonem, aby usunąć wszelkie pozostałości. Następnie formowanie replik polidimetylosiloksanu sprawia, że baza elastomerowa PDMS z utwardzaczem w stosunku wagowym 10 do 1 w jednorazowym pojemniku umieszczonym na wadze elektronicznej.
Następnie wlej roztwór PDMS na płytkę krzemową i umieść mieszaninę w próżni, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Po utwardzeniu mieszaniny w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny, za pomocą czubka żyletki wytnij uformowany PDMS i oderwij go od płytki silikonowej. Następnie za pomocą zaostrzonego stempla do biopsji wyjmij PDMS z wlotu i wylotu urządzenia.
Następnie zaprogramuj generator plazmy do klejenia PDMS. Następnie umieść PDMS i szklaną elektrodę w systemie z funkcjami skierowanymi do góry i uruchom program. Po zakończeniu programu wyjmij urządzenia i użyj stereoskopu, aby szybko wyrównać cechy kanału do elektrod.
Mocno dociśnij od środka PDMS w kierunku boków, aby usunąć wszelkie niechciane pęcherzyki powietrza na styku. Zbierz komórki HEK293, odwiruj je i ponownie zawieś osad w buforze do elektroporacji przy około pięciu milionach ogniw na mililitr. Następnie dodać DNA osocza kodujące GFP do końcowego stężenia 20 mikrogramów na mililitr i delikatnie wymieszać.
Następnie przenieś zawiesinę komórek plazmotycznego DNA do strzykawki o pojemności jednego centymetra sześciennego w celu przeprowadzenia eksperymentów. Umieść mikrourządzenie na stoliku mikroskopu za pomocą uchwytu na szkiełko. Następnie włącz naładowane sprzężone urządzenie, kamerę CCD i ustaw ostrość kanału mikroprzepływowego.
Następnie w przypadku elektroporacji pojedynczej komórki ustaw natężenie przepływu pompy strzykawkowej na 0,1 do 0,3 mikrolitra na minutę, aby zapewnić przepływ pojedynczych komórek przez zestaw elektrod. Następnie ustaw parametry impulsu dla początkowego i najniższego impulsu elektroporacyjnego energii elektrycznej. Postępuj zgodnie z ustaloną liczbą wykryć komórek na aplikację impulsową.
Pod koniec każdego badanego stanu odessać komórki z wylotu mikrourządzenia i uzupełnić wylot pożywką regeneracyjną. Iteruj do następnego warunku impulsu elektroporacyjnego i powtarzaj, aż wszystkie warunki impulsu elektroporacji zostaną przetestowane. Następnie określ parametry impulsu elektroporacyjnego dla populacyjnego sprzężenia zwrotnego o wysokiej przepustowości.
W przypadku elektroporacji sterowanej populacyjnym ze sprzężeniem zwrotnym należy ustawić natężenie przepływu pompy strzykawkowej na jeden do trzech mikrolitrów na minutę i ustawić amplitudę impulsu na optymalny stan. Następnie wyłącz tryb wyzwalania i ustaw szerokość impulsu tak, aby odpowiadała czasowi przejścia komórki. Po elektroporowaniu żądanej liczby ogniw należy wyłączyć zarówno pompę strzykawkową, jak i generator funkcyjny.
Następnie przenieść komórki ze zbiornika wylotowego do kolby lub płytki do hodowli komórkowej o odpowiedniej wielkości, wypełnionej wstępnie podgrzaną pożywką odzysku i przenieść kolbę lub płytkę hodowlaną do inkubatora. W celu analizy danych załaduj dane do oprogramowania analitycznego i wygeneruj wykres prądu w funkcji czasu dla każdego stanu pulsacji. Następnie określ stopień przepuszczalności błony komórkowej, wygeneruj mapę przepuszczalności błony komórkowej we wszystkich badanych warunkach impulsu i zweryfikuj optymalne warunki pulsacji.
Po inkubacji uchwyć obrazy epi-fluorescencji za pomocą filtrów FITC i dalekiej czerwieni, a następnie przeanalizuj zestawy obrazów ręcznie lub za pomocą algorytmu. Poniżej przedstawiono zasady działania stojące za wykrywaniem przepuszczalności na poziomie pojedynczej komórki dla pojedynczej amplitudy impulsu. Po każdym parametrze impulsu elektroporacyjnego testowany jest następny impuls elektroporacyjny o najwyższej energii.
Mapa przenikania błony komórkowej dla komórek HEK293 wykazała wyraźną korelację między zastosowaną energią elektryczną a stopniem przepuszczalności błony komórkowej. W tym eksperymencie jako optymalne określono natężenie pola elektrycznego 1,8 kilowolta na centymetr i impuls 670 mikrosekund. Przy tych wartościach osiągnięto 70% sprawność elektrotransfekcji.
W przeciwieństwie do natężenia pola elektrycznego wynoszącego 0,4 kilowolta na centymetr i czasu trwania impulsu wynoszącego trzy milisekundy, wydajność elektrotransfekcji po 24 godzinach wynosiła mniej niż 5%Termin receptura, który jest często używany przy opisywaniu specyfiki procesu mikroprodukcji, podkreśla znaczenie śledzenia lub optymalizacji każdego kroku w celu pomyślnego wytworzenia działającego urządzenia. Ta technologia elektroporacji może być wykorzystana w dodatkowych biomedycznych projektach badawczych, takich jak generowanie i testowanie limfocytów T CAR lub optymalizacja i testowanie technik edycji genów CRISPR-Cas9. Ta technologia mikroelektroporacji pozwala na elektryczne badanie reakcji różnych typów komórek w celu zastosowania warunków impulsów elektrycznych i skorelowania tych informacji z dostarczeniem klinicznie istotnego ładunku molekularnego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje techniki mikrofabrykacji w celu stworzenia urządzenia mikrofluidycznego do elektroporacji, które umożliwia kontrolowane transfekcje pojedynczych komórek. Umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym permeabilizacji błony komórkowej podczas procesu elektroporacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrofluidyka
- Elektroporacja
- Biologia komórki
Tło
- Elektroporacja to technika stosowana do wprowadzania substancji do komórek.
- Urządzenia mikrofluidyczne umożliwiają precyzyjne sterowanie przepływem płynu i manipulacją komórkami.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym stanu błony komórkowej zwiększa dokładność eksperymentu.
- Ta metoda zmniejsza zależność od tradycyjnych podejść empirycznych.
Cel badania
- Opracowanie skalowalnego urządzenia mikrofluidycznego do elektroporacji.
- Optymalizacja warunków pulsacji dla różnych typów komórek.
- Monitorowanie permeabilizacji błony komórkowej w czasie rzeczywistym.
Stosowane metody
- Techniki mikroelektroporacji do produkcji urządzenia.
- Wykorzystanie płytki krzemu i fotorezysty SU-8 w procesie produkcyjnym.
- Kontrolowane warunki pulsacji do elektroporacji.
- Monitorowanie elektryczne w czasie rzeczywistym stanu błony komórkowej.
Główne wyniki
- Urządzenie skutecznie przeprowadza elektroporację pojedynczych komórek.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym dostarcza informacji na temat permeabilizacji błony komórkowej.
- Optymalne warunki prowadzą do poprawy efektywności transfekcji.
- Metoda może być skalowana do zastosowań o wyższym przepływie.
Wnioski
- Mikrofluidyczne urządzenie do elektroporacji jest skuteczne w kontrolowanych transfekcjach.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym poprawia zrozumienie dynamiki elektroporacji.
- To podejście może usprawnić proces transfekcji komórek w badaniach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This micro-electroporation system addresses the high manufacturing costs and lengthy protocol development associated with viral-mediated gene delivery in cell therapy development. By enabling real-time monitoring of cell membrane permeabilization and optimizing pulsing conditions through population-based feedback control, the technology reduces empirical experimentation and supports scalable transfection workflows. This positions the method as a predictive, cost-effective alternative for early-stage target validation and lead identification in biologics development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating electrical pulsing conditions with molecular delivery efficiency.
- Operational Value: Reduces reliance on trial-and-error protocol optimization for difficult-to-transfect primary cells.
- Predictive Value: Supports data-driven go/no-go decisions by establishing permeability-transfection relationships early in discovery.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantitative permeability maps that enable consistent compound or cargo evaluation across conditions.
- Scalability: Population-based feedback control increases throughput from single-cell to higher-rate processing while maintaining real-time monitoring.
- Reproducibility: Fabrication via established microfabrication techniques ensures device consistency across batches for assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-scale optimization to preclinical validation by providing transferable pulsing parameters for difficult cell types.
- Mechanistic De-risking: Correlates electrical inputs with functional outputs (e.g., GFP expression) to reduce ambiguity in gene delivery mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables prioritization of cell types or constructs based on empirically derived transfection efficiency thresholds.
Pipeline & Workflow Integration
The system integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, where optimized electroporation conditions support reliable delivery of genetic constructs for functional screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling precise, measurable delivery of siRNA, DNA, or CRISPR components into target cells.
- Screening: Delivers assay-ready cells with standardized permeabilization states for consistent response measurement to therapeutic candidates.
- Analytics: Generates real-time current versus time readouts and post-transfection fluorescence data to quantify delivery efficiency under varying conditions.
- Translational Research: Provides optimized pulsing conditions that can be transferred to preclinical models for continued validation of gene-editing or cell-therapy constructs.
- Enterprise Reuse: Fabricated using scalable microfluidic and photolithography techniques, the device serves as a reusable platform across multiple projects and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in transgene delivery by linking electrical parameters to functional outcomes.
- Operational Value: Standardizes electroporation through feedback-controlled pulsing, reducing variability and operator-dependent optimization.
- Strategic Value: Lowers development costs and timelines by minimizing empirical screening and enabling rapid condition optimization.
- Portfolio Impact: Improves risk-adjusted prioritization of gene delivery constructs based on quantifiable transfection efficiency data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication, microfluidics, and electrical pulse control for device setup and operation.
- Depends on access to photolithography equipment, sputter coaters, and cleanroom-compatible processes for electrode and channel fabrication.
- Necessitates standardization of cell preparation, suspension concentration, and recovery protocols across users and labs.
- Adaptation to different cell types requires re-running the permeability mapping and feedback optimization steps.
- Practical limitations include the need for fluorescent cargo (e.g., GFP) for efficiency validation and constraints on maximum throughput due to cell transit time and detection speed.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Device Fabrication‐Photolithography
3:12
Device Fabrication
5:21
Cell Preparation, Experimental Setup, Operation, and Analysis
8:24
Results: Cell Membrane Permeabilization and Electro‐Transfection Efficiency Using the Continuous Flow, Micro‐Electroporation System
9:36
Conclusion
