Obrazowanie 3D macierzy zewnątrzkomórkowej wątroby w mysim modelu niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby
25 lutego 2022
Obecny protokół optymalizuje metody perfuzji/decelularyzacji wątroby in situ i mikroskopii dwufotonowej w celu stworzenia niezawodnej platformy do wizualizacji dynamiki przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) podczas niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH).
NASH jest jedną z najważniejszych przewlekłych chorób wątroby na świecie. Może przejść do zwłóknienia, marskości wątroby i ostatecznie raka wątroby. Badanie dynamicznej zmiany ECM w NASH może pomóc w lepszym zrozumieniu zwłóknienia.
Tradycyjne obrazowanie nie może wykazać zmian w strukturze 3D ECM, co ogranicza zrozumienie dynamicznego procesu przebudowy ECM w zwłóknieniu wątroby. Aby rozpocząć, zważ mysz przed zabiegiem. Po znieczuleniu myszy należy ogolić okolicę brzuszną za pomocą maszynki do strzyżenia włosów i zdezynfekować skórę 70% etanolem.
Połóż mysz na plecach i unieruchamij nogi na tablicy operacyjnej za pomocą taśmy. Użyj nożyczek Mayo i kleszczy Adson, aby wykonać trzycentymetrowe nacięcie boczne w dolnej części brzucha. A następnie pięciocentymetrowe nacięcie pionowo od dolnej części brzucha do wyrostka mieczykowatego bez otwierania jamy klatki piersiowej.
Po otwarciu otrzewnej delikatnie umieść jelita po lewej stronie zwierzęcia i podnieś prawy płat wątroby za pomocą aplikatora zakończonego sztucznym jedwabiem, aby odsłonić żyłę wrotną. Aby cewnikować żyłę wrotną, należy wprowadzić cewnik dożylny o rozmiarze 24 do dystalnego końca żyły wrotnej. Umieść końcówkę cewnika, zanim żyła wrotna rozgałęzi się do płatów wątroby.
Wyjmij igłę natychmiast po wprowadzeniu cewnika do żyły. Sprawdź, czy cewnik jest prawidłowo umieszczony wewnątrz żyły, wykonując perfuzję wątroby za pomocą PBS za pomocą jednomililitrowej strzykawki przez cewnik. Użyj mikrokleszczyków Dumont, mikroigły Castroviejo i szwu 4-0, aby umieścić szew poniżej rozgałęzienia żyły wrotnej i drugi szew jeden centymetr poniżej, aby zabezpieczyć cewnik.
Podłącz cewnik do silikonowej rurki o długości jednego metra, średnicy wewnętrznej trzech milimetrów i średnicy zewnętrznej 4,1 milimetra za pomocą łącznika przynęty. Podłącz silikonową rurkę do pompy perystaltycznej i zbiornika zawierającego wodę dejonizowaną. Ostrożnie usuń pęcherzyki powietrza z wnętrza rurki i unikaj tworzenia nowych pęcherzyków podczas perfuzji.
Ustaw pompę perystaltyczną na wydajność 0,2 mililitra na minutę. Najpierw zanurz się w wodzie dejonizowanej przez dwie godziny, a kolor wątroby zmieni się z czerwonego na żółty podczas perfuzji. Zamień roztwór perfuzyjny na 0,5% deoksycholan sodu i kontynuuj przez noc, a wątroba stanie się biała pod koniec perfuzji.
Zamień roztwór perfuzyjny na wodę dejonizowaną i upływaj przez dwie godziny. Użyj mikrokleszczyków Dumont i mikronożyczek sprężynujących, aby zebrać pozbawioną komórek wątrobę i dokładnie umyć ją na szalce Petriego z PBS. Przenieś mały kawałek pozbawionej komórek wątroby na szkiełko mikroskopowe i umieść tkankę pośrodku.
Dodaj 10 mikrolitrów pożywki mocującej zapobiegającej blaknięciu do tkanki za pomocą pipety, aby uniknąć wysuszenia tkanki. Przykryj chusteczkę szkłem nakrywkowym i przyłóż niewielką siłę, aby spłaszczyć próbkę. Uszczelnij krawędzie szkła nakrywkowego bezbarwnym i przezroczystym lakierem do paznokci.
Umieść kroplę olejku immersyjnego na wierzchu szkła nakrywkowego i umieść szkiełko na uchwycie szkiełka mikroskopowego. Opuść soczewkę obiektywu olejowego 20X, aż zetknie się z olejkiem immersyjnym. Przełącz na kanał fioletowy o długości fali 405 nanometrów.
Włącz migawkę i ustaw ostrość próbki. Nawiguj i ustaw obszar zainteresowania do obrazowania. Wyłącz migawkę przed przejściem do akwizycji obrazu za pomocą światła laserowego.
Aby uruchomić laser dwufotonowy, przełącz się na sterowanie komputerowe i najpierw włącz laser dwufotonowy. Następnie włącz kontroler lasera dwufotonowego i migawkę, upewniając się, że moc wyjściowa jest wyższa niż 2,5 wata. Zmniejsz moc lasera, aby zapobiec wygaszaniu fluorescencji.
Wybierz i dostosuj detektory, zarówno powielacze zdjęć, jak i hybrydę, aby pomieścić wybrane fluorofory. Wybierz jednoczesną lub sekwencyjną akwizycję obrazu. Ustaw otwór na najwyższą wartość.
Dostosuj długości fal lasera, wzmocnienie, moc, przesuń czas przebywania pikseli, uśrednianie rozmiaru piksela i powiększenie. Przewiń kontroler Z komputera i ustaw wymiary Z. Zdefiniuj początek i koniec oraz wybierz liczbę obrazów podanych w woluminie.
Pobieranie obrazów. Po wykonaniu dwóch mikroskopii fotonowych włókna kolagenowe bez decelularyzacji ujawniły obraz sieci kolagenowej o niskiej rozdzielczości. W zdecelularyzowanej macierzy zewnątrzkomórkowej zaobserwowano wyraźne różnice w morfologii i rozmieszczeniu przestrzennym między wątrobami diety karmowej i fast food.
Włókna kolagenowe i myszy na diecie chow wykazywały przeplatającą się i dobrze zorganizowaną sieć, podczas gdy myszy na diecie fast food wykazywały wiązki kolagenu z mniejszą łącznością. Trójwymiarowa struktura macierzy zewnątrzkomórkowej wątroby pokazuje, że włókna kolagenowe u myszy na diecie karm wykazywały dobrze zorganizowaną sieć, ale nie u myszy na diecie typu fast food. Aby potwierdzić jakość kolagenu fibrylarnego w bezkomórkowej macierzy zewnątrzkomórkowej, szkiełka wybarwiono hematoksyliną eozyną i czerwienią Picrosirius.
Hematoksylina i Eozyna pokazują, że wszystkie komórki zostały usunięte. Na obrazach z czerwonym zabarwieniem Picrosiriusa macierz zewnątrzkomórkowa myszy karmionych karmą ujawniła dobrze zorganizowaną sieć. W przeciwieństwie do tego, myszy na diecie fast food wykazywały gęstsze włókna kolagenowe.
Ostrożnie usuń pęcherzyk z wnętrza probówki przed perfuzją. Bąbelek zablokuje naczynie w wątrobie i wpłynie na perfuzję.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół optymalizuje metody perfuzji/decelularyzacji wątroby in situ oraz mikroskopii dwufotonowej w celu wizualizacji przebudowy macierzy pozakomórkowej (ECM) podczas niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH). Zrozumienie dynamiki ECM jest kluczowe dla uzyskania wiedzy na temat włóknienia wątroby.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Badania nad chorobami wątroby
Wstęp
- NASH jest istotną chorobą przewlekłą wątroby w skali globalnej.
- Może ona prowadzić do włóknienia, marskości oraz raka wątroby.
- Tradycyjne metody obrazowania nie pozwalają na uchwycenie zmian w trójwymiarowej strukturze ECM.
- Zrozumienie dynamiki ECM jest niezbędne do badania włóknienia wątroby.
Cel badania
- Optymalizacja metod wizualizacji przebudowy ECM w NASH.
- Pogłębienie zrozumienia procesu włóknienia.
- Stworzenie niezawodnej platformy do przyszłych badań.
Zastosowane metody
- Perfuzja i decelularyzacja wątroby in situ.
- Mikroskopia dwufotonowa do obrazowania.
- Model mysi do badania NASH.
- Przygotowanie i dezynfekcja myszy przed procedurami.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja dynamiki przebudowy ECM.
- Lepsze zrozumienie zależności między ECM a włóknieniem wątroby.
- Stworzenie niezawodnej platformy obrazowania.
- Wnioski dotyczące progresji NASH.
Wnioski
- Zoptymalizowane metody dostarczają cennych informacji na temat dynamiki ECM.
- Niniejsze badanie może stanowić podstawę dla przyszłych analiz dotyczących chorób wątroby.
- Zrozumienie przebudowy ECM jest kluczowe dla walki z włóknieniem wątroby.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Trójwymiarowe obrazowanie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) wątroby w modelach NASH wypełnia krytyczną lukę w zrozumieniu progresji włóknienia i przebudowy ECM. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w przedklinicznych modelach chorób wątroby i dostarcza danych do walidacji celów w procesie odkrywania leków przeciw włóknieniowych. Integracja zaawansowanej wizualizacji ECM wspiera decyzje dotyczące portfela projektów w punkcie przejścia z etapu odkrywania do fazy przedklinicznej, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację przebudowy ECM w celu wyjaśnienia szlaków fibrogennych w NASH.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnienie strukturalnych zmian ECM pomiędzy stanem zdrowym a chorobowym.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie oddziaływania na cel oraz istotności biologicznej w modelach włóknienia.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie odkomórkowanych rusztowań wątroby do ilościowych analiz obrazowych.
- Umożliwia powtarzalną ocenę architektury ECM w celu przesiewania związków.
- Zapewnia zestandaryzowane wyniki obrazowania 3D do oceny wydajności i skalowalności testu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie wyników obrazowania ECM z punktami końcowymi istotnymi dla przebiegu choroby w progresji NASH.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną, umożliwiając bezpośrednie porównanie przebudowy ECM w różnych modelach.
- Wspiera rozwój biomarkerów translacyjnych poprzez korelację cech 3D ECM z wynikami histopatologicznymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając wysokorozdzielczą analizę ECM w mysich modelach NASH, co wspiera zarówno walidację celów terapeutycznych, jak i procesy badawcze w ramach medycyny translacyjnej.
- Biologia odkrywcza: Dostarcza ilościowych danych 3D dotyczących ECM w celu testowania hipotez fibrogennych i wyjaśniania mechanizmów przebudowy.
- Screening: Zapewnia powtarzalne wyniki obrazowania do oceny interwencji antyfibrotycznych w walidowanych modelach.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty struktury ECM, wspierając porównania statystyczne grup eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki przedkliniczne z klinicznymi punktami końcowymi włóknienia poprzez zaawansowaną charakterystykę ECM.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę obrazowania z możliwością ponownego wykorzystania w różnorodnych badaniach nad chorobami i włóknieniem wątroby.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad włóknieniem wątroby.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje obrazowanie i analizę ECM w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności w różnych badaniach.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne wykorzystanie kapitału w rozwoju programów antyfibrotycznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację aktywów w obszarze chorób wątroby z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o solidne dane dotyczące przebudowy ECM.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie perfuzji in situ, decelularyzacji oraz zaawansowanej mikroskopii.
- Niezbędny jest dostęp do mikroskopii dwufotonowej oraz infrastruktury do analizy obrazów.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja protokołów obrazowania i interpretacji danych.
- Może być wymagana adaptacja metody dla różnych gatunków lub modeli chorób wątroby.
- Staranna technika perfuzji jest kluczowa, aby uniknąć artefaktów i zapewnić wysoką jakość danych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Surgical Preparation and Procedures of Liver Perfusion
2:08
Tissue Decellularization and Slide Preparation for Imaging
3:35
Image Acquisition
4:58
Results: Two-Photon Microscopy of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse
6:19
Conclusion
