Name: Obrazowanie 3D macierzy zewnątrzkomórkowej wątroby w mysim modelu niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Poznaj metodę obrazowania 3D macierzy zewnątrzkomórkowej wątroby w mysim modelu niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby. Technika perfuzji in situ i mikroskopii dwufotonowej umożliwia wizualizację dynamiki ECM.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Hyesuk Park za pomoc techniczną. Badania te były finansowane przez National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, do NJT), National Institute on Aging (NIA), NIH (1R01AG060726, do NJT). Serdecznie dziękujemy Jonowi Mulhollandowi i Kitty Lee z Cell Sciences Imaging Facility w Beckman Center za pomoc techniczną przy obrazowaniu za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Eksperymenty na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z procedurami eksperymentalnymi zatwierdzonymi przez instytucjonalne komitety ds. opieki i użytkowania zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Stanforda oraz Szpitala Weteranów w Palo Alto. 6-8 tygodniowe samce myszy C57BL/6J były karmione karmą lub dietą typu fast-food uzupełnioną syropem kukurydzianym o wysokiej zawartości 4,2% (patrz Tabela Materiałów) w wodzie pitnej przez 14 tygodni5. Myszy trzymano w standardowych klatkach w 12-godzinnym cyklu ciemności/światła.
1. Chirurgiczne przygotowanie i procedury perfuzji wątroby
<ol>
	<li>Zważ mysz przed zabiegiem.</li>
	<li>Znieczulić mysz, podając ketaminę (90 mg/kg) i ksylazynę (10 mg/kg) (patrz tabela materiałów) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Upewnij się, że mysz jest w pełni znieczulona przez szczypanie palców u nóg przed przejściem do następnego kroku. 
	UWAGA: Izofluran nie jest tutaj potrzebny, ponieważ jest to operacja niepozwalająca na przeżycie.</li>
	<li>Ogol okolicę brzuszną za pomocą maszynki do strzyżenia włosów i zdezynfekuj skórę 70% etanolem. Połóż mysz na plecach i unieruchom nogi na tablicy operacyjnej za pomocą taśmy.</li>
	<li>Po ponownym potwierdzeniu głębokości znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi, za pomocą nożyczek Mayo i kleszczyków Adson (patrz Tabela materiałów) wykonaj 3 cm nacięcie boczne w dolnej części brzucha, a następnie 5 cm nacięcie pionowo od dolnej części brzucha do wyrostka mieczykowatego. Uważaj, aby nie otworzyć jamy klatki piersiowej.</li>
	<li>Po otwarciu otrzewnej delikatnie umieść jelita po lewej stronie zwierzęcia i podnieś prawy płat wątroby za pomocą aplikatora ze sztucznego jedwabiu (patrz tabela materiałów), aby odsłonić żyłę wrotną.</li>
	<li>Cewnikować żyłę wrotną za pomocą cewnika 24 G IV. Wprowadzić cewnik do dystalnego końca żyły wrotnej. Umieść końcówkę cewnika, zanim żyła wrotna rozgałęzi się do płatów wątroby.</li>
	<li>Wyjmij igłę natychmiast po wprowadzeniu cewnika do żyły. Sprawdź, czy cewnik jest prawidłowo umieszczony wewnątrz żyły, wykonując perfuzję wątroby za pomocą PBS za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml przez cewnik. 
	UWAGA: Po perfuzji PBS wszystkie płaty powinny natychmiast zblednąć. Jeśli cewnik zostanie prawidłowo założony, krew żylna szybko przepłynie przez cewnik.</li>
	<li>Użyj mikrokleszczyków Dumont, uchwytu na mikroigły Castroviejo i szwu 4-0 (patrz Tabela materiałów), aby umieścić ścieg poniżej rozgałęzienia żyły wrotnej i drugi szew 1 cm poniżej, aby zabezpieczyć cewnik.</li>
</ol>
2. Decelularyzacja tkanek
<ol>
	<li>Podłącz cewnik do silikonowej rurki (~1 m długości, 3 mm średnicy wewnętrznej i 4.1 mm średnicy zewnętrznej) ze złączem Luer. Podłącz silikonową rurkę do pompy perystaltycznej i zbiornika zawierającego wodę dejonizowaną (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Ostrożnie usuń pęcherzyki powietrza z wnętrza rurki i unikaj tworzenia nowych pęcherzyków podczas perfuzji. Ustaw pompę perystaltyczną na wydatek 0,2 ml/min (tj. 288 ml/24 h).</li>
	<li>Najpierw utrwalaj się wodą dejonizowaną (~50 ml / mysz) przez 2 godziny. Kolor wątroby zmieni się z czerwonego na żółty podczas perfuzji. 
	UWAGA: Zwierzę umrze po 10 minutach perfuzji.</li>
	<li>Zamień roztwór perfuzyjny na 0,5% (wag./obj.) deoksycholanu sodu (DOC, patrz tabela materiałów) i kontynuuj przez noc (18 godzin, ~250 ml / mysz). Wątroba stanie się biała pod koniec perfuzji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Zamień roztwór perfuzyjny na wodę dejonizowaną (~50 ml / mysz) i uzyskuj przez 2 godziny.</li>
	<li>Użyj mikrokleszczyków Dumont i nożyczek z mikrosprężynami (patrz Tabela materiałów), aby zebrać pozbawioną komórek wątrobę i dokładnie umyć ją na szalce Petriego z PBS.</li>
	<li>Pokrój pozbawioną komórek tkankę na małe kawałki w celu natychmiastowego obrazowania lub zamroź w temperaturze -80 °C w celu dalszej analizy biochemicznej, takiej jak tandemowa spektrometria mas, ELISA lub western blot.</li>
</ol>
3. Przygotowanie preparatu do obrazowania (za pomocą wielofotonowego/konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego)
<ol>
	<li>Przenieś mały kawałek pozbawionej komórek wątroby (<3 x 3 x 3 mm) na szkiełko mikroskopowe i umieść tkankę pośrodku.</li>
	<li>Dodać 10 μl podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu (patrz tabela materiałów) do chusteczki za pomocą pipety, aby uniknąć wysuszenia tkanki.</li>
	<li>Przykryj chusteczkę szkłem nakrywkowym i przyłóż niewielką siłę, aby spłaszczyć próbkę. Uszczelnij krawędzie szkła nakrywkowego bezbarwnym i przezroczystym lakierem do paznokci (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
	UWAGA: Ze względu na ustawienie pionowego dwufotonu przez mikroskop, na próbce zastosowano szkło nakrywkowe. Jednak próbki mogą być umieszczane inaczej, jeśli używany jest mikroskop odwrócony.</li>
</ol>
4. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Umieść kroplę olejku immersyjnego na wierzchu szkła nakrywkowego i umieść szkiełko na uchwycie szkiełka mikroskopowego. Opuść soczewkę obiektywu olejowego 20x, aż zetknie się z olejkiem immersyjnym.</li>
	<li>Przełącz się na kanał fioletowy (405 nm), włącz migawkę i skup się na próbce. Nawiguj i ustaw obszar zainteresowania do obrazowania. Wyłącz migawkę przed przejściem do akwizycji obrazu za pomocą światła laserowego.</li>
	<li>Przełącz się na sterowanie komputerowe i uruchom laser dwufotonowy. Najpierw włącz laser dwufotonowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A), a następnie włącz dwufotonowy kontroler laserowy (patrz Tabela materiałów) i migawkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B,C). Upewnij się, że moc wyjściowa jest wyższa niż 2.5 W. 
	Zmniejsz moc lasera, aby zapobiec wygaszaniu fluorescencji. Wybierz i dostosuj detektory (zarówno fotopowielacze, jak i hybrydę) do wybranych fluoroforów. 
	UWAGA: Obrazowanie dwufotonowe przeprowadzono przy długości fali wzbudzenia 860 nm. Wybrano dwa kanały odpowiednio dla obrazów kolagenu SHG i fluorescencji wzbudzonej dwufotonami (TPEF). Jeden kanał odpowiadający zakresowi długości fal 415-445 nm wykrył szczegółową strukturę kolagenu na podstawie sygnałów SHG. Kolejny kanał obejmował zakres 465-669 nm do zbierania sygnałów TPEF.</li>
	<li>Wybierz jednoczesną lub sekwencyjną akwizycję obrazu. Ustaw otwór na najwyższą wartość. Dostosuj długości fal lasera, wzmocnienie, moc i przesunięcie. Dostosuj czas przebywania piksela, rozmiar piksela, uśrednianie i powiększenie (Rysunek 4A).</li>
	<li>Przewiń kontroler z komputera i ustaw wymiary z, zdefiniuj początek i koniec oraz wybierz liczbę obrazów podanych w woluminie (z-stosie). Pobierz images. 
	UWAGA: W tym przypadku wybrano objętość Z 20 μm i rozmiar kroku Z 1 μm (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4B).</li>
</ol>

<ol><li>Friedman, S. L., Pinzani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+fibrosis%3A+2022+unmet+needs+and+a+blueprint+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future.</a> Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).</li>
<li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence%2C+incidence%2C+and+outcomes+of+non-obese+or+lean+non-alcoholic+fatty+liver+disease%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).</li>
<li>Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+fibrosis+development+in+non-alcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis.</a> Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).</li>
<li>Arteel, G. E., Naba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+matrisome+-+looking+beyond+collagens%5BTitle%5D)+AND+%22JHEP+Reports%22%5BJournal%5D)">The liver matrisome - looking beyond collagens.</a> JHEP Reports. 2 (4), 100115(2020).</li>
<li>Jiang, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonphagocytic+activation+of+NOX2+is+implicated+in+progressive+non-alcoholic+steatohepatitis+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging.</a> Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).</li>
<li>Dehnad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGER1+downregulation+associates+with+fibrosis+in+non-alcoholic+steatohepatitis+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).</li>
<li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cirrhotic+human+liver+extracellular+matrix+3D+scaffolds+promote+smad-dependent+tgf-beta1+epithelial+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition.</a> Cells. 9 (1), 83(2019).</li>
<li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alterations+in+the+extracellular+matrix+composition+guide+the+repair+of+damaged+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue.</a> Scientific Reports. 6, 27398(2016).</li>
<li>Mattei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanostructure+and+composition+of+highly+reproducible+decellularized+liver+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices.</a> Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).</li>
<li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).</li>
<li>Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+cancer%3A+A+strained+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and cancer: A strained relationship.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356(2020).</li>
<li>Cox, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+matrix+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The matrix in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).</li>
<li>Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tissue+engineering+as+an+emerging+alternative+for+liver+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).</li>
<li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+human+liver+as+a+natural+3D-scaffold+for+liver+bioengineering+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation.</a> Scientific Reports. 5, 13079(2015).</li>
<li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+system+for+liver+tissue+mimicking+hepatic+plates+for+improvement+of+human+hepatocyte+%28C3A%29+function+and+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity.</a> BioMed Research International. 2020, 6354183(2020).</li>
<li>Shimoda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+liver+scaffolds+promote+liver+regeneration+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12543(2019).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że w związku z tym artykułem nie występują konflikty interesów.

Obecny protokół pokazuje, że decelularyzacja poprzez perfuzję in situ DOC o niskim natężeniu przepływu zachowuje łamliwe struktury potrójnej helisy i natywnego kolagenu fibrylarnego, zapewniając niezawodną i opłacalną platformę do przechwytywania dynamicznej przebudowy ECM w zwłóknieniu wątroby NASH. Chociaż decelularyzacja została przeprowadzona w prawidłowych i zwłóknienionych wątrobach przed zidentyfikowaniem składników ECM lub wygenerowaniem biologicznych rusztowań do hodowli komórek, dynamika przebudowy ECM...

Niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD) jest najczęstszą chorobą wątroby, dotykającą 20%-25% dorosłej populacji. 25% pacjentów z NAFLD przechodzi w niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby (NASH), gdzie wzrasta ryzyko marskości wątroby, niewydolności wątroby i raka wątrobowokomórkowego1. Szacuje się, że w ciągu najbliższych 20 lat NASH będzie odpowiadać za 2 miliony zgonów związanych z wątrobą w U.S2. Ponieważ nie ma zatwierdzonych metod leczenia, istnieje pilna potrzeba rozszyfrowania mechanizmów, które powodują zwłóknienie wątroby u pacjentów z NASH i opracowania ukierunkowanego leczenia3.
Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) to dynamiczne, złożone mikrośrodowisko, które wywiera dwukierunkową komunikację z komórkami w celu regulacji homeostazy tkanek4. ECM wątroby składa się z elementów strukturalnych, takich jak proteoglikany, kolageny, fibronektyna, elastyna i inne białka niestrukturalne (np. olfaktomedyna i trombospondyna), aby zapewnić fizyczne i strukturalne wsparcie4.
Zwłóknienie wątroby to przewlekła reakcja gojenia ran na uszkodzenie wątroby o różnej etiologii, w tym NASH3. Wynika to z braku równowagi w dynamicznym procesie przebudowy macierzy ECM i charakteryzuje się nadmiarem białek strukturalnych w uszkodzonej wątrobie4. Fibrogeneza zależy od dynamicznej komunikacji komórka-komórka między różnymi typami komórek wątroby. Komórki gwiaździste wątroby (HSC), po aktywacji, różnicują się w komórki podobne do miofibroblastów alfa 2 alfa 2 mięśni gładkich i syntetyzują białka ECM jako działanie zamykające rany. Aktywowane HSC są centralnymi komórkami produkującymi kolagen w klasie liver<sup="xref">1.
Molekularny mechanizm przebudowy ECM, wzorce zwłóknienia i ich związek ze zdarzeniami komórkowymi nie są jasne. Nadal potrzebne jest lepsze zrozumienie trójwymiarowej (3D) struktury ECM, mimo że techniki spektrometrii mas pomogły w analizie składu białek ECM4. Tradycyjnie, barwienie trichromowe Massona, barwienie czerwienią Picro Sirius i obrazowanie drugiej generacji harmonicznej (SHG) przeprowadzono na dwuwymiarowych (2D) cienkich skrawkach wątroby. Typowy wzorzec zwłóknienia NASH nazywa się "drutem z kurczaka", który rozciąga się do strefy 3 i jest zwłóknieniem okołosinusoidalnym/okołokomórkowym5,6. Brakowało jednak badań skupiających się na strukturze 3D natywnej wątroby, szczególnie tych, które nie obejmują sekcji tkanek. Solidne metody obrazowania w celu identyfikacji wzorców i cech zwłóknienia podczas dynamicznej przebudowy ECM w zwłóknieniu wątroby znacznie pogłębiłyby zrozumienie mechanizmów NASH i pozwoliłyby zidentyfikować nowe cele terapeutyczne.
Aby sprostać tym wyzwaniom, zoptymalizowano szybki i wydajny protokół do obrazowania natywnego ECM wątroby za pomocą decelularyzacji7. Decelularyzacja całej wątroby to podejście polegające na usunięciu zawartości komórkowej wątroby przy jednoczesnym zachowaniu natywnej sieci ECM 3D poprzez perfuzję detergentu. Myszy były karmione dietą karmową lub fast-food (FFD) przez 14 tygodni. Decelularyzacja przeprowadzono po perfuzji żyły wrotnej in situ łagodnym detergentem i niskimi prędkościami przepływu w celu zachowania struktur potrójnej helisy i natywnego kolagenu fibrylarnego. Mikroskopię dwufotonową zastosowano do analizy zmian w strukturach kolagenu w ECM. Obrazy 3D natywnej struktury ECM w prawidłowej wątrobie i NASH zostały odtworzone i przeanalizowane. Przeprowadzanie decelularyzacji perfuzyjnej in situ i analiza rusztowania za pomocą mikroskopii dwufotonowej stanowi praktyczną i niedrogą platformę do wizualizacji dynamicznej przebudowy ECM w wątrobie.

<table><tbody><tr><td>4-0 MONOCRYL NIEBARWIONY 1 x 18" P-3</td><td>MONOCRYL</td><td>Y494G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 szew</td><td>fisher scientific</td><td>10-000-649</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true</td></tr><tr><td>AnaSed Injection (ksylazyna)</td><td>AnaSed</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>ten lek do stosowania przez licencjonowanego lekarza weterynarii lub na jego zlecenie.</td></tr><tr><td>Cewnik dożylny BD INSYTE AUTOGUARD Z TECHNOLOGIĄ BC</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> 382612 <tr><td>Dieta Chow</td><td>Envigo</td><td># 2918</td><td>Dieta kontrolna. Dieta o stałej formule, nieautoklawowalna, wyprodukowana z wysokiej jakości składników i zaprojektowana w celu wspierania ciąży, laktacji i wzrostu gryzoni.</td></tr><tr><td>Dieta fast-food (AIN76A Dieta Zachodnia)</td><td>Test diety</td><td>1810060</td><td>https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf</td></tr><tr><td>Zestaw barwników hematoksyliny i eozyny</td><td>vectorlabs</td><td>H-3502</td><td>https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html</td></tr><tr><td>Kent Scientific Zestaw chirurgiczny dla szczurów</td><td>fisher scientific</td><td>13-005-205</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit</td></tr><tr><td>CHLOROWODOREK KETAMINY DO WSTRZYKIWAŃ</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-996-06 - 10 ml - fiolka.</td><td>KetaVed był badany klinicznie na naczelnych innych niż ludzie, oprócz gatunków wymienionych w sekcji Administracja i dawkowanie.</td></tr><tr><td>Leica SP5 - pionowy koncentryczny, wielofotonowy</td> łącznik <td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Luer (zawór trójdrogowy z blokadą SPIN-LOCK&reg;)</td><td>bbraun</td><td>D300</td><td>https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html</td></tr><tr><td>Zestaw czerwonych plam Picrosirius</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>24901</td><td>https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771</td></tr><tr><td>Aplikator z końcówką ze sztucznego jedwabiu</td><td>purytan</td><td>25-806 1PR</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>sigmaaldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Syrop</td><td>www.target.com</td><td>24 uncje</td><td>https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna o zmiennej prędkości</td><td>INTLLAB</td><td>BT100</td><td>https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Medium</td><td>montażowe vectorlabs</td><td>H-1000-10</td><td>https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html</td></tr></tbody></table>

obrazowanie 3d macierzy zewnątrzkomórkowej wątroby w mysim modelu niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby

3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

Niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby (NASH) jest najczęstszą przewlekłą chorobą wątroby w Stanach Zjednoczonych, dotykającą ponad 70 milionów Amerykanów. NASH może prowadzić do zwłóknienia, a ostatecznie do marskości wątroby, istotnego czynnika ryzyka raka wątrobowokomórkowego. Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) zapewnia wsparcie strukturalne i utrzymuje homeostazę wątroby poprzez sygnały matrikomórkowe. Zwłóknienie wątroby wynika z braku równowagi w dynamicznym procesie przebudowy ECM i charakteryzuje się nadmiernym nagromadzeniem elementów strukturalnych i związanymi z tym zmianami w glikozaminoglikanach. Typowy wzór zwłóknienia NASH nazywa się "drutem kurzym", który zwykle składa się ze zwłóknienia okołosinusoidalnego/okołokomórkowego strefy 3, w oparciu o cechy obserwowane przez plamę trichromową Massona i plamy Picrosirius Red. Jednak te tradycyjne, cienkie, dwuwymiarowe (2D) techniki obrazowania tkanek oparte na szkiełkach nie mogą wykazać szczegółowych trójwymiarowych (3D) zmian strukturalnych ECM, co ogranicza zrozumienie dynamicznej przebudowy ECM w zwłóknieniu wątroby.
Obecne prace optymalizują szybki i wydajny protokół do obrazowania natywnej struktury ECM w wątrobie poprzez decelularyzację, aby sprostać powyższym wyzwaniom. Myszy były karmione dietą karmową lub fast-food przez 14 tygodni. Decelularyzację przeprowadzono po perfuzji żyły wrotnej in situ, a techniki mikroskopii dwufotonowej zastosowano do obrazowania i analizy zmian w natywnym ECM. Obrazy 3D prawidłowej wątroby i NASH zostały odtworzone i przeanalizowane. Przeprowadzenie decelularyzacji perfuzyjnej in situ i analiza rusztowania za pomocą mikroskopii dwufotonowej zapewniły praktyczną i niezawodną platformę do wizualizacji dynamicznej przebudowy ECM w wątrobie.

Włókna kolagenowe wykryto za pomocą generacji drugiej harmonicznej oraz mikroskopii dwufotonowej. Sygnał pochodzi z kruchych struktur potrójnej helisy oraz natywnych struktur włóknistych kolagenu. Do analizy podtypów kolagenu nie użyto specyficznych przeciwciał; można jednak wprowadzić ten element do techniki obrazowania.
Podczas badania tkanki wątroby bez decelularyzacji uzyskanie obrazów sieci kolagenowej o wysokiej rozdzielczości jest utrudnione (Rycina 5A</stro...

Obecny protokół optymalizuje metody perfuzji/decelularyzacji wątroby in situ i mikroskopii dwufotonowej w celu stworzenia niezawodnej platformy do wizualizacji dynamiki przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) podczas niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH).

Obrazowanie 3D macierzy zewnątrzkomórkowej wątroby w mysim modelu niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

NASH jest jedną z najważniejszych przewlekłych chorób wątroby na świecie. Może przejść do zwłóknienia, marskości wątroby i ostatecznie raka wątroby. Badanie dynamicznej zmiany ECM w NASH może pomóc w lepszym zrozumieniu zwłóknienia.Tradycyjne obrazowanie nie może wykazać zmian w strukturze 3D ECM, co ogranicza zrozumienie dynamicznego procesu przebudowy ECM w zwłóknieniu wątroby. Aby rozpocząć, zważ mysz przed zabiegiem. Po znieczuleniu myszy należy ogolić okolicę brzuszną za pomocą maszynki do strzyżenia włosów i zdezynfekować skórę 70% etanolem.Połóż mysz na plecach i unieruchamij nogi na tablicy operacyjnej za pomocą taśmy. Użyj nożyczek Mayo i kleszczy Adson, aby wykonać trzycentymetrowe nacięcie boczne w dolnej części brzucha. A następnie pięciocentymetrowe nacięcie pionowo od dolnej części brzucha do wyrostka mieczykowatego bez otwierania jamy klatki piersiowej.Po otwarciu otrzewnej delikatnie umieść jelita po lewej stronie zwierzęcia i podnieś prawy płat wątroby za pomocą aplikatora zakończonego sztucznym jedwabiem, aby odsłonić żyłę wrotną. Aby cewnikować żyłę wrotną, należy wprowadzić cewnik dożylny o rozmiarze 24 do dystalnego końca żyły wrotnej. Umieść końcówkę cewnika, zanim żyła wrotna rozgałęzi się do płatów wątroby.Wyjmij igłę natychmiast po wprowadzeniu cewnika do żyły. Sprawdź, czy cewnik jest prawidłowo umieszczony wewnątrz żyły, wykonując perfuzję wątroby za pomocą PBS za pomocą jednomililitrowej strzykawki przez cewnik. Użyj mikrokleszczyków Dumont, mikroigły Castroviejo i szwu 4-0, aby umieścić szew poniżej rozgałęzienia żyły wrotnej i drugi szew jeden centymetr poniżej, aby zabezpieczyć cewnik.Podłącz cewnik do silikonowej rurki o długości jednego metra, średnicy wewnętrznej trzech milimetrów i średnicy zewnętrznej 4,1 milimetra za pomocą łącznika przynęty. Podłącz silikonową rurkę do pompy perystaltycznej i zbiornika zawierającego wodę dejonizowaną. Ostrożnie usuń pęcherzyki powietrza z wnętrza rurki i unikaj tworzenia nowych pęcherzyków podczas perfuzji.Ustaw pompę perystaltyczną na wydajność 0,2 mililitra na minutę. Najpierw zanurz się w wodzie dejonizowanej przez dwie godziny, a kolor wątroby zmieni się z czerwonego na żółty podczas perfuzji. Zamień roztwór perfuzyjny na 0,5% deoksycholan sodu i kontynuuj przez noc, a wątroba stanie się biała pod koniec perfuzji.Zamień roztwór perfuzyjny na wodę dejonizowaną i upływaj przez dwie godziny. Użyj mikrokleszczyków Dumont i mikronożyczek sprężynujących, aby zebrać pozbawioną komórek wątrobę i dokładnie umyć ją na szalce Petriego z PBS. Przenieś mały kawałek pozbawionej komórek wątroby na szkiełko mikroskopowe i umieść tkankę pośrodku.Dodaj 10 mikrolitrów pożywki mocującej zapobiegającej blaknięciu do tkanki za pomocą pipety, aby uniknąć wysuszenia tkanki. Przykryj chusteczkę szkłem nakrywkowym i przyłóż niewielką siłę, aby spłaszczyć próbkę. Uszczelnij krawędzie szkła nakrywkowego bezbarwnym i przezroczystym lakierem do paznokci.Umieść kroplę olejku immersyjnego na wierzchu szkła nakrywkowego i umieść szkiełko na uchwycie szkiełka mikroskopowego. Opuść soczewkę obiektywu olejowego 20X, aż zetknie się z olejkiem immersyjnym. Przełącz na kanał fioletowy o długości fali 405 nanometrów.Włącz migawkę i ustaw ostrość próbki. Nawiguj i ustaw obszar zainteresowania do obrazowania. Wyłącz migawkę przed przejściem do akwizycji obrazu za pomocą światła laserowego.Aby uruchomić laser dwufotonowy, przełącz się na sterowanie komputerowe i najpierw włącz laser dwufotonowy. Następnie włącz kontroler lasera dwufotonowego i migawkę, upewniając się, że moc wyjściowa jest wyższa niż 2,5 wata. Zmniejsz moc lasera, aby zapobiec wygaszaniu fluorescencji.Wybierz i dostosuj detektory, zarówno powielacze zdjęć, jak i hybrydę, aby pomieścić wybrane fluorofory. Wybierz jednoczesną lub sekwencyjną akwizycję obrazu. Ustaw otwór na najwyższą wartość.Dostosuj długości fal lasera, wzmocnienie, moc, przesuń czas przebywania pikseli, uśrednianie rozmiaru piksela i powiększenie. Przewiń kontroler Z komputera i ustaw wymiary Z. Zdefiniuj początek i koniec oraz wybierz liczbę obrazów podanych w woluminie.Pobieranie obrazów. Po wykonaniu dwóch mikroskopii fotonowych włókna kolagenowe bez decelularyzacji ujawniły obraz sieci kolagenowej o niskiej rozdzielczości. W zdecelularyzowanej macierzy zewnątrzkomórkowej zaobserwowano wyraźne różnice w morfologii i rozmieszczeniu przestrzennym między wątrobami diety karmowej i fast food.Włókna kolagenowe i myszy na diecie chow wykazywały przeplatającą się i dobrze zorganizowaną sieć, podczas gdy myszy na diecie fast food wykazywały wiązki kolagenu z mniejszą łącznością. Trójwymiarowa struktura macierzy zewnątrzkomórkowej wątroby pokazuje, że włókna kolagenowe u myszy na diecie karm wykazywały dobrze zorganizowaną sieć, ale nie u myszy na diecie typu fast food. Aby potwierdzić jakość kolagenu fibrylarnego w bezkomórkowej macierzy zewnątrzkomórkowej, szkiełka wybarwiono hematoksyliną eozyną i czerwienią Picrosirius.Hematoksylina i Eozyna pokazują, że wszystkie komórki zostały usunięte. Na obrazach z czerwonym zabarwieniem Picrosiriusa macierz zewnątrzkomórkowa myszy karmionych karmą ujawniła dobrze zorganizowaną sieć. W przeciwieństwie do tego, myszy na diecie fast food wykazywały gęstsze włókna kolagenowe.Ostrożnie usuń pęcherzyk z wnętrza probówki przed perfuzją. Bąbelek zablokuje naczynie w wątrobie i wpłynie na perfuzję.

3d-imaging-liver-extracellular-matrix-mouse-model-non-alcoholic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Stabilne przyżyciowe obrazowanie komórek odpornościowych w wątrobie w wysokiej rozdzielczości jest wyzwaniem. W tym miejscu zapewniamy wysoce czułą i wiarygodną metodę badania migracji i interakcji komórka-komórka komórek odpornościowych w wątrobie myszy przez długi czas (około 6 godzin) za pomocą wielofotonowej laserowej mikroskopii skaningowej w połączeniu z monitorowaniem intensywnej terapii.

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie mikroskopii wielofotonowej komórek odpornościowych w zdrowej i chorej wątrobie przy użyciu myszy reporterowych CXCR6.Gfp

Prezentowany tutaj jest protokół izolacji hepatocytów myszy z wątroby dorosłych myszy przy użyciu zmodyfikowanej techniki perfuzji kolagenazy. Opisano również długoterminową hodowlę hepatocytów w warstwie kolagenowej 3D, a także znakowanie immunologiczne składników cytoszkieletu w celu zbadania tworzenia kanałów żółciowych i ich odpowiedzi na leczenie.

Izolacja i hodowla kanapkowa kolagenu 3D pierwotnych hepatocytów myszy w celu zbadania roli cytoszkieletu w tworzeniu kanałów żółciowych in vitro

Ten protokół przedstawia model biomimetyczny 3D z towarzyszącym zwłóknieniowym przedziałem zrębowym. Przygotowany z fizjologicznie odpowiednich hydrożeli w proporcjach naśladujących biofizyczne właściwości zrębu macierzy zewnątrzkomórkowej, aktywnego mediatora interakcji komórkowych, wzrostu guza i przerzutów.

Model biomimetyczny raka wątroby do badania interakcji guz-zręb w środowisku 3D o przestrajalnych właściwościach biofizycznych

Ten protokół opisuje użycie ulepszonej techniki ultradźwiękowej do nieinwazyjnej obserwacji i ilościowego oznaczania zmian w tkance wątroby w modelach niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby u gryzoni.

Zastosowanie obrazowania ultrasonograficznego i elastografii fali poprzecznej w szczurzym modelu NAFLD/NASH

Choroby wątroby są wywoływane przez wiele przyczyn, które sprzyjają zwłóknieniu lub marskości wątroby. Przeszczep to jedyna opcja na odzyskanie zdrowia. Biorąc jednak pod uwagę niedobór narządów nadających się do przeszczepu, należy zbadać alternatywne rozwiązania. Nasze badania proponują wszczepienie rusztowań kolagenowych w tkance wątroby z modelu zwierzęcego.

Implantacja trójwymiarowego rusztowania macierzy kolagenowej jako strategia regeneracji wątroby

Korzystając z mysiego modelu niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD) wywołanego dietą, opisujemy użycie nowatorskich technik obrazowania mikrotomografii komputerowej in vivo jako nieinwazyjnej metody oceny etapów progresji NAFLD, koncentrując się głównie na sieci naczyniowej wątroby ze względu na jej znaczący udział w dysregulacji wątroby związanej z NAFLD.

Nowatorskie techniki obrazowania mikrotomografii komputerowej in vivo do oceny postępu niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby

Celem tego badania było opracowanie nowatorskiego trójwymiarowego cyfrowego modelu do wczesnej diagnozy zwłóknienia wątroby, który obejmuje sztywność każdego woksela w wątrobie pacjenta i dlatego może być wykorzystany do obliczenia proporcji dystrybucji wątroby pacjenta w różnych stadiach zwłóknienia.

Trójwymiarowy cyfrowy model do wczesnej diagnostyki zwłóknienia wątroby w oparciu o elastografię rezonansu magnetycznego

Tutaj opisujemy platformę, która umożliwia nieinwazyjne obrazowanie in vivo sferoidów wątroby wszczepionych do przedniej komory oka myszy. Przebieg pracy obejmuje zarówno generowanie sferoid z pierwotnych komórek wątroby, jak i przeszczep do oka myszy oraz obrazowanie in vivo w rozdzielczości komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie in vivo sferoid wątroby wszczepionych do przedniej komory oka myszy

Model myszy choroby wątroby związanej z zaburzeniami metabolicznymi (MASLD) z zaburzeniami metabolicznymi, zmianami ekspresji genów wątroby oraz zmianami histologicznymi przypominającymi ludzkie MASLD, w tym zwłóknieniem przechodzącym do zaawansowanego stadium 3. Model ten może być wykorzystywany w badaniach patofizjologii MASLD oraz w przedklinicznych badaniach nowych terapii.

Model myszy dotyczący zaburzenia metabolicznego związane ze steatotyczną chorobą wątroby z włóknieniem

Protokół ten wprowadza nowoczesne, wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby (RHIT) do mikroskopii śródżyciowej (IVM) żywych myszy, które zwiększa stabilność tkanek podczas szybkich i ostrych eksperymentów. Konstrukcja RHIT, drukowana w 3D, oferuje opłacalną produkcję, skalowalność i wszechstronność, umożliwiając długotrwałą obserwację procesów metabolicznych u myszy o różnych rozmiarach.

Wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby: wielokrotnego użytku narzędzie drukowane w 3D do mikroskopii śródżyciowej wątroby

Protokół ten oferuje kompleksowy pipeline obrazowania umożliwiający wizualizację i modelowanie morfologii komórek wątrobowych gwiaździstych w nienaruszonej tkance wątroby. Podejście to łączy znakowanie fluorescencyjne fibroblastów z wykorzystaniem genetyki myszy, przygotowanie tkanek in situ oparte na perfuzji wątroby oraz zmodyfikowaną metodę oczyszczania tkanek iDISCO, aby uzyskać optyczną przezroczystość.

Mapowanie morfologii komórek gwiaździstych wątroby wątroby w myszych modelach włóknienia wątroby

Poznaj metodę obrazowania 3D macierzy zewnątrzkomórkowej wątroby w mysim modelu niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby. Technika perfuzji in situ i mikroskopii dwufotonowej umożliwia wizualizację dynamiki ECM.

Obrazowanie 3D macierzy zewnątrzkomórkowej wątroby w mysim modelu niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby

Przeglądaj więcej filmów