Kwantyfikacja potencjalnego wpływu produktów na bazie glifosatu na mikrobiomy
10 stycznia 2022
Produkty na bazie glifosatu (GBP) są najpopularniejszymi herbicydami o szerokim spektrum działania na świecie. W tym artykule przedstawiamy ogólne wytyczne dotyczące ilościowego określania wpływu GBP na mikrobiomy, od eksperymentów terenowych po analizy bioinformatyczne
.W tym miejscu zapewniamy przepływ pracy, który obejmuje najlepszą metodę bioinformatyczną do przeprowadzania eksperymentów w celu oceny wpływu glifosatu na mikrobiomy. Główną zaletą jest to, że zapewnia solidną, testowalną hipotezę dla przyszłych eksperymentów terenowych i laboratoryjnych. Opisana metodologia może być stosowana do różnych systemów, w tym roślin, zwierząt i drobnoustrojów.
Każda część metodologii jest dość prosta. Być może najtrudniejszą częścią jest zintegrowanie multidyscyplinarnego zespołu zdolnego do wykonywania różnych części pracy. Procedurę zademonstruje Suni Matthew, badaczka z mojego laboratorium.
Na początek rozpocznij pierwszy eksperyment od podzielenia pola doświadczalnego na 10 powtórzeń kontroli i traktowania GBP z buforowymi pasami roślinności między powierzchniami. Poletka kontrolne należy potraktować wodą z kranu, a poletka GBP komercyjnym GBP, aby naśladować maksymalną dozwoloną dawkę glifosatu w praktykach rolniczych. Pobranie próbki mikrobioty z roślin doświadczalnych.
Zbierz 10 powtórzeń próbek roślin z pola, natychmiast umieść je na lodzie i przynieś do laboratorium w celu dalszego przetwarzania. W drugim eksperymencie zbierz ściółkę, w tym wióry drzewne, kał i trochę rozlanej paszy z przepiórek karmionych paszami zanieczyszczonymi GBP lub kontrolnymi w 12-miesięcznym eksperymencie wolierowym. Próbki ściółki należy wysłać do akredytowanego laboratorium w celu zmierzenia stężenia glifosatu bezpośrednio po jego rozprowadzeniu.
Posadź wieloletnie trawy i truskawki na każdej działce, aby zbadać ich mikrobiotę korzeni i liści. Zidentyfikuj i usuń drobnoustroje endofityczne, myjąc i sterylizując próbki roślin. Po wysterylizowaniu próbek wyekstrahuj genomowe DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji DNA roślinnego zgodnie z protokołem producenta.
Stosując podejście zagnieżdżone, amplifikuj zmienne regiony od V6 do V8 genu 16S rRNA i wykonaj główną mieszankę PCR dla wymaganej liczby próbek, jak opisano w manuskrypcie tekstowym. W pierwszej rundzie PCR użyj starterów 799 do przodu i 1492 do tyłu. Ustaw profil wzmocnienia w termocyklerze na 35 cykli.
Aby zweryfikować amplifikację, należy przeprowadzić elektroforezę przy użyciu pięciu mikrolitrów amplifikowanego produktu, a następnie rozcieńczyć pozostałe 25 mikrolitrów produktu PCR w autoklawowanej ultraczystej wodzie w stosunku jeden do 10. Używając uniwersalnych starterów 1062 do przodu i 1390 do tyłu, przeprowadź drugą rundę amplifikacji z 25 cyklami. Rozcieńczyć powstałe produkty PCR w autoklawowanej ultraczystej wodzie w równym stosunku.
Przeprowadź trzecią rundę amplifikacji z ośmioma cyklami, aby oznaczyć produkty kodami kreskowymi i sekwencją adaptera P1. Sprawdź stężenie w jakości produktów PCR na bioanalizatorze i zbierz objętości stanowiące 30 nanogramów DNA każdej próbki w probówce o pojemności 1,5 mililitra, aby przygotować bibliotekę równomolową. Wybierz amplikony o wielkości od 350 do 550 par zasad przez frakcjonowanie wielkości za pomocą automatycznego systemu wyboru wielkości DNA na kasecie z żelem agarozowym.
Zebrać elucję zawierającą amplikony o określonej wielkości do fiolki w kasecie, w wyniku czego otrzymamy oczyszczoną bibliotekę genów 16S rRNA. Przenieś pobrany eluent do probówki o pojemności 1,5 mililitra i sprawdź czystość i stężenie na bioanalizatorze. Rozcieńczyć bibliotekę DNA za pomocą autoklalawowanej ultraczystej wody do końcowego stężenia 26 pikomolarów.
Aby wzmocnić obszar ITS, po ustawieniu reakcji za pomocą starterów ITS, ustaw profil amplifikacji na termocyklerze. Następnie przeanalizuj pięć mikrolitrów amplifikowanego produktu na 1,5% żelu agarozowym i rozcieńcz pozostałe 25 mikrolitrów produktu w stosunku od 1 do 10 za pomocą autoklawowanej ultraczystej wody. Przygotować wzorcową mieszankę PCR dla wymaganej liczby próbek z oznaczonymi kodami kreskowymi starterami do przodu i starterami odwrotnymi oznaczonymi adapterem P1.
Używając rozcieńczonego produktu PCR jako matrycy, przeprowadzić drugą rundę amplifikacji. Podobnie jak w przypadku przygotowania biblioteki dla genu 16S rRNA, przygotuj bibliotekę dla oczyszczonego regionu ITS. Rozpoczęcie analiz bioinformatycznych sekwencji białka EPSPS.
Oceń potencjalną wrażliwość sekwencji zapytania na glifosat na podstawie danych wyjściowych dostarczonych przez serwer, gdzie dane wyjściowe pokazują frakcję markerów aminokwasowych obecnych w sekwencjach zapytań i liczbę motywów. Dane wyjściowe dwa pokazują wyrównania sekwencji zapytania i odwołań na podstawie pozostałości znaczników. Dane wyjściowe trzy pokazują pełne wyrównania parami sekwencji zapytania i odwołań.
Wynik czwarty przedstawia sekwencje referencyjne EPSPS Vibrio cholerae, Coxiella burnetii, Brevundimonas vesicularis i Streptomyces davawensis. Na końcu strony danych wyjściowych znajdują się łącza do narzędzi zewnętrznych, takich jak BLASTp i domeny zachowane, aby dokładniej przeanalizować sekwencję zapytania EPSPS. Po zidentyfikowaniu sekwencji EPSPS z repozytoriów publicznych uzyskaj dostęp do tych zestawów danych ze strony głównej serwera klas EPSPS zawierającej informacje taksonomiczne i klasę EPSPS zawierającą ponad 50 000 sekwencji.
Zważyć nadziemną biomasę roślin pod koniec sezonu polowego, aby porównać wzrost roślin na GBP i na poletkach kontrolnych. W arkuszu kalkulacyjnym zmapuj bakteryjne OTU do eksperymentów mikrobiomu we wstępnie obliczonych zestawach danych. Na podstawie wyniku probabilistycznego oblicz wewnętrzną wrażliwość na glifosat.
Metodę tę wykorzystano do ilościowego określenia zmian wrażliwości białka EPSPS na poziomie mikroewolucyjnym. Zidentyfikowaliśmy zmiany w stanie wrażliwości w 12 z 32 ściśle spokrewnionych analizowanych grup prokariontów. W związku z tym ciągłe stosowanie produktów na bazie glifosatu może powodować dysbiozę mikrobiologiczną w mikrobiomie roślinnym, zwierzęcym i glebowym.
Zapewnienie jakości procedur przed i po PCR w celu uzyskania optymalnych bibliotek amplikonów. Upewnij się również, że sekwencja białka EPSPS nie jest częściowa przed użyciem oprogramowania. Podczas eksperymentów terenowych należy upewnić się, że nie dopuścić do zanieczyszczenia kontroli glifosatem.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia kompleksową metodologię oceny wpływu produktów na bazie glifosatu na mikrobiomy. Opisano w nim plany doświadczalne oraz podejścia bioinformatyczne służące do ilościowego określenia zmian w społecznościach drobnoustrojów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Nauki o środowisku
- Praktyki rolnicze
Wstęp
- Glifosat jest powszechnie stosowanym herbicydem, który może oddziaływać na mikrobiomy.
- Zrozumienie jego wpływu jest kluczowe dla zdrowia ekologicznego i rolniczego.
- Badanie integruje eksperymenty polowe z analizami bioinformatycznymi.
- Wielodyscyplinarna współpraca jest niezbędna dla skutecznego prowadzenia badań.
Cel badania
- Ilościowe określenie wpływu glifosatu na mikrobiomy roślin, zwierząt i gleby.
- Zapewnienie solidnych ram dla przyszłych badań w tym obszarze.
- Zidentyfikowanie potencjalnej dysbiozy mikrobiologicznej wywołanej przez glifosat.
Zastosowane metody
- Doświadczenia polowe z działkami kontrolnymi i traktowanymi glifosatem.
- Pobieranie próbek mikrobioty z roślin i materiałów ściółkowych.
- Ekstrakcja genomowego DNA i amplifikacja PCR genów mikrobiologicznych.
- Analizy bioinformatyczne sekwencji białka EPSPS.
Główne wyniki
- Zidentyfikowano zmiany w wrażliwości drobnoustrojów na glifosat.
- Wykazano potencjał do wystąpienia dysbiozy mikrobiologicznej w środowiskach poddanych działaniu preparatu.
- Przedstawiono szczegółowy schemat oceny wpływu glifosatu.
- Podkreślono znaczenie kontroli jakości w procedurach doświadczalnych.
Wnioski
- Ciągłe stosowanie glifosatu może zaburzać społeczności drobnoustrojów.
- Metodykę można dostosować do różnych badań ekologicznych.
- Przyszłe badania powinny skoncentrować się na długoterminowych skutkach ekologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe określenie wpływu produktów na bazie glifosatu na mikrobiomy pozwala rozwiązać kluczowy problem w biotechnologii rolniczej i środowiskowej, gdzie niezamierzone skutki oddziaływania na nietarczowe społeczności drobnoustrojów mogą wpływać na zdrowie roślin i stabilność ekosystemu. Przedstawiony schemat postępowania umożliwia rzetelne testowanie hipotez oraz predykcyjną ocenę wrażliwości drobnoustrojów, co wspiera podejmowanie decyzji opartych na analizie ryzyka w portfelach badawczo-rozwojowych agrochemikaliów. Integracja bioinformatyki z danymi terenowymi zwiększa ciągłość translacyjną od etapu odkryć po ocenę ryzyka środowiskowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie podatności szlaków mikrobiologicznych na glifosat poprzez analizę sekwencji EPSPS.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez identyfikację organizmów nietarczowych, które mogą zostać dotknięte ekspozycją na herbicyd.
- Ułatwia uzyskanie wiarygodnych przewidywań w ramach ocen bezpieczeństwa środowiskowego dla nowych kandydatów na środki agrochemiczne.
Przesiew i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane próbki mikrobiomu do dalszego sekwencjonowania i analiz bioinformatycznych.
- Standaryzuje amplifikację metodą PCR oraz przygotowanie bibliotek w celu uzyskania powtarzalnych profili mikrobiologicznych.
- Generuje ilościowe dane dotyczące składu społeczności drobnoustrojów i wrażliwości na glifosat.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgadza dane terenowe i laboratoryjne w celu oceny znaczenia translacyjnego zmian mikrobiomu w warunkach rzeczywistych.
- Zapewnia ciągłość od analizy celów molekularnych do badań wpływu na poziomie ekosystemu.
- Służy jako podstawa do rozwoju produktów agrochemicznych z uwzględnieniem analizy ryzyka oraz zasad odpowiedzialnego zarządzania środowiskiem.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Niniejsza metodologia łączy wczesne etapy odkryć, screening oraz badania translacyjne poprzez integrację pobierania próbek terenowych, profilowania molekularnego oraz analizy bioinformatycznej wrażliwości EPSPS.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia ramy do testowania hipotez dotyczących wpływu glifosatu na szlaki mikrobiologiczne.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe dane o mikrobiomie do analizy porównawczej pomiędzy różnymi wariantami traktowania.
- Analityka: Generuje probabilistyczne wyniki wrażliwości oraz dopasowania sekwencji w celu wsparcia oceny ryzyka.
- Badania translacyjne: Łączą odkrycia molekularne z efektami ekologicznymi w terenie na potrzeby decyzji regulacyjnych i zarządzania środowiskiem.
- Zastosowania przemysłowe: Oferuje skalowalny schemat postępowania, który można dostosować do różnorodnych systemów roślinnych, zwierzęcych i środowiskowych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w ocenach wpływu na organizmy nietarczowe oraz w walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje multidyscyplinarne przepływy pracy w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zmniejsza ryzyko ekologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów na środki agrochemiczne z uwzględnieniem ryzyka i czynników środowiskowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu biologii molekularnej, bioinformatyki oraz ekologii terenowej.
- Wymaga dostępu do platform sekwencjonowania, aparatury PCR oraz zasobów obliczeniowych.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji międzyzespołowej w zakresie obsługi próbek i analizy danych.
- Konieczne jest dostosowanie protokołów do różnych źródeł mikrobiomu i macierzy środowiskowych.
- Opiera się na wysokiej jakości danych sekwencyjnych i kontroli zanieczyszczeń w celu uzyskania wiarygodnych wyników.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:52
Two Field Experiments to Test the Effect of Glyphosate Based Products (GBPs)
1:58
Microbiome Analyses: 16S rRNA and ITS Gene Amplification, and Library Preparation
4:59
Algorithm to Determine the Potential Sensitivity of Organisms to Glyphosate
5:56
Assessing the EPSPS Class from Universal Microbial Markers
6:40
Results: Quantification of Microbial Species Sensitivity after GBPs Usage
7:10
Conclusion
