Name: Kwantyfikacja potencjalnego wpływu produktów na bazie glifosatu na mikrobiomy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Dowiedz się metodologii bioinformatycznej do oceny wpływu glifosatu na mikrobiomy roślin, zwierząt i gleby. Przedstawiono protokoły ekstrakcji DNA, PCR i analizy sekwencji białka EPSPS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Akademię Fińską (grant nr 311077 dla Marjo Helander).

Konflikt interesów: brak.

Protokół ten zawiera ogólne wytyczne dotyczące ilościowego określania wpływu GBP na mikrobiomy w oparciu o analizę białka EPSPS. Protokół składa się z trzech głównych kluczowych etapów: (i) Kwantyfikacja białka EPSPS na podstawie danych mikrobiomu. Ten krok ma kluczowe znaczenie, ponieważ EPSPS jest bezpośrednim enzymem docelowym herbicydu. W związku z tym stosowanie GBP może mieć wpływ na gatunki, które mają kopię genu EPSPS. Niemniej jednak, nawet gatunki, które nie mają kopii genu EPSPS, mogą być dotknięte przez herbicyd poprzez alternatywne mechanizmy niebędące celem43,44. (ii) Jeśli analiza genu EPSPS nie jest uwzględniona w projekcie badania, możliwe jest uzyskanie dobrego oszacowania poprzez analizę 16S rRNA (bakterie) lub ITS (grzyby). W takim przypadku konieczne jest oparcie się na wyczerpującej tabeli referencyjnej (np. baza danych ATGC zawiera sekwencje białka EPSPS z kilku blisko spokrewnionych gatunków). (iii) Białko EPSPS dzieli się na potencjalnie wrażliwe lub odporne na glifosat, w zależności od pewnych reszt aminokwasowych w miejscu aktywnym EPSPS. Jednak mutacje wpływające na pojedynczy aminokwas mogą zmienić tę klasyfikację45, a przejścia między klasami mogą wystąpić w stosunkowo krótkim czasie14.
Potencjalną wrażliwość organizmów na glifosat można określić na podstawie genomów referencyjnych, markerów aminokwasowych i dopasowań sekwencji. (i) Genomy referencyjne: Enzym EPSPS można sklasyfikować jako potencjalnie wrażliwy (klasa I [alfa lub beta]46,47) lub oporny (klasy II48,49, III50 i IV51) na glifosat ze względu na obecność markerów i motywów aminokwasowych (w przypadku klasy III). Te markery i motywy aminokwasowe opierają się na lokalizacji reszt aminokwasowych w białku EPSPS Vibrio cholerae (vcEPSPS, klasa I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, klasa II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, klasa III) i Streptomyces davawensis (sdEPSPS, klasa IV). (ii) Markery aminokwasowe: Glifosat oddziałuje z enzymem EPSPS i konkuruje z fosfoenolopirogronianem (PEP, drugi substrat enzymu EPSPS)52,53. U niektórych gatunków niewielkie zmiany aminokwasów w sekwencji EPSPS zapewniają większe powinowactwo do PEP i odporność na glifosat12, 14, 52, 54, 55. W innych sekwencjach glifosat wiąże sekwencję EPSPS w konformacji niehamującej 45. Chociaż opisano wiele opornych na glifosat sekwencji 12,14,48,49,52,52,54,55 i tolerancyjnych 56,57 EPSP, obecny system klasyfikacji EPSPS jest podzielony na cztery główne klasy (I-IV)12 (Tabela 5). (iii) Dopasowania sekwencji: Aby sklasyfikować enzym EPSPS, przeprowadziliśmy dopasowania parami, z programem do dopasowywania wielu sekwencji - domyślne parametry35-, sekwencji zapytania względem każdej z sekwencji referencyjnych (vcEPSPS, cbEPSPS, bvEPSPS i sdEPSPS). Te wyrównania są niezbędne do zidentyfikowania pozycji markerów aminokwasów w sekwencji zapytania. W rezultacie enzym jest klasyfikowany jakoopisany 12-klasowy I, II i/lub IV na podstawie obecności markerów aminokwasowych i markerów motywów opartych na klasie III.
Protokół opiera się na czterech znanych typach EPSPS: jeden typ jest wrażliwy, pozostałe trzy są odporne). Jednak około 10% sekwencji EPSPS u prokariontów nie jest jeszcze sklasyfikowanych (16% u archeonów i 8% u bakterii)12. W związku z tym dalsze badania powinny przeanalizować te sekwencje w celu określenia wrażliwości na glifosat. Serwer EPSPSClass umożliwia testowanie nowych markerów genetycznych. Identyfikacja znanych klas EPSPS jest prosta, jak pokazano w sekcji 4.4. i rysunek 5. Ponadto w przypadkach, gdy użytkownicy chcą porównać własne białka zapytania i białka referencyjne, serwer zapewnia opcję ręcznego dołączenia sekwencji referencyjnej i zestawu markerów aminokwasowych (Figura 11). Opcja ta może być wykorzystana do identyfikacji nowych klas EPSPS, a także do testowania innych herbicydów i sekwencji docelowych.
Analizę klasy EPSPS określa się na podstawie analizy sekwencji i obecności/braku markerów aminokwasowych. Jest to wstępne oszacowanie, które można wykorzystać do testowania hipotez w terenie. Markery aminokwasowe zostały określone w literaturze na podstawie badań empirycznych i obserwacyjnych 46,47,48,49,50,51. Jednak referencyjne sekwencje białek w celu określenia klasy EPSPS zostały przetestowane tylko na ograniczonej liczbie gatunków i czasami mogą nie wyjaśniać oporności na glifosat. Wpływ mutacji kompensacyjnych i domen związanych z EPSPS (głównie u grzybów) może również wpływać na wrażliwość na glifosat58. Analiza w niniejszym artykule opiera się na czterech klasach EPSPS. Badanie bakterii w ludzkim mikrobiomie jelitowym wykazało, że około 30% z nich było niesklasyfikowanych (tj. białka EPSPS z tych gatunków nie należą do żadnej ze znanych klas) i potrzebne są dodatkowe badania w celu zidentyfikowania innych klas EPSPS. Należy również zauważyć, że sekwencja białka EPSPS u bakterii i roślin jest jednodomenowa, podczas gdy białka EPSPS grzybów zawierają kilka domen59. Tak więc fałdowanie białek u grzybów może prowadzić do innej odpowiedzi enzymu EPSPS na glifosat. Ponadto nie uwzględnia się dodatkowych mechanizmów oporności niezwiązanych z celem (np. pompy wypływowe i nadekspresja genu EPSPS 13) lub wrażliwości na glifosat (np. wpływ glifosatu na mitochondrialny łańcuch transportowy12).
Chociaż GBP istnieją jako herbicydy od 1974 roku i są szeroko stosowane od 1991 roku, jest to pierwsza metoda bioinformatyczna do określania potencjalnej wrażliwości organizmów na glifosat. Metoda opiera się na identyfikacji znanych reszt aminokwasowych w sekwencji docelowej. W związku z tym nasza metoda zapewnia podstawowe oszacowanie potencjalnego wpływu glifosatu na gatunek. W niedalekiej przyszłości nowatorskie metody bioinformatyczne powinny obejmować dodatkowe klasy białka EPSPS w celu określenia potencjalnej wrażliwości na glifosat niesklasyfikowanych sekwencji 12,54,55. Ponadto, biorąc pod uwagę, że dokładne zachowanie enzymu EPSPS może różnić się w zależności od zmian pojedynczych aminokwasów 12,14,52,54,55, dalsze eksperymenty in silico powinny uwzględniać niewielkie różnice w fałdowaniu białka EPSPS, a także wpływ domen związanych z EPSPS na strukturę białka u grzybów 58. Ponadto wykazano, że tolerancja na glifosat może być spowodowana nadekspresją białka EPSPS56,57; w związku z tym analizy bioinformatyczne oparte na poprawie użycia kodonów60 mogą być wykorzystane do identyfikacji nowych sekwencji EPSPS, które maksymalizują lub minimalizują ekspresję genów.
Rolnicy, politycy i decydenci pilnie potrzebują dogłębnego zrozumienia zagrożeń związanych z intensywnym stosowaniem pestycydów. W związku z tym niezbędne są zarówno narzędzia bioinformatyczne ujawniające potencjalną wrażliwość organizmów na pestycydy, jak i dobrze odtworzone, randomizowane i realistyczne w terenie badania eksperymentalne prowadzone w różnych środowiskach. Przedstawiona metoda bioinformatyczna przeznaczona do badania wrażliwości organizmów na glifosat może być modulowana dla innych pestycydów. Podobnie, metody ekologii eksperymentalnej mogą być stosowane do badania wszelkich powiązanych zagadnień ekologicznych. Razem metody te mogą być wykorzystane do wykazania liczby ofiar między obserwacjami terenowymi, danymi genomicznymi i stosowaniem pestycydów. Wszystkie przedstawione metody są nieocenione w ocenie ryzyka. Metody bioinformatyczne mogą być wykorzystywane na przykład do monitorowania adaptacji mikroorganizmów do agrochemikaliów oraz do zapewnienia ilościowej metody badania potencjalnych innych powiązanych zagrożeń, takich jak wzrost odporności patogenów na agrochemikalia, negatywny wpływ na drobnoustroje stosowane jako środki kontroli biologicznej w integrowanej ochronie roślin (IPM) oraz oporność bakterii na antybiotyki.

Intensywne stosowanie pestycydów w nowoczesnym rolnictwie jest niewątpliwie głównym czynnikiem przyczyniającym się do spadku różnorodności biologicznej1. Niniejszy artykuł koncentruje się na glifosacie, ponieważ produkty na bazie glifosatu (GBP) stały się najczęściej stosowanymi pestycydami na świecie ze względu na ich skuteczność i przystępną cenę2,3. Oprócz zabijania chwastów na polach uprawnych, GBP są powszechnie stosowane w gospodarce leśnej, środowiskach miejskich i ogrodach przydomowych; Ponadto zostały uznane za nietoksyczne dla organizmów niebędących przedmiotem zwalczania, jeśli są stosowane zgodnie z instrukcjami producenta. Jednak coraz więcej ostatnich badań wykazało, że pozostałości glifosatu i produktów jego degradacji mogą być zatrzymywane i transportowane w glebie, wywołując w ten sposób efekt kaskadowy na organizmy niebędące przedmiotem zwalczania4,5,6,7,8 . Działanie glifosatu nie ogranicza się tylko do roślin - szlak szikimowy jest również obecny u wielu grzybów i prokariontów. Glifosat jest ukierunkowany na enzym syntazę 5-enolopiruzyloszikimo-3-fosforanu (EPSPS) w szlaku szikimowym, znanym również jako aroA9. Enzym ten znajduje się w centrum szlaku szikimowego w syntezie trzech niezbędnych aminokwasów aromatycznych (fenyloalaniny, tyrozyny i tryptofanu) i jest obecny w większości prokariontów, roślin i grzybów10,11. Niektóre gatunki drobnoustrojów rozwinęły częściową lub całkowitą oporność na glifosat za pomocą kilku mechanizmów, w tym mutacji w sekwencjach EPSPS. W związku z tym zasugerowano, że stosowanie GBP może mieć bezpośredni wpływ na mikrobiomy roślinne i zwierzęce, w tym na mikrobiom jelitowy człowieka12,13,14. Niemniej jednak stosowanie GBP może mieć niekorzystny wpływ na praktycznie każdą funkcję i usługę ekosystemu opartą na mikroorganizmach i procesach wspomaganych przez drobnoustroje. Wynikające z tego zagrożenia mogą dotyczyć biochemicznych procesów glebowych, biologii zapylania oraz dobrostanu zwierząt i ludzi. Wymaga to bardziej wszechstronnego zrozumienia, w jaki sposób glifosat wpływa na szlaki szikimowe oraz metod oceny wrażliwości drobnoustrojów na glifosat.
W tym protokole prezentujemy proces testowania wpływu glifosatu i GBP na mikrobiom, od eksperymentów terenowych po analizy bioinformatyczne. Szczegółowo opisujemy niedawno opublikowaną metodę bioinformatyczną, która może być wykorzystana do określenia potencjalnej wrażliwości organizmów na glifosat12. Zgodnie z wiedzą naukowców jest to pierwsze i jak dotąd jedyne narzędzie bioinformatyczne do oceny wewnętrznej wrażliwości enzymu EPSPS na aktywny składnik GBP. Ta metoda bioinformatyczna opiera się na wykrywaniu znanych markerów aminokwasowych w docelowym enzymie glifosatu (EPSPS)12. Rurociąg jest podzielony na pięć głównych faz roboczych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1): 1) krótkie wprowadzenie do dwóch eksperymentów terenowych w celu przetestowania wpływu GBPs, 2) krótkie podsumowanie analiz mikrobiomu (16S rRNA, ITS i gen EPSPS), 3) zbieranie sekwencji EPSPS z repozytoriów publicznych, 4) określanie potencjalnej wrażliwości organizmów na glifosat oraz 5) ocena klasy EPSPS na podstawie uniwersalnych markerów mikrobiologicznych (16S rRNA i ITS).

<table><tbody><tr><td>2100 Bioanalizator</td><td>Agilent</td><td>G2939B</td><td>Do sprawdzania stężenia i jakości produktów PCR</td></tr><tr><td>Mieszanka dNTP (10 mM każdy)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0192</td><td>Do reakcji PCR</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Zestaw polimerazy DNA Promega</td><td></td><td>M7848</td><td>Bufor PCR i polimeraza DNA do amplifikacji PCR</td></tr><tr><td>Invisorb Spin Plant Mini Kit</td><td>INVITEK Molecular</td><td>1037100300</td><td>Ekstrakcja genomowego DNA z tkanek roślinnych</td></tr><tr><td>Ion Chip Minifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4479672</td><td>Do celowanego sekwencjonowania mikrobiologicznych produktów PCR</td></tr><tr><td>Ion PGM System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4462921</td><td>Do celowanego sekwencjonowania mikrobiologicznych produktów PCR</td></tr><tr><td>Ion PGM Torrent Server</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4483643</td><td>Do ukierunkowanego sekwencjonowania mikrobiologicznych produktów PCR</td></tr><tr><td>Pippinprep</td><td>SageScience</td><td>PIP0001</td><td>Do frakcjonowania wielkości amplikonów PCR</td></tr><tr><td>Zbiornik ciśnieniowy</td><td>Berthoud</td><td>102140</td><td>Do rozpylania produktów na bazie glifosatu w terenie</td></tr><tr><td>Podkłady</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Wykonane na zamówienie</td><td>Do amplifikacji PCR</td></tr><tr><td>Glebogryzarka rotacyjna</td><td>Grillo</td><td>984511</td><td>Do uprawy gleby na poletkach doświadczalnych</td></tr><tr><td>S1000 ThermalCycler</td><td>BIO-RAD</td><td>1852196</td><td>Do amplifikacji PCR</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja potencjalnego wpływu produktów na bazie glifosatu na mikrobiomy

Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes

Produkty na bazie glifosatu (GBP) są najpopularniejszymi herbicydami o szerokim spektrum działania na świecie. Celem glifosatu jest enzym syntaza 5-enolopiruzyloszikimo-3-fosforanu (EPSPS) w szlaku szikimowym, który jest praktycznie uniwersalny u roślin. Hamowanie enzymu zatrzymuje produkcję trzech niezbędnych aminokwasów: fenyloalaniny, tyrozyny i tryptofanu. EPSPS jest również obecny w grzybach i prokariotach, takich jak archeony i bakterie; w związku z tym stosowanie GBP może mieć wpływ na skład mikrobiomu gleb, roślin, roślinożerców i konsumentów wtórnych. Niniejszy artykuł ma na celu przedstawienie ogólnych wytycznych do oceny wpływu GBP na mikrobiomy od eksperymentów terenowych po analizy bioinformatyczne oraz przedstawienie kilku możliwych do przetestowania hipotez. Przedstawiono dwa doświadczenia terenowe w celu przetestowania GBP na organizmach niebędących przedmiotem zwalczania. W pierwszej kolejności pobiera się i analizuje próbki drobnoustrojów związanych z roślinami z 10 powtórzonych powierzchni kontrolnych i traktowanych przez GBP symulujących uprawę bezorkową. W drugim doświadczeniu uzyskano próbki z poletek doświadczalnych nawożonych obornikiem drobiowym zawierającym pozostałości glifosatu lub nieprzetworzonym obornikiem kontrolnym. Analiza bioinformatyczna sekwencji białek EPSPS jest wykorzystywana do określenia potencjalnej wrażliwości drobnoustrojów na glifosat. Pierwszym krokiem w oszacowaniu wpływu GBP na mikrobiomy jest określenie ich potencjalnej wrażliwości na enzym docelowy (EPSPS). Sekwencje mikrobiologiczne można uzyskać albo z publicznych repozytoriów, albo za pomocą amplifikacji PCR. Jednak w większości badań terenowych skład mikrobiomu został określony na podstawie uniwersalnych markerów DNA, takich jak 16S rRNA i wewnętrzny transkrybowany dystans (ITS). W takich przypadkach wrażliwość na glifosat można oszacować jedynie poprzez probabilistyczną analizę sekwencji EPSPS z wykorzystaniem blisko spokrewnionych gatunków. Kwantyfikacja potencjalnej wrażliwości organizmów na glifosat, w oparciu o enzym EPSPS, stanowi solidne podejście do dalszych eksperymentów mających na celu zbadanie mechanizmów oporności na glifosat.

Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie ogólnego schematu postępowania, od eksperymentów terenowych po analizy bioinformatyczne, który pozwala na określenie potencjalnej wrażliwości organizmów na herbicyd glifosat. W Eksperymentcie 2 średnie stężenie glifosatu w paszy dla przepiórek wynosiło 164 mg/kg, a średnie stężenie glifosatu w próbkach wydzielin (połączone próbki moczu i kału) wynosiło 199 mg/kg. Podściółki zebrane od przepiórek karmionych paszą zanieczyszczoną GBP zawierały średnio 158 mg/kg glifosatu, natomiast w podściółkach kontrolnych stężenie to wynosiło 0,17 mg/kg (Tabela 3). W eksperymentach terenowych gatunki roślin różnie reagowały na pozostałości glifosatu w glebach (sekcja 1). Biomasa owsa i rzepaki brukiewnego była większa w glebach kontrolnych w porównaniu do gleb traktowanych GBP. Jednakże boby i ziemniaki zdawały się odnieść korzyść z traktowania GBP pod koniec sezonu wegetacyjnego15. Glifosat w oborniku drobiowym ograniczył wzrost roślin trawy (Festuca pratensis) oraz truskawki (Fragaria x vescana) (sekcja 1). Analizy mikrobiomu z eksperymentów terenowych nie zostały jeszcze w pełni opracowane i nie są tutaj przedstawione (sekcja 2). Wyniki tego protokołu, interpretowane bezpośrednio (jak pokazano w sekcjach 3 i 4) lub pośrednio (sekcja 5), pozwalają określić proporcję organizmów potencjalnie wrażliwych i opornych na glifosat w zbiorze danych (Rysunek 9). Zastosowanie tej metody przetestowano na zbiorze sekwencji białka EPSPS z gatunków mikroorganizmów tworzących rdzeń ludzkiego mikrobiomu jelitowego, pozyskanych z publicznych repozytoriów12. W badaniu 890 szczepów z 101 najliczniejszych gatunków bakterii przeanalizowano metodą EPSPSClass w celu określenia proporcji bakterii wrażliwych i opornych. Wyniki wykazały, że 54% gatunków w rdzeniu ludzkiego mikrobiomu jelitowego jest potencjalnie wrażliwych na glifosat12. Tendencja ta jest obserwowana również w większości świata prokariontów; dodatkowo u eukariontów (głównie roślin i grzybów) proporcja gatunków potencjalnie wrażliwych jest jeszcze wyższa12. Ponadto wykorzystaliśmy tę metodę do określenia zmian wrażliwości białka EPSPS na poziomie mikroewolucyjnym (Rysunek 10)14. Zidentyfikowano zmiany statusu wrażliwości w 12 z 32 analizowanych, blisko spokrewnionych grup prokariontów (Tabela 4)14. Zatem ciągłe stosowanie GBP może prowadzić do dysbiozy mikrobiologicznej (tj. zaburzenia równowagi między wrażliwymi a opornymi gatunkami bakterii) w mikrobiomach roślin, zwierząt i gleby. Ponadto postawiono hipotezę, że wzrost liczby bakterii opornych na glifosat może sprzyjać powstawaniu mikrobiomów wielolekoopornych14,41,42. W związku z tym protokół ten rzuca światło na interpretację wszystkich tych scenariuszy, ponieważ metoda klasyfikacji EPSPS dostarcza bezpośredniego szacunku wrodzonej wrażliwości mikrobiomów na glifosat. Ponieważ wrodzona wrażliwość białka EPSPS na glifosat jest konserwatywna filogenetycznie14, możliwe jest ekstrapolowanie wyników z istniejących zbiorów danych na nieznane mikrobiomy (Rysunek 8).
<img alt="Schemat wrażliwości na narażenie na glifosat; eksperymenty polowe, przepływ danych EPSPS, analiza wrażliwości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ogólny schemat postępowania Jest to ogólny schemat analizy wrażliwości na GBP, obejmujący etapy od eksperymentów polowych po analizy bioinformatyczne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat planu płodozmianu, obejmujący kontrolę (C1-C10) i GBP (G1-G10), z rzepą, owsem, bobem i ziemniakiem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Eksperyment polowy 1 w celu zbadania wpływu pozostałości GBP na mikroby związane z roślinami uprawnymi. Pole doświadczalne składa się z naprzemiennych 10 działek kontrolnych i 10 działek traktowanych GBP (23 m x 1,5 m) z pasami buforowymi o szerokości 1,5 m pomiędzy działkami. Od 2014 roku, dwa razy w roku, działki GBP były traktowane komercyjnym preparatem GBP (stężenie glifosatu 450 g L-1, dawka aplikacyjna 6,4 L ha-1 w 5 L wody kranowej na działkę), a działki kontrolne taką samą ilością wody kranowej bez glifosatu. Preparaty aplikowano za pomocą ręcznego opryskiwacza ciśnieniowego z plastikową osłoną na końcówce dyszy, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się GBP poza działki traktowane. Po dwutygodniowym okresie bezpieczeństwa po aplikacji GBP w działkach wysiano owies (Avena sativa), bób (Vicia faba) i rzepę (Brassica rapa subsp. oleifera), a także posadzono ziemniaki (Solanum tuberosum). Próbki mikrobioty z badanych roślin uprawnych, z liści i korzeni, pobierano kilkakrotnie od rozpoczęcia eksperymentu w 2014 roku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat eksperymentu w wolierze: wpływ obornika z przepiórników na poletki roślinne; pobieranie próbek danych do analizy mikrobioty." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3Doświadczenie polowe 2 miało na celu zbadanie wpływu pozostałości GBP w nawozie z obornika na dwie uprawy wieloletnie oraz powiązaną z nimi mikrobiotę. Podłoża zebrane z 12-miesięcznego eksperymentu w wolierze z przepiórkami japońskimi karmionymi paszą kontrolną lub zanieczyszczoną GBP zostały wykorzystane jako nawóz organiczny w doświadczeniu polowym. Pole doświadczalne składało się z 18 działek kontrolnych i 18 działek GBP (1 m x 1 m), rozmieszczonych w układzie szachownicy 6 x 6. Podłoża rozprowadzano na polu doświadczalnym dwukrotnie, w sierpniu 2018 roku i maju 2019 roku (25 l / działkę). Działki kontrolne nawożono podłożami zebranymi od przepiórek karmionych paszą kontrolną, a działki GBP podłożami od przepiórek karmionych paszą zanieczyszczoną GBP. Pozostałości glifosatu w podłożach kontrolnych wynosiły 0,17 mg/kg glifosatu, natomiast w podłożach GBP ilość ta wynosiła 158 mg/kg glifosatu. Dwie linie z endofitami (E+) oraz dwie linie pozbawione endofitów (E-) Festuca pratensis, oraz dwa Fragaria x vescana posadzono na każdą pole và w wrześniu 2018 roku, w przybliżeniu miesiąc po wysianiu pierwszych grządek. Pomiary kondycji i przystosowania roślin, a także pobieranie próbek mikrobioty związanej z korzeniami i liśćmi, przeprowadzono podczas dwóch kolejnych sezonów wegetacyjnych (2019 &amp; 2020). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu PCR dla sekwencjonowania genów; primery na drobnoustrojach; tworzenie biblioteki sekwencjonowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Analiza taksonów mikrobiologicznych z wykorzystaniem genu 16S rRNA/regionu ITS oraz wrażliwość mikrobiomów na glifosat z wykorzystaniem genu EPSPS. (A) Analiza sekwencji 16S rRNA lub ITS w celu identyfikacji taksonów mikrobiologicznych. (B) Analiza sekwencji EPSPS w celu określenia wrażliwości drobnoustrojów na glifosat (GS – wrażliwe na glifosat / GR – oporne na glifosat) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig04large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat dopasowania sekwencji DNA przedstawiający klasy EPSPS oraz procenty markerów tożsamości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Algorytm identyfikacji klasy sekwencji białek EPSPS. Danem wejściowym jest sekwencja białka EPSPS w formacie FASTA. Algorytm przeprowadza porównania z znanymi markerami aminokwasowymi w referencyjnych sekwencjach białkowych, które określają potencjalną wrażliwość na glifosat. Algorytm został zaimplementowany na ogólnodostępnym serwerze WWW EPSPSClass29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Konfiguracja analizy sekwencji syntazy EPSP, wprowadzanie sekwencji, wyniki dopasowania, wykres tożsamości klas, analiza BLAST." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Podstawowe dane wejściowe i wyjściowe serwera internetowego EPSPSClass. (A) Dane wejściowe: sekwencja białka EPSPS w formacie FASTA. (B) Wynik 1 – tożsamość: frakcja markerów aminokwasowych obecnych w sekwencjach zapytania (Klasy I-IV) i motywach (Klasa III). (C) Wynik 2 – tożsamość: dopasowania sekwencji zapytania i referencyjnych. (D) Wynik 3 – dopasowania parowe sekwencji zapytania i referencyjnych. (E) Referencyjne sekwencje EPSPS: Vibrio cholerae (vcEPSPS, klasa I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, klasa II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, klasa III), Streptomyces davawensis (sdEPSPS, klasa IV). (F) Linki do przeprowadzenia dodatkowych wyszukiwań blastp oraz identyfikacji domen konserwatywnych <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig06large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Klasyfikacja syntazy EPSPS, schemat; prekomputowane zestawy danych, dane taksonomiczne, przewidywanie gatunków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Dostęp do prekomputowanych zestawów danych sekwencji EPSPS. Postępuj zgodnie ze wskazówkami na rysunku, aby uzyskać dostęp do prekomputowanego zestawu danych sekwencji EPSPS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig07large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres projektu mikrobiomu przedstawiający klasyfikację wrażliwości mikrobiologicznej; zestawy danych; od S. aureus do S. islandicus." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Przykład szacowania potencjalnej wrażliwości w projektach mikrobiomu bez sekwencji EPSPS. Przykład wykorzystuje wartości z bazy danych Alignable Tight Genomic Clusters30, która zawiera sekwencje gatunków prokariontów. Hipotetyczne gatunki z projektu mikrobiomu to Staphylococcus aureus, Corynebacterium diphtheriae, Campylobacter jejuni, Chlamydia psittaci oraz Sulfolobus islandicus. Wynik wrażliwości na glifosat oblicza się jako Liczba_Sekwencji_Wrażliwych/Całkowita_Liczba_Sekwencji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig08large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Reakcja mikrobiomu na glifosat; Wrażliwe, oporne, niezaklasyfikowane; Diagram, progresja czasowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig09.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9: Schemat interpretacji wyników z niniejszego protokołu oraz hipotetyczne scenariusze ewolucyjne. (A) W mikrobiomie proporcja bakterii potencjalnie wrażliwych (na zielono) i opornych (na czerwono) wynosi około 50:50. Czarne kropki oznaczają gatunki drobnoustrojów niezaklasyfikowane; zatem ich wrażliwość na glifosat jest nieznana. W niektórych mikrobiomach proporcja bakterii wrażliwych jest nieco wyższa, jak w przypadku mikrobiomu jelitowego człowieka12. (B) Z biegiem czasu stosowanie glifosatu może prowadzić do dysbiozy mikrobiomu (tj. zachwiania proporcji bakterii wrażliwych i opornych), co prowadzi do różnych hipotetycznych scenariuszy. (C) Hipotetyczny przypadek 1 (brak selekcji): Stosowanie glifosatu nie wpływa na mikrobiom; zatem proporcja bakterii wrażliwych i opornych pozostaje stała. (D) Hipotetyczny przypadek 2: Stosowanie glifosatu eliminuje z populacji bakterie wrażliwe na glifosat. Przypuszczamy, że ten scenariusz może być zależny od dawki. (E) Hipotetyczny przypadek 3: Presja selekcyjna wynikająca ze stosowania glifosatu nasila mutacje w genie EPSPS, które zmieniają status wrażliwości bakterii. W konsekwencji cała populacja drobnoustrojów staje się oporna na glifosat. Co więcej, w tym scenariuszu może nastąpić wzrost liczby bakterii wielolekoopornych. (F) Hipotetyczny przypadek 4: Stosowanie glifosatu zmienia skład niektórych gatunków bakteryjnych, powodując zachwianie równowagi na korzyść bakterii opornych, podczas gdy niektóre gatunki bakterii pozostają niezmienione, prawdopodobnie ze względu na dodatkowe mechanizmy oporności, takie jak pompy efflux lub nadekspresja genu EPSPS13. Scenariusz ten może również prowadzić do wzrostu liczby bakterii opornych na glifosat, a także do wzrostu oporności bakteryjnej na dodatkowe antybiotyki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig09large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Diagram drzewa filogenetycznego odporności na glifosat; taksonomia, tryb życia, analiza zawartości GC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig10v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 10"> 
Rycina 10: Rozkład przewidywanej wrażliwości na glifosat w obrębie drzewa gatunków. Wykresy kołowe wskazują proporcję gatunków uznanych za wrażliwe (zielony) lub odporne (czerwony) na glifosat, a także niezaklasyfikowane (czarny). Rycina została opracowana na podstawie publikacji Rainio i wsp.14 za zgodą autorów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig10largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Interfejs wstawiania sekwencji do analizy białek; zawiera pola wprowadzania danych FASTA i markerów aminokwasowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig10.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 11"> 
Rycina 11: Wejścia i wyjścia serwera internetowego EPSPSClass służącego do testowania własnych sekwencji referencyjnych użytkownika. (A) Wejście 1: sekwencja zapytania. (B) Wejście 2: sekwencja referencyjna. (C) Wejście 3: markery aminokwasowe w sekwencjach referencyjnych. (D) Wyjście: identyczność: ułamek markerów aminokwasowych w sekwencjach zapytania (klasy I-IV oraz własne sekwencje referencyjne użytkownika). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig10large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Lista starterów do amplifikacji PCR genu 16S rRNA i regionu ITS w analizie mikrobiomu <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%201-63109R2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Kody enzymu syntazy 5-enolopirowyloszykimatu-3-fosforanu (EPSPS) w różnych bazach danych <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%202_63109R2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Średnie stężenie glifosatu <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%203-63109R2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 4: Tabela podsumowująca procent gatunków wrażliwych/odpornych na glifosat. Tabela ta została opracowana za zgodą Rainio et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%204-63109R2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 5: Pozycje markerów aminokwasowych w sekwencjach referencyjnych <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%205-63109R2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Produkty na bazie glifosatu (GBP) są najpopularniejszymi herbicydami o szerokim spektrum działania na świecie. W tym artykule przedstawiamy ogólne wytyczne dotyczące ilościowego określania wpływu GBP na mikrobiomy, od eksperymentów terenowych po analizy bioinformatyczne.

Kwantyfikacja potencjalnego wpływu produktów na bazie glifosatu na mikrobiomy

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme ...

W tym miejscu zapewniamy przepływ pracy, który obejmuje najlepszą metodę bioinformatyczną do przeprowadzania eksperymentów w celu oceny wpływu glifosatu na mikrobiomy. Główną zaletą jest to, że zapewnia solidną, testowalną hipotezę dla przyszłych eksperymentów terenowych i laboratoryjnych. Opisana metodologia może być stosowana do różnych systemów, w tym roślin, zwierząt i drobnoustrojów.Każda część metodologii jest dość prosta. Być może najtrudniejszą częścią jest zintegrowanie multidyscyplinarnego zespołu zdolnego do wykonywania różnych części pracy. Procedurę zademonstruje Suni Matthew, badaczka z mojego laboratorium.Na początek rozpocznij pierwszy eksperyment od podzielenia pola doświadczalnego na 10 powtórzeń kontroli i traktowania GBP z buforowymi pasami roślinności między powierzchniami. Poletka kontrolne należy potraktować wodą z kranu, a poletka GBP komercyjnym GBP, aby naśladować maksymalną dozwoloną dawkę glifosatu w praktykach rolniczych. Pobranie próbki mikrobioty z roślin doświadczalnych.Zbierz 10 powtórzeń próbek roślin z pola, natychmiast umieść je na lodzie i przynieś do laboratorium w celu dalszego przetwarzania. W drugim eksperymencie zbierz ściółkę, w tym wióry drzewne, kał i trochę rozlanej paszy z przepiórek karmionych paszami zanieczyszczonymi GBP lub kontrolnymi w 12-miesięcznym eksperymencie wolierowym. Próbki ściółki należy wysłać do akredytowanego laboratorium w celu zmierzenia stężenia glifosatu bezpośrednio po jego rozprowadzeniu.Posadź wieloletnie trawy i truskawki na każdej działce, aby zbadać ich mikrobiotę korzeni i liści. Zidentyfikuj i usuń drobnoustroje endofityczne, myjąc i sterylizując próbki roślin. Po wysterylizowaniu próbek wyekstrahuj genomowe DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji DNA roślinnego zgodnie z protokołem producenta.Stosując podejście zagnieżdżone, amplifikuj zmienne regiony od V6 do V8 genu 16S rRNA i wykonaj główną mieszankę PCR dla wymaganej liczby próbek, jak opisano w manuskrypcie tekstowym. W pierwszej rundzie PCR użyj starterów 799 do przodu i 1492 do tyłu. Ustaw profil wzmocnienia w termocyklerze na 35 cykli.Aby zweryfikować amplifikację, należy przeprowadzić elektroforezę przy użyciu pięciu mikrolitrów amplifikowanego produktu, a następnie rozcieńczyć pozostałe 25 mikrolitrów produktu PCR w autoklawowanej ultraczystej wodzie w stosunku jeden do 10. Używając uniwersalnych starterów 1062 do przodu i 1390 do tyłu, przeprowadź drugą rundę amplifikacji z 25 cyklami. Rozcieńczyć powstałe produkty PCR w autoklawowanej ultraczystej wodzie w równym stosunku.Przeprowadź trzecią rundę amplifikacji z ośmioma cyklami, aby oznaczyć produkty kodami kreskowymi i sekwencją adaptera P1. Sprawdź stężenie w jakości produktów PCR na bioanalizatorze i zbierz objętości stanowiące 30 nanogramów DNA każdej próbki w probówce o pojemności 1,5 mililitra, aby przygotować bibliotekę równomolową. Wybierz amplikony o wielkości od 350 do 550 par zasad przez frakcjonowanie wielkości za pomocą automatycznego systemu wyboru wielkości DNA na kasecie z żelem agarozowym.Zebrać elucję zawierającą amplikony o określonej wielkości do fiolki w kasecie, w wyniku czego otrzymamy oczyszczoną bibliotekę genów 16S rRNA. Przenieś pobrany eluent do probówki o pojemności 1,5 mililitra i sprawdź czystość i stężenie na bioanalizatorze. Rozcieńczyć bibliotekę DNA za pomocą autoklalawowanej ultraczystej wody do końcowego stężenia 26 pikomolarów.Aby wzmocnić obszar ITS, po ustawieniu reakcji za pomocą starterów ITS, ustaw profil amplifikacji na termocyklerze. Następnie przeanalizuj pięć mikrolitrów amplifikowanego produktu na 1,5% żelu agarozowym i rozcieńcz pozostałe 25 mikrolitrów produktu w stosunku od 1 do 10 za pomocą autoklawowanej ultraczystej wody. Przygotować wzorcową mieszankę PCR dla wymaganej liczby próbek z oznaczonymi kodami kreskowymi starterami do przodu i starterami odwrotnymi oznaczonymi adapterem P1.Używając rozcieńczonego produktu PCR jako matrycy, przeprowadzić drugą rundę amplifikacji. Podobnie jak w przypadku przygotowania biblioteki dla genu 16S rRNA, przygotuj bibliotekę dla oczyszczonego regionu ITS. Rozpoczęcie analiz bioinformatycznych sekwencji białka EPSPS.Oceń potencjalną wrażliwość sekwencji zapytania na glifosat na podstawie danych wyjściowych dostarczonych przez serwer, gdzie dane wyjściowe pokazują frakcję markerów aminokwasowych obecnych w sekwencjach zapytań i liczbę motywów. Dane wyjściowe dwa pokazują wyrównania sekwencji zapytania i odwołań na podstawie pozostałości znaczników. Dane wyjściowe trzy pokazują pełne wyrównania parami sekwencji zapytania i odwołań.Wynik czwarty przedstawia sekwencje referencyjne EPSPS Vibrio cholerae, Coxiella burnetii, Brevundimonas vesicularis i Streptomyces davawensis. Na końcu strony danych wyjściowych znajdują się łącza do narzędzi zewnętrznych, takich jak BLASTp i domeny zachowane, aby dokładniej przeanalizować sekwencję zapytania EPSPS. Po zidentyfikowaniu sekwencji EPSPS z repozytoriów publicznych uzyskaj dostęp do tych zestawów danych ze strony głównej serwera klas EPSPS zawierającej informacje taksonomiczne i klasę EPSPS zawierającą ponad 50 000 sekwencji.Zważyć nadziemną biomasę roślin pod koniec sezonu polowego, aby porównać wzrost roślin na GBP i na poletkach kontrolnych. W arkuszu kalkulacyjnym zmapuj bakteryjne OTU do eksperymentów mikrobiomu we wstępnie obliczonych zestawach danych. Na podstawie wyniku probabilistycznego oblicz wewnętrzną wrażliwość na glifosat.Metodę tę wykorzystano do ilościowego określenia zmian wrażliwości białka EPSPS na poziomie mikroewolucyjnym. Zidentyfikowaliśmy zmiany w stanie wrażliwości w 12 z 32 ściśle spokrewnionych analizowanych grup prokariontów. W związku z tym ciągłe stosowanie produktów na bazie glifosatu może powodować dysbiozę mikrobiologiczną w mikrobiomie roślinnym, zwierzęcym i glebowym.Zapewnienie jakości procedur przed i po PCR w celu uzyskania optymalnych bibliotek amplikonów. Upewnij się również, że sekwencja białka EPSPS nie jest częściowa przed użyciem oprogramowania. Podczas eksperymentów terenowych należy upewnić się, że nie dopuścić do zanieczyszczenia kontroli glifosatem.

quantification-potential-impact-glyphosate-based-products-on

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Konsorcja mikrobiologiczne w ulach trzmieli wzbogacają i zachowują pyłek dla larw pszczół. Wykorzystując sekwencjonowanie nowej generacji, wraz z eksperymentami laboratoryjnymi i terenowymi, manuskrypt ten opisuje protokoły stosowane do testowania hipotezy, że pozostałości fungicydów zmieniają mikrobiom pyłku i demografię kolonii, ostatecznie prowadząc do utraty kolonii.

Techniki empiryczne, metagenomiczne i obliczeniowe rzucają światło na mechanizmy, za pomocą których fungicydy zagrażają zdrowiu pszczół

Wydobywanie korzeni roślin z pola, jak również przetwarzanie próbek do endosfery, ryzosfery i gleby są szczegółowo opisane, łącznie z metodami ekstrakcji DNA i analizy danych. Niniejszy artykuł ma na celu umożliwienie innym laboratoriom wykorzystania tych technik do badania mikrobiomów glebowych, endosfery i ryzosfer.

Izolacja i analiza zbiorowisk mikrobiologicznych w glebie, ryzosferze i korzeniach w eksperymentach z wieloletnimi trawami

Tutaj udostępniamy szczegółowe protokoły doustnego podawania antybiotyków myszom, pobierania próbek kału, ekstrakcji DNA i kwantyfikacji bakterii kałowych metodą qPCR.

Ilościowe analizy mikrobioty jelitowej myszy po doustnym leczeniu antybiotykami oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy

Ten protokół opisuje system fermentacji in vitro mikroflory kałowej przy użyciu inuliny (dobrze znanego prebiotyku i jednego z najczęściej badanych modulatorów mikrobioty), aby zademonstrować użycie tego systemu do szacowania wpływu konkretnych interwencji na skład mikrobioty kałowej i aktywność metaboliczną.

Model hodowli okresowej in vitro w celu oszacowania wpływu schematów interwencyjnych na mikrobiotę kału ludzkiego

Wydzielanie wysięków z korzeni jest zazwyczaj zewnętrzną strategią detoksykacji roślin w warunkach stresu. Protokół ten opisuje, w jaki sposób można ocenić wpływ ksenobiotyków na lucernę za pomocą niecelowanej analizy metabolomicznej.

Pobieranie wysięków z korzenia lucerny w celu zbadania wpływu ftalanu di(2-etyloheksylu) na produkcję metabolitów

Caenorhabditis elegans to potężny model do badania molekularnych determinantów kierujących interakcjami gospodarz-mikrobiom. Przedstawiamy wysokoprzepustowy potok profilujący poziomy kolonizacji mikrobiomu jelitowego u pojedynczych zwierząt wraz z kluczowymi aspektami fizjologii C. elegans.

Zastosowanie wermimetrii przepływowej do kwantyfikacji i analizy mikrobiomu jelitowego Caenorhabditis elegans

Prezentowany tutaj jest protokół do określania absorpcji, translokacji i dystrybucji imidakloprydu w pszenicy w warunkach hydroponicznych przy użyciu chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS-MS). Wyniki pokazały, że imidaklopryd może być wchłaniany przez pszenicę, a imidaklopryd wykryto zarówno w korzeniach, jak i liściach pszenicy.

Oznaczanie absorpcji, translokacji i dystrybucji imidakloprydu w pszenicy

Obecny protokół opisuje prostą i skuteczną metodę identyfikacji metabolitów 2,4-dibromofenolu w roślinach.

Wyjaśnienie metabolizmu 2,4-dibromofenolu w roślinach

Protokół opisuje nową metodę oceny całkowitej cytotoksyczności metabolitów triazolowych pestycydów w roślinach.

Ocena cytotoksyczności metabolitów typowych pestycydów triazolowych w roślinach

Aby zmierzyć potencjalne tempo aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w glebie, do próbek gleby dodaje się syntetyczne substraty, które są związane z barwnikiem fluorescencyjnym.  Aktywność enzymu mierzy się, gdy barwnik fluorescencyjny jest uwalniany z substratu w reakcji katalizowanej enzymatem, gdzie wyższa fluorescencja wskazuje na większą degradację substratu.

Wysokoprzepustowy pomiar fluorometryczny potencjalnej aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w glebie

Dowiedz się metodologii bioinformatycznej do oceny wpływu glifosatu na mikrobiomy roślin, zwierząt i gleby. Przedstawiono protokoły ekstrakcji DNA, PCR i analizy sekwencji białka EPSPS.

Kwantyfikacja potencjalnego wpływu produktów na bazie glifosatu na mikrobiomy

Przeglądaj więcej filmów