Kwantyfikacja potencjalnego wpływu produktów na bazie glifosatu na mikrobiomy
January 10th, 2022
Produkty na bazie glifosatu (GBP) są najpopularniejszymi herbicydami o szerokim spektrum działania na świecie. W tym artykule przedstawiamy ogólne wytyczne dotyczące ilościowego określania wpływu GBP na mikrobiomy, od eksperymentów terenowych po analizy bioinformatyczne
.W tym miejscu zapewniamy przepływ pracy, który obejmuje najlepszą metodę bioinformatyczną do przeprowadzania eksperymentów w celu oceny wpływu glifosatu na mikrobiomy. Główną zaletą jest to, że zapewnia solidną, testowalną hipotezę dla przyszłych eksperymentów terenowych i laboratoryjnych. Opisana metodologia może być stosowana do różnych systemów, w tym roślin, zwierząt i drobnoustrojów.
Każda część metodologii jest dość prosta. Być może najtrudniejszą częścią jest zintegrowanie multidyscyplinarnego zespołu zdolnego do wykonywania różnych części pracy. Procedurę zademonstruje Suni Matthew, badaczka z mojego laboratorium.
Na początek rozpocznij pierwszy eksperyment od podzielenia pola doświadczalnego na 10 powtórzeń kontroli i traktowania GBP z buforowymi pasami roślinności między powierzchniami. Poletka kontrolne należy potraktować wodą z kranu, a poletka GBP komercyjnym GBP, aby naśladować maksymalną dozwoloną dawkę glifosatu w praktykach rolniczych. Pobranie próbki mikrobioty z roślin doświadczalnych.
Zbierz 10 powtórzeń próbek roślin z pola, natychmiast umieść je na lodzie i przynieś do laboratorium w celu dalszego przetwarzania. W drugim eksperymencie zbierz ściółkę, w tym wióry drzewne, kał i trochę rozlanej paszy z przepiórek karmionych paszami zanieczyszczonymi GBP lub kontrolnymi w 12-miesięcznym eksperymencie wolierowym. Próbki ściółki należy wysłać do akredytowanego laboratorium w celu zmierzenia stężenia glifosatu bezpośrednio po jego rozprowadzeniu.
Posadź wieloletnie trawy i truskawki na każdej działce, aby zbadać ich mikrobiotę korzeni i liści. Zidentyfikuj i usuń drobnoustroje endofityczne, myjąc i sterylizując próbki roślin. Po wysterylizowaniu próbek wyekstrahuj genomowe DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji DNA roślinnego zgodnie z protokołem producenta.
Stosując podejście zagnieżdżone, amplifikuj zmienne regiony od V6 do V8 genu 16S rRNA i wykonaj główną mieszankę PCR dla wymaganej liczby próbek, jak opisano w manuskrypcie tekstowym. W pierwszej rundzie PCR użyj starterów 799 do przodu i 1492 do tyłu. Ustaw profil wzmocnienia w termocyklerze na 35 cykli.
Aby zweryfikować amplifikację, należy przeprowadzić elektroforezę przy użyciu pięciu mikrolitrów amplifikowanego produktu, a następnie rozcieńczyć pozostałe 25 mikrolitrów produktu PCR w autoklawowanej ultraczystej wodzie w stosunku jeden do 10. Używając uniwersalnych starterów 1062 do przodu i 1390 do tyłu, przeprowadź drugą rundę amplifikacji z 25 cyklami. Rozcieńczyć powstałe produkty PCR w autoklawowanej ultraczystej wodzie w równym stosunku.
Przeprowadź trzecią rundę amplifikacji z ośmioma cyklami, aby oznaczyć produkty kodami kreskowymi i sekwencją adaptera P1. Sprawdź stężenie w jakości produktów PCR na bioanalizatorze i zbierz objętości stanowiące 30 nanogramów DNA każdej próbki w probówce o pojemności 1,5 mililitra, aby przygotować bibliotekę równomolową. Wybierz amplikony o wielkości od 350 do 550 par zasad przez frakcjonowanie wielkości za pomocą automatycznego systemu wyboru wielkości DNA na kasecie z żelem agarozowym.
Zebrać elucję zawierającą amplikony o określonej wielkości do fiolki w kasecie, w wyniku czego otrzymamy oczyszczoną bibliotekę genów 16S rRNA. Przenieś pobrany eluent do probówki o pojemności 1,5 mililitra i sprawdź czystość i stężenie na bioanalizatorze. Rozcieńczyć bibliotekę DNA za pomocą autoklalawowanej ultraczystej wody do końcowego stężenia 26 pikomolarów.
Aby wzmocnić obszar ITS, po ustawieniu reakcji za pomocą starterów ITS, ustaw profil amplifikacji na termocyklerze. Następnie przeanalizuj pięć mikrolitrów amplifikowanego produktu na 1,5% żelu agarozowym i rozcieńcz pozostałe 25 mikrolitrów produktu w stosunku od 1 do 10 za pomocą autoklawowanej ultraczystej wody. Przygotować wzorcową mieszankę PCR dla wymaganej liczby próbek z oznaczonymi kodami kreskowymi starterami do przodu i starterami odwrotnymi oznaczonymi adapterem P1.
Używając rozcieńczonego produktu PCR jako matrycy, przeprowadzić drugą rundę amplifikacji. Podobnie jak w przypadku przygotowania biblioteki dla genu 16S rRNA, przygotuj bibliotekę dla oczyszczonego regionu ITS. Rozpoczęcie analiz bioinformatycznych sekwencji białka EPSPS.
Oceń potencjalną wrażliwość sekwencji zapytania na glifosat na podstawie danych wyjściowych dostarczonych przez serwer, gdzie dane wyjściowe pokazują frakcję markerów aminokwasowych obecnych w sekwencjach zapytań i liczbę motywów. Dane wyjściowe dwa pokazują wyrównania sekwencji zapytania i odwołań na podstawie pozostałości znaczników. Dane wyjściowe trzy pokazują pełne wyrównania parami sekwencji zapytania i odwołań.
Wynik czwarty przedstawia sekwencje referencyjne EPSPS Vibrio cholerae, Coxiella burnetii, Brevundimonas vesicularis i Streptomyces davawensis. Na końcu strony danych wyjściowych znajdują się łącza do narzędzi zewnętrznych, takich jak BLASTp i domeny zachowane, aby dokładniej przeanalizować sekwencję zapytania EPSPS. Po zidentyfikowaniu sekwencji EPSPS z repozytoriów publicznych uzyskaj dostęp do tych zestawów danych ze strony głównej serwera klas EPSPS zawierającej informacje taksonomiczne i klasę EPSPS zawierającą ponad 50 000 sekwencji.
Zważyć nadziemną biomasę roślin pod koniec sezonu polowego, aby porównać wzrost roślin na GBP i na poletkach kontrolnych. W arkuszu kalkulacyjnym zmapuj bakteryjne OTU do eksperymentów mikrobiomu we wstępnie obliczonych zestawach danych. Na podstawie wyniku probabilistycznego oblicz wewnętrzną wrażliwość na glifosat.
Metodę tę wykorzystano do ilościowego określenia zmian wrażliwości białka EPSPS na poziomie mikroewolucyjnym. Zidentyfikowaliśmy zmiany w stanie wrażliwości w 12 z 32 ściśle spokrewnionych analizowanych grup prokariontów. W związku z tym ciągłe stosowanie produktów na bazie glifosatu może powodować dysbiozę mikrobiologiczną w mikrobiomie roślinnym, zwierzęcym i glebowym.
Zapewnienie jakości procedur przed i po PCR w celu uzyskania optymalnych bibliotek amplikonów. Upewnij się również, że sekwencja białka EPSPS nie jest częściowa przed użyciem oprogramowania. Podczas eksperymentów terenowych należy upewnić się, że nie dopuścić do zanieczyszczenia kontroli glifosatem.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia kompleksową metodologię oceny wpływu produktów na bazie glifosatu na mikrobiomy. Przedstawia on projekty eksperymentalne i podejścia bioinformatyczne do ilościowego określania zmian w społecznościach mikroorganizmów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Nauki o środowisku
- Praktyka rolnicza
Tło
- Glifosat jest szeroko stosowanym herbicydem o potencjalnym wpływie na mikrobiomy.
- Rozumienie jego wpływu jest kluczowe dla ekologicznego i rolniczego zdrowia.
- Badanie łączy eksperymenty polowe z analizami bioinformatycznymi.
- Interdyscyplinarna współpraca jest niezbędna do efektywnego badania.
Cel badania
- Ilościowe określenie wpływu glifosatu na mikrobiomy roślin, zwierząt i gleby.
- Dostarczenie solidnej ramy dla przyszłych badań w tej dziedzinie.
- Zidentyfikowanie potencjalnej dysbiozy mikrobiomu wywołanej przez glifosat.
Zastosowane metody
- Eksperymenty polowe z działkami kontrolnymi i traktowanymi glifosatem.
- Pobranie mikrobiomu z roślin i materiałów opatrunkowych.
- Ekstrakcja genomowej DNA i amplifikacja genów mikroorganizmów metodą PCR.
- Analizy bioinformatyczne sekwencji białka EPSPS.
Główne wyniki
- Identyfikacja zmian w wrażliwości mikroorganizmów na glifosat.
- Wykazanie potencjalnej dysbiozy mikrobiomu w traktowanych środowiskach.
- Przedstawienie szczegółowego przepływu pracy do oceny wpływu glifosatu.
- Podkreślenie znaczenia kontroli jakości w procedurach eksperymentalnych.
Wnioski
- Ciągłe stosowanie glifosatu może zakłócać społeczności mikroorganizmów.
- Metodologia może być stosowana w różnych badaniach ekologicznych.
- Przyszłe badania powinny koncentrować się na długoterminowych wpływach ekologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying the impact of glyphosate-based products on microbiomes addresses a critical challenge in agricultural and environmental biotechnology, where unintended effects on non-target microbial communities can influence plant health and ecosystem stability. This workflow enables robust hypothesis testing and predictive assessment of microbial sensitivity, supporting risk-adjusted decisions in agrochemical R&D portfolios. Integrating bioinformatics with field data enhances translational continuity from discovery to environmental risk evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microbial pathway susceptibility to glyphosate via EPSPS sequence analysis.
- Supports biological de-risking by identifying non-target organisms potentially affected by herbicide exposure.
- Facilitates predictive confidence in environmental safety assessments for new agrochemical candidates.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microbiome samples for downstream sequencing and bioinformatics workflows.
- Standardizes PCR-based amplification and library preparation for reproducible microbial profiling.
- Generates quantitative outputs on microbial community composition and glyphosate sensitivity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns field and laboratory data to assess translational relevance of microbiome shifts in real-world settings.
- Supports continuity from molecular target analysis to ecosystem-level impact studies.
- Informs risk-adjusted advancement of agrochemical products with environmental stewardship considerations.
Pipeline & Workflow Integration
This methodology bridges early discovery, screening, and translational research by integrating field sampling, molecular profiling, and bioinformatics analysis of EPSPS sensitivity.
- Discovery Biology: Provides a framework for hypothesis-driven testing of glyphosate effects on microbial pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative microbiome data for comparative analysis across treatments.
- Analytics: Outputs probabilistic sensitivity scores and sequence alignments to inform risk assessment.
- Translational Research: Connects molecular findings to field-level ecological outcomes for regulatory and stewardship decisions.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable workflow adaptable to diverse plant, animal, and environmental systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in non-target impact assessments and target validation.
- Operational Value: Standardizes multidisciplinary workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage ecological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of agrochemical candidates with environmental considerations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, bioinformatics, and field ecology.
- Needs access to sequencing platforms, PCR instrumentation, and computational resources.
- Demands rigorous cross-team standardization for sample handling and data analysis.
- Must adapt protocols for different microbiome sources and environmental matrices.
- Relies on high-quality sequence data and contamination control for reliable outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:52
Two Field Experiments to Test the Effect of Glyphosate Based Products (GBPs)
1:58
Microbiome Analyses: 16S rRNA and ITS Gene Amplification, and Library Preparation
4:59
Algorithm to Determine the Potential Sensitivity of Organisms to Glyphosate
5:56
Assessing the EPSPS Class from Universal Microbial Markers
6:40
Results: Quantification of Microbial Species Sensitivity after GBPs Usage
7:10
Conclusion
