Kolumny chromatograficzne powinowactwa błony komórkowej do identyfikacji wyspecjalizowanych metabolitów roślinnych oddziałujących z unieruchomionym receptorem kinazy tropomiozynowej B

Ta pionowa branża przedstawia ważne kroki w łączeniu kolumn chromatograficznych powinowactwa błony komórkowej z funkcjonalnymi receptorami transbłonowymi. Kolumny te mogą być wykorzystywane do identyfikacji małych cząsteczek obecnych w złożonych ekstraktach i oddziałujących z unieruchomionymi receptorami transbłonowymi. Kolumny chromatograficzne z powinowactwem błony komórkowej przyspieszają identyfikację związków biologicznie czynnych obecnych w złożonych mieszaninach.

Zastosowanie kolumn chromatograficznych z powinowactwem błony komórkowej może być szczególnie interesujące dla osób zainteresowanych identyfikacją farmakologicznie aktywnych związków obecnych w złożonych matrycach naturalnych, takich jak ekstrakty roślinne, grzybowe lub bakteryjne. Na początek przygotuj 200-milimolowy roztwór podstawowy benzamidyny, rozpuszczając 120 benzamidyny w pięciu mililitrach ultraczystej wody dejonizowanej. Przygotować 10-milimolowy roztwór podstawowy PMSF, rozpuszczając 0,017 grama PMSF w 10 mililitrach etanolu w dygestorium.

Przygotuj koktajl inhibitorów proteaz 100X, rozpuszczając dostępną na rynku mieszaninę inhibitorów proteazy w jednym mililitrze ultraczystej wody dejonizowanej. Dokładnie wymieszaj i podlej od 200 do 300 mikrolitrów koktajlu. Przygotować 100 milimolowy roztwór podstawowy ATP, rozpuszczając 55,114 miligramów hydratu soli disodowej ATP w jednym mililitrze zjonizowanej ultraczystej wody.

Dokładnie wymieszać i podać 100 mikrolitrów mieszanki. Przygotować bufor, rozpuszczając 3,03 grama Tris-HCL, 2,9 grama chlorku sodu, 0,22 grama bezwodnego chlorku wapnia, 0,2 grama sześciowodnego chlorku magnezu i 0,19 grama chlorku potasu w 500 mililitrach ultraczystej wody dejonizowanej. Przygotować bufor homogenizacyjny, mieszając 17,3 mililitra buforu Tris z 0,3 mililitra roztworu podstawowego benzamidyny, 0,2 mililitra roztworu podstawowego PMSF, 0,2 mililitra koktajlu inhibitorów proteaz, 20 mikrolitrów roztworu podstawowego ATP, dwóch mililitrów glicerolu i 0,029 grama EDTA.

Dostosuj pH do 7,4 za pomocą roztworu kwasu solnego. Odwiruj komórki zebrane w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut przy 400 x g, usuń supernatant i umyj pozostałą osadkę komórek 10 mililitrami 1X pH 7,4 lodowatego PBS. Odrzucić supernatant i dodać 20 mililitrów buforu homogenizacyjnego.

Umieść stożkową rurkę na lodzie. Przenieś zawiesinę komórkową do 40-mililitrowego młynka do tkanek homogenizatora Dounce, homogenizuj zawiesinę ręcznie na lodzie, wykonując 40 ruchów tłuczkiem w górę iw dół. Przenieść homogenizowaną zawiesinę komórek do 50-mililitrowej stożkowej probówki, wyrzucić osad i przenieść supernatant do nowej stożkowej probówki.

Zachowaj osad błony komórkowej i wyrzuć supernatant. Przygotować bufor do solubilizacji, mieszając 8,7 mililitra roztworu buforowego z 0,1 mililitra roztworu podstawowego PMSF, 0,15 mililitra roztworu podstawowego benzamidyny, 0,1 mililitra koktajlu inhibitorów proteaz, 10 mikrolitrów roztworu podstawowego ATP, jednym mililitrem glicerolu i 0,2 grama cholanu sodu. Przenieś bufor solubilizacyjny do stożkowej rurki z fragmentami błony komórkowej.

I ponownie zawiesić pellet. Obracaj powstałą mieszaninę z prędkością 150 obr./min w czterech stopniach Celsjusza przez 18 godzin. Po 18 godzinach odwirować mieszaninę solubilizacyjną w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut w temperaturze 47, 900 x g.

Dodaj 100 miligramów IAM. Komputer osobisty. DD2 do supernatantu i obracać powstałą mieszaninę zawiesiny z prędkością 150 obr./min w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Przygotuj bufor do dializy w czterech litrach ultraczystej wody dejonizowanej, dodając 24 gramy Tris-HCl, 23,4 grama chlorku sodu, 0,06 grama chlorku wapnia, 5,85 grama EDTA i 0,07 grama PMSF.

Najpierw rozpuść PMSF w małej objętości etanolu, a następnie powoli dodawaj do zlewki z buforem. Wyciąć 10 centymetrów rurki do dializy z membraną celulozową, aby przygotować rurkę do dializy i przenieść zawiesinę zawierającą IAM. Komputer osobisty. Cząsteczki DD2 i fragmenty błony komórkowej do rurki dializowej.

Zamknąć oba końce rurki dializacyjnej za pomocą zacisków do rurek dializacyjnych. Umieścić rurkę dializacyjną w buforze do dializy. Po 24 godzinach umieścić rurkę dializacyjną w świeżo przygotowanym buforze do dializy i kontynuować dializę przez kolejne 24 godziny.

Przygotować 10-milimolowy bufor octanu amonu o pH 7,4, który zostanie użyty do przepłukania IAM. Komputer osobisty. Cząstki DD2 i eksperymenty z charakterystyką kolumnową przez rozpuszczenie 0,778 grama octanu amonu w jednym litrze ultraczystej wody dejonizowanej. Po 48 godzinach dializy należy wyjąć rurkę dializacyjną z buforu dializacyjnego i przenieść zawartość rurki dializacyjnej do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.

Odrzucić sklarowany osad i trzykrotnie przemyć pozostały osad 10 mililitrami buforu octanu amonu. Po trzecim praniu ponownie zawiesić pozostały osad w jednym mililitrze buforu octanu amonu. Dokładnie wymieszać i użyć powstałej zawiesiny do wypełnienia szklanej kolumny o wymiarach 5 x 20, aby uzyskać kolumnę chromatograficzną CMAC.

Aby upakować kolumnę, umieść dolny filtr uprzednio nasączony buforem octanu amonu w uchwycie filtra. Zamontuj uchwyt filtra w szklanej kolumnie i przykręć nasadkę kolumny, aby zabezpieczyć pozycję uchwytu. Umieść kolumnę pionowo w zacisku palcowym i zabezpiecz ją w stojaku laboratoryjnym.

Umieścić zlewkę pod kolumną, powoli przenieść niewielką objętość gnojowicy do szklanej kolumny za pomocą pipetera jednokanałowego, przytrzymując końcówkę pipety przy ściance szklanej kolumny. Aby przyspieszyć proces pakowania, należy wyjąć bufor znad nieruchomego łoża za pomocą mikropipety między każdym etapem. Umieść filtr górny i przykręć adapter tak, aby nad fazą stacjonarną nie pozostał bufor.

Zabezpiecz pozycję adaptera za pomocą blokady adaptera. Podłączyć kolumnę do wysokowydajnej pompy do chromatografii cieczowej i przepłukać kolumnę przez noc buforem octanu amonu, ustawić natężenie przepływu na 0,2 mililitra na minutę. W celu dłuższego przechowywania należy uruchomić kolumnę z 0,05% roztworem azydku sodu w buforze octanu amonu, zakładając fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice podczas pracy z azydkiem sodu i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

komputer osobisty. Cząstki DD2 z unieruchomionymi fragmentami błony komórkowej nerwiaka zarodkowego TrkB i w obecności BDNF powodowały powstanie cząstek fluorescencyjnych. Nie zaobserwowano fluorescencji w cząstkach IAM zamkniętych w błonie komórkowej TrkB lub gdy nie zastosowano BDNF, jak w przypadku cząstek IAM otoczonych błoną komórkową TrkB. Pokazano funkcjonalny chromatogram powinowactwa czołowego kolumn CMAC o rosnących stężeniach 7, 8-DHF jednego milimola, 750 nanomolowców, 500 nanomolowców i 300 nanomolowców do unieruchomionych receptorów TrkB, który wykazał zależną od stężenia zmianę czasu retencji.

Niefunkcjonalna kolumna CMAC wykazała brak zależnych od stężenia zmian w retencji ligandu markerowego. Kolumnę kontroli ujemnej CMAC przygotowano poprzez unieruchomienie fragmentów błony komórkowej, bez ekspresji docelowego białka, aby wykluczyć niespecyficzne interakcje. Dodatek 0,2% wodnego ekstraktu z Gotu kola spowodował znaczne zmniejszenie retencji 7,8-DHF, co wskazuje na obecność konkurujących ligandów dla miejsca wiązania agonisty.

Brak redukcji retencji 7,8-DHF na ujemnej kolumnie zerowej CMAC TrkB dodatkowo potwierdził brak funkcjonalnych receptorów TrkB na tej kolumnie. Podejście oparte na chromatografii brakujących pików zidentyfikowało związek silnie zatrzymany na kolumnie TrkB, podczas gdy wcześnie eluował się na kolumnie zerowej TrkB, co wskazuje na specyficzną interakcję. Ważne jest, aby znać źródło receptorów dla szybkiej kolumny chromatografii powinowactwa błony komórkowej.

Upewnij się, że zapoznałeś się z literaturą, aby prawidłowo zaprojektować do homogenizacji i solubilizacji. Przygotowana w tym protokole kolumna chromatograficzna powinowactwa błony komórkowej została wykorzystana do identyfikacji nowych potencjalnych trafień leków oraz do scharakteryzowania charakteru interakcji między unieruchomionym receptorem a jego naturalnymi ligandami.