Name: Kolumny chromatograficzne powinowactwa błony komórkowej do identyfikacji wyspecjalizowanych metabolitów roślinnych oddziałujących z unieruchomionym receptorem kinazy tropomiozynowej B (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Poznaj technikę chromatografii powinowactwa błon komórkowych do identyfikacji metabolitów roślinnych oddziałujących z receptorami kinazy tropomiozynowej B. Ta metoda przyspiesza odkrywanie nowych związków farmakologicznie aktywnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z.C.A. był wspierany przez Naukową i Technologiczną Radę Badań Naukowych Turcji (TUBITAK) 2219- Międzynarodowy Program Stypendialny dla Doktorantów. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez Narodowe Centrum Medycyny Komplementarnej i Integracyjnej Narodowych Instytutów Zdrowia pod numerem nagrody 1R41AT011716-01. Praca ta była również częściowo wspierana przez American Society of Pharmacognostyy Research Starter Grant, grant Regis Technologies dla L.C. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Łukasz Cieśla współpracuje z firmą Regis Technologies, dostawcą IAM. Komputer osobisty. Cząsteczki DD2.

Identyfikacja związków czynnych obecnych w złożonych mieszaninach wyspecjalizowanych metabolitów jest bardzo trudnym zadaniem23. Tradycyjnie izoluje się poszczególne związki, a ich aktywność bada się w różnych testach. Podejście to jest czasochłonne i kosztowne i często prowadzi do izolacji i identyfikacji najliczniejszych i najlepiej scharakteryzowanych związków23. Obecnie stosowane wysokoprzepustowe testy przesiewowe opierają się w dużej mierze na przesiewowych biblioteka...

Mieszanki botaniczne są bogate w farmakologicznie aktywne związki1, służąc jako dobre źródło do identyfikacji nowych trafień i potencjalnych leków2,3,4,5. Odkrycie nowych leków z produktów naturalnych było owocnym podejściem i wiele obecnie zatwierdzonych leków pochodzi ze związków zidentyfikowanych po raz pierwszy w przyroda. Różnorodność chemiczna naturalnych związków jest trudna do dopasowania przez stworzone przez człowieka biblioteki chemicznie syntetyzowanych cząsteczek. Wiele naturalnych związków oddziałuje i moduluje ludzkie cele białkowe i można je uznać za ewolucyjnie zoptymalizowane cząsteczki podobne do leków6. Te naturalne związki szczególnie dobrze nadają się do identyfikacji ołowiu leku do stosowania w zaburzeniach neurologicznych6. Dwa z obecnie zatwierdzonych przez FDA leków stosowanych w leczeniu choroby Alzheimera (AD) pochodzą z naturalnych alkaloidów, a mianowicie: galantaminy i rywastygminy (pochodna fizostygminy)6. L-DOPA, obecnie najczęściej przepisywany lek na chorobę Parkinsona, został po raz pierwszy zidentyfikowany z bobu (Vicia faba L.)7. Pergolid i lizuryd, agoniści receptorów dopaminergicznych są pochodnymi naturalnych alkaloidów sporyszu pasożytniczego grzyba Claviceps purpurea8. Rezerpina, alkaloid wyizolowany z węża indyjskiego (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) był jednym z pierwszych leków przeciwpsychotycznych9. Ostatnio rozregulowana odpowiedź immunologiczna i ogólnoustrojowe stany zapalne zostały powiązane z rozwojem licznych dolegliwości neurologicznych, takich jak duże zaburzenie depresyjne lub choroby neurodegeneracyjne10. Stwierdzono, że dieta roślinna wraz z innymi interwencjami związanymi ze stylem życia poprawia zdolności poznawcze i funkcjonalne u osób starszych11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Stwierdzono, że niektóre cząsteczki elektrofilowe należące do triterpenów i polifenoli modulują reakcje zapalne zarówno w modelach in vitro, jak i in vivo12. Na przykład naturalne związki zawierające α,β-nienasycony karbonyl (np. kurkumina, aldehyd cynamonowy) lub grupę izotiocyjanianów (np. sulforafan) zakłócają dimeryzację receptora Toll-like 4 (TLR4), hamując dalszą syntezę cytokin pro-zapalnych w mysiej linii komórkowej pro-B zależnej od interleukiny-312,22. Dowody epidemiologiczne wskazują jednoznacznie, że fitochemikalia dietetyczne, obecne w złożonych matrycach żywnościowych, mogą również stanowić realne źródło nowych leków leads6.
Jedną z głównych przeszkód w identyfikacji biologicznie aktywnych cząsteczek obecnych w ekstraktach roślinnych, w tym w żywności pochodzenia roślinnego, jest złożoność badanych próbek. Tradycyjnie, poszczególne związki są izolowane, oczyszczane, a następnie badane pod kątem aktywności biologicznej. Takie podejście zwykle prowadzi do identyfikacji najobficiej występujących i najlepiej scharakteryzowanych związków. Podejścia do odkrywania leków fenotypowych bez zdefiniowanego celu molekularnego opierają się na biokierowanym frakcjonowaniu złożonych mieszanin23. W tym podejściu ekstrakt jest frakcjonowany na mniej złożone podfrakcje, które są następnie testowane w testach fenotypowych. Izolacja i oczyszczanie związków aktywnych odbywa się w oparciu o zweryfikowaną w teście aktywność biologiczną. Wiedza o tożsamości określonego celu działania leku może znacząco przyspieszyć identyfikację związków farmakologicznie czynnych obecnych w złożonych mieszaninach. Podejścia te zwykle opierają się na unieruchomieniu celu molekularnego, na przykład enzymu, na stałej powierzchni, takiej jak kulki magnetyczne23. Unieruchomione cele są następnie wykorzystywane w eksperymentach przesiewowych, w wyniku których dochodzi do wyizolowania związków oddziałujących z celem. Chociaż podejście to było szeroko stosowane w identyfikacji związków ukierunkowanych na białka cytozolowe, rzadziej było stosowane w identyfikacji substancji chemicznych oddziałujących z białkami transbłonowymi (TMPs)23. Dodatkowym wyzwaniem w immobilizacji TMP jest fakt, że aktywność białka zależy od jego interakcji z fosfolipidami błony komórkowej i innymi cząsteczkami w dwuwarstwie, takimi jak cholesterol23,24. Ważne jest, aby zachować te subtelne interakcje między białkami a ich natywnym środowiskiem dwuwarstwowym fosfolipidowym podczas próby unieruchomienia celu transbłonowego.
W chromatografii powinowactwa błony komórkowej (CMAC) fragmenty błony komórkowej, a nie oczyszczone białka, są unieruchomione na cząstkach fazy stacjonarnej sztucznej błony (IAM)23. Fazy stacjonarne IAM są przygotowywane przez kowalencyjne wiązanie analogów fosfatydylocholiny z krzemionką. Ostatnio opracowano nowe klasy stacjonarnych faz IAM, w których grupy wolnych amin i silanoli są zakończone (IAM. Komputer osobisty. Cząstki DD2). Podczas przygotowania kolumn CMAC fragmenty błony komórkowej są unieruchamiane na powierzchni cząstek IAM poprzez adsorpcję.
Kolumny CMAC były do tej pory używane do unieruchamiania różnych klas TMP, w tym kanałów jonowych (np. receptorów nikotynowych), GPCR (np. receptorów opioidowych), transporterów białek (np. p-glikoproteiny), itd.24. Unieruchomione cele białkowe znalazły zastosowanie w charakterystyce farmakodynamiki (np. stałej dysocjacji, Kd) lub wyznaczaniu kinetyki wiązania (kon ik off) ligandów drobnocząsteczkowych oddziałujących z celem, a także w procesie identyfikacji potencjalnych nowych odprowadzeń leków obecnych w złożonych matrycach24. W artykule przedstawiono przygotowanie kolumn CMAC z unieruchomionym receptorem kinazy tropomiozynowej B (TrkB), który stał się realnym celem do odkrycia leków na liczne zaburzenia układu nerwowego.
Poprzednie badania wykazały, że aktywacja szlaku czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF)/TrkB wiąże się z poprawą niektórych dolegliwości neurologicznych, takich jak AD lub duże zaburzenie depresyjne25,26,27,28. Doniesiono, że poziom BDNF i ekspresja jego receptora TrkB zmniejszają się w AD, a podobne redukcje upośledzają funkcję hipokampa w modelach zwierzęcych AD29. Obniżone poziomy BDNF odnotowano w surowicy i mózgu pacjentów z AD30,31,32. Stwierdzono, że nadekspresja tau lub hiperfosforylacja obniżają ekspresję BDNF w pierwotnych neuronach i modelach zwierzęcych AD33,34,35. Ponadto donoszono, że BDNF ma działanie ochronne na neurotoksyczność wywołaną β-amyloidem in vitro i in vivo36. Wykazano, że bezpośrednie podawanie BDNF do mózgu szczura zwiększa uczenie się i pamięć u zwierząt z zaburzeniami poznawczymi37. BDNF/TrkB okazał się ważnym celem dla poprawy zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych, w tym AD28,38. Ukierunkowanie na szlak sygnałowy BDNF/TrkB w celu opracowania terapii w chorobie Alzheimera potencjalnie poszerzy naszą wiedzę na temat choroby39. Niestety, sam BDNF nie może być stosowany w leczeniu ze względu na jego słabe właściwości farmakokinetyczne i niepożądane skutki uboczne40. Aktywatory małych cząsteczek szlaków TrkB/BDNF zostały zbadane jako potencjalne ligandy TrkB41,42,43. Wśród badanych agonistów małocząsteczkowych wykazano, że 7,8-dihydroksyflawon (7,8-DHF) aktywuje szlak BDNF/TrkB41,44,45,46. Pochodna 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenylo-4H-chromeno-7,8-diyl bis(metylokarbaminian)) jest obecnie rozważana jako możliwy lek dla AD47. Niedawno wykazano, że kilka leków przeciwdepresyjnych działa poprzez bezpośrednie wiązanie się z TrkB i promowanie sygnalizacji BDNF, co dodatkowo podkreśla znaczenie dążenia do TrkB jako ważnego celu w leczeniu różnych zaburzeń neurologicznych48.
Protokół opisuje proces składania funkcjonalnej kolumny TrkB i kolumny kontroli negatywnej TrkB-NULL. Kolumny scharakteryzowano przy użyciu znanego naturalnego produktu małocząsteczkowego liganda: 7,8-DHF. Dodatkowo opisujemy proces przesiewowych złożonych matryc, na przykładzie ekstraktu roślinnego, w celu identyfikacji związków oddziałujących z TrkB.

<table><tbody><tr><td>7-8 Hydrat dihydroksyflawonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5446-10 mg</td><td>&ge; 98% (HPLC)</td></tr><tr><td>Adenozyno-5'-trifosforan (ATP) sól disodowa hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383-1 g</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>BDH9204-500 g</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało BDNF</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-15198-400 &mu; L</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe; Stężenie 2 mg/ml</td></tr><tr><td>Hydrat chlorowodorku benzamidyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6506-25 g</td><td></td></tr><tr><td>Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF) ludzki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3795-10 &mu; g</td><td>Rekombinant, wyrażony w E. coli, liofilizowany proszek, odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>VWR Analytical</td><td>BDH9224-1 kg</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa kwasu cholowego</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62050-100 g</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator Dounce</td><td>VWR</td><td>71000-516</td><td>40 mL, 285 mm (długość całkowita), 32 x 140 mm (OD x H)</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>VWR Analytical</td><td>BDH-9232-500 g</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500 ml</td><td>sterylnie filtrowana, odpowiednia do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>G418 roztwór soli dwusiarczanowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8168-100 ml</td><td>50 mg/ml w H2O, 0,1 &mu; m filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR Life Science</td><td>E520-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>Unieruchomiona sztuczna membrana (IAM. Komputer osobisty. DD2)</td><td>Regis Technologies, Inc.</td><td>1-771050-500</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>VWR Analytical</td><td>BDH9244-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Metanolu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322425</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C2 DUVb</td><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td>firmy <td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Normalna kozia surowica (10%)</td><td>Life Technologies</td><td>50197Z</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978-5 g</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>VWR Life Science</td><td>K812-500 ml</td><td>1x</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>0395-1 kg</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>VWR Life Science Ambreso</td><td>M221-1 ml</td><td>Stopień proteomiczny, zawierający 50 mM AEBSF, 30 &mikro; M aprotonina, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 i 1 mM leupeptyna</td></tr><tr><td>RPMI-1640 podłoże</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-500 mL</td><td>z L-glutaminą i wodorowęglanem sodu, płynne, sterylnie filtrowane, odpowiednie do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe koza anty-królicze IgG (H+L)</td><td>Invitrogen Alexa Mąka Plus 488</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>SH-SY5Y Linie komórkowe nerwiaka zarodkowego eksprymujące Trk-B</td><td>Kerafast</td><td>ECP007</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa SH-SY5Y Trk-NULL</td><td>Kerafast</td><td>ECP005</td><td></td></tr><tr><td>Rurka do dializy ze skóry węża</td><td>Thermo Scientific</td><td>88245</td><td>10K MWCO, 35 mm sucha średnica wewnętrzna</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>BDH VWR Analityczny</td><td>BDH9286-2,5 kg</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Tricorn 5/20</td><td>GE Healthcare</td><td>24-4064-08</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>VWR Life Science</td><td>0497-1 kg</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-500 ml</td><td>0,25%, sterylnie filtrowane, odpowiednie do hodowli komórkowych, 2,5 g trypsyny wieprzowej i 0,2&nbsp; g EDTA</td></tr></tbody></table>

kolumny chromatograficzne powinowactwa błony komórkowej do identyfikacji wyspecjalizowanych metabolitów roślinnych oddziałujących z unieruchomionym receptorem kinazy tropomiozynowej b

Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

Chemikalia syntetyzowane przez rośliny, grzyby, bakterie i bezkręgowce morskie były bogatym źródłem nowych trafień i tropów narkotykowych. Leki takie jak statyny, penicylina, paklitaksel, rapamycyna lub artemizynina, powszechnie stosowane w praktyce medycznej, zostały po raz pierwszy zidentyfikowane i wyizolowane z produktów naturalnych. Jednak identyfikacja i izolacja biologicznie aktywnych wyspecjalizowanych metabolitów ze źródeł naturalnych jest trudnym i czasochłonnym procesem. Tradycyjnie, po ekstrakcji biomasy, poszczególne metabolity są izolowane i oczyszczane ze złożonych mieszanin. Następnie wyizolowane cząsteczki są testowane w testach funkcjonalnych w celu zweryfikowania ich aktywności biologicznej. W artykule przedstawiono zastosowanie kolumn chromatografii powinowactwa błony komórkowej (CMAC) do identyfikacji związków biologicznie czynnych bezpośrednio z mieszanin złożonych. Kolumny CMAC pozwalają na identyfikację związków oddziałujących z unieruchomionymi funkcjonalnymi białkami transbłonowymi (TMP) osadzonymi w ich natywnym środowisku dwuwarstwowym fosfolipidowym. Jest to podejście celowane, które wymaga znajomości TMP, którego aktywność zamierza się modulować za pomocą nowo zidentyfikowanego kandydata na lek małocząsteczkowy. W niniejszym protokole przedstawiamy podejście do przygotowania kolumn CMAC z unieruchomionym receptorem B kinazy tropomiozyny (TrkB), który stał się realnym celem do odkrycia leku na wiele zaburzeń układu nerwowego. W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół montażu kolumny CMAC z unieruchomionymi receptorami TrkB przy użyciu linii komórkowych nerwiaka zarodkowego z nadekspresją receptorów TrkB. Dalej przedstawiamy podejście do badania funkcjonalności kolumny i jej wykorzystania w identyfikacji wyspecjalizowanych metabolitów roślinnych oddziałujących z receptorami TrkB.

Zgodnie z protokołem przygotowano dwie kolumny chromatograficzne CMAC: jedną z unieruchomionymi fragmentami błony komórkowej neuroblastoma SH-SY5Y z nadekspresją TrkB oraz drugą z fragmentami błony komórkowej SH-SY5Y TrkB-NULL. Prawidłowo przygotowaną kolumnę CMAC przedstawiono na Rysunku 1, a etapy unieruchamiania fragmentów błony komórkowej przedstawiono na Rysunku 2.
Ponieważ wcześniej nie podejmowano prób unieruchomienia receptoró...

Protokół opisuje przygotowanie kolumn chromatografii powinowactwa błony komórkowej (CMAC) z unieruchomionymi fragmentami błony komórkowej zawierającymi funkcjonalne białka transbłonowego receptora B kinazy tropomiozyny. Wyjaśniono również zastosowanie kolumn CMAC w identyfikacji wyspecjalizowanych metabolitów roślinnych oddziałujących z tymi receptorami i obecnych w złożonych mieszaninach naturalnych.

Kolumny chromatograficzne powinowactwa błony komórkowej do identyfikacji wyspecjalizowanych metabolitów roślinnych oddziałujących z unieruchomionym receptorem kinazy tropomiozynowej B

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

Ta pionowa branża przedstawia ważne kroki w łączeniu kolumn chromatograficznych powinowactwa błony komórkowej z funkcjonalnymi receptorami transbłonowymi. Kolumny te mogą być wykorzystywane do identyfikacji małych cząsteczek obecnych w złożonych ekstraktach i oddziałujących z unieruchomionymi receptorami transbłonowymi. Kolumny chromatograficzne z powinowactwem błony komórkowej przyspieszają identyfikację związków biologicznie czynnych obecnych w złożonych mieszaninach.Zastosowanie kolumn chromatograficznych z powinowactwem błony komórkowej może być szczególnie interesujące dla osób zainteresowanych identyfikacją farmakologicznie aktywnych związków obecnych w złożonych matrycach naturalnych, takich jak ekstrakty roślinne, grzybowe lub bakteryjne. Na początek przygotuj 200-milimolowy roztwór podstawowy benzamidyny, rozpuszczając 120 benzamidyny w pięciu mililitrach ultraczystej wody dejonizowanej. Przygotować 10-milimolowy roztwór podstawowy PMSF, rozpuszczając 0,017 grama PMSF w 10 mililitrach etanolu w dygestorium.Przygotuj koktajl inhibitorów proteaz 100X, rozpuszczając dostępną na rynku mieszaninę inhibitorów proteazy w jednym mililitrze ultraczystej wody dejonizowanej. Dokładnie wymieszaj i podlej od 200 do 300 mikrolitrów koktajlu. Przygotować 100 milimolowy roztwór podstawowy ATP, rozpuszczając 55,114 miligramów hydratu soli disodowej ATP w jednym mililitrze zjonizowanej ultraczystej wody.Dokładnie wymieszać i podać 100 mikrolitrów mieszanki. Przygotować bufor, rozpuszczając 3,03 grama Tris-HCL, 2,9 grama chlorku sodu, 0,22 grama bezwodnego chlorku wapnia, 0,2 grama sześciowodnego chlorku magnezu i 0,19 grama chlorku potasu w 500 mililitrach ultraczystej wody dejonizowanej. Przygotować bufor homogenizacyjny, mieszając 17,3 mililitra buforu Tris z 0,3 mililitra roztworu podstawowego benzamidyny, 0,2 mililitra roztworu podstawowego PMSF, 0,2 mililitra koktajlu inhibitorów proteaz, 20 mikrolitrów roztworu podstawowego ATP, dwóch mililitrów glicerolu i 0,029 grama EDTA.Dostosuj pH do 7,4 za pomocą roztworu kwasu solnego. Odwiruj komórki zebrane w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut przy 400 x g, usuń supernatant i umyj pozostałą osadkę komórek 10 mililitrami 1X pH 7,4 lodowatego PBS. Odrzucić supernatant i dodać 20 mililitrów buforu homogenizacyjnego.Umieść stożkową rurkę na lodzie. Przenieś zawiesinę komórkową do 40-mililitrowego młynka do tkanek homogenizatora Dounce, homogenizuj zawiesinę ręcznie na lodzie, wykonując 40 ruchów tłuczkiem w górę iw dół. Przenieść homogenizowaną zawiesinę komórek do 50-mililitrowej stożkowej probówki, wyrzucić osad i przenieść supernatant do nowej stożkowej probówki.Zachowaj osad błony komórkowej i wyrzuć supernatant. Przygotować bufor do solubilizacji, mieszając 8,7 mililitra roztworu buforowego z 0,1 mililitra roztworu podstawowego PMSF, 0,15 mililitra roztworu podstawowego benzamidyny, 0,1 mililitra koktajlu inhibitorów proteaz, 10 mikrolitrów roztworu podstawowego ATP, jednym mililitrem glicerolu i 0,2 grama cholanu sodu. Przenieś bufor solubilizacyjny do stożkowej rurki z fragmentami błony komórkowej.I ponownie zawiesić pellet. Obracaj powstałą mieszaninę z prędkością 150 obr./min w czterech stopniach Celsjusza przez 18 godzin. Po 18 godzinach odwirować mieszaninę solubilizacyjną w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut w temperaturze 47, 900 x g.Dodaj 100 miligramów IAM. Komputer osobisty. DD2 do supernatantu i obracać powstałą mieszaninę zawiesiny z prędkością 150 obr./min w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Przygotuj bufor do dializy w czterech litrach ultraczystej wody dejonizowanej, dodając 24 gramy Tris-HCl, 23,4 grama chlorku sodu, 0,06 grama chlorku wapnia, 5,85 grama EDTA i 0,07 grama PMSF.Najpierw rozpuść PMSF w małej objętości etanolu, a następnie powoli dodawaj do zlewki z buforem. Wyciąć 10 centymetrów rurki do dializy z membraną celulozową, aby przygotować rurkę do dializy i przenieść zawiesinę zawierającą IAM. Komputer osobisty. Cząsteczki DD2 i fragmenty błony komórkowej do rurki dializowej.Zamknąć oba końce rurki dializacyjnej za pomocą zacisków do rurek dializacyjnych. Umieścić rurkę dializacyjną w buforze do dializy. Po 24 godzinach umieścić rurkę dializacyjną w świeżo przygotowanym buforze do dializy i kontynuować dializę przez kolejne 24 godziny.Przygotować 10-milimolowy bufor octanu amonu o pH 7,4, który zostanie użyty do przepłukania IAM. Komputer osobisty. Cząstki DD2 i eksperymenty z charakterystyką kolumnową przez rozpuszczenie 0,778 grama octanu amonu w jednym litrze ultraczystej wody dejonizowanej. Po 48 godzinach dializy należy wyjąć rurkę dializacyjną z buforu dializacyjnego i przenieść zawartość rurki dializacyjnej do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.Odrzucić sklarowany osad i trzykrotnie przemyć pozostały osad 10 mililitrami buforu octanu amonu. Po trzecim praniu ponownie zawiesić pozostały osad w jednym mililitrze buforu octanu amonu. Dokładnie wymieszać i użyć powstałej zawiesiny do wypełnienia szklanej kolumny o wymiarach 5 x 20, aby uzyskać kolumnę chromatograficzną CMAC.Aby upakować kolumnę, umieść dolny filtr uprzednio nasączony buforem octanu amonu w uchwycie filtra. Zamontuj uchwyt filtra w szklanej kolumnie i przykręć nasadkę kolumny, aby zabezpieczyć pozycję uchwytu. Umieść kolumnę pionowo w zacisku palcowym i zabezpiecz ją w stojaku laboratoryjnym.Umieścić zlewkę pod kolumną, powoli przenieść niewielką objętość gnojowicy do szklanej kolumny za pomocą pipetera jednokanałowego, przytrzymując końcówkę pipety przy ściance szklanej kolumny. Aby przyspieszyć proces pakowania, należy wyjąć bufor znad nieruchomego łoża za pomocą mikropipety między każdym etapem. Umieść filtr górny i przykręć adapter tak, aby nad fazą stacjonarną nie pozostał bufor.Zabezpiecz pozycję adaptera za pomocą blokady adaptera. Podłączyć kolumnę do wysokowydajnej pompy do chromatografii cieczowej i przepłukać kolumnę przez noc buforem octanu amonu, ustawić natężenie przepływu na 0,2 mililitra na minutę. W celu dłuższego przechowywania należy uruchomić kolumnę z 0,05% roztworem azydku sodu w buforze octanu amonu, zakładając fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice podczas pracy z azydkiem sodu i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza.komputer osobisty. Cząstki DD2 z unieruchomionymi fragmentami błony komórkowej nerwiaka zarodkowego TrkB i w obecności BDNF powodowały powstanie cząstek fluorescencyjnych. Nie zaobserwowano fluorescencji w cząstkach IAM zamkniętych w błonie komórkowej TrkB lub gdy nie zastosowano BDNF, jak w przypadku cząstek IAM otoczonych błoną komórkową TrkB. Pokazano funkcjonalny chromatogram powinowactwa czołowego kolumn CMAC o rosnących stężeniach 7, 8-DHF jednego milimola, 750 nanomolowców, 500 nanomolowców i 300 nanomolowców do unieruchomionych receptorów TrkB, który wykazał zależną od stężenia zmianę czasu retencji.Niefunkcjonalna kolumna CMAC wykazała brak zależnych od stężenia zmian w retencji ligandu markerowego. Kolumnę kontroli ujemnej CMAC przygotowano poprzez unieruchomienie fragmentów błony komórkowej, bez ekspresji docelowego białka, aby wykluczyć niespecyficzne interakcje. Dodatek 0,2% wodnego ekstraktu z Gotu kola spowodował znaczne zmniejszenie retencji 7,8-DHF, co wskazuje na obecność konkurujących ligandów dla miejsca wiązania agonisty.Brak redukcji retencji 7,8-DHF na ujemnej kolumnie zerowej CMAC TrkB dodatkowo potwierdził brak funkcjonalnych receptorów TrkB na tej kolumnie. Podejście oparte na chromatografii brakujących pików zidentyfikowało związek silnie zatrzymany na kolumnie TrkB, podczas gdy wcześnie eluował się na kolumnie zerowej TrkB, co wskazuje na specyficzną interakcję. Ważne jest, aby znać źródło receptorów dla szybkiej kolumny chromatografii powinowactwa błony komórkowej.Upewnij się, że zapoznałeś się z literaturą, aby prawidłowo zaprojektować do homogenizacji i solubilizacji. Przygotowana w tym protokole kolumna chromatograficzna powinowactwa błony komórkowej została wykorzystana do identyfikacji nowych potencjalnych trafień leków oraz do scharakteryzowania charakteru interakcji między unieruchomionym receptorem a jego naturalnymi ligandami.

cellular-membrane-affinity-chromatography-columns-to-identify

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Badanie oddziaływań białko-białko jest niezbędne do analizy funkcjonalności białek. W niniejszym materiale przedstawiamy test wiązania białko-białko in vitro, służący do badania interakcji między białkiem unieruchomionym w błonie a białkiem rozpuszczalnym. Test ten stanowi niezawodną metodę sprawdzania oddziaływań pomiędzy białkiem nierozpuszczalnym a białkiem w roztworze.

Analiza nakładkowa białek błonowych: protokół badania interakcji między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi in vitro

Tutaj opisujemy solidną metodę frakcjonowania błon plazmatycznych roślin na membrany odporne na detergenty i rozpuszczalne w detergentach, oparte na mieszaninie nieznakowanych i in vivo w pełni znakowanych 15N kultur komórkowych Arabidopsis thaliana. Procedura jest stosowana do porównawczych badań proteomicznych w celu zrozumienia procesów sygnalizacyjnych.

Znakowanie metaboliczne i frakcjonowanie błonowe do porównawczej analizy proteomicznej hodowli zawiesinowych komórek Arabidopsis thaliana

Opisano metody cienkowarstwowej chromatografii (TLC) separacji ekstraktów roślinnych i kontaktowej bioautografii w celu identyfikacji metabolitów przeciwbakteryjnych. Metody te stosuje się do badań przesiewowych związków fenolowych koniczyny czerwonej hamujących bakterie wytwarzające hiperamoniak (HAB) pochodzące ze żwacza bydła.

Separacje metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i testy biologiczne ekstraktów roślinnych w celu identyfikacji związków przeciwdrobnoustrojowych

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Prezentujemy tutaj sprawdzony i przetestowany protokół oczyszczania kompleksów importujących białka chloroplastowe (kompleks TOC-TIC) za pomocą znacznika TAP. Jednoetapowy protokół izolacji powinowactwa może być potencjalnie zastosowany do dowolnego białka i może być wykorzystany do identyfikacji nowych partnerów interakcji za pomocą spektrometrii mas.

Oczyszczanie powinowactwa kompleksów białkowych chloroplastów translokonu za pomocą znacznika TAP

W tej procedurze, ligand epitopowy oparty na DsRed jest unieruchamiany w celu wytworzenia wysoce selektywnej żywicy o powinowactwie do wychwytywania przeciwciał monoklonalnych z surowych ekstraktów roślinnych lub supernatantów do hodowli komórkowych, jako alternatywa dla białka A.

Aktywowana usieciowana agaroza do szybkiego rozwoju żywic chromatograficznych o powinowactwie - wychwytywanie przeciwciał jako studium przypadku

Opisana tutaj jest metoda etykietowania zbliżeniowego do identyfikacji partnerów interakcji domeny TIR receptora immunologicznego NLR w tkance liścia Nicotiana benthamiana. Podano również szczegółowy protokół identyfikacji interakcji między innymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania przy użyciu tej techniki u Nicotiana i innych gatunków roślin.

Znakowanie zbliżeniowe oparte na TurboID do identyfikacji sieci interakcji białko-białko in planta

Kilka powszechnie stosowanych metod jest tutaj wprowadzanych do badania zdarzeń transportu błonowego kinazy receptora błony komórkowej. Manuskrypt ten opisuje szczegółowe protokoły, w tym przygotowanie materiału roślinnego, leczenie farmakologiczne i konfokalną.

Oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej

Prezentujemy metodę szybkiej spektrometrii mas (MS)/spektrometrii mas (MS) opartej na adnotacji i klasyfikacji alkaloidów tropanowych, przydatną zarówno do wstępnej dereplikacji próbek zawierających tropan jak i odkrywania nowych alkaloidów do izolacji.

Zastosowania tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej w badaniach nad produktami naturalnymi: alkaloidy tropanowe jako studium przypadku

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Poznaj technikę chromatografii powinowactwa błon komórkowych do identyfikacji metabolitów roślinnych oddziałujących z receptorami kinazy tropomiozynowej B. Ta metoda przyspiesza odkrywanie nowych związków farmakologicznie aktywnych.

Kolumny chromatograficzne powinowactwa błony komórkowej do identyfikacji wyspecjalizowanych metabolitów roślinnych oddziałujących z unieruchomionym receptorem kinazy tropomiozynowej B (Wideo) | JoVE Journal

Kolumny chromatograficzne powinowactwa błony komórkowej do identyfikacji wyspecjalizowanych metabolitów roślinnych oddziałujących z unieruchomionym receptorem kinazy tropomiozynowej B

Przeglądaj więcej filmów