Name: Izolacja pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty specyficznych dla pacjenta i półilościowe pomiary skurczu w czasie rzeczywistym in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Poznaj metodę izolacji pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty z wykorzystaniem techniki eksplantowej i pomiaru skurczu w czasie rzeczywistym. Umożliwia badanie różnic między pacjentami z tętniakami aorty.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy serdecznie podziękować Tarze van Merrienboer, Albertowi van Wijk, Jolandzie van der Velden, Janowi D. Blankensteijnowi, Lan Tranowi, Peterowi L. Hordijkowi, zespołowi PAREL-AAA oraz wszystkim chirurgom naczyniowym z UMC w Amsterdamie, Zaans Medisch Centrum i szpitalowi Dijklander za dostarczenie materiałów i wsparcie dla tego badania. To badanie jest finansowane przez Holenderską Fundację Serca, Dekkerbeurs senior clinical scientist, nr projektu 2019T065.

<ol><li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections%3A+focus+on+smooth+muscle+cell+contractile+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).</li>
<li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+smooth+muscle+cell+force+generation+as+a+driver+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).</li>
<li>Groeneveld, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaglycan+%28TGFBR3%29+up-regulation+correlates+with+increased+TGF-%CE%B2+signaling+in+Marfan+patient+fibroblasts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-β signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro.</a> Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).</li>
<li>Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-smooth+muscle+actin+expression+enhances+cell+traction+force%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).</li>
<li>Peyton, S. R., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+governs+smooth+muscle+cell+motility+in+a+biphasic+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion.</a> Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).</li>
<li>Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+gradients+in+single+smooth+muscle+cells+revealed+by+the+digital+imaging+microscope+using+Fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2.</a> Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).</li>
<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+%28nucleotide+oligomerization+domain-like+receptor+family%2C+pyrin+domain+containing+3%29-caspase-1+inflammasome+degrades+contractile+proteins%3A+implications+for+aortic+biomechanical+dysfunction+and+aneurysm+and+dissection+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).</li>
<li>Bogunovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+smooth+muscle+cell+contractility+as+a+novel+concept+of+abdominal+aortic+aneurysm+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).</li>
<li>Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearrangement+of+adherens+junctions+by+transforming+growth+factor-%CE%B21%3A+role+of+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-β1: role of contraction.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).</li>
<li>Hu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+ECIS+and+LAPS+for+establishing+a+cardiomyocyte-based+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).</li>
<li>Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+cellular+impedance+assays%3A+bringing+cardiotoxicity+screening+to+the+front+line%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line.</a> Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).</li>
<li>Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-stimulated+cyclic+guanosine+monophosphate+inhibits+vascular+smooth+muscle+cell+migration+by+inhibiting+Ca%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II.</a> Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).</li>
<li>Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+factor+of+activated+T+cells+5+regulates+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).</li>
<li>Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombomodulin+induces+a+quiescent+phenotype+and+inhibits+migration+in+vascular+smooth+muscle+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro.</a> Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).</li>
<li>Burger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+and+functional+assessment+of+smooth+muscle+like-cells+with+pathogenic+variants+in+aneurysm+genes+ACTA2%2C+MYH11%2C+SMAD3+and+FBN1%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1.</a> Human Molecular Genetics. , (2021).</li>
<li>Yeung, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdifferentiation+of+human+dermal+fibroblasts+to+smooth+muscle-like+cells+to+study+the+effect+of+MYH11+and+ACTA2+mutations+in+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms.</a> Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

W pracy przedstawiono metodę pomiaru skurczu SMC in vitro, w oparciu o zmiany impedancji i zajętości powierzchni. Po pierwsze, opisano izolację, hodowlę i ekspansję specyficznych dla pacjenta pierwotnych ludzkich SMC i fibroblastów skóry, a następnie sposób ich wykorzystania do pomiarów skurczu. 
Ograniczenie badania jest związane z pozyskiwaniem komórek za pomocą protokołu eksplantacji. Komórki, które namnażają się w wyniku biopsji, mogą mieć inne właściwości niż oryginalna tkanka <e...

Komórki mięśni gładkich (SMC) są dominującym typem komórek w przyśrodkowej warstwie aorty, najgrubszej warstwie aorty. W obrębie ściany są one zorientowane promieniowo i biorą udział między innymi w zwężeniu naczyń krwionośnych i rozszerzeniu naczyń krwionośnych1. Maszyneria kurczliwa SMC bierze udział w przenoszeniu siły w aorcie poprzez funkcjonalne połączenie z macierzą zewnątrzkomórkową2. Mutacje w genach kodujących białka aparatu skurczowego SMC, takie jak łańcuch ciężki miozyny mięśni gładkich (MYH11) i aktyna mięśni gładkich (ACTA2), zostały powiązane z przypadkami rodzinnych tętniaków aorty piersiowej, podkreślając znaczenie skurczu SMC w utrzymaniu strukturalnej i funkcjonalnej integralności aorty1,2. Co więcej, mutacje w szlaku sygnałowym TGFβ są również związane z tętniakami aorty, a ich wpływ na patofizjologię tętniaka aorty można również badać w fibroblastach skóry3.
Wysokoprzepustowy pomiar skurczu SMC in vitro jest wyzwaniem. Ponieważ kurczliwości SMC nie można zmierzyć in vivo u ludzi, testy in vitro na komórkach ludzkich stanowią realną alternatywę. Co więcej, rozwój tętniaka aorty brzusznej (AAA) w modelach zwierzęcych jest albo indukowany chemicznie, na przykład przez perfuzję elastazy, albo spowodowany określoną mutacją. W związku z tym dane na zwierzętach nie są porównywalne z rozwojem AAA u ludzi, który w większości przypadków ma przyczynę wieloczynnikową, taką jak palenie tytoniu, wiek i/lub miażdżyca. Metody in vitro Kurczliwość SMC była do tej pory mierzona głównie za pomocą mikroskopii siły pociągowej4,5, oznaczanie ilościowe wewnątrzkomórkowych strumieni wapnia fluorescencji Fura-26 oraz testy marszczenia kolagenu7. Chociaż mikroskopia sił trakcyjnych dostarcza nieocenionych danych numerycznych na temat sił generowanych przez pojedynczą komórkę, nie nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych ze względu na złożone przetwarzanie danych matematycznych i analizę jednej komórki na raz, co oznacza, że pomiar reprezentatywnej liczby komórek na dawcę jest bardzo czasochłonny. Testy barwienia barwnika Fura-2 i kolagenu pozwalają na powierzchowne określenie skurczu i nie dają precyzyjnych danych liczbowych, co czyni je mniej odpowiednimi do rozróżniania różnic specyficznych dla pacjenta. Upośledzony skurcz SMC w komórkach pochodzących z aorty pacjentów z tętniakiem aorty brzusznej wykazano po raz pierwszy poprzez optymalizację nowatorskiej metody pomiaru skurczu SMC in vitro8. Dokonano tego poprzez zmianę przeznaczenia metody wykrywania impedancji podłoża elektrycznego (ECIS). ECIS to średnioprzepustowy test w czasie rzeczywistym do ilościowego określania zachowania i kurczenia się przylegających komórek9,10,11 takich jak wzrost i zachowanie SMC w testach gojenia się ran i migracji12,13,14. Dokładna metoda jest opisana w sekcji protokołu. W ten zoptymalizowany sposób ECIS może być również wykorzystywany do badania skurczu fibroblastów ze względu na ich podobny rozmiar i morfologię.
Celem tego artykułu jest przedstawienie szczegółowego opisu metody pomiaru skurczu SMC in vitro za pomocą ECIS8 i porównania skurczu między kontrolnymi i pacjentskimi SMC. Po pierwsze, wyjaśniono izolację i hodowlę pierwotnych SMC z kontrolnych i biopsji aorty pacjenta, które można wykorzystać do pomiaru skurczu. Po drugie, opisano pomiary i analizę skurczu, wraz z weryfikacją ekspresji markera SMC. Ponadto w artykule opisano metodę izolacji specyficznych dla pacjenta fibroblastów skóry, których skurcz można zmierzyć przy użyciu tej samej metodologii. Komórki te mogą być wykorzystywane w badaniach specyficznych dla pacjenta skoncentrowanych na tętniaku aorty lub innych patologiach sercowo-naczyniowych15 lub badaniach prognostycznych wykorzystujących protokół transdyferencjacji, który umożliwia pomiar skurczu przed operacją tętniaka16.

<table><tbody><tr><td>96-dołkowa tablica</td><td>Biofizyka stosowana</td><td>96W10idf PET</td><td>Tablica używana do pomiaru skurczu w konfiguracji ECIS</td></tr><tr><td>Custodiol</td><td>Dr. Franz H&ouml; hler Chemie GmbH</td><td>RVG 12801</td><td>Roztwór stosowany do przenoszenia tkanek z sali operacyjnej do laboratorium</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>Roztwór stosowany do rozcieńczania jonomycyny</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>26140079</td><td>Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Mieszanka składników odżywczych F-10 dla szynki</td><td>Gibco</td><td>11550043</td><td>Pożywka stosowana do hodowli fibroblastów skóry</td></tr><tr><td>Ludzkie komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych Podłoże podstawowe (dawniej ''Medium 231'')</td><td>Gibco</td><td>M231500</td><td>Pożywka używana do hodowli komórek mięśni gładkich</td></tr><tr><td>Invitrogen hrabina II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>Automatyczny licznik komórek</td></tr><tr><td>Sól wapniowa jonomycyny ze Streptomyces conglobatus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634-1MG</td><td>Związek stosowany do stymulacji skurczu</td></tr><tr><td>NaCl 0,9% </td><td>Fresenius Kabi</td><td>B230561</td><td>Roztwór używany do przenoszenia tkanek z sali operacyjnej do laboratorium</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Antybiotyki stosowane w pożywce do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Fospathe buforowana sól fizjologiczna</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Służy do mycia komórek</td></tr><tr><td>Quick-RNA Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1055</td><td>Zestaw używany do izolacji</td></tr> <tr><td>RNASuplement na wzrost mięśni gładkich (SMGS)</td><td>Gibco</td><td>S00725</td><td>Suplement dodawany do pożywki do hodowli komórek mięśni gładkich</td></tr><tr><td>SuperScript VILO Zestaw do syntezy cDNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11754250</td><td>Kit używany do syntezy cDNA</td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4309155</td><td>Odczynnik do qPCR</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>Służy do trypsynizacji komórki</td></tr><tr><td>ZTheta</td><td>Biofizyka stosowana</td><td>ZTheta</td><td>ECIS instrument służący do pomiarów skurczu</td></tr></tbody></table>

izolacja pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty specyficznych dla pacjenta i półilościowe pomiary skurczu w czasie rzeczywistym in vitro

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Komórki mięśni gładkich (SMC) są dominującym typem komórek w aortach. Ich mechanizm skurczowy jest ważny dla przenoszenia siły w aorcie i reguluje zwężenie i rozszerzenie naczyń krwionośnych. Mutacje w genach kodujących białka aparatu skurczowego SMC są związane z chorobami aorty, takimi jak tętniaki aorty piersiowej. Pomiar skurczu SMC in vitro jest wyzwaniem, zwłaszcza w sposób wysokoprzepustowy, który jest niezbędny do badań przesiewowych materiału pacjenta. Obecnie dostępne metody nie są odpowiednie do tego celu. W artykule przedstawiono nowatorską metodę opartą na wykrywaniu impedancji ogniwa elektrycznego i podłoża (ECIS). Po pierwsze, opisano protokół eksplantacji w celu wyizolowania specyficznych dla pacjenta ludzkich pierwotnych SMC z biopsji aorty i specyficznych dla pacjenta ludzkich pierwotnych fibroblastów skóry do badania tętniaków aorty. Następnie podano szczegółowy opis nowej metody skurczu w celu zmierzenia odpowiedzi skurczowej tych komórek, w tym późniejszą analizę i sugestię porównania różnych grup. Metoda ta może być stosowana do badania skurczu przylegających komórek w kontekście badań translacyjnych (sercowo-naczyniowych) oraz badań przesiewowych pacjentów i leków.

Aby przetestować powtarzalność tej metody, w pierwszej kolejności przeprowadzono jej walidację z wykorzystaniem wyłącznie kontrolnych SMC. W celu określenia powtarzalności pomiarów między doświadczeniami, dwa niezależne pomiary wszystkich uwzględnionych linii komórkowych kontrolnych i pacjentów przedstawiono na wykresie Blanda-Altmana (Rycina 3B). Wykres wykazał, że metoda ta nie wykazuje zmienności poza przedziałem ufności, z wyjątkiem jednej linii komórkowej będącej wartością odstającą. Po...

Ten artykuł opisuje metodę opartą na hodowli eksplantatów do izolacji i hodowli pierwotnych, specyficznych dla pacjenta ludzkich komórek mięśni gładkich aorty i fibroblastów skóry. Ponadto przedstawiono nowatorską metodę pomiaru skurczu komórek i późniejszej analizy, która może być wykorzystana do badania specyficznych dla pacjenta różnic w tych komórkach.

Izolacja pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty specyficznych dla pacjenta i półilościowe pomiary skurczu w czasie rzeczywistym in vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...

Metoda ta pozwala naukowcom badać kurczenie się komórek wielu linii komórkowych pacjenta jednocześnie. Dzięki temu możemy badać choroby szybciej i skuteczniej. Ta technika pozwala nam określić ilościowo skurcz komórek w czasie rzeczywistym.W ciągu godziny możemy uzyskać wartości skurczu kilkudziesięciu komórek. Po raz pierwszy wykazaliśmy, że skurcz komórek mięśniowych jest zmniejszony w grupie pacjentów z tętniakami aorty. Może to być nowy biomarker lub cel terapii medycznej.Zacznij od wysterylizowania dwóch par kleszczy chirurgicznych i skalpela, zanurzając je w 70% etanolu, a następnie wycierając do sucha. Następnie odpipetować dwa mililitry pożywki SMC na szalce Petriego, na której zostanie przeprowadzona sekcja tkanek. Następnie odpipetować 2,5 mililitra pożywki SMC do dwóch kolb T-25.Obracać kolby tak, aby mała objętość podłoża pokryła całą powierzchnię. Sprawdź wzrokowo biopsję, identyfikując trzy warstwy aorty na podstawie obecności blaszek miażdżycowych po stronie wewnętrznej i śluzowatej tkanki łącznej po stronie przybyszowej, aby odróżnić warstwy. Aby wyizolować SMC z pożywki, usuń pozostałe dwie warstwy, umieszczając najpierw tkankę z płytką wewnętrzną do góry, a następnie usuń stałą płytkę nazębną, odciągając ją od tkanki za pomocą kleszczy, jednocześnie dociskając tkankę w dół drugą parą kleszczy, aż do wyświetlenia różowej jednolitej warstwy przyśrodkowej.Teraz odwróć tkankę i powtórz tę samą procedurę, ściągając warstwę przybyszową, upewniając się, że usunąłeś wszystkie widoczne części w tylu próbach, ile potrzeba, ponieważ ta warstwa nie oderwie się łatwo od podłoża. Po wyizolowaniu warstwy podłoża pokrój tkankę w kostkę, dociskając podłoże kleszczami i przecinając tkankę w jednym kierunku za pomocą skalpela, wykonując czyste jednokierunkowe cięcia, aby zminimalizować uszkodzenia. Umieść od 10 do 20 kawałków tej tkanki w górnej ćwiartce flaka T-25 za pomocą kleszczy.Po wysterylizowaniu dwóch par kleszczy chirurgicznych i skalpela, jak opisano wcześniej, odpipetuj dwa mililitry pożywki fibroblastowej na szalce Petriego, na której zostanie przeprowadzona sekcja tkanki. Następnie odpipetować 2,5 mililitra pożywki z fibroblastami do dwóch kolb T-25 i obracać kolbami tak, aby mała objętość pożywki pokryła całą powierzchnię. Sprawdź wzrokowo biopsję w celu zidentyfikowania naskórka z rozpoznawalną powierzchnią skóry, czasami z widocznymi włosami, a następnie poszukaj żółtego i śluzowatego tłuszczu podskórnego po przeciwnej stronie.Warstwa między naskórkiem a podskórną tkanką tłuszczową to skóra właściwa, źródło żywotnych fibroblastów. Aby wyizolować fibroblasty ze skóry właściwej, usuń pozostałe dwie warstwy, umieszczając tkankę po stronie skóry właściwej, aby wszystkie trzy warstwy były widoczne. Następnie przytrzymaj tkankę kleszczami i odetnij cały naskórek w jednej czystej linii, nie uszkadzając tkanki.Teraz odwróć tkankę i powtórz tę samą procedurę, przecinając skórę właściwą równolegle do granicy z podskórnym tłuszczem. Po wyizolowaniu skóry właściwej pokrój tkankę w kostkę, dociskając tkankę kleszczami i przecinając tkankę w jednym kierunku za pomocą skalpela. Następnie umieść od 10 do 20 tych kawałków tkanki w górnej ćwiartce kolby T-25 za pomocą kleszczy.Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i zasiej SMC w trzech egzemplarzach przy gęstości wysiewu 30 000 komórek na studzienkę w 200 mikrolitrach pożywki SMC na pokrytej żelatyną płytce ECIS. Umieścić płytkę z SMC w 96-dołkowym uchwycie ECIS w inkubatorze do hodowli komórkowych. Kliknij dwukrotnie oprogramowanie ECIS Applied BioPhysics, aby otworzyć program i naciśnij przycisk Setup.Sprawdź, czy wszystkie elektrody stykają się z uchwytem w lewym dolnym panelu oznaczonym Konfiguracją studni. Jeśli elektrody nie są prawidłowo podłączone, wyreguluj płytkę w uchwycie przed rozpoczęciem pomiaru. Teraz wybierz typ blachy w tym samym panelu, klikając Typ szyku.Następnie przygotuj dwie pipety o objętości dwóch mikrolitrów i 150 mikrolitrów. Przed rozpoczęciem stymulacji naciśnij Zaznacz w oprogramowaniu i umieść komentarz. Aby pobudzić komórki, zdejmij pokrywę i umieść ją na sterylnej powierzchni wewnątrz inkubatora.Następnie wywołać skurcz SMC, pipetując dwa mikrolitry roztworu roboczego jonomycyny do każdego dołka tak szybko, jak to możliwe. Po stymulacji wszystkich komórek wymieszać pożywkę w studzienkach za pomocą drugiej pipety. Aby określić odtwarzalność pomiarów międzyeksperymentalnych, dwa niezależne pomiary wszystkich uwzględnionych linii komórkowych kontrolnych i pacjentów zostały wykreślone jako wykres Blanda-Altmana, wykazując, że metoda ta nie wykazała zmienności poza przedziałem ufności, z wyjątkiem jednej odstającej linii komórkowej.Dwa dołki wysiane tym samym eksperymentem i stymulowane jednocześnie wykazywały praktycznie tę samą umowną krzywą odpowiedzi. W celu sprawdzenia, czy pokazana odpowiedź była skurczem, a nie stresem osmotycznym spowodowanym stymulacją jonomycyną, pożywkę wymieniono po stymulacji i zarejestrowano zachowanie komórek, co wykazało, że stymulowane komórki zaczęły ponownie rozprzestrzeniać się po elektrodzie. Odpowiedź skurczowa w SMC pochodząca ze zdrowych, nieposzerzonych aort wykazała medianę odpowiedzi 61% w porównaniu z medianą odpowiedzi 52% u pacjentów z tętniakiem aorty brzusznej.Średnia odpowiedź skurczowa grupy kontrolnej została wykorzystana do zidentyfikowania czterech pacjentów, którzy mieli niższe wartości skurczu niż normalne wartości. Analiza Western blot i późniejsza kwantyfikacja potwierdziły, że komórki wyrażają markery SMC. W celu określenia zdolności proliferacyjnej SMC przeprowadzono qPCR dla Ki67.Ekspresja Ki67 była wykrywalna we wszystkich komórkach, ale nie korelowała z wyjściem skurczowym. Stymulując komórki do skurczu, pamiętaj, aby nie pipetować zbyt wielu studzienek w tym samym czasie i staraj się pipetować tak szybko, jak to możliwe. Ta procedura może wymagać trochę praktyki.Korzystając z tej metody, podzieliliśmy pacjentów na podstawie ich skurczu i niższego normalnego skurczu, co pozwoliło nam zbadać tych pacjentów i powiązania z ich cechami klinicznymi, takimi jak palenie tytoniu.

isolation-primary-patient-specific-aortic-smooth-muscle-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje pomiar skurczu komórek mięśni gładkich aorty (SMC) za pomocą wykrywania impedancji elektrycznej komórki-substratu (ECIS). ECIS mierzy lokomocję komórek i jest wiarygodną metodą pomiaru skurczów.

Pomiar skurczu SMC in vitro: nieinwazyjna metoda oceny skurczu komórek mięśni gładkich za pomocą wykrywania impedancji elektrycznego podłoża ogniwa

Opracowaliśmy nowatorską i powtarzalną technikę izolowania pierwotnych kultur komórek mięśni gładkich tętnicy płucnej (PASMC) od myszy w wieku P7, umożliwiając tym samym lepsze badanie szlaków sygnałowych zaangażowanych w skurcz i rozluźnienie komórek mięśni gładkich noworodków.

Izolacja komórek mięśni gładkich tętnicy płucnej od nowonarodzonych myszy

Patologia aorty może prowadzić do ciężkiej zachorowalności i śmiertelności, dlatego uzasadnione są badania nad progresją choroby i potencjalnymi terapiami. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji i wycięcia mysiej aorty, aby pomóc naukowcom w badaniu chorób sercowo-naczyniowych.

izolacja i wycięcie aorty mysiej; Wszechstronna technika w badaniu chorób sercowo-naczyniowych

Komórki śródbłonka naczyniowego odgrywają znaczącą rolę w wielu ważnych zaburzeniach sercowo-naczyniowych. W tym artykule opisano prostą metodę izolowania i rozszerzania komórek śródbłonka z aorty myszy bez użycia specjalnego sprzętu. Nasz protokół zapewnia skuteczny sposób identyfikacji mechanizmów w fizjopatologii komórek śródbłonka.

Izolacja i pierwotna hodowla komórek śródbłonka aorty myszy

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie technik izolacji i hodowli mysich pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) z krążenia wieńcowego. Po wyizolowaniu VSMC można je stosować w wielu standardowych technikach hodowli.

Izolacja mysich komórek mięśni gładkich naczyń wieńcowych

Protokoły badania embrionalnej i okołoporodowej mysiej aorty za pomocą analizy klonalnej in vivo i mapowania losu, eksplantatów aorty i izolowanych komórek mięśni gładkich są szczegółowo opisane tutaj. Te różnorodne podejścia ułatwiają badanie morfogenezy aorty zarodkowej i okołoporodowej w prawidłowym rozwoju oraz patogenezy choroby.

Wykorzystanie metod in vivo oraz eksplantatów tkanek i komórek do badania morfogenezy i patogenezy aorty embrionalnej i okołoporodowej

Mikronaczyniowe komórki śródbłonka mięśni szkieletowych (MMEC) kształtują wewnętrzną ścianę naczyń włosowatych mięśni i regulują zarówno wymianę płynów/molekuł, jak i migrację komórek (immunologicznych) między tkanką mięśniową a krwią. Opisana tutaj izolacja pierwotnego mysiego MMEC umożliwia kompleksowe badania in vitro "jednostki mięśniowo-naczyniowej".

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mięśni szkieletowych

Ten protokół ma na celu opisanie krok po kroku techniki ekstrakcji i oceny funkcji serca za pomocą kardiomiocytów ze skóry. Metodologia ta umożliwia pomiar i ostrą modulację funkcji miofilamentów za pomocą małych zamrożonych biopsji, które można pobrać z różnych lokalizacji serca, od myszy po mężczyzn.

Ocena in vitro czynności serca przy użyciu kardiomiocytów ze skórą

Ten protokół opisuje zbieranie ludzkich zastawek aortalnych pobranych podczas zabiegów chirurgicznej wymiany zastawki aortalnej lub z tkanki zwłok, a następnie izolację, rozszerzanie i charakterystykę specyficznych dla pacjenta komórek śródbłonka i śródmiąższu pierwotnej zastawki. Uwzględniono ważne szczegóły dotyczące procesów potrzebnych do zapewnienia żywotności komórek i swoistości fenotypu.

Izolacja ludzkich pierwotnych komórek zastawki do modelowania chorób in vitro

Obecny protokół opisuje ostrą izolację żywotnych komórek mięśni gładkich serca i naczyń krwionośnych od dorosłego, młodocianego, larwalnego i embrionalnego danio pręgowanego (Danio rerio), nadającego się do badań elektrofizjologicznych.

Izolacja komórek mięśni gładkich serca i naczyń krwionośnych od dorosłych, młodocianych, larwalnych i embrionalnych danio pręgowanego do badań elektrofizjologicznych

Tutaj opracowaliśmy model ludzkiego narządu na chipie komórek mięśni gładkich aorty, aby odtworzyć in vivo biomechaniczne napięcie komórek mięśni gładkich w ludzkiej ścianie aorty.

Budowa modelu narządów na chipie komórek mięśni gładkich ludzkiej aorty do rekapitulacji naprężeń biomechanicznych w ścianie aorty

Poznaj metodę izolacji pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty z wykorzystaniem techniki eksplantowej i pomiaru skurczu w czasie rzeczywistym. Umożliwia badanie różnic między pacjentami z tętniakami aorty.

Izolacja pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty specyficznych dla pacjenta i półilościowe pomiary skurczu w czasie rzeczywistym in vitro (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty specyficznych dla pacjenta i półilościowe pomiary skurczu w czasie rzeczywistym in vitro

Przeglądaj więcej filmów