Izolacja pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty specyficznych dla pacjenta i półilościowe pomiary skurczu w czasie rzeczywistym in vitro

Metoda ta pozwala naukowcom badać kurczenie się komórek wielu linii komórkowych pacjenta jednocześnie. Dzięki temu możemy badać choroby szybciej i skuteczniej. Ta technika pozwala nam określić ilościowo skurcz komórek w czasie rzeczywistym.

W ciągu godziny możemy uzyskać wartości skurczu kilkudziesięciu komórek. Po raz pierwszy wykazaliśmy, że skurcz komórek mięśniowych jest zmniejszony w grupie pacjentów z tętniakami aorty. Może to być nowy biomarker lub cel terapii medycznej.

Zacznij od wysterylizowania dwóch par kleszczy chirurgicznych i skalpela, zanurzając je w 70% etanolu, a następnie wycierając do sucha. Następnie odpipetować dwa mililitry pożywki SMC na szalce Petriego, na której zostanie przeprowadzona sekcja tkanek. Następnie odpipetować 2,5 mililitra pożywki SMC do dwóch kolb T-25.

Obracać kolby tak, aby mała objętość podłoża pokryła całą powierzchnię. Sprawdź wzrokowo biopsję, identyfikując trzy warstwy aorty na podstawie obecności blaszek miażdżycowych po stronie wewnętrznej i śluzowatej tkanki łącznej po stronie przybyszowej, aby odróżnić warstwy. Aby wyizolować SMC z pożywki, usuń pozostałe dwie warstwy, umieszczając najpierw tkankę z płytką wewnętrzną do góry, a następnie usuń stałą płytkę nazębną, odciągając ją od tkanki za pomocą kleszczy, jednocześnie dociskając tkankę w dół drugą parą kleszczy, aż do wyświetlenia różowej jednolitej warstwy przyśrodkowej.

Teraz odwróć tkankę i powtórz tę samą procedurę, ściągając warstwę przybyszową, upewniając się, że usunąłeś wszystkie widoczne części w tylu próbach, ile potrzeba, ponieważ ta warstwa nie oderwie się łatwo od podłoża. Po wyizolowaniu warstwy podłoża pokrój tkankę w kostkę, dociskając podłoże kleszczami i przecinając tkankę w jednym kierunku za pomocą skalpela, wykonując czyste jednokierunkowe cięcia, aby zminimalizować uszkodzenia. Umieść od 10 do 20 kawałków tej tkanki w górnej ćwiartce flaka T-25 za pomocą kleszczy.

Po wysterylizowaniu dwóch par kleszczy chirurgicznych i skalpela, jak opisano wcześniej, odpipetuj dwa mililitry pożywki fibroblastowej na szalce Petriego, na której zostanie przeprowadzona sekcja tkanki. Następnie odpipetować 2,5 mililitra pożywki z fibroblastami do dwóch kolb T-25 i obracać kolbami tak, aby mała objętość pożywki pokryła całą powierzchnię. Sprawdź wzrokowo biopsję w celu zidentyfikowania naskórka z rozpoznawalną powierzchnią skóry, czasami z widocznymi włosami, a następnie poszukaj żółtego i śluzowatego tłuszczu podskórnego po przeciwnej stronie.

Warstwa między naskórkiem a podskórną tkanką tłuszczową to skóra właściwa, źródło żywotnych fibroblastów. Aby wyizolować fibroblasty ze skóry właściwej, usuń pozostałe dwie warstwy, umieszczając tkankę po stronie skóry właściwej, aby wszystkie trzy warstwy były widoczne. Następnie przytrzymaj tkankę kleszczami i odetnij cały naskórek w jednej czystej linii, nie uszkadzając tkanki.

Teraz odwróć tkankę i powtórz tę samą procedurę, przecinając skórę właściwą równolegle do granicy z podskórnym tłuszczem. Po wyizolowaniu skóry właściwej pokrój tkankę w kostkę, dociskając tkankę kleszczami i przecinając tkankę w jednym kierunku za pomocą skalpela. Następnie umieść od 10 do 20 tych kawałków tkanki w górnej ćwiartce kolby T-25 za pomocą kleszczy.

Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i zasiej SMC w trzech egzemplarzach przy gęstości wysiewu 30 000 komórek na studzienkę w 200 mikrolitrach pożywki SMC na pokrytej żelatyną płytce ECIS. Umieścić płytkę z SMC w 96-dołkowym uchwycie ECIS w inkubatorze do hodowli komórkowych. Kliknij dwukrotnie oprogramowanie ECIS Applied BioPhysics, aby otworzyć program i naciśnij przycisk Setup.

Sprawdź, czy wszystkie elektrody stykają się z uchwytem w lewym dolnym panelu oznaczonym Konfiguracją studni. Jeśli elektrody nie są prawidłowo podłączone, wyreguluj płytkę w uchwycie przed rozpoczęciem pomiaru. Teraz wybierz typ blachy w tym samym panelu, klikając Typ szyku.

Następnie przygotuj dwie pipety o objętości dwóch mikrolitrów i 150 mikrolitrów. Przed rozpoczęciem stymulacji naciśnij Zaznacz w oprogramowaniu i umieść komentarz. Aby pobudzić komórki, zdejmij pokrywę i umieść ją na sterylnej powierzchni wewnątrz inkubatora.

Następnie wywołać skurcz SMC, pipetując dwa mikrolitry roztworu roboczego jonomycyny do każdego dołka tak szybko, jak to możliwe. Po stymulacji wszystkich komórek wymieszać pożywkę w studzienkach za pomocą drugiej pipety. Aby określić odtwarzalność pomiarów międzyeksperymentalnych, dwa niezależne pomiary wszystkich uwzględnionych linii komórkowych kontrolnych i pacjentów zostały wykreślone jako wykres Blanda-Altmana, wykazując, że metoda ta nie wykazała zmienności poza przedziałem ufności, z wyjątkiem jednej odstającej linii komórkowej.

Dwa dołki wysiane tym samym eksperymentem i stymulowane jednocześnie wykazywały praktycznie tę samą umowną krzywą odpowiedzi. W celu sprawdzenia, czy pokazana odpowiedź była skurczem, a nie stresem osmotycznym spowodowanym stymulacją jonomycyną, pożywkę wymieniono po stymulacji i zarejestrowano zachowanie komórek, co wykazało, że stymulowane komórki zaczęły ponownie rozprzestrzeniać się po elektrodzie. Odpowiedź skurczowa w SMC pochodząca ze zdrowych, nieposzerzonych aort wykazała medianę odpowiedzi 61% w porównaniu z medianą odpowiedzi 52% u pacjentów z tętniakiem aorty brzusznej.

Średnia odpowiedź skurczowa grupy kontrolnej została wykorzystana do zidentyfikowania czterech pacjentów, którzy mieli niższe wartości skurczu niż normalne wartości. Analiza Western blot i późniejsza kwantyfikacja potwierdziły, że komórki wyrażają markery SMC. W celu określenia zdolności proliferacyjnej SMC przeprowadzono qPCR dla Ki67.

Ekspresja Ki67 była wykrywalna we wszystkich komórkach, ale nie korelowała z wyjściem skurczowym. Stymulując komórki do skurczu, pamiętaj, aby nie pipetować zbyt wielu studzienek w tym samym czasie i staraj się pipetować tak szybko, jak to możliwe. Ta procedura może wymagać trochę praktyki.

Korzystając z tej metody, podzieliliśmy pacjentów na podstawie ich skurczu i niższego normalnego skurczu, co pozwoliło nam zbadać tych pacjentów i powiązania z ich cechami klinicznymi, takimi jak palenie tytoniu.