Kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi

W retinopatiach zmiany naczyniowe są pierwszym objawem wykrywanym przez klinicystów. Śledzą postęp choroby i dobierają leczenie zgodnie z tymi zmianami. Opracowano kilka modeli zwierzęcych w celu zbadania różnych etapów patologii.

W tej pracy pokażemy, jak mierzyć różne zmiany naczyniowe. W tym celu zamierzamy wykorzystać dwa modele zwierzęce. Jednym z nich jest mysi model retinopatii indukowanej tlenem, który odtwarza retinopatię wcześniaków i niektóre aspekty proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej.

Tutaj zmierzymy obszary jałowe, obszary neowaskularne oraz rozszerzenie i krętość tętniczek. W naszym laboratorium opracowano mysi model zespołu metabolicznego, który indukuje retinopatię nieproliferacyjną. W pracy oceniono gęstość naczyń krwionośnych i rozgałęzienia.

Po złożeniu ofiary z myszy wynukleatyzuj nożyczkami. Utrwal wyłuszczone oczy świeżo przygotowanym paraformaldehydem przez godzinę w temperaturze pokojowej. Pod mikroskopem preparacyjnym usuń rogówki nożyczkami, przecinając wzdłuż rąbka i wypreparuj całe siatkówki.

Wyrzuć przedni odcinek oka, a następnie oddziel siatkówkę od naczyniówki RPE. Umieść siatkówki w rurkach o pojemności 200 mikrolitrów. Następnie zablokuj i przesiąknij siatkówki w 100 mikrolitrach TBS zawierających 5% albuminy surowicy bydlęcej Triton przez sześć godzin w czterech stopniach z delikatnym mieszaniem w shakerze.

Następnie odwróć rurkę, aby umieścić siatkówkę w kubku i usuń roztwór blokujący za pomocą pipety. Dodać 100 mikrolitrów roztworu zawierającego izollektynę. Owiń probówki folią aluminiową, aby chronić próbki przed światłem.

Inkubować siatkówki z roztworem lektyny przez noc w temperaturze czterech stopni, delikatnie mieszając w shakerze. Przemyć siatkówki 100 mikrolitrami TBS-Triton przez 20 minut, delikatnie mieszając w shakerze. Powtórz ten krok trzy razy.

Umieść siatkówkę na szkiełku i dodaj kroplę PBS. Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj cztery jednakowo odległe nacięcia od krawędzi siatkówki w kierunku nerwu wzrokowego. Aby rozłożyć płatki siatkówki, użyj kleszczy lub małych kawałków bibuły filtracyjnej.

Upewnij się, że strona fotoreceptora jest skierowana w dół. Usuń pozostały PBS ze szkiełka za pomocą bibuły filtracyjnej. Następnie dodaj pas montażowy i szkiełko nakrywkowe.

Pozostaw do wyschnięcia na godzinę w temperaturze pokojowej. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze czterech stopni, chronić przed światłem. W mikroskopie konfokalnym umieść szkiełko na płytce ekranem do dołu.

Skoncentruj splot górny układu naczyniowego siatkówki i wybierz obszar, aby rozpocząć akwizycję obrazu. Ustaw ogólne parametry lasera w oprogramowaniu. Ustaw współrzędne w osiach X, Y i Z.

Zainicjuj skanowanie. Po zakończeniu procesu skanowania otwórz obraz i zapisz go z preferowanym rozszerzeniem. W oprogramowaniu ImageJ FIJI przejdź do paska menu i kliknij Plik, Otwórz.

Wybierz obraz do przetworzenia. W oknie Opcja importu formatów biologicznych wybierz opcję Wyświetl metadane OME-XML i kliknij OK.In oknie Metadane OME wyszukaj informacje o rozmiarze piksela. Skopiuj te dane.

Aby skalibrować obraz, przejdź do paska menu i wybierz Właściwości obrazu. Skopiuj informacje i kliknij przycisk OK. Przypisz preferowaną tabelę lut do obrazu. Aby wyświetlić wszystkie stosy na jednym obrazie, przejdź do paska menu i wybierz Obraz, Stosy, Projekt Z.

W wyświetlonym oknie projekcji zaznacz wszystkie stosy, w których wizualizowane są naczynia. W polu Typ projekcji wybierz opcję Średnia intensywność i kliknij przycisk OK. Przejdź do paska menu, Obraz, Dostosuj, Jasność/Kontrast. Kliknij Zastosuj i zapisz zmiany.

Skopiuj parametry wybrane dla jasności i kontrastu. Muszą one być identyczne dla wszystkich obrazów. Na pasku menu wybierz narzędzie Różdżka.

Wybierz obszar siatkówki, w którym brakuje uformowanych naczyń. Naciśnij T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrane obszary w Menedżerze ROI. Kliknij opcję Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji, aby uzyskać informacje o obszarze bezczynności.

Powtórz te kroki, aby zmierzyć całkowitą powierzchnię siatkówki. Na pasku menu wybierz narzędzie Różdżka. Powiększ obraz, aby lepiej zobrazować neonaczynia.

Zaznaczaj nowe naczynia jeden po drugim za pomocą narzędzia Różdżka. Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI. Kliknij opcję Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji, aby uzyskać dane obszaru.

Na pasku menu wybierz narzędzie Linia prosta. Powiększ obraz, aby lepiej zobrazować ścianę naczynia. Wykonaj trzy linie poprzeczne do głównego naczynia przed pierwszym odgałęzieniem.

Naciśnij T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrane obszary w Menedżerze zwrotu z inwestycji. Kliknij opcję Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji, aby uzyskać dane dotyczące odległości. Na pasku menu kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę narzędzia Linia prosta i wybierz opcję Linia segmentowana.

Narysuj linię wewnątrz naczynia od nerwu wzrokowego do pierwszego rozgałęzienia naczynia, zgodnie z kształtem naczynia. Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI. Na pasku menu wybierz narzędzie Linia prosta

Narysuj linię od nerwu wzrokowego do pierwszego rozgałęzienia naczynia. Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI. Kliknij przycisk Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji, aby uzyskać dane dotyczące odległości.

Za pomocą narzędzia Owal na pasku menu zdefiniuj obszar stosowany jednakowo do wszystkich warunków eksperymentalnych. Wybrany obszar musi być koncentrycznym okręgiem narysowanym wokół nerwu wzrokowego. Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI.

Ręcznie policz liczbę głównych gałęzi wyrastających z głównych statków znajdujących się w obszarze wyboru. Przekształć obraz do trybu 8-bitowego. Przejdź do Wtyczki na pasku menu, wybierz Analiza naczyń, Gęstość naczyniowa.

Za pomocą narzędzia Kwadrat na pasku menu zdefiniuj obszar, w którym chcesz zmierzyć gęstość naczyń. Kliknij przycisk OK. Program wyświetli nowe okno z wymaganymi informacjami. W pierwszym przykładzie eksperymentalnym wykorzystano mysi model retinopatii indukowanej tlenem.

Iniekcje doszklistkowe wykonano w 12. dniu po urodzeniu w celu określenia skuteczności leku jako środka przeciwangiogennego. Myszy, którym wstrzyknięto nośnik, zastosowano jako kontrolę. Obszary jałowe definiuje się jako strefy, w których brakuje naczyń krwionośnych siatkówki.

Na podstawie uzyskanych obrazów obszary beznaczyniowe można określić ilościowo jako sumę obszarów bez naczyń podzieloną na całkowitą powierzchnię siatkówki. Na obszarach z uszkodzeniami mechanicznymi również nie ma naczyń. Aby zidentyfikować uszkodzone obszary, przeanalizuj integralność warstw neuronalnych za pomocą barwienia Hoechst.

Naczynia nowotworowe to naczynia małego kalibru, które pochodzą z wcześniej istniejących naczyń górnego splotu naczyniowego. Obliczono obszar zajmowany przez kępki neonazy, określając ilościowo obszar neowaskularny siatkówki zajmowany przez całkowitą powierzchnię siatkówki. Ponieważ kształt i rozmiar naczyń jest zmienny, czasami mogą wyglądać podobnie do szczątków i artefaktów.

Aby odróżnić neonaczynia, sprawdź, czy kępka wyrasta z dojrzałego naczynia. Na potrzeby analizy dylatacji zmierzyliśmy średnicę naczynia głównego na trzech wysokościach przed pierwszym odgałęzieniem. Badacze muszą określić z góry określoną odległość, aby zmierzyć średnicę naczynia, aby zmniejszyć zmienność wyników.

Idealnie, najdalszy punkt od nerwu wzrokowego powinien mieć około 300 mikrometrów. Sugerujemy przeprowadzenie analizy, a następnie uśrednienie co najmniej sześciu zwierząt na warunek. Jeśli chodzi o krętość, mierzymy odległość przebytą przez główne naczynie zgodnie z jego kształtem, w odniesieniu do odległości w linii prostej między nerwem wzrokowym a pierwszym punktem rozgałęzienia.

Jak widać na obrazie, istnieje niejednorodność w falistości głównych naczyń. Aby uzyskać reprezentatywny wynik, należy określić ilościowo nie mniej niż sześć myszy na każdy warunek. Najnowsze parametry, rozgałęzienia i gęstość naczyń krwionośnych, analizowano w modelu zespołu metabolicznego wykazującego retinopatię nieproliferacyjną.

W celu pomiaru rozgałęzień naczyniowych określiliśmy obszar kwantyfikacji, rysując koncentryczny okrąg, a następnie policzyliśmy, jedna po drugiej, pierwotne gałęzie powstające z głównego naczynia centralnego. Na podstawie uzyskanych obrazów gęstość naczyń krwionośnych określono ilościowo jako obszar zajmowany przez naczynia podzielone przez obszar ROI, który był umieszczony w różnych miejscach na każdej mikrofotografii. Unikaj ilościowego określania obszarów z uszkodzeniami mechanicznymi.

Jeśli nakłucia obejmują więcej niż dwa obszary, siatkówkę należy wyrzucić. Podsumowując, w tym artykule pokazaliśmy klasyczne, ugruntowane i powtarzalne techniki ilościowego określania niektórych z najistotniejszych parametrów uwzględnianych w praktyce klinicznej.