Name: Kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Poznaj metodę barwienia lektynowego do kwantyfikacji parametrów naczyniowych w siatkówkach myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę zmian naczyniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Carlosowi Masowi, Maríi Pilar Crespo i Cecilii Sampedro z CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentyna) za pomoc w mikroskopii konfokalnej, Soledad Miró i Victorii Blanco za troskę o zwierzęta oraz Laurze Gatica za pomoc histologiczną. Dziękujemy również Victorowi Diazowi (Pro-Sekretarzowi ds. Komunikacji Instytucjonalnej FCQ) za produkcję i edycję filmu oraz Paulowi Hobsonowi za jego krytyczną lekturę i korektę językową manuskryptu.
Ten artykuł został sfinansowany z grantów Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (wszystkie dla M.C.S.).

myszy C57BL/6J były obsługiwane zgodnie z wytycznymi Oświadczenia ARVO dotyczącego wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Procedury eksperymentalne zostały opracowane i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (CICUAL) Wydziału Nauk Chemicznych Narodowego Uniwersytetu w Kordobie (Res. HCD 1216/18).
1. Przygotowanie roztworów buforowych i odczynników
<ol>
	<li>Przygotowanie 1x buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS): Dodać 8 g chlorku sodu (NaCl), 0,2 g chlorku potasu (KCl), 14,4 g dwuwodnego fosforanu sodu (Na2HPO4 2H2O) i 0,24 g diwodorofosforanu potasu (KH2PO4) do 800 ml wody destylowanej. Mieszaj roztwór, aż do całkowitego rozpuszczenia soli. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą kwasu chlorkowego (HCl) i dostosować objętość do 1 l za pomocą dodatkowej wody destylowanej. Przefiltrować roztwór i przechowywać go w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotowanie 4% paraformaldehydu (PFA): Dodać 40 g stałego PFA do 800 ml świeżo przygotowanego PBS. Wymieszać roztwór na płycie grzewczej o stałej temperaturze 60 °C. Dodać 1 M wodorotlenek sodu (NaOH) aż do całkowitego rozpuszczenia PFA, sprawdzając, czy pH jest utrzymywane w zakresie 7,2-7,4. Uzupełnij objętość do 1,000 ml za pomocą PBS i wymieszaj. Wyłączyć płytę grzewczą i przefiltrować roztwór, gdy jego temperatura spadnie poniżej 35 °C. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 dni. 
	UWAGA: PFA jest szkodliwy w przypadku połknięcia lub wdychania i prawdopodobnie jest związkiem mutagennym. Podczas całego procesu należy używać rękawiczek i maski na twarz oraz pracować w kabinie bezpieczeństwa.</li>
	<li>Przygotowanie 1x soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS): Dodać 6,1 g Tris i 9 g NaCl do 800 ml wody destylowanej. Mieszaj roztwór, aż do całkowitego rozpuszczenia soli. Za pomocą HCl należy dostosować pH do 7,4 i zwiększyć objętość do 1 litra za pomocą dodatkowej wody destylowanej. Przefiltrować roztwór i przechowywać go w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotowanie TBS-0,1% Triton X-100: Dodać 0,1 ml TritonX-100 do 100 ml TBS. Delikatnie wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia. 
	UWAGA: Ponieważ Triton jest bardzo gęstym detergentem, należy lekko przeciąć końcówkę końcówki, aby uzyskać lepsze pipetowanie.</li>
	<li>Przygotowanie TBS-5%-Albuminy surowicy bydlęcej (BSA) -0,1% Triton-X-100: Odważyć 5 g BSA i dodać TBS-0,1% roztwór tritonu X-100 do końcowej objętości 100 ml. Delikatnie wymieszaj. Porcjować i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 2 miesięcy.</li>
	<li>Izolektyna GSA-IB4 Alexa fluor-488 koniugat (Izolektyna GSA-IB4): Waga 36,75 mg dwuwodnego chlorku wapnia (CaCl2·2H2O) i dodać go do 500 ml świeżo przygotowanego PBS. Wymieszaj roztwór za pomocą mieszadła. Pobrać pipetą 500 μl roztworu CaCl2/PBS i dodać go do fiolki zawierającej 500 μg liofilizowanego proszku izolektyny GSA-IB4. Delikatnie wymieszać i rozdzielić roztwór na porcje do probówek o pojemności 0,5 ml. Przechowywać je w temperaturze -20 °C, chronić przed światłem.</li>
	<li>Poli(alkohol winylowy) w glicerolu/Tris: Zważ 2,4 g poli(alkoholu winylowego), dodaj 6 g glicerolu i delikatnie wymieszaj. Następnie dodaj 6 ml wody i kontynuuj mieszanie przez kilka godzin w temperaturze pokojowej. Dodać 12 ml podgrzanego 0,2 M roztworu Tris (pH: 8,5) i podgrzewać w stałej temperaturze 50 °C przez 10 minut i od czasu do czasu mieszać. Na koniec odwirować roztwór o sile 5 000 x g przez 15 minut w celu klarowania. 
	UWAGA: Pozostawić roztwór do ostygnięcia w temperaturze pokojowej, podzielić go na porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Barwienie fluorescencyjne lektynami
<ol>
	<li>Po złożeniu ofiar na myszach przez wdychanie dwutlenku węgla (CO2) wyłuszczenie oczu nożyczkami16. Utrwalić wyłuszczone oczy świeżo przygotowanym 4% PFA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). 
	UWAGA: Utrwalenie można również przeprowadzić poprzez inkubację oczu w 4% PFA przez noc (ON) w temperaturze 4 °C. Myszy zostały uśmiercone zgodnie z wytycznymi Oświadczenia ARVO dotyczącego wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych oraz Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (CICUAL) Wydziału Nauk Chemicznych Narodowego Uniwersytetu w Kordobie (Res. HCD 1216/18).</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym usuń rogówki nożyczkami, przecinając wzdłuż rąbka i wypreparuj całe siatkówki. Wyrzuć przedni odcinek oka, a następnie oddziel siatkówkę od naczyniówki RPE. 
	UWAGA: Upewnij się, że usunąłeś pozostałe zanieczyszczenia i naczynia hialoidalne z siatkówki za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Umieść siatkówki w probówkach o pojemności 200 μl. Następnie zablokować i przepuścić siatkówki w 100 μl roztworu soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS) zawierającego 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,1% Triton-X-100 przez 6 godzin w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając w shakerze. 
	UWAGA: Ten krok można wykonywać przez 2 godziny w RT.</li>
	<li>Następnie odwróć rurkę, aby umieścić siatkówkę w nasadce i usuń roztwór blokujący za pomocą pipety.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu zawierającego 0,01 μg/μl izolektyny GSA-IB4 (GSA-IB4). Owiń probówki folią aluminiową, aby chronić próbki przed światłem. Inkubować siatkówki w włączonym roztworze lektyny w temperaturze 4 °C lub przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając w wytrząsarce.</li>
	<li>Przemyć siatkówkę 100 μl TBS zawierającego 0,1% Triton-X-100 przez 20 minut, delikatnie mieszając w shakerze. Aby zapewnić prawidłowe mycie, umieść siatkówkę w nasadce rurki, odwracając ją. Ustawić probówkę z powrotem w pozycji stojącej i usunąć pożywkę pozostałą w pojemniku. Powtórz ten krok trzy razy.</li>
	<li>Umieść siatkówkę na szkiełku i dodaj kroplę PBS. Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj cztery jednakowo odległe nacięcia od krawędzi siatkówki w kierunku nerwu wzrokowego.</li>
	<li>Aby rozłożyć płatki siatkówki, użyj kleszczy lub małych kawałków bibuły filtracyjnej. Upewnij się, że strona fotoreceptora jest skierowana w dół.</li>
	<li>Usunąć pozostały PBS ze szkiełka za pomocą bibuły filtracyjnej. Następnie dodaj podłoże montażowe (poli(alkohol winylowy) w glicerolu/Tris) i szkiełko nakrywkowe. Pozostaw do wyschnięcia na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C z dala od światła. 
	UWAGA: Siatkówki mogą być również przechowywane w PBS w temperaturze 4 °C do czasu wizualizacji mikroskopii konfokalnej.</li>
</ol>
3. Wizualizacja mikroskopii konfokalnej i akwizycja mikrofotografii
<ol>
	<li>Przed wizualizacją inkubuj szkiełka przez 10 minut w temperaturze pokojowej pod osłoną światła.</li>
	<li>W mikroskopie konfokalnym umieść szkiełko na płytce ekranem do dołu.</li>
	<li>Skoncentruj splot górny układu naczyniowego siatkówki i wybierz obszar, aby rozpocząć akwizycję obrazu.</li>
	<li>Ustaw ogólne parametry lasera w oprogramowaniu: Długość fali: 488 nm; Intensywność lasera; HV; Przesunięcie; Zysk. 
	UWAGA: Intensywność lasera, PMT, przesunięcie i wzmocnienie mogą się różnić w zależności od warunków i użytkowania lampy. Optymalne ustawienia zapewniają wyraźny obraz naczyń krwionośnych, unikając nasycenia czułości lampy fotopowielacza, aby mieć liniową zależność od sygnału fluorescencji.</li>
	<li>Ustaw inne parametry akwizycji: Tryb; Rozmiar; Obiektywny, bez zoomu; Nie ma Kalmana; Rozmiar kroku. 
	UWAGA: Identyczne warunki akwizycji muszą być stosowane do obrazowania próbek kontrolnych i eksperymentalnych.</li>
	<li>Ustaw współrzędne w osiach x i y: Zeskanuj siatkówkę w ostrości 2x. Jeśli obszar pokazuje naczynia, zaznacz go, klikając dwukrotnie obszar, aby oznaczyć go do późniejszego pobrania obrazu. 
	UWAGA: Zdecydowanie zaleca się wybór obszaru siatkówki zgodnie ze splotem naczyniowym górnym, ponieważ fluorescencja większych naczyń jest wyższa.</li>
	<li>Przesuń siatkę do sąsiedniego kwadratu, ustaw ostrość siatkówki i wybierz obszar, jeśli odpowiada. Powtarzaj ten krok, aż wybrany obszar obejmie całą siatkówkę.</li>
	<li>Wybierz jeden obszar i ustaw współrzędne w osi z, aby zdefiniować zakres grubości do skanowania. Aby to zrobić, wizualizuj siatkówkę w ostrości 2x; za pomocą mikrometru przejdź do górnej części siatkówki i kliknij Ustaw w pozycji Start. Następnie przejdź do dolnej części siatkówki i kliknij Ustaw w pozycji końcowej.</li>
	<li>Powtórz krok 3.8 w każdym obszarze zaznaczonym w siatce. 
	UWAGA: Aby dokładnie sprawdzić zeskanowany obszar, naciśnij Go w pozycji Start. Jeśli naczynia są nadal wizualizowane, dostosuj pozycję, przesuwając mikrometr, a następnie kliknij Ustaw. Powtórz proces w pozycji końcowej.</li>
	<li>Zainicjuj skanowanie automatyczne.</li>
	<li>Po zakończeniu procesu skanowania otwórz obraz.</li>
	<li>Wybierz format Seria, aby nagrać obraz jako mozaikę i zapisać go z preferowanym rozszerzeniem. Na koniec zszyty obraz zostanie wyświetlony na ekranie.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie obrazu
<ol>
	<li>W oprogramowaniu ImageJ FIJI przejdź do paska menu i kliknij Plik > Otwórz. Wybierz obraz do przetworzenia. W oknie Opcje importu formatów biologicznych wybierz opcję Wyświetl metadane OME-XML i kliknij przycisk OK. 
	UWAGA: Obrazy o podobnej nazwie powinny być zapisywane w osobnych folderach.</li>
	<li>W oknie Metadane OME wyszukaj informacje o rozmiarze piksela o nazwach PhysicalSizeX, PhysicalSizeY i PhysicalSizeZ. Skopiuj te dane.</li>
	<li>Aby skalibrować obraz, przejdź do paska menu i wybierz Image > Properties (Właściwości obrazu). Skopiuj informacje z obrazu w kroku 4.2 i kliknij OK. Obraz otwiera się jako okno z kilkoma zdjęciami, z których każde reprezentuje mikrofotografie wykonane w osi z.</li>
	<li>Przypisz preferowaną tabelę lut do obrazu, aby przypisać kolor do etykiety fluorescencyjnej. Aby to zrobić, przejdź do paska menu i kliknij ikonę LUT.</li>
	<li>Aby zwizualizować wszystkie stosy na jednym obrazie, przejdź do paska menu i wybierz pozycję Obraz > stosy > projekt Z.</li>
	<li>W wyświetlonym oknie Projekcja Z zaznacz wszystkie stosy, w których wizualizowane są naczynia. W polu Projection Type (Typ projekcji) wybierz opcję Average Intensity (Średnia intensywność) i kliknij OK. 
	UWAGA: Wynik sumy stosów zostanie wyświetlony na nowym obrazie o nazwie AVG (nazwa obrazu).</li>
	<li>Dostosuj jasność i kontrast na wynikowym obrazie, aby zmniejszyć tło i podświetlić naczynia. Przejdź do paska menu i kliknij Obraz> Dostosuj> Jasność/Kontrast. W oknach B i C przesuwaj paski, aż do momentu zaobserwowania lepszej intensywności. Kliknij Zastosuj i zapisz zmiany.</li>
	<li>Skopiuj parametry wybrane dla opcji Jasność/Kontrast; muszą one być identyczne dla wszystkich obrazów.</li>
	<li>Przed kwantyfikacją obrazu należy zdefiniować parametry, które będą mierzone. Na pasku menu przejdź do opcji Analizuj > ustaw pomiary. W opisanych tutaj procedurach konieczne będzie uzyskanie Obszaru i Obwodu (docelowo jest to również potrzebne do pomiaru odległości). Kliknij OK.</li>
	<li>Pobierz wtyczkę wymaganą do kwantyfikacji gęstości naczyń17 i postępuj zgodnie z instrukcjami instalacji dostarczonymi przez wtyczkę.</li>
	<li>Kontynuuj kwantyfikację określonego parametru naczyniowego.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja obszarów beznaczyniowych
<ol>
	<li>Na pasku menu wybierz narzędzie Różdżka. Wybierz obszar siatkówki, w którym brakuje naczyń. 
	UWAGA: W zależności od tolerancji można wybrać większe lub mniejsze obszary. Aby dostosować tolerancję, kliknij dwukrotnie ikonę narzędzia różdżki. Zastosowany tryb: Dziedzictwo.</li>
	<li>Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI. Powtórz kroki 5.1 i 5.2 dla wszystkich jałowych obszarów siatkówki.</li>
	<li>Kliknij Zmierz w menedżerze ROI, aby uzyskać informacje o obszarze bezczynności. Program wyświetli nowe okno z wymaganymi informacjami. Skopiuj dane do innego programu lub zapisz plik. 
	UWAGA: Na niektórych obrazach można preferować ręczne wybieranie obszarów bezczynności. W takim przypadku wybierz narzędzie Zaznaczanie wielokątów, narysuj krótkie odległości wokół obszaru beznaczyniowego i kliknij obraz, gdy nowa odległość ma się rozpocząć. Zamknij wybrany obszar, klikając pierwszy punkt.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.1, 5.2 i 5.3, aby zmierzyć całkowitą powierzchnię siatkówki.</li>
	<li>Oblicz obszar jałowy siatkówki jako sumę wszystkich zmierzonych obszarów jałowych podzieloną przez całkowitą powierzchnię siatkówki.</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja obszarów neowaskularnych
<ol>
	<li>Na pasku menu wybierz narzędzie Różdżka.</li>
	<li>Powiększ obraz, aby lepiej zobrazować neonaczynia. Wybierz nowe naczynia jeden po drugim za pomocą narzędzia różdżki. 
	UWAGA: Dostosuj tolerancję nie wyższą niż 20, aby zapewnić wybór pojedynczego naczynia neo. Ten poziom tolerancji musi pozostać niezmienny podczas wszystkich kwantyfikacji obrazu.</li>
	<li>Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI. Powtórz kroki 6.1 i 6.2 dla wszystkich neowaskularnych obszarów siatkówki.</li>
	<li>Kliknij Zmierz w menedżerze ROI, aby uzyskać dane obszaru. Program wyświetli nowe okno z wymaganymi informacjami. Skopiuj dane do innego programu lub zapisz plik.</li>
	<li>Powtórz kroki 6.1, 6.2 i 6.3, aby określić ilościowo całkowitą powierzchnię siatkówki.</li>
	<li>Oblicz obszar neowaskularny siatkówki jako sumę wszystkich zmierzonych obszarów naczyń neovessel podzieloną przez całkowitą powierzchnię siatkówki.</li>
</ol>
7. Kwantyfikacja średnicy naczynia
<ol>
	<li>Na pasku menu wybierz narzędzie Linia prosta</li>.
	<li>Powiększ obraz, aby lepiej zobrazować ścianę naczynia. Wykonaj trzy linie poprzeczne do głównego naczynia przed pierwszym odgałęzieniem. Należy to zrobić, rysując linię od granicy jednej ściany naczynia do przeciwnej. 
	UWAGA: Linia musi być idealnie prostopadła do naczynia ściennego, aby uniknąć błędów kwantyfikacji.</li>
	<li>Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI. Powtórzyć kroki 7.1 i 7.2 dla wszystkich zbiorników, które muszą zostać oznaczone ilościowo.</li>
	<li>Kliknij Zmierz w menedżerze ROI, aby uzyskać dane dotyczące odległości. Program wyświetli nowe okno z wymaganymi informacjami. Skopiuj dane do innego programu lub zapisz plik.</li>
</ol>
8. Kwantyfikacja krętości statku
<ol>
	<li>Na pasku menu kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę narzędzia linii prostej i wybierz opcję Linia segmentowa lub Linia odręczna. Narysuj linię wewnątrz naczynia od nerwu wzrokowego do pierwszego rozgałęzienia naczynia zgodnie z kształtem naczynia. 
	UWAGA: Linia musi podążać za kształtem naczyń krwionośnych, aby uniknąć błędów kwantyfikacji.</li>
	<li>Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI.</li>
	<li>Na pasku menu wybierz narzędzie Linia prosta. Narysuj linię od nerwu wzrokowego do pierwszego rozgałęzienia naczynia.</li>
	<li>Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI.</li>
	<li>Kliknij Zmierz w Menedżerze ROI, aby uzyskać dane dotyczące odległości. Program wyświetli nowe okno z wymaganymi informacjami. Skopiuj dane do innego programu lub zapisz plik.</li>
	<li>Oblicz wskaźnik krętości w następujący sposób: odległość uzyskana za pomocą linii segmentowej podzielona przez odległość uzyskaną za pomocą linii prostej.</li>
</ol>
9. Kwantyfikacja rozgałęzień naczyniowych
<ol>
	<li>Za pomocą narzędzia Owal na pasku menu zdefiniuj obszar stosowany jednakowo do wszystkich warunków eksperymentalnych. Wybrany obszar musi być koncentrycznym okręgiem narysowanym wokół nerwu wzrokowego.</li>
	<li>Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI. 
	UWAGA: W takim przypadku zaleca się zapisanie zwrotu z inwestycji, ponieważ kwantyfikacja jest powolna i identyczny zwrot z inwestycji musi być używany na wszystkich obrazach. Aby to zrobić, w Menedżerze ROI kliknij WIĘCEJ > Zapisz.</li>
	<li>Ręcznie policz liczbę głównych gałęzi wyrastających z głównych statków znajdujących się w obszarze wyboru.</li>
	<li>Powtórz kroki 9.2 i 9.3 w sąsiednich obszarach, zachowując kryteria obwodu nerwu wzrokowego.</li>
</ol>
10. Kwantyfikacja gęstości naczyń krwionośnych
<ol>
	<li>Przekształć obraz do trybu 8-bitowego.</li>
	<li>Przejdź do Wtyczki na pasku menu, wybierz Analiza naczyń > Gęstość naczyniowa.</li>
	<li>Za pomocą narzędzia Kwadrat na pasku menu zdefiniuj obszar, w którym należy zmierzyć gęstość naczynia. Kliknij OK.</li>
	<li>Program wyświetli nowe okno z wymaganymi informacjami. Skopiuj dane do innego programu lub zapisz plik.</li>
	<li>Powtórz kroki 10.2, 10.3 i 10.4 w sąsiednich obszarach, utrzymując zwrot z inwestycji, ale umieszczając go dziewięć razy obejmując obwód i środek całej siatkówki.</li>
</ol>

<ol><li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li>
<li>McDougal, D. H., Gamlin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomic+control+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Autonomic control of the eye.</a> Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).</li>
<li>Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vasculature+development+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retinal vasculature development in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+alterations+in+the+retinal+microvasculature%2C+microcirculation%2C+and+microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).</li>
<li>Lavia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+vessel+density+in+the+superficial+and+deep+plexuses+in+diabetic+retinopathy+is+associated+with+structural+changes+in+corresponding+retinal+layers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers.</a> PLoS One. 14 (7), 0219164(2019).</li>
<li>Rosenblatt, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+factors+in+a+rigorous+longitudinal+image-based+assessment+of+retinopathy+of+prematurity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5369(2021).</li>
<li>Edwards, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Funduscopic+examination+of+patients+with+diabetes+who+are+admitted+to+hospital%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Medical+Association+Journal%22%5BJournal%5D)">Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital.</a> Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).</li>
<li>Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+associated+with+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">The pathology associated with diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 7-14 (2017).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((angiography+metrics+predict+progression+of+diabetic+retinopathy+and+development+of+diabetic+macular+edema%3A+A+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study.</a> Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+optical+coherence+tomography+angiography+of+vascular+abnormalities+in+the+living+human+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).</li>
<li>Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+vascular+changes+in+macular+telangiectasia+type+2%3A+comparison+between+SD-OCT+and+OCT+angiography%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).</li>
<li>Gammons, M. V., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+oxygen+induced+retinopathy+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Models of oxygen induced retinopathy in rodents.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).</li>
<li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li>
<li>Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-203a-3p+inhibits+retinal+angiogenesis+and+alleviates+proliferative+diabetic+retinopathy+in+oxygen-induced+retinopathy+%28OIR%29+rat+model+via+targeting+VEGFA+and+HIF-1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1α.</a> Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).</li>
<li>Paz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+syndrome+triggered+by+fructose+diet+impairs+neuronal+function+and+vascular+integrity+in+ApoE-KO+mouse+retinas%3A+Implications+of+autophagy+deficient+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987(2020).</li>
<li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse%3A+a+model+of+vessel+loss%2C+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).</li>
<li>Zarb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ossified+blood+vessels+in+primary+familial+brain+calcification+elicit+a+neurotoxic+astrocyte+response%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response.</a> Brain. 142 (4), 885-902 (2019).</li>
<li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li>
<li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+autophagy+modulators+on+vascular%2C+glial%2C+and+neuronal+alterations+in+the+oxygen-induced+retinopathy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279(2019).</li>
<li>Lutty, G. A., McLeod, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+hyaloid%2C+choroidal+and+retinal+vasculatures+in+the+fetal+human+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).</li>
<li>Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+mouse+model+of+oxygen-induced+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+and+Brain%22%5BJournal%5D)">Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy.</a> Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).</li>
<li>Guaiquil, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+for+retinopathy+of+prematurity+identifies+endothelial+cell+proliferation+as+a+potential+mechanism+for+plus+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).</li>
<li>Mezu-Ndubuisi, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+angiography+quantifies+oxygen-induced+retinopathy+vascular+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Optometry+and+Vision+Science%3A+Official+Publication+of+the+American+Academy+of+Optometry%22%5BJournal%5D)">In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery.</a> Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).</li>
<li>Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+vascular+tortuosity+as+an+early+outcome+measure+in+oxygen+induced+retinopathy+%28OIR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR).</a> Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).</li>
<li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+microvascular+density+and+morphology+in+diabetic+retinopathy+using+spectral-domain+optical+coherence+tomography+angiography%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 362(2016).</li>
<li>Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ocular+angiogenesis%3A+from+development+to+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies.</a> FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).</li>
<li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).</li>
<li>Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+diabetic+retinopathy%3A+Contribution+and+limitations+of+laboratory+research%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research.</a> Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).</li>
<li>Lorenc, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF-1R+regulates+the+extracellular+level+of+active+MMP-2%2C+pathological+neovascularization%2C+and+functionality+in+retinas+of+OIR+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model.</a> Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).</li>
<li>Ma, N., Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+microglia+as+passenger+leukocytes+to+the+fate+of+intraocular+neuronal+retinal+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).</li>
<li>Mazzaferri, J., Larrivée, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+machine+learning+approach+for+automated+assessment+of+retinal+vasculature+in+the+oxygen+induced+retinopathy+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3916(2018).</li>
<li>Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+retina+in+3D%3A+quantification+of+vascular+growth+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%3A+Quantitative+Biosciences+from+Nano+to+Macro+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).</li>
<li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+of+indirect+contact+coculture+decrease+integrity+of+inner+blood-retina+barrier+model+in+vitro+by+upgrading+MMP-2%2F9+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Markers%22%5BJournal%5D)">Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity.</a> Disease Markers. 2021, 7124835(2021).</li>
<li>Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEDF-deficient+mice+exhibit+an+enhanced+rate+of+retinal+vascular+expansion+and+are+more+sensitive+to+hyperoxia-mediated+vessel+obliteration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).</li>
<li>Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+D-amino+acid+oxidase+prevents+retinal+neurovascular+pathologies+in+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats.</a> Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Zwierzęce modele retinopatii są potężnymi narzędziami do badania rozwoju naczyń krwionośnych, przebudowy lub patologicznej angiogenezy. Sukces tych badań w terenie zależy od łatwego dostępu do tkanki, który pozwala na wykonywanie szerokiej gamy technik, dostarczając danych od myszy in vivo i pośmiertnych 26,27. Co więcej, stwierdzono dużą korelację między badaniami in vivo a analizą kliniczną, co zapewnia solidną identyfikowalność i wia...

Oczy są odżywiane przez dwa układy tętniczo-żylne: naczyniówkę, zewnętrzną sieć naczyniową, która nawadnia barwnikowy nabłonek siatkówki i fotoreceptory; oraz układ nerwowo-siatkówkowy, który nawadnia warstwę komórek zwojowych i wewnętrzną warstwę jądrową siatkówki1. Unaczynienie siatkówki to zorganizowana sieć naczyń, które dostarczają składniki odżywcze i tlen do komórek siatkówki oraz zbierają produkty przemiany materii, aby zapewnić prawidłową transdukcję sygnalizacji wizualnej. Ten układ naczyniowy ma pewne wyraźne cechy, w tym: brak autonomicznego unerwienia, regulację napięcia naczyniowego przez wewnętrzne mechanizmy siatkówki oraz posiadanie złożonej bariery siatkówkowo-krwionośnej2. Dlatego unaczynienie siatkówki było przedmiotem zainteresowania wielu badaczy, którzy intensywnie badali nie tylko unaczynienie podczas rozwoju, ale także zmiany i patologiczną angiogenezę, której ulegają te naczynia w chorobach3. Najczęstszymi zmianami naczyniowymi obserwowanymi w retinopatiach są poszerzenie naczyń, neowaskularyzacja, utrata arboryzacji naczyń krwionośnych oraz deformacja głównych naczyń siatkówki, co sprawia, że stają się one bardziej zygzakowate4,5,6. Jedna lub więcej z opisanych zmian jest najwcześniejszymi objawami wykrywanymi przez klinicystów. Wizualizacja naczyń krwionośnych zapewnia szybką, nieinwazyjną i niedrogą metodę badań przesiewowych7. Szeroko zakrojone badanie zmian zaobserwowanych w drzewie naczyniowym określi, czy retinopatia jest nieproliferacyjna czy proliferacyjna i jakie będzie dalsze leczenie. Retinopatie nieproliferacyjne mogą objawiać się m.in. nieprawidłową morfologią naczyń krwionośnych, zmniejszoną gęstością naczyń krwionośnych, naczyniami włosowatymi bezkomórkowymi, śmiercią perycytów, obrzękiem plamki żółtej. Ponadto retinopatie proliferacyjne rozwijają również zwiększoną przepuszczalność naczyń, przebudowę zewnątrzkomórkową i tworzenie kępek naczyniowych w kierunku jamy ciała szklistego, które łatwo się rozpadają lub wywołują odwarstwienie siatkówki8.
Po wykryciu retinopatii można monitorować poprzez zmiany naczyniowe9,10. Postęp patologii można śledzić poprzez zmiany strukturalne naczyń, które wyraźnie określają etapy choroby11. Kwantyfikacja zmian naczyniowych w tych modelach pozwoliła na skorelowanie zmian naczyniowych i śmierci neuronów oraz przetestowanie terapii farmakologicznych dla pacjentów w różnych fazach choroby.
W świetle powyższych stwierdzeń uważamy, że rozpoznawanie i kwantyfikacja zmian naczyniowych ma fundamentalne znaczenie w badaniach nad retinopatiami. W tej pracy pokażemy, jak mierzyć różne parametry naczyniowe. W tym celu wykorzystamy dwa modele zwierzęce. Jednym z nich jest mysi model retinopatii indukowanej tlenem12, który naśladuje retinopatię wcześniaków i niektóre aspekty proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej13,14. W tym modelu zmierzymy obszary jałowe, obszary neowaskularne oraz poszerzenie i krętość naczyń głównych. W naszym laboratorium opracowano mysi model zespołu metabolicznego (MetS), który indukuje retinopatię nieproliferacyjną15. Tutaj ocenimy gęstość naczyń krwionośnych i rozgałęzienia.

<table><tbody><tr><td>Folia</td><td></td><td></td><td></td>aluminiowa</tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej Merck</td><td></td><td>A4503</td><td>jakość</td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Merck</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Biopack</td><td>9632.08</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny FV1200</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td>z płytką z napędem silnikowym</td></tr><tr><td>Pokrowce</td><td>Paul Marienfeld GmnH & Współ.</td><td>111520</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>NIKON</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrat fosforanu disodu i wodoru</td><td>Merck</td><td>119753</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L&nbsp; rurka</td><td>Merck</td><td>Z316121</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Merck</td><td>WHA5201090</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do inkubatora GyroMini</td><td>LabNet International</td><td>S0500</td><td></td></tr><tr><td>Izolektyna GS-IB4 Z Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Sprzężony</td><td>Invitrogen</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>Poli(alkohol winylowy) (Mowiol 4-88)</td><td>Merck</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>Miernik pH</td><td>158127</td><td></td>Paraformaldehydu <td>Merck</td></tr><tr><td></td><td>SANXIN</td><td>PHS-3D-03</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Merck</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Merck</td><td>1,04,873</td><td></td></tr><tr><td>Slajdy</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Sód wodorotlenek</td><td>Merck</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>GE17-1321-01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>X100-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Analiza statków Fidżi oprogramowanie</td><td>Mai Elfarnawany</td><td></td><td>https://imagej.net/Vessel_Analysis</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi

Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

Retinopatie to niejednorodna grupa chorób, które wpływają na tkankę neurosensoryczną oka. Charakteryzują się neurodegeneracją, glejozą oraz postępującą zmianą funkcji i struktury naczyń krwionośnych. Chociaż początek retinopatii charakteryzuje się subtelnymi zaburzeniami percepcji wzrokowej, zmiany w splocie naczyniowym są pierwszymi objawami wykrywanymi przez klinicystów. Brak lub obecność neowaskularyzacji decyduje o tym, czy retinopatia jest klasyfikowana jako nieproliferacyjna (NPDR) czy proliferacyjna (PDR). W tym sensie kilka modeli zwierzęcych próbowało naśladować specyficzne cechy naczyniowe każdego etapu, aby określić mechanizmy leżące u podstaw zmian śródbłonka, śmierci neuronów i innych zdarzeń zachodzących w siatkówce. W tym artykule przedstawimy pełny opis procedur wymaganych do pomiaru parametrów naczyniowych siatkówki u dorosłych i myszy wcześnie urodzonych w dniu postnatalnym (P)17. Omówimy szczegółowo protokoły przeprowadzania barwienia naczyń siatkówki izolektyną GSA-IB4 w całych mocowaniach w celu późniejszej wizualizacji mikroskopowej. Podano również kluczowe kroki przetwarzania obrazu za pomocą oprogramowania Image J Fiji, dzięki czemu czytelnicy będą mogli zmierzyć gęstość naczyń, średnicę i krętość, rozgałęzienia naczyń krwionośnych, a także obszary jałowe i neowaskularne. Narzędzia te są bardzo pomocne w ocenie i ilościowym określaniu zmian naczyniowych zarówno w retinopatiach nieproliferacyjnych, jak i proliferacyjnych.

Zgodnie z opisem w sekcji protokołu, z jednego testu barwienia fluorescencyjnego można uzyskać obraz morfologii naczyniowej i ilościowo ocenić kilka interesujących parametrów. Poszukiwanie konkretnych zmian będzie zależeć od badanego typu retinopatii. W niniejszym artykule w mysim modelu retinopatii proliferacyjnej oceniano obszary awaskularne i neowaskularne, krętość oraz poszerzenie naczyń, natomiast w mysim modelu MetS, który indukuje retinopatię nieproliferacyjną, analizowano rozgałęzienia i gęstość naczyń.
<p cl...

Ten artykuł opisuje dobrze sprawdzony i powtarzalny test barwienia lektyny dla całego preparatu siatkówki Mount oraz protokoły wymagane do ilościowego pomiaru parametrów naczyniowych często zmienianych w retinopatiach proliferacyjnych i nieproliferacyjnych.

Kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

W retinopatiach zmiany naczyniowe są pierwszym objawem wykrywanym przez klinicystów. Śledzą postęp choroby i dobierają leczenie zgodnie z tymi zmianami. Opracowano kilka modeli zwierzęcych w celu zbadania różnych etapów patologii.W tej pracy pokażemy, jak mierzyć różne zmiany naczyniowe. W tym celu zamierzamy wykorzystać dwa modele zwierzęce. Jednym z nich jest mysi model retinopatii indukowanej tlenem, który odtwarza retinopatię wcześniaków i niektóre aspekty proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej.Tutaj zmierzymy obszary jałowe, obszary neowaskularne oraz rozszerzenie i krętość tętniczek. W naszym laboratorium opracowano mysi model zespołu metabolicznego, który indukuje retinopatię nieproliferacyjną. W pracy oceniono gęstość naczyń krwionośnych i rozgałęzienia.Po złożeniu ofiary z myszy wynukleatyzuj nożyczkami. Utrwal wyłuszczone oczy świeżo przygotowanym paraformaldehydem przez godzinę w temperaturze pokojowej. Pod mikroskopem preparacyjnym usuń rogówki nożyczkami, przecinając wzdłuż rąbka i wypreparuj całe siatkówki.Wyrzuć przedni odcinek oka, a następnie oddziel siatkówkę od naczyniówki RPE. Umieść siatkówki w rurkach o pojemności 200 mikrolitrów. Następnie zablokuj i przesiąknij siatkówki w 100 mikrolitrach TBS zawierających 5% albuminy surowicy bydlęcej Triton przez sześć godzin w czterech stopniach z delikatnym mieszaniem w shakerze.Następnie odwróć rurkę, aby umieścić siatkówkę w kubku i usuń roztwór blokujący za pomocą pipety. Dodać 100 mikrolitrów roztworu zawierającego izollektynę. Owiń probówki folią aluminiową, aby chronić próbki przed światłem.Inkubować siatkówki z roztworem lektyny przez noc w temperaturze czterech stopni, delikatnie mieszając w shakerze. Przemyć siatkówki 100 mikrolitrami TBS-Triton przez 20 minut, delikatnie mieszając w shakerze. Powtórz ten krok trzy razy.Umieść siatkówkę na szkiełku i dodaj kroplę PBS. Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj cztery jednakowo odległe nacięcia od krawędzi siatkówki w kierunku nerwu wzrokowego. Aby rozłożyć płatki siatkówki, użyj kleszczy lub małych kawałków bibuły filtracyjnej.Upewnij się, że strona fotoreceptora jest skierowana w dół. Usuń pozostały PBS ze szkiełka za pomocą bibuły filtracyjnej. Następnie dodaj pas montażowy i szkiełko nakrywkowe.Pozostaw do wyschnięcia na godzinę w temperaturze pokojowej. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze czterech stopni, chronić przed światłem. W mikroskopie konfokalnym umieść szkiełko na płytce ekranem do dołu.Skoncentruj splot górny układu naczyniowego siatkówki i wybierz obszar, aby rozpocząć akwizycję obrazu. Ustaw ogólne parametry lasera w oprogramowaniu. Ustaw współrzędne w osiach X, Y i Z.Zainicjuj skanowanie. Po zakończeniu procesu skanowania otwórz obraz i zapisz go z preferowanym rozszerzeniem. W oprogramowaniu ImageJ FIJI przejdź do paska menu i kliknij Plik, Otwórz.Wybierz obraz do przetworzenia. W oknie Opcja importu formatów biologicznych wybierz opcję Wyświetl metadane OME-XML i kliknij OK.In oknie Metadane OME wyszukaj informacje o rozmiarze piksela. Skopiuj te dane.Aby skalibrować obraz, przejdź do paska menu i wybierz Właściwości obrazu. Skopiuj informacje i kliknij przycisk OK. Przypisz preferowaną tabelę lut do obrazu. Aby wyświetlić wszystkie stosy na jednym obrazie, przejdź do paska menu i wybierz Obraz, Stosy, Projekt Z.W wyświetlonym oknie projekcji zaznacz wszystkie stosy, w których wizualizowane są naczynia. W polu Typ projekcji wybierz opcję Średnia intensywność i kliknij przycisk OK. Przejdź do paska menu, Obraz, Dostosuj, Jasność/Kontrast. Kliknij Zastosuj i zapisz zmiany.Skopiuj parametry wybrane dla jasności i kontrastu. Muszą one być identyczne dla wszystkich obrazów. Na pasku menu wybierz narzędzie Różdżka.Wybierz obszar siatkówki, w którym brakuje uformowanych naczyń. Naciśnij T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrane obszary w Menedżerze ROI. Kliknij opcję Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji, aby uzyskać informacje o obszarze bezczynności.Powtórz te kroki, aby zmierzyć całkowitą powierzchnię siatkówki. Na pasku menu wybierz narzędzie Różdżka. Powiększ obraz, aby lepiej zobrazować neonaczynia.Zaznaczaj nowe naczynia jeden po drugim za pomocą narzędzia Różdżka. Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI. Kliknij opcję Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji, aby uzyskać dane obszaru.Na pasku menu wybierz narzędzie Linia prosta. Powiększ obraz, aby lepiej zobrazować ścianę naczynia. Wykonaj trzy linie poprzeczne do głównego naczynia przed pierwszym odgałęzieniem.Naciśnij T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrane obszary w Menedżerze zwrotu z inwestycji. Kliknij opcję Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji, aby uzyskać dane dotyczące odległości. Na pasku menu kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę narzędzia Linia prosta i wybierz opcję Linia segmentowana.Narysuj linię wewnątrz naczynia od nerwu wzrokowego do pierwszego rozgałęzienia naczynia, zgodnie z kształtem naczynia. Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI. Na pasku menu wybierz narzędzie Linia prosta.Narysuj linię od nerwu wzrokowego do pierwszego rozgałęzienia naczynia. Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI. Kliknij przycisk Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji, aby uzyskać dane dotyczące odległości.Za pomocą narzędzia Owal na pasku menu zdefiniuj obszar stosowany jednakowo do wszystkich warunków eksperymentalnych. Wybrany obszar musi być koncentrycznym okręgiem narysowanym wokół nerwu wzrokowego. Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI.Ręcznie policz liczbę głównych gałęzi wyrastających z głównych statków znajdujących się w obszarze wyboru. Przekształć obraz do trybu 8-bitowego. Przejdź do Wtyczki na pasku menu, wybierz Analiza naczyń, Gęstość naczyniowa.Za pomocą narzędzia Kwadrat na pasku menu zdefiniuj obszar, w którym chcesz zmierzyć gęstość naczyń. Kliknij przycisk OK. Program wyświetli nowe okno z wymaganymi informacjami. W pierwszym przykładzie eksperymentalnym wykorzystano mysi model retinopatii indukowanej tlenem.Iniekcje doszklistkowe wykonano w 12. dniu po urodzeniu w celu określenia skuteczności leku jako środka przeciwangiogennego. Myszy, którym wstrzyknięto nośnik, zastosowano jako kontrolę. Obszary jałowe definiuje się jako strefy, w których brakuje naczyń krwionośnych siatkówki.Na podstawie uzyskanych obrazów obszary beznaczyniowe można określić ilościowo jako sumę obszarów bez naczyń podzieloną na całkowitą powierzchnię siatkówki. Na obszarach z uszkodzeniami mechanicznymi również nie ma naczyń. Aby zidentyfikować uszkodzone obszary, przeanalizuj integralność warstw neuronalnych za pomocą barwienia Hoechst.Naczynia nowotworowe to naczynia małego kalibru, które pochodzą z wcześniej istniejących naczyń górnego splotu naczyniowego. Obliczono obszar zajmowany przez kępki neonazy, określając ilościowo obszar neowaskularny siatkówki zajmowany przez całkowitą powierzchnię siatkówki. Ponieważ kształt i rozmiar naczyń jest zmienny, czasami mogą wyglądać podobnie do szczątków i artefaktów.Aby odróżnić neonaczynia, sprawdź, czy kępka wyrasta z dojrzałego naczynia. Na potrzeby analizy dylatacji zmierzyliśmy średnicę naczynia głównego na trzech wysokościach przed pierwszym odgałęzieniem. Badacze muszą określić z góry określoną odległość, aby zmierzyć średnicę naczynia, aby zmniejszyć zmienność wyników.Idealnie, najdalszy punkt od nerwu wzrokowego powinien mieć około 300 mikrometrów. Sugerujemy przeprowadzenie analizy, a następnie uśrednienie co najmniej sześciu zwierząt na warunek. Jeśli chodzi o krętość, mierzymy odległość przebytą przez główne naczynie zgodnie z jego kształtem, w odniesieniu do odległości w linii prostej między nerwem wzrokowym a pierwszym punktem rozgałęzienia.Jak widać na obrazie, istnieje niejednorodność w falistości głównych naczyń. Aby uzyskać reprezentatywny wynik, należy określić ilościowo nie mniej niż sześć myszy na każdy warunek. Najnowsze parametry, rozgałęzienia i gęstość naczyń krwionośnych, analizowano w modelu zespołu metabolicznego wykazującego retinopatię nieproliferacyjną.W celu pomiaru rozgałęzień naczyniowych określiliśmy obszar kwantyfikacji, rysując koncentryczny okrąg, a następnie policzyliśmy, jedna po drugiej, pierwotne gałęzie powstające z głównego naczynia centralnego. Na podstawie uzyskanych obrazów gęstość naczyń krwionośnych określono ilościowo jako obszar zajmowany przez naczynia podzielone przez obszar ROI, który był umieszczony w różnych miejscach na każdej mikrofotografii. Unikaj ilościowego określania obszarów z uszkodzeniami mechanicznymi.Jeśli nakłucia obejmują więcej niż dwa obszary, siatkówkę należy wyrzucić. Podsumowując, w tym artykule pokazaliśmy klasyczne, ugruntowane i powtarzalne techniki ilościowego określania niektórych z najistotniejszych parametrów uwzględnianych w praktyce klinicznej.

quantification-vascular-parameters-whole-mount-retinas-mice-with-non

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Mikroskopia przyżyciowe może być używana u zwierząt do wizualizacji i pomiaru średnic naczyń krwionośnych siatkówki, prędkości przepływu krwi i całkowitego przepływu krwi w siatkówce.

Przyżyciowe pomiary wideomikroskopii przepływu krwi w siatkówce u myszy

Siatkówka gryzonia od dawna jest uznawana za dostępne okno do mózgu. W tym artykule technicznym przedstawiamy protokół, który wykorzystuje mysi model retinopatii indukowanej tlenem do badania mechanizmów, które prowadzą do niepowodzenia regeneracji naczyń w ośrodkowym układzie nerwowym po urazie niedokrwiennym. Opisany system można również wykorzystać do zbadania strategii wspomagających odrastanie funkcjonalnych naczyń krwionośnych w obrębie siatkówki i ośrodkowego układu nerwowego.

Ocena regeneracji naczyń w OUN za pomocą siatkówki myszy

Tutaj prezentujemy protokół neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem myszy (CNV), eksperymentalny model, który odtwarza naczyniowe cechy neowaskularnego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD). Po opanowaniu może niezawodnie i skutecznie indukować CNV jako system modelowy do testowania różnych środków eksperymentalnych.

Mysi model do neowaskularyzacji naczyniówkowej indukowanej laserem

Tutaj prezentujemy przydatność podłużnego obrazowania in vivo w obserwacji zmian morfologicznych wywołanej laserem neowaskularyzacji naczyniówkowej u myszy.

In vivo (in vivo) Multimodalne obrazowanie i analiza mysiego modelu neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem

Wiele zagrażających wzrokowi chorób oczu jest związanych z dysfunkcyjnymi mikronaczyniami siatkówki. Dlatego pomiar odpowiedzi tętniczek siatkówki jest ważny dla zbadania podstawowych mechanizmów patofizjologicznych. W artykule opisano szczegółowy protokół izolacji i przygotowania tętniczek siatkówki myszy do oceny wpływu substancji wazoaktywnych na średnicę naczyń krwionośnych.

Etapy przygotowania do pomiaru reaktywności tętniczek siatkówki myszy ex vivo

Retinopatia indukowana tlenem (OIR) może być używana do modelowania chorób niedokrwiennych siatkówki, takich jak retinopatia wcześniaków i proliferacyjna retinopatia cukrzycowa, a także służyć jako model dla badań potwierdzających słuszność koncepcji w ocenie leków antyangiogennych w chorobach neowaskularnych. OIR indukuje solidną i powtarzalną neowaskularyzację w siatkówce, którą można określić ilościowo.

Model retinopatii indukowanej tlenem w chorobach niedokrwiennych siatkówki u gryzoni

Ten protokół opisuje szczegółową metodę przygotowania i immunofluorescencji barwienia płaskich mocowań siatkówki myszy oraz analizy. Szczegółowo opisano również zastosowanie angiografii dna oka fluoresceiny (FFA) u młodych myszy i przetwarzanie obrazu.

Monitorowanie dynamicznego wzrostu naczyń siatkówki w mysim modelu retinopatii indukowanej tlenem

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół do zamykania żył siatkówki za pomocą róży bengalskiej i sterowanego laserowo systemu obrazowania siatkówki z zaleceniami maksymalizacji jego odtwarzalności w genetycznie modyfikowanych szczepach.

Optymalizacja mysiego modelu niedrożności żyły siatkówki w celu ograniczenia zmienności

Tutaj prezentujemy trzy protokoły analizy danych dla obrazów angiografii fluoresceinowej (FA) i optycznej koherentnej tomografii (OCT) w badaniu okluzji żył siatkówki (RVO).

In vivo (in vivo) Odczyty uszkodzeń naczyniowych w siatkówce myszy w celu zwiększenia odtwarzalności

Unaczynienie siatkówki myszy jest szczególnie interesujące w zrozumieniu mechanizmów powstawania wzorców naczyniowych. Protokół ten automatycznie mierzy średnicę naczyń siatkówki myszy na podstawie obrazów dna oka angiografii fluorescencyjnej w stałej odległości od tarczy nerwu wzrokowego.

Pomiar średnicy naczynia siatkówki na podstawie obrazów angiografii fluorescencyjnej myszy

Perycyty w unaczynieniu siatkówki zostały zbadane za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego z receptorem czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego β po retro-orbitalnym wstrzyknięciu fluorescencyjnej lektyny pomidorowej. Znakowaną siatkówkę poddano dalszej obróbce metodą oczyszczania tkanek i zamontowano w całości w celu wizualizacji trójwymiarowych widoków perycytów otaczających naczynia krwionośne siatkówki pod mikroskopem konfokalnym.

Wizualizacja 3D perycytów naczyniowych siatkówki myszy za pomocą immunostainingu

Poznaj metodę barwienia lektynowego do kwantyfikacji parametrów naczyniowych w siatkówkach myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę zmian naczyniowych.

Kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi (Wideo) | JoVE Journal

Kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi

Przeglądaj więcej filmów