Kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi
12 marca 2022
Ten artykuł opisuje dobrze sprawdzony i powtarzalny test barwienia lektyny dla całego preparatu siatkówki Mount oraz protokoły wymagane do ilościowego pomiaru parametrów naczyniowych często zmienianych w retinopatiach proliferacyjnych i nieproliferacyjnych.
W retinopatiach zmiany naczyniowe są pierwszym objawem wykrywanym przez klinicystów. Śledzą postęp choroby i dobierają leczenie zgodnie z tymi zmianami. Opracowano kilka modeli zwierzęcych w celu zbadania różnych etapów patologii.
W tej pracy pokażemy, jak mierzyć różne zmiany naczyniowe. W tym celu zamierzamy wykorzystać dwa modele zwierzęce. Jednym z nich jest mysi model retinopatii indukowanej tlenem, który odtwarza retinopatię wcześniaków i niektóre aspekty proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej.
Tutaj zmierzymy obszary jałowe, obszary neowaskularne oraz rozszerzenie i krętość tętniczek. W naszym laboratorium opracowano mysi model zespołu metabolicznego, który indukuje retinopatię nieproliferacyjną. W pracy oceniono gęstość naczyń krwionośnych i rozgałęzienia.
Po złożeniu ofiary z myszy wynukleatyzuj nożyczkami. Utrwal wyłuszczone oczy świeżo przygotowanym paraformaldehydem przez godzinę w temperaturze pokojowej. Pod mikroskopem preparacyjnym usuń rogówki nożyczkami, przecinając wzdłuż rąbka i wypreparuj całe siatkówki.
Wyrzuć przedni odcinek oka, a następnie oddziel siatkówkę od naczyniówki RPE. Umieść siatkówki w rurkach o pojemności 200 mikrolitrów. Następnie zablokuj i przesiąknij siatkówki w 100 mikrolitrach TBS zawierających 5% albuminy surowicy bydlęcej Triton przez sześć godzin w czterech stopniach z delikatnym mieszaniem w shakerze.
Następnie odwróć rurkę, aby umieścić siatkówkę w kubku i usuń roztwór blokujący za pomocą pipety. Dodać 100 mikrolitrów roztworu zawierającego izollektynę. Owiń probówki folią aluminiową, aby chronić próbki przed światłem.
Inkubować siatkówki z roztworem lektyny przez noc w temperaturze czterech stopni, delikatnie mieszając w shakerze. Przemyć siatkówki 100 mikrolitrami TBS-Triton przez 20 minut, delikatnie mieszając w shakerze. Powtórz ten krok trzy razy.
Umieść siatkówkę na szkiełku i dodaj kroplę PBS. Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj cztery jednakowo odległe nacięcia od krawędzi siatkówki w kierunku nerwu wzrokowego. Aby rozłożyć płatki siatkówki, użyj kleszczy lub małych kawałków bibuły filtracyjnej.
Upewnij się, że strona fotoreceptora jest skierowana w dół. Usuń pozostały PBS ze szkiełka za pomocą bibuły filtracyjnej. Następnie dodaj pas montażowy i szkiełko nakrywkowe.
Pozostaw do wyschnięcia na godzinę w temperaturze pokojowej. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze czterech stopni, chronić przed światłem. W mikroskopie konfokalnym umieść szkiełko na płytce ekranem do dołu.
Skoncentruj splot górny układu naczyniowego siatkówki i wybierz obszar, aby rozpocząć akwizycję obrazu. Ustaw ogólne parametry lasera w oprogramowaniu. Ustaw współrzędne w osiach X, Y i Z.
Zainicjuj skanowanie. Po zakończeniu procesu skanowania otwórz obraz i zapisz go z preferowanym rozszerzeniem. W oprogramowaniu ImageJ FIJI przejdź do paska menu i kliknij Plik, Otwórz.
Wybierz obraz do przetworzenia. W oknie Opcja importu formatów biologicznych wybierz opcję Wyświetl metadane OME-XML i kliknij OK.In oknie Metadane OME wyszukaj informacje o rozmiarze piksela. Skopiuj te dane.
Aby skalibrować obraz, przejdź do paska menu i wybierz Właściwości obrazu. Skopiuj informacje i kliknij przycisk OK. Przypisz preferowaną tabelę lut do obrazu. Aby wyświetlić wszystkie stosy na jednym obrazie, przejdź do paska menu i wybierz Obraz, Stosy, Projekt Z.
W wyświetlonym oknie projekcji zaznacz wszystkie stosy, w których wizualizowane są naczynia. W polu Typ projekcji wybierz opcję Średnia intensywność i kliknij przycisk OK. Przejdź do paska menu, Obraz, Dostosuj, Jasność/Kontrast. Kliknij Zastosuj i zapisz zmiany.
Skopiuj parametry wybrane dla jasności i kontrastu. Muszą one być identyczne dla wszystkich obrazów. Na pasku menu wybierz narzędzie Różdżka.
Wybierz obszar siatkówki, w którym brakuje uformowanych naczyń. Naciśnij T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrane obszary w Menedżerze ROI. Kliknij opcję Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji, aby uzyskać informacje o obszarze bezczynności.
Powtórz te kroki, aby zmierzyć całkowitą powierzchnię siatkówki. Na pasku menu wybierz narzędzie Różdżka. Powiększ obraz, aby lepiej zobrazować neonaczynia.
Zaznaczaj nowe naczynia jeden po drugim za pomocą narzędzia Różdżka. Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI. Kliknij opcję Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji, aby uzyskać dane obszaru.
Na pasku menu wybierz narzędzie Linia prosta. Powiększ obraz, aby lepiej zobrazować ścianę naczynia. Wykonaj trzy linie poprzeczne do głównego naczynia przed pierwszym odgałęzieniem.
Naciśnij T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrane obszary w Menedżerze zwrotu z inwestycji. Kliknij opcję Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji, aby uzyskać dane dotyczące odległości. Na pasku menu kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę narzędzia Linia prosta i wybierz opcję Linia segmentowana.
Narysuj linię wewnątrz naczynia od nerwu wzrokowego do pierwszego rozgałęzienia naczynia, zgodnie z kształtem naczynia. Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI. Na pasku menu wybierz narzędzie Linia prosta
.Narysuj linię od nerwu wzrokowego do pierwszego rozgałęzienia naczynia. Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI. Kliknij przycisk Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji, aby uzyskać dane dotyczące odległości.
Za pomocą narzędzia Owal na pasku menu zdefiniuj obszar stosowany jednakowo do wszystkich warunków eksperymentalnych. Wybrany obszar musi być koncentrycznym okręgiem narysowanym wokół nerwu wzrokowego. Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI.
Ręcznie policz liczbę głównych gałęzi wyrastających z głównych statków znajdujących się w obszarze wyboru. Przekształć obraz do trybu 8-bitowego. Przejdź do Wtyczki na pasku menu, wybierz Analiza naczyń, Gęstość naczyniowa.
Za pomocą narzędzia Kwadrat na pasku menu zdefiniuj obszar, w którym chcesz zmierzyć gęstość naczyń. Kliknij przycisk OK. Program wyświetli nowe okno z wymaganymi informacjami. W pierwszym przykładzie eksperymentalnym wykorzystano mysi model retinopatii indukowanej tlenem.
Iniekcje doszklistkowe wykonano w 12. dniu po urodzeniu w celu określenia skuteczności leku jako środka przeciwangiogennego. Myszy, którym wstrzyknięto nośnik, zastosowano jako kontrolę. Obszary jałowe definiuje się jako strefy, w których brakuje naczyń krwionośnych siatkówki.
Na podstawie uzyskanych obrazów obszary beznaczyniowe można określić ilościowo jako sumę obszarów bez naczyń podzieloną na całkowitą powierzchnię siatkówki. Na obszarach z uszkodzeniami mechanicznymi również nie ma naczyń. Aby zidentyfikować uszkodzone obszary, przeanalizuj integralność warstw neuronalnych za pomocą barwienia Hoechst.
Naczynia nowotworowe to naczynia małego kalibru, które pochodzą z wcześniej istniejących naczyń górnego splotu naczyniowego. Obliczono obszar zajmowany przez kępki neonazy, określając ilościowo obszar neowaskularny siatkówki zajmowany przez całkowitą powierzchnię siatkówki. Ponieważ kształt i rozmiar naczyń jest zmienny, czasami mogą wyglądać podobnie do szczątków i artefaktów.
Aby odróżnić neonaczynia, sprawdź, czy kępka wyrasta z dojrzałego naczynia. Na potrzeby analizy dylatacji zmierzyliśmy średnicę naczynia głównego na trzech wysokościach przed pierwszym odgałęzieniem. Badacze muszą określić z góry określoną odległość, aby zmierzyć średnicę naczynia, aby zmniejszyć zmienność wyników.
Idealnie, najdalszy punkt od nerwu wzrokowego powinien mieć około 300 mikrometrów. Sugerujemy przeprowadzenie analizy, a następnie uśrednienie co najmniej sześciu zwierząt na warunek. Jeśli chodzi o krętość, mierzymy odległość przebytą przez główne naczynie zgodnie z jego kształtem, w odniesieniu do odległości w linii prostej między nerwem wzrokowym a pierwszym punktem rozgałęzienia.
Jak widać na obrazie, istnieje niejednorodność w falistości głównych naczyń. Aby uzyskać reprezentatywny wynik, należy określić ilościowo nie mniej niż sześć myszy na każdy warunek. Najnowsze parametry, rozgałęzienia i gęstość naczyń krwionośnych, analizowano w modelu zespołu metabolicznego wykazującego retinopatię nieproliferacyjną.
W celu pomiaru rozgałęzień naczyniowych określiliśmy obszar kwantyfikacji, rysując koncentryczny okrąg, a następnie policzyliśmy, jedna po drugiej, pierwotne gałęzie powstające z głównego naczynia centralnego. Na podstawie uzyskanych obrazów gęstość naczyń krwionośnych określono ilościowo jako obszar zajmowany przez naczynia podzielone przez obszar ROI, który był umieszczony w różnych miejscach na każdej mikrofotografii. Unikaj ilościowego określania obszarów z uszkodzeniami mechanicznymi.
Jeśli nakłucia obejmują więcej niż dwa obszary, siatkówkę należy wyrzucić. Podsumowując, w tym artykule pokazaliśmy klasyczne, ugruntowane i powtarzalne techniki ilościowego określania niektórych z najistotniejszych parametrów uwzględnianych w praktyce klinicznej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia analizę z użyciem barwienia lektynowego, opracowaną dla preparatów całej siatkówki, w celu ilościowego pomiaru parametrów naczyniowych związanych z retinopatiami. Badanie wykorzystuje dwa modele zwierzęce: myszy z retinopatią indukowaną tlenem oraz model mysi z zespołem metabolicznym, koncentrując się na zmianach naczyniowych kluczowych dla progresji retinopatii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Retinopatia
- Biologia naczyniowa
Wprowadzenie
- Zmiany naczyniowe są wczesnymi wskaźnikami w progresji retinopatii.
- Modele zwierzęce są kluczowe dla badania różnych etapów patologii siatkówki.
- Analiza koncentruje się na pomiarze gęstości naczyń, obszarów awaskularnych oraz neowaskularyzacji.
Cel badania
- Szczegółowe opisanie powtarzalnej metody analizy zmian naczyniowych w preparatach siatkówki.
- Zbadanie specyficznych parametrów naczyniowych związanych z proliferacyjnymi i nieproliferacyjnymi retinopatiami.
- Wsparcie identyfikacji skuteczności leczenia na podstawie zmian naczyniowych.
Zastosowane metody
- Oceny naczyniowe przeprowadzono z wykorzystaniem preparatów całej siatkówki myszy.
- W badaniu zastosowano mysi model retinopatii indukowanej tlenem oraz model zespołu metabolicznego.
- Siatkówki barwiono izolektyną i analizowano przy użyciu mikroskopii konfokalnej.
- Kluczowe etapy obejmowały fiksację, barwienie oraz różnorodne techniki obrazowania w celu przeprowadzenia analizy ilościowej.
Główne wyniki
- Badanie pozwoliło na skuteczne określenie ilości obszarów awaskularnych i neowaskularnych, a także charakterystyki naczyń, takich jak rozszerzenia i krętość.
- Wyniki dostarczają informacji na temat dynamiki naczyniowej związanej z różnymi typami retinopatii.
- Analiza ta umożliwia spójny pomiar kluczowych parametrów naczyniowych w badaniach nad siatkówką.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia skuteczną metodę badania zmian naczyniowych w patologiach siatkówki.
- Wyniki pogłębiają zrozumienie mechanizmów choroby i mogą stanowić podstawę dla potencjalnych interwencji terapeutycznych.
- Opisany protokół wzbogaca zestaw narzędzi dostępnych dla badaczy analizujących dynamikę naczyniową siatkówki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa ocena parametrów naczyniowych siatkówki umożliwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka w przedklinicznych modelach retinopatii, wspierając walidację celów terapeutycznych oraz wyjaśnianie szlaków sygnalizacyjnych. Metoda ta zapewnia wiarygodną wartość prognostyczną w ocenie interwencji antyangiogennych poprzez pomiar obszarów awaskularnych i neowaskularnych, średnicy naczyń, ich krętości oraz stopnia rozgałęzienia. Dzięki temu badanie to stanowi translacyjne narzędzie biomarkerowe do wczesnego etapu odkrywania leków oraz selekcji projektów w rozwoju leków okulistycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określenie zmian naczyniowych w modelach retinopatii indukowanej tlenem oraz zespołu metabolicznego.
- Wartość operacyjna: Umożliwienie funkcjonalnej walidacji celów terapeutycznych poprzez standaryzowany pomiar kłębków neowaskularnych i stref awaskularnych.
- Wartość prognostyczna: Wsparcie w selekcji projektów badawczych poprzez dostarczenie ilościowych progów dysregulacji naczyniowej powiązanej z progresją choroby.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych układów siatkówek w całości do późniejszego przesiewu związków z wykorzystaniem barwienia naczyniowego opartego na izolektynach.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie standaryzacji analizy poprzez stałe protokoły barwienia, obrazowanie konfokalne oraz przepływy pracy kwantyfikacji w programie ImageJ FIJI.
- Skalowalność: Umożliwienie powtarzalnych pomiarów gęstości, średnicy i krętości naczyń w różnych warunkach eksperymentalnych w celu rzetelnej oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy wskaźniki naczyniowe z fazy odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez ilościowe określenie obszarów awaskularnych i neowaskularnych w kontekście danej choroby.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Zmniejsza niejednoznaczność w modulacji szlaków angiogenezy, zapewniając bezpośrednie odczyty rozgałęzień i rozszerzeń naczyniowych.
- Pewność prognostyczna: Jest spójna z punktami końcowymi badań klinicznych, odwzorowując parametry naczyniowe stosowane do klasyfikacji nieproliferacyjnych i proliferacyjnych retinopatii.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Test ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków — od weryfikacji hipotez dotyczących punktów uchwytu po identyfikację związków wiodących — umożliwiając ilościowe fenotypowanie naczyniowe przed badaniami nad skutecznością przedkliniczną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez pomiar gęstości i rozgałęzień naczyń w modelach zespołu metabolicznego oraz retinopatii indukowanej tlenem.
- Przesiew: Zapewnia gotowość do przeprowadzania analiz dzięki standaryzowanemu barwieniu izolektynami, akwizycji konfokalnej i kwantyfikacji parametrów naczyniowych w oparciu o ROI.
- Analityka: Generuje ilościowe wskaźniki, w tym stosunek obszaru beznaczyniowego, ułamek obszaru neowaskularyzacji, średnicę naczyń, indeks krętości oraz liczbę głównych odgałęzień w celu porównania różnych stanów.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy naczyniowe z etapem choroby poprzez kwantyfikację parametrów odróżniających retinopatię nieproliferacyjną od proliferacyjnej.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Tworzy platformę fenotypowania naczyniowego z możliwością ponownego wykorzystania w modelach retinopatii genetycznych, farmakologicznych i środowiskowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w zakresie oddziaływania na cel poprzez ilościowe określenie funkcjonalnych wyników naczyniowych w systemach istotnych dla danej choroby.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji procedur fiksacji, blokowania, inkubacji z lektynami, płukania i montowania preparatów.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie ilościowych progów naczyniowych, co zmniejsza ryzyko biologiczne w późnych fazach programów okulistycznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko w oparciu o mierzalne zmiany w strefach awaskularnych, kępkach neowaskularnych i patologii tętniczek.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w preparatyce wycinania siatkówki, przygotowywaniu preparatów całych (whole mount) oraz mikroskopii konfokalnej.
- Zależność od infrastruktury mikroskopii fluorescencyjnej oraz programu ImageJ FIJI z wtyczkami do analizy naczyniowej.
- Konieczność standaryzacji wyboru ROI, ustawień jasności/kontrastu oraz głębokości próbkowania pomiędzy laboratoriami.
- Konieczność uwzględnienia zmienności biologicznej poprzez uśrednianie danych z co najmniej sześciu zwierząt na każdą grupę badawczą.
- Ograniczenie do jakościowego odróżniania neonaczyniotworów od artefaktów, co wymaga weryfikacji pochodzenia kęp naczyniowych z naczyń dojrzałych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące Biofarmacji
Chapters in this video
0:13
Introduction
1:19
Fluorescent Lectin Statining
3:31
Confocal Microscopy Visualization and Microphotograph Acquisition
4:14
Image Processing
5:31
Quantification of Avascular Areas
6:01
Quantification of Neovascular Areas
6:27
Quantification of Vessel Diameter
6:57
Quantification of Vessel Tortuosity
7:44
Quantification of Vascular Branching
8:16
Quantification of Vascular Density
8:43
Results
12:00
Conclusion
