Prosty chip mikroprzepływowy do długoterminowego wzrostu i obrazowania Caenorhabditis elegans

Główną zaletą tej techniki jest to, że zwierzę może swobodnie rosnąć wewnątrz urządzenia i może zostać uwięzione w celu obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Urządzenie może być wielokrotnie używane. Podczas produkcji urządzenia czystość jest najważniejszym czynnikiem, aby móc wytwarzać urządzenia bezpyłowe, aby uniknąć wycieków podczas pracy urządzenia.

Aby rozpocząć, zaprojektuj wzór pierwszy dla warstwy przepływu i wzór drugi dla warstwy kontrolnej przy użyciu prostokątnych kształtów w edytorze tekstu i wydrukuj maski fotograficzne za pomocą plotera laserowego o minimalnym rozmiarze elementu wynoszącym osiem mikrometrów na folii na bazie poliestru. Pokrój wafle krzemowe na kwadratowe kawałki o wysokości i szerokości 2,5 centymetra. Oczyść je 20% wodorotlenkiem potasu przez minutę i opłucz wafle w wodzie dejonizowanej.

Użyj jednej płytki do przepływu, a drugiej do warstwy kontrolnej. Wysuszyć kawałki sprężonym azotem 14 P-S-I, a następnie odwodnić na gorącej płycie w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Po schłodzeniu weź jeden kawałek silikonu, umieść go na uchwycie kodera spinowego i włącz próżnię, aby utrzymać wafel na miejscu.

Umieść około 20 mikrolitrów heksametylodilanu na kawałku krzemu i pokryj go za pomocą kodera spinowego przy 500 R-P-M przez pięć sekund, a następnie 3000 R-PM przez 30 sekund. Aby uzyskać jednolitą grubość fotorezystu wynoszącą około 40 mikrometrów specyficzną dla warstwy przepływu, pokryj płytkę krzemową około 1,5 mililitra ujemnego fotorezystu za pomocą kodera spinowego przy 500 R-P-M przez pięć sekund, a następnie 2000 R-PM przez 30 sekund. Powtórzyć powlekanie kawałka krzemu heksametylodirylanem i ujemnym fotorezysłem dla drugiej płytki, aby uzyskać jednolitą grubość fotorezystu około 40 mikrometrów właściwą dla warstwy kontrolnej.

Alternatywnie, aby zwiększyć grubość warstwy przepływowej do około 80 mikrometrów dla starszych zwierząt, pokryj płytki krzemowe około 1,5 mililitra ujemnego fotorezystu dwa, używając kodera spinowego przy 500 R-P-M przez pięć sekund, a następnie 2000 R-P-M przez 30 sekund. Piecz oba wcześniej pokryte fotorezystem kawałki silikonu na gorącej płycie w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez minutę, a następnie w 95 stopniach Celsjusza przez 10 minut. Po schłodzeniu umieść miękkie, wypieczone kawałki silikonu na stoliku naświetlającym UV z powierzchnią pokrytą fotorezystem skierowaną w stronę lampy UV.

Wystaw oba elementy oddzielnie na działanie promieniowania UV przez 15 sekund za pomocą lampy o mocy 200 W przez maskę fotograficzną z wzorami pierwszym i drugim, aby uzyskać odpowiednio warstwę przepływu i kontrolę. Upiecz dwa odsłonięte kawałki silikonu, jak opisano wcześniej, z powlekanymi warstwami skierowanymi do góry. Po schłodzeniu kawałków opracuj wzory, mocząc kawałki silikonu w roztworze wywoływacza fotorezystu przez 20 minut.

Gdy wzór będzie widoczny, spłucz kawałki czystym alkoholem izopropylowym i delikatnie wysusz suszarką za pomocą gazowego azotu. Trzymaj kawałki silikonu w eksykatorze powlekaną powierzchnią skierowaną do góry. Wystaw kawałki na działanie oparów silanów, wylewając 50 mikrolitrów czystego T-C-P-F-O-S na szklane szkiełko.

Umieścić szkiełko w eksykatorze i inkubować przez dwie godziny. Zrób P-D-M-S w plastikowym kubku, mieszając bazę elastomerową z utwardzaczem i ciągle mieszaj przez trzy minuty. Odgazuj P-D-M-S, mieszaj w eksykatorze przez 30 minut, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.

Umieść wafle krzemowe warstwy kontrolnej na szalce Petriego i wylej warstwę mieszanki P-D-M-S o grubości pięciu milimetrów na kawałki krzemu. Po procesie nalewania P-D-M-S powtórz odgazowanie mieszanki P-D-M-S. Umieść płytkę krzemową z warstwą przepływową skierowaną w stronę wózka obrotowego, stosując podciśnienie od 200 do 500 militorów.

Wlej około jednego mililitra P-D-M-S na płytkę krzemową. Zakoduj go za pomocą powlekarki wirowej, aby uzyskać warstwę o grubości około 80 mikrometrów. Piecz dwie płytki krzemowe z powlekanym wirowo P-D-M-S i wylewaj warstwy P-D-M-S w temperaturze 50 stopni Celsjusza w piecu konwekcyjnym na gorące powietrze przez sześć godzin.

Po schłodzeniu kawałki odetnij warstwę P-D-M-S o grubości pięciu milimetrów od kawałka silikonu wokół warstwy kontrolnej za pomocą ostrego ostrza i oderwij ją od podłoża silikonowego. Przebić dwa otwory o średnicy około jednego milimetra za pomocą dziurkacza Harris w zbiorniku bloku P-D-M-S, aby połączyć kanał unieruchamiający i wloty kanału izolacyjnego z przewodami gazowymi w celu ugięcia membrany P-D-M-S. Umieść kawałek silikonu z warstwą PDS pokrytą spinem na wzór pierwszy z powierzchnią pokrytą P-D-M-S skierowaną do góry na plastikowej tacy.

Trzymaj dziurkowany blok P-D-M-S ze wzorem drugim na tacy uformowaną stroną do góry. Trzymaj plastikową tacę w środku środka do czyszczenia plazmowego i wystawiaj dwie powierzchnie P-D-M-S na działanie plazmy powietrznej o mocy 18 W przez dwie minuty, stosując niskie podciśnienie. Wyjmij dwa bloki poddane obróbce plazmowej i delikatnie zwiąż bloki, ściskając ze sobą powierzchnie poddane obróbce plazmowej wzorów pierwszego i drugiego.

Piecz połączone wzory w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez dwie godziny w piecu konwekcyjnym na gorące powietrze. Po wyjęciu klejonego urządzenia z pieca, należy je wyciąć z wafla krzemowego wzorem pierwszym i wzorem drugim i przebić otwory w zbiornikach wlotowych i wylotowych warstwy przepływowej za pomocą dziurkacza Harrisa. Umieść klejony blok P-D-M-S warstwą przepływową skierowaną do góry na plastikowej tacy i utrzymuj czystą szklankę nakrywkową na tej samej tacy.

Wystaw bloki w szkle nakrywkowym na działanie plazmy powietrznej o mocy 18 W przez dwie minuty. Dostosuj podciśnienie, aby zobaczyć fioletową komorę. Umieść naświetlony plazmą blok P-D-M-S na szkle nakrywkowym i piecz połączoną strukturę w piekarniku w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Przechowuj urządzenie w czystej komorze do wszelkich przyszłych eksperymentów. Weź urządzenie, umieść je w mikroskopie stereoskopowym i przymocuj rurki. Podłącz rurkę microflex do przewodu gazowego ze sprężonym azotem i trójdrożnego łącznika na drugim końcu.

Podłącz rurki jeden i dwa łączniki trójdrogowe odpowiednio do syfonu w membranach izolacyjnych. Podłącz dwie rurki microflex do dwóch portów wylotowych trójdrogowego kurka. Podłącz drugi koniec dwóch rurek do igły o długości ośmiu milimetrów i rozmiarze 18.

Napełnij warstwę przepływową buforem M-9 za pomocą mikropipety przez port wlotowy. Napełnij obie probówki wodą dejonizowaną przez koniec podłączony do igły. Włóż dwie igły do wybitych otworów łączących membranę izolacyjną i pułapkową.

Otwórz regulator azotu gazowego na 14 PS-I i przekręć zawór trójdrogowy z pierwszej rurki, aby wepchnąć wodę do urządzenia przez kanały mikroprzepływowe w warstwach kontrolnych, a mianowicie w membranach syfonu i izolacji. Zwolnij ciśnienie za pomocą trójdrogowego kranu, gdy kanały zostaną napełnione wodą i zalane. Usuń pęcherzyki, przepuszczając dodatkowe media przez kanał przepływowy.

Rysunek przedstawia obrazy P-S-3-2-3-9, zwierzęcia rosnącego wewnątrz chipa mikroprzepływowego i unieruchamianego co osiem do 10 godzin w celu uchwycenia obrazów fluorescencyjnych. Zmienność wzorca ekspresji stanowi przykład czasowej regulacji genów, w której ten sam gen ulega ekspresji w różnych komórkach na różnych etapach rozwoju. Obrazowanie indywidualnego genotypu W-D-I-S-5-1 caenorhabditis elegans pokazuje podobną do menory rozgałęzioną architekturę dendrytyczną w każdym neuronie P-V-D, obejmującą pierwszorzędowe, drugorzędowe i czwartorzędowe procesy odpowiednio w stadiach rozwojowych L-2, późnego L-2, L-3 i L-4.

Na rysunku porównano zwierzęta rozwijające się i hodowane w urządzeniach P-V-D oraz te hodowane na płytkach N-G-M. Liczba S-P i Q-P na różnych etapach rozwoju robaka wzrastała wraz z wiekiem. Caenorhabditis elegans leczono kroplą trzymilimolowego lewamizolu, aby spowodować wystarczający paraliż wymagany do obrazowania w wysokiej rozdzielczości.

Wartości S-P nie różniły się istotnie, gdy mierzono je podobnymi zwierzętami w stadium hodowanymi na płytkach N-G-M i obrazowanymi przy użyciu trzymilimolowego lewamizolu na szkiełku agarowym. Co więcej, odległość między dwoma ciałami komórek P-V-C, jednym obecnym w ogonie, a drugim w pobliżu sromu, zwiększa się w miarę ich oddalania się zarówno u zwierząt hodowanych w urządzeniu, jak i tych hodowanych na płytkach N-G-M. Rysunek przedstawia obraz o wysokiej rozdzielczości neuronów receptorów dotyku u zwierząt rosnących wewnątrz urządzenia mikroprzepływowego.

Montaż przedstawia cały proces neuronalny P-L-M-R w kolejnych punktach czasowych, podkreślając mitochondria i proces neuronalny. Wykres przedstawia całkowitą długość procesu neuronalnego, który zaobserwowano, że zwiększa się wraz ze spadkiem 10,4 mikrometra na godzinę. Mikro-wytworzone urządzenie wykorzystuje cienką membranę P-D-M-S odchylającą się w obecności azotu pod wysokim ciśnieniem do unieruchamiania i utrzymywania C-eleganów na miejscu w celu obrazowania o wysokiej rozdzielczości.

Procedura ta może umożliwić badania podłużne procesów komórkowych i subkomórkowych u C-elegan, które wymagają okresowych obserwacji przez długi okres czasu.