Name: Prosty chip mikroprzepływowy do długoterminowego wzrostu i obrazowania Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj metodę mikroprzepływową do długoterminowego wzrostu Caenorhabditis elegans z ciągłym dostarczaniem pokarmu i obrazowaniem wysokiej rozdzielczości. To podejście umożliwia badanie procesów komórkowych podczas rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy ośrodku obrazowania CIFF, NCBS za korzystanie z mikroskopów konfokalnych wspieranych przez DST - Centrum Nanotechnologii (No. SR/55/NM-36-2005). Dziękujemy za finansowanie badań z DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), spinning disc wspieranego przez DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK i Gautam Menon) oraz grantu HHMI-IECS numer 55007425 (SPK). Szczepy HB101, PS3239 i wdIs51 zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center (CGC), które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440). S.P.K. wyprodukował jsIs609 w laboratorium Mike'a Noneta.

<ol><li>Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+Mutant+Identification+with+a+One-Step+Whole-Genome-Sequencing+and+SNP+Mapping+Strategy%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy.</a> PloS One. 5 (11), 15435(2010).</li>
<li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook.+The+C.+elegans.+Research+Community%2C+WormBook%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).</li>
<li>Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+vivo+neuronal+transport+in+genetic+model+organisms+using+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices.</a> Traffic. 12 (4), Copenhagen, Denmark. 372-385 (2011).</li>
<li>Steele, L. M., Sedensky, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+Anesthetic+Mechanisms%3A+The+C.+elegans+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model.</a> Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).</li>
<li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook.+The+C.+elegans.+Research+Community%2C+WormBook%22%5BJournal%5D)">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).</li>
<li>Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laterally+orienting+C.+elegans+using+geometry+at+microscale+for+high-throughput+visual+screens+in+neurodegeneration+and+neuronal+development+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies.</a> PloS One. 7 (4), 35037(2012).</li>
<li>Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+device+for+size+based+separation+of+C.+elegans+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages.</a> Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).</li>
<li>Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+on-chip+rapid+microscopy%2C+phenotyping+and+sorting+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).</li>
<li>Desta, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+and+Trapping+of+a+Single+C.+elegans+Worm+in+a+Microfluidic+Chip+for+Automated+Microplate+Dispensing%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Technology%22%5BJournal%5D)">Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing.</a> SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).</li>
<li>Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+and+High-Throughput+In+Vivo+Drug+Screening+Platforms+Using+Microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics.</a> Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).</li>
<li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nature Communications. 7, 13023(2016).</li>
<li>Fehlauer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+Microfluidics+Device+for+Mechanical+Stimulation+and+High+Resolution+Imaging+of+C.+Elegant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530(2018).</li>
<li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li>
<li>Cornaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+microfluidic+platform+for+C.+elegans+embryo+arraying%2C+phenotyping%2C+and+long-term+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging.</a> Scientific Reports. 5, 10192(2015).</li>
<li>Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ultra-thin+chips+for+immobilization+of+Caenorhabditis+elegans+in+microfluidic+channels+during+irradiation+and+selection+of+buffer+solution+to+prevent+dehydration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).</li>
<li>Hulme, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan-on-a-chip%3A+microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Devices+for+Behavioral+Analysis%2C+Microscopy%2C+and+Neuronal+Imaging+in+Caenorhabditis+Elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 1327, Clifton, N.J. 159-179 (2015).</li>
<li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li>
<li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NemaLife+chip%3A+a+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16190(2020).</li>
<li>Allen, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-synapse+ablation+and+long-term+imaging+in+live+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).</li>
<li>Guo, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).</li>
<li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Mitochondrial+Density+and+Positioning+along+a+Growing+Neuronal+Process+in+Individual+C.+elegans+Neuron+Using+a+Long-Term+Growth+and+Imaging+Microfluidic+Device%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device.</a> eNeuro. 8 (4), (2021).</li>
<li>Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+High-Resolution+Imaging+of+Developing+C.+elegans+Larvae+with+Microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics.</a> Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).</li>
<li>Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+time-lapse+microscopy+of+C.+Elegans+post-embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development.</a> Nature Communications. 7, 12500(2016).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biostable%2C+anti-fouling+zwitterionic+polyurethane-urea+based+on+PDMS+for+use+in+blood-contacting+medical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+materials+chemistry+B%22%5BJournal%5D)">A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices.</a> Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).</li>
<li>Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28dimethylsiloxane%29+thin+films+as+biocompatible+coatings+for+microfluidic+devices%3A+cell+culture+and+flow+studies+with+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+ResearchPart+A%22%5BJournal%5D)">Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells.</a> Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).</li>
<li>Folch, A., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+micropatterns+on+biocompatible+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Cellular micropatterns on biocompatible materials.</a> Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).</li>
<li>Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+PDMS+%28polydimethylsiloxane%29+bioreactor+for+large-scale+culture+of+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes.</a> Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).</li>
<li>Mehta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+and+control+of+oxygen+levels+in+microfluidic+poly%28dimethylsiloxane%29+bioreactors+during+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture.</a> Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).</li>
<li>Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+polydimethylsiloxane+substrates+with+tunable+elastic+modulus+to+study+cell+mechanobiology+in+muscle+and+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve.</a> PloS One. 7 (12), 51499(2012).</li>
<li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+markers+for+Caenorhabditis+elegans+vulval+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells.</a> Mechanisms of Development. 119, Suppl 1 203-209 (2002).</li>
<li>Fatouros, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Tau+aggregation+in+a+novel+caenorhabditis+elegans+model+of+tauopathy+mitigates+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity.</a> Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).</li>
<li>Smith, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+and+cell-speci+fi+c+expression+pro+fi+ling+reveal+dynamic+branching+and+molecular+determinants+of+a+multi-dendritic+nociceptor+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans.</a> Developmental Biology. 345 (1), 18-33 (2010).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOren-Suissa%2C+M+%22Science%22">Science</a>. 328 (5983), New York, N.Y. 1285-1288 (2010).</li>
<li>Smith, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+neuron+fates+are+distinguished+by+a+transcriptional+switch+that+regulates+dendrite+branch+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization.</a> Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).</li>
<li>Shrestha, B. R., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+morphogenesis%3A+worms+get+an+EFF+in+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization.</a> Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).</li>
<li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nanosecond+laser+axotomy%3A+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).</li>
<li>Sure, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-16%2FJIP3+and+UNC-76%2FFEZ1+limit+the+density+of+mitochondria+in+C.+elegans+neurons+by+maintaining+the+balance+of+anterograde+and+retrograde+mitochondrial+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8938(2018).</li>
<li>Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+distribution+of+mitochondria+in+touch+receptor+neurons+of+C.+elegans+influences+touch+response%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
</ol>

S.M. i S.P.K. są autorami oczekującego na opatentowanie urządzenia do mikroprzepływowego wzrostu i obrazowania (zgłoszenie patentowe nr 640/CHE/2011).

W niniejszej pracy opisano protokół wytwarzania i stosowania prostego urządzenia mikroprzepływowego do hodowli C. elegans ze stałym dopływem pokarmu i obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości pojedynczego zwierzęcia podczas jego rozwoju. Ten proces wytwarzania jest prosty i można go przeprowadzić w niesterylnym środowisku. Środowisko wolne od kurzu ma kluczowe znaczenie na etapach produkcji. Obecność cząstek pyłu doprowadziłaby do niewłaściwego kontaktu między dwiema powierzchniami łączącymi, co skutkowałoby słaby...

Caenorhabditis elegans okazał się być potężnym organizmem modelowym do badania biologii komórki, starzenia się, biologii rozwoju i neurobiologii. Zalety, takie jak przezroczysta powłoka, krótki cykl życia, łatwa konserwacja, określona liczba komórek, homologia z kilkoma ludzkimi genami i dobrze zbadana genetyka, sprawiły, że C. elegans stał się popularnym modelem zarówno dla podstawowych odkryć biologicznych, jak i badań stosowanych1,2. Zrozumienie procesów biologicznych i rozwojowych zachodzących w komórce na podstawie wielokrotnych, długotrwałych obserwacji poszczególnych zwierząt może okazać się korzystne. Konwencjonalnie C. elegans jest znieczulana na podkładkach agarowych i obrazowana pod mikroskopem. Niekorzystny wpływ środków znieczulających na zdrowie zwierząt ogranicza stosowanie znieczulonych zwierząt do długotrwałego i powtarzającego się przerywanego obrazowania tego samego zwierzęcia3,4. Najnowsze postępy w technologiach mikroprzepływowych i ich adaptacja do odłowu C. elegans bez znieczulenia przy znikomym zagrożeniu dla zdrowia umożliwiają obrazowanie tego samego zwierzęcia w wysokiej rozdzielczości w krótkim i długim okresie czasu.
Mikroprzepływowe chipy zostały zaprojektowane dla C. elegans'5 wysokoprzepustowych badań przesiewowych6,7,8, pułapkowanie i dozowanie9, badanie przesiewowe leków10,11, stymulacja neuronów za pomocą obrazowania w wysokiej rozdzielczości12 i wysoka rozdzielczość Obrazowanie zwierzęcia12,13,14. Opracowano również ultracienkie arkusze mikroprzepływowe do unieruchamiania na szkiełkach15. Długoterminowe badania C. elegans przeprowadzono przy użyciu obrazów o niskiej rozdzielczości zwierząt rosnących w płynnej kulturze, aby obserwować wzrost, dynamikę wapnia, wpływ leków na ich zachowanie16,17,18,19, ich długowieczność i starzenie się20. Przeprowadzono długoterminowe badania z wykorzystaniem mikroskopii o wysokiej rozdzielczości w celu oceny rozwoju synaptycznego21, regeneracji neuronów22 oraz addycji mitochondrialnej23. Długoterminowe obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i śledzenie losu i różnicowania komórek zostało przeprowadzone w urządzeniach wielokanałowych24,25. Kilka zdarzeń komórkowych i subkomórkowych zachodzi w skali czasowej kilku godzin i wymaga uwięzienia tego samego osobnika w różnych punktach czasowych podczas jego rozwoju, aby scharakteryzować wszystkie pośrednie etapy procesu w celu zrozumienia dynamiki komórkowej in vivo. Aby zobrazować procesy biologiczne, takie jak organogeneza, rozwój neuronów i migracja komórek, zwierzę musi być unieruchomione w tej samej orientacji w wielu punktach czasowych. Wcześniej opublikowaliśmy protokół obrazowania C. elegans w wysokiej rozdzielczości przez ponad 36 godzin, aby określić, gdzie mitochondria są dodawane wzdłuż neuronów receptora dotyku (TRN)23.
Ten artykuł zawiera protokół do ustanowienia metodologii opartej na mikrofluidyce dla wielokrotnego obrazowania w wysokiej rozdzielczości. To urządzenie, z pojedynczym kanałem przepływu, najlepiej nadaje się do wielokrotnego obrazowania pojedynczego zwierzęcia na urządzenie. Aby zwiększyć przepustowość i obrazować wiele zwierząt jednocześnie, wiele urządzeń można podłączyć do tego samego przewodu ciśnieniowego, ale z oddzielnymi trójdrożnymi złączami sterującymi pojedynczym zwierzęciem w każdym urządzeniu. Projekt jest przydatny w badaniach, które wymagają obrazów poklatkowych o wysokiej rozdzielczości, takich jak procesy rozwojowe po zarodku, migracja komórek, transport organelli, badania ekspresji genów itp. Technologia ta może być ograniczona w przypadku niektórych zastosowań, takich jak badania nad długością życia i starzeniem się, które wymagają równoległego wzrostu i obrazowania wielu zwierząt w późnym stadium rozwoju. Elastomer polidimetylosiloksanu (PDMS) został użyty do produkcji tego urządzenia ze względu na jego biostabilność26, biocompatibility27,28, przepuszczalność gazu29,30, oraz przestrajalny moduł sprężystości31. To dwuwarstwowe urządzenie umożliwia wzrost zwierząt przy ciągłym dostarczaniu pokarmu w kanale mikroprzepływowym oraz wychwytywanie pojedynczych C. elegans poprzez kompresję membrany PDMS przy użyciu gazowego azotu. To urządzenie jest rozszerzeniem poprzednio opublikowanego urządzenia z tą zaletą, że hoduje i obrazuje to samo zwierzę w mikrokanale pod ciągłym podawaniem pokarmu3. Dodatkowa sieć membran izolacyjnych oraz membrana pułapkowa o szerokości 2 mm umożliwiają skuteczne unieruchomienie rozwijających się zwierząt. Urządzenie było używane do obserwacji rozwoju neuronów, rozwoju sromu i arboryzacji dendrytycznej w neuronach czuciowych PVD. Zwierzęta rosną w urządzeniu bez negatywnych skutków zdrowotnych i mogą być wielokrotnie unieruchamiane, aby ułatwić obrazowanie zdarzeń subkomórkowych u tego samego zwierzęcia podczas jego rozwoju.
Cały protokół jest podzielony na pięć części. Część 1 opisuje produkcję urządzenia do wzrostu i obrazowania chipa. W części 2 opisano, jak ustawić system ciśnieniowy dla ugięcia membrany PDMS w celu unieruchomienia i odizolowania poszczególnych C. elegans. Część 3 opisuje, jak zsynchronizować C. elegans na płytce pożywki wzrostowej nicieni (NGM) do obrazowania urządzenia. Część 4 opisuje, jak załadować pojedyncze zwierzę do urządzenia i hodować je w urządzeniu mikroprzepływowym przez kilka dni. W części 5 opisano, jak unieruchomić pojedyncze zwierzę w wielu punktach czasowych, rejestrować obrazy w wysokiej rozdzielczości przy użyciu różnych obiektywów i analizować obrazy za pomocą Fidżi.

<table><tbody><tr><td>Igły 18 G</td><td>Sigma-Aldrich, Bangalore, Indie</td><td>Miernik 18</td><td></td></tr><tr><td>3-drogowy kran</td><td>Cole-Parmer</td><td>WW-30600-02</td><td>Złączka Masterflex z blokadą typu luer lock</td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Andor Technology</td><td>EMCCD C9100-13no</td><td></td></tr><tr><td>Folia do obwodów drukowanych</td><td>Fine Line Imaging, Kolorado, USA</td><td></td><td>Projekty są drukowane z 65 024 punktami na cal (DPI)</td></tr><tr><td>Piec konwekcyjny</td><td>Meta-Lab Scientific Industries, Indie</td><td>MSI-5</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Niebieskie mikroskopijne szkło nakrywkowe stat</td><td>22mm x 10Gms</td>Etanol Hi media Jednordzeniowy dziurkacz Harris 1mm Qiagen Z708801 Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich, Bangalore, Indie 440191 Płyta grzejna <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>&nbsp; IKA</td><td>RCT B S 22</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>26895</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laserowy mikroskop skaningowy</td><td>ZEISS</td><td>LSM 5 LIVE</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet</td><td>Tarsons</td><td></td><td>0,5-10 i mikro; Końcówki do mikropipet L służą do zaopatrzenia w żywność</td></tr><tr><td>Negative Photoresist-1</td><td>Microchem</td><td>SU8-2025</td><td>http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm</td></tr><tr><td>Negative Photoresist-2</td><td>Microchem</td><td>SU8-2050</td><td>http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm</td></tr><tr><td>Azot gazowy</td><td>Lokalny dostawca</td><td>Komercyjny gaz azotowy</td><td>Pojemność butli 7 metrów sześciennych</td></tr><tr><td>PDMS (roztwór utwardzający)</td><td>Dow Corning Corporation, Michigan, Stany Zjednoczone</td><td>&nbsp; Sylgard roztwór</td><td>utwardzający utwardzacz</td></tr> płytki <tr><td>Petriego</td><td>Praveen Scientific Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmy</td><td>Harrick Plasma, NY, USA&</td><td>nbsp; PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Maszynka do golenia i ostrza</td><td>Lister chirurgiczne Ostrze</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elastomer silikonowy (podstawa)</td><td>Dow Corning Corporation, MI, USA</td><td>Podstawa elastomerowa</td><td>Sylgard 184</td></tr><tr><td>Rurki silikonowe</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Rurki plastikowe o średnicy wewnętrznej 1,59 mm i średnicy zewnętrznej 3,18 mm</td></tr><tr><td>Wafel krzemowy</td> University <td>Wafer, MA, USA[</td><td>100] orientacja, 4 cale średnica</td><td>Małe kawałki (2 mm i razy 2 mm) zostały wycięte z wafla o średnicy 100 mm</td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>SPS-Europe B.V., Holandia</td><td>Mikroskop SPIN 150</td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disk</td><td>System Perkin Elmer ultra-view VOX</td><td>CSU-X1-A3 N</td><td>System został wyposażony w cztery lasery (405/488/561/640 nm) i sterowany za pomocą pakietu oprogramowania Volocity.</td></tr><tr><td>Deweloper SU8</td><td>Microchem, MA, USA</td> Deweloper <td></td><td>SU8</td></tr><tr><td>Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylo) silan</td><td>Sigma-Aldrich, Bangalore, Indie</td><td>448931</td><td>Opary trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylu) silanu są toksyczne</td></tr><tr><td>Lampa UV</td><td>Oriel Instruments, Bangalore, Indie</td><td></td><td>200 W i skolimowane źródło światła UV</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Volocity Obraz</td><td>Perkina-Elmera</td><td></td><td> analiza</td></tr></tbody></table>

prosty chip mikroprzepływowy do długoterminowego wzrostu i obrazowania caenorhabditis elegans

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) okazały się być cennym modelem do badania procesów rozwojowych i biologicznych komórek. Zrozumienie tych procesów biologicznych często wymaga długotrwałego i wielokrotnego obrazowania tego samego zwierzęcia. Długi czas rekonwalescencji związany z konwencjonalnymi metodami unieruchamiania wykonywanymi na podkładkach agarowych ma szkodliwy wpływ na zdrowie zwierząt, co sprawia, że wielokrotne obrazowanie tego samego zwierzęcia przez długi czas jest niewłaściwe. W artykule opisano projekt chipa mikroprzepływowego, metodę wytwarzania, protokół hodowli C. elegans na chipie oraz trzy przykłady długoterminowego obrazowania w celu zbadania procesów rozwojowych u poszczególnych zwierząt. Chip, wykonany z polidimetylosiloksanu i przyklejony do szkła nakrywkowego, unieruchamia zwierzęta na szklanym podłożu za pomocą membrany elastomerowej, która jest odchylana za pomocą gazowego azotu. Całkowite unieruchomienie C. elegans umożliwia solidne obrazowanie poklatkowe zdarzeń komórkowych i subkomórkowych w sposób wolny od znieczulenia. Geometria kanału o dużym przekroju poprzecznym pozwala zwierzęciu na swobodne poruszanie się w dwóch częściowo uszczelnionych błonach izolacyjnych, co umożliwia wzrost w kanale przy ciągłym dopływie pokarmu. Za pomocą tego prostego chipa można przeprowadzić obrazowanie zjawisk rozwojowych, takich jak wzrost procesów neuronalnych, rozwój sromu i arboryzacja dendrytyczna w neuronach czuciowych PVD, gdy zwierzę rośnie wewnątrz kanału. Chip do długoterminowego wzrostu i obrazowania działa z pojedynczą linią ciśnieniową, bez zewnętrznych zaworów, niedrogich płynnych materiałów eksploatacyjnych i wykorzystuje standardowe protokoły obsługi ślimaków, które mogą być łatwo dostosowane przez inne laboratoria przy użyciu C. elegans.

Charakterystyka urządzenia: Urządzenie do hodowli i obrazowania składa się z dwóch warstw PDMS połączonych ze sobą (Rysunek 1) za pomocą nieodwracalnego wiązania plazmowego. Warstwa przepływowa (wzór 1) o długości 10 mm i wysokości 40 µm lub 80 µm umożliwia hodowlę zwierzęcia w kulturze płynnej (Rysunek 1A). Warstwa pułapkująca (wzór 2) posiada membranę o szerokości 2 mm (Rysunek 1B), służącą do unieruchomienia zwie...

Protokół opisuje prosty mikroprzepływowy układ scalony i metodologię mikroprodukcji używaną do hodowli C. elegans w obecności ciągłego dostarczania pożywienia przez okres do 36 godzin. Urządzenie do wzrostu i obrazowania umożliwia również przerywane, długotrwałe obrazowanie procesów komórkowych i subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości podczas rozwoju przez kilka dni.

Prosty chip mikroprzepływowy do długoterminowego wzrostu i obrazowania Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Główną zaletą tej techniki jest to, że zwierzę może swobodnie rosnąć wewnątrz urządzenia i może zostać uwięzione w celu obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Urządzenie może być wielokrotnie używane. Podczas produkcji urządzenia czystość jest najważniejszym czynnikiem, aby móc wytwarzać urządzenia bezpyłowe, aby uniknąć wycieków podczas pracy urządzenia.Aby rozpocząć, zaprojektuj wzór pierwszy dla warstwy przepływu i wzór drugi dla warstwy kontrolnej przy użyciu prostokątnych kształtów w edytorze tekstu i wydrukuj maski fotograficzne za pomocą plotera laserowego o minimalnym rozmiarze elementu wynoszącym osiem mikrometrów na folii na bazie poliestru. Pokrój wafle krzemowe na kwadratowe kawałki o wysokości i szerokości 2,5 centymetra. Oczyść je 20% wodorotlenkiem potasu przez minutę i opłucz wafle w wodzie dejonizowanej.Użyj jednej płytki do przepływu, a drugiej do warstwy kontrolnej. Wysuszyć kawałki sprężonym azotem 14 P-S-I, a następnie odwodnić na gorącej płycie w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Po schłodzeniu weź jeden kawałek silikonu, umieść go na uchwycie kodera spinowego i włącz próżnię, aby utrzymać wafel na miejscu.Umieść około 20 mikrolitrów heksametylodilanu na kawałku krzemu i pokryj go za pomocą kodera spinowego przy 500 R-P-M przez pięć sekund, a następnie 3000 R-PM przez 30 sekund. Aby uzyskać jednolitą grubość fotorezystu wynoszącą około 40 mikrometrów specyficzną dla warstwy przepływu, pokryj płytkę krzemową około 1,5 mililitra ujemnego fotorezystu za pomocą kodera spinowego przy 500 R-P-M przez pięć sekund, a następnie 2000 R-PM przez 30 sekund. Powtórzyć powlekanie kawałka krzemu heksametylodirylanem i ujemnym fotorezysłem dla drugiej płytki, aby uzyskać jednolitą grubość fotorezystu około 40 mikrometrów właściwą dla warstwy kontrolnej.Alternatywnie, aby zwiększyć grubość warstwy przepływowej do około 80 mikrometrów dla starszych zwierząt, pokryj płytki krzemowe około 1,5 mililitra ujemnego fotorezystu dwa, używając kodera spinowego przy 500 R-P-M przez pięć sekund, a następnie 2000 R-P-M przez 30 sekund. Piecz oba wcześniej pokryte fotorezystem kawałki silikonu na gorącej płycie w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez minutę, a następnie w 95 stopniach Celsjusza przez 10 minut. Po schłodzeniu umieść miękkie, wypieczone kawałki silikonu na stoliku naświetlającym UV z powierzchnią pokrytą fotorezystem skierowaną w stronę lampy UV.Wystaw oba elementy oddzielnie na działanie promieniowania UV przez 15 sekund za pomocą lampy o mocy 200 W przez maskę fotograficzną z wzorami pierwszym i drugim, aby uzyskać odpowiednio warstwę przepływu i kontrolę. Upiecz dwa odsłonięte kawałki silikonu, jak opisano wcześniej, z powlekanymi warstwami skierowanymi do góry. Po schłodzeniu kawałków opracuj wzory, mocząc kawałki silikonu w roztworze wywoływacza fotorezystu przez 20 minut.Gdy wzór będzie widoczny, spłucz kawałki czystym alkoholem izopropylowym i delikatnie wysusz suszarką za pomocą gazowego azotu. Trzymaj kawałki silikonu w eksykatorze powlekaną powierzchnią skierowaną do góry. Wystaw kawałki na działanie oparów silanów, wylewając 50 mikrolitrów czystego T-C-P-F-O-S na szklane szkiełko.Umieścić szkiełko w eksykatorze i inkubować przez dwie godziny. Zrób P-D-M-S w plastikowym kubku, mieszając bazę elastomerową z utwardzaczem i ciągle mieszaj przez trzy minuty. Odgazuj P-D-M-S, mieszaj w eksykatorze przez 30 minut, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.Umieść wafle krzemowe warstwy kontrolnej na szalce Petriego i wylej warstwę mieszanki P-D-M-S o grubości pięciu milimetrów na kawałki krzemu. Po procesie nalewania P-D-M-S powtórz odgazowanie mieszanki P-D-M-S. Umieść płytkę krzemową z warstwą przepływową skierowaną w stronę wózka obrotowego, stosując podciśnienie od 200 do 500 militorów.Wlej około jednego mililitra P-D-M-S na płytkę krzemową. Zakoduj go za pomocą powlekarki wirowej, aby uzyskać warstwę o grubości około 80 mikrometrów. Piecz dwie płytki krzemowe z powlekanym wirowo P-D-M-S i wylewaj warstwy P-D-M-S w temperaturze 50 stopni Celsjusza w piecu konwekcyjnym na gorące powietrze przez sześć godzin.Po schłodzeniu kawałki odetnij warstwę P-D-M-S o grubości pięciu milimetrów od kawałka silikonu wokół warstwy kontrolnej za pomocą ostrego ostrza i oderwij ją od podłoża silikonowego. Przebić dwa otwory o średnicy około jednego milimetra za pomocą dziurkacza Harris w zbiorniku bloku P-D-M-S, aby połączyć kanał unieruchamiający i wloty kanału izolacyjnego z przewodami gazowymi w celu ugięcia membrany P-D-M-S. Umieść kawałek silikonu z warstwą PDS pokrytą spinem na wzór pierwszy z powierzchnią pokrytą P-D-M-S skierowaną do góry na plastikowej tacy.Trzymaj dziurkowany blok P-D-M-S ze wzorem drugim na tacy uformowaną stroną do góry. Trzymaj plastikową tacę w środku środka do czyszczenia plazmowego i wystawiaj dwie powierzchnie P-D-M-S na działanie plazmy powietrznej o mocy 18 W przez dwie minuty, stosując niskie podciśnienie. Wyjmij dwa bloki poddane obróbce plazmowej i delikatnie zwiąż bloki, ściskając ze sobą powierzchnie poddane obróbce plazmowej wzorów pierwszego i drugiego.Piecz połączone wzory w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez dwie godziny w piecu konwekcyjnym na gorące powietrze. Po wyjęciu klejonego urządzenia z pieca, należy je wyciąć z wafla krzemowego wzorem pierwszym i wzorem drugim i przebić otwory w zbiornikach wlotowych i wylotowych warstwy przepływowej za pomocą dziurkacza Harrisa. Umieść klejony blok P-D-M-S warstwą przepływową skierowaną do góry na plastikowej tacy i utrzymuj czystą szklankę nakrywkową na tej samej tacy.Wystaw bloki w szkle nakrywkowym na działanie plazmy powietrznej o mocy 18 W przez dwie minuty. Dostosuj podciśnienie, aby zobaczyć fioletową komorę. Umieść naświetlony plazmą blok P-D-M-S na szkle nakrywkowym i piecz połączoną strukturę w piekarniku w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez dwie godziny.Przechowuj urządzenie w czystej komorze do wszelkich przyszłych eksperymentów. Weź urządzenie, umieść je w mikroskopie stereoskopowym i przymocuj rurki. Podłącz rurkę microflex do przewodu gazowego ze sprężonym azotem i trójdrożnego łącznika na drugim końcu.Podłącz rurki jeden i dwa łączniki trójdrogowe odpowiednio do syfonu w membranach izolacyjnych. Podłącz dwie rurki microflex do dwóch portów wylotowych trójdrogowego kurka. Podłącz drugi koniec dwóch rurek do igły o długości ośmiu milimetrów i rozmiarze 18.Napełnij warstwę przepływową buforem M-9 za pomocą mikropipety przez port wlotowy. Napełnij obie probówki wodą dejonizowaną przez koniec podłączony do igły. Włóż dwie igły do wybitych otworów łączących membranę izolacyjną i pułapkową.Otwórz regulator azotu gazowego na 14 PS-I i przekręć zawór trójdrogowy z pierwszej rurki, aby wepchnąć wodę do urządzenia przez kanały mikroprzepływowe w warstwach kontrolnych, a mianowicie w membranach syfonu i izolacji. Zwolnij ciśnienie za pomocą trójdrogowego kranu, gdy kanały zostaną napełnione wodą i zalane. Usuń pęcherzyki, przepuszczając dodatkowe media przez kanał przepływowy.Rysunek przedstawia obrazy P-S-3-2-3-9, zwierzęcia rosnącego wewnątrz chipa mikroprzepływowego i unieruchamianego co osiem do 10 godzin w celu uchwycenia obrazów fluorescencyjnych. Zmienność wzorca ekspresji stanowi przykład czasowej regulacji genów, w której ten sam gen ulega ekspresji w różnych komórkach na różnych etapach rozwoju. Obrazowanie indywidualnego genotypu W-D-I-S-5-1 caenorhabditis elegans pokazuje podobną do menory rozgałęzioną architekturę dendrytyczną w każdym neuronie P-V-D, obejmującą pierwszorzędowe, drugorzędowe i czwartorzędowe procesy odpowiednio w stadiach rozwojowych L-2, późnego L-2, L-3 i L-4.Na rysunku porównano zwierzęta rozwijające się i hodowane w urządzeniach P-V-D oraz te hodowane na płytkach N-G-M. Liczba S-P i Q-P na różnych etapach rozwoju robaka wzrastała wraz z wiekiem. Caenorhabditis elegans leczono kroplą trzymilimolowego lewamizolu, aby spowodować wystarczający paraliż wymagany do obrazowania w wysokiej rozdzielczości.Wartości S-P nie różniły się istotnie, gdy mierzono je podobnymi zwierzętami w stadium hodowanymi na płytkach N-G-M i obrazowanymi przy użyciu trzymilimolowego lewamizolu na szkiełku agarowym. Co więcej, odległość między dwoma ciałami komórek P-V-C, jednym obecnym w ogonie, a drugim w pobliżu sromu, zwiększa się w miarę ich oddalania się zarówno u zwierząt hodowanych w urządzeniu, jak i tych hodowanych na płytkach N-G-M. Rysunek przedstawia obraz o wysokiej rozdzielczości neuronów receptorów dotyku u zwierząt rosnących wewnątrz urządzenia mikroprzepływowego.Montaż przedstawia cały proces neuronalny P-L-M-R w kolejnych punktach czasowych, podkreślając mitochondria i proces neuronalny. Wykres przedstawia całkowitą długość procesu neuronalnego, który zaobserwowano, że zwiększa się wraz ze spadkiem 10,4 mikrometra na godzinę. Mikro-wytworzone urządzenie wykorzystuje cienką membranę P-D-M-S odchylającą się w obecności azotu pod wysokim ciśnieniem do unieruchamiania i utrzymywania C-eleganów na miejscu w celu obrazowania o wysokiej rozdzielczości.Procedura ta może umożliwić badania podłużne procesów komórkowych i subkomórkowych u C-elegan, które wymagają okresowych obserwacji przez długi okres czasu.

a-simple-microfluidic-chip-for-long-term-growth-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Opracowano proste urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania in vivo bez użycia środków znieczulających dla C. elegans, nienaruszonych larw Drosophila oraz larw rybek danio. Urządzenie wykorzystuje odkształcalną membranę z PDMS do unieruchomienia tych organizmów modelowych w celu wykonania obrazowania poklatkowego licznych procesów, takich jak bicie serca, podział komórkowy i podkomórkowy transport neuronalny. Prezentujemy zastosowanie tego urządzenia i pokazujemy przykłady różnych typów danych...

Proste urządzenia mikrofluidyczne do in vivo Obrazowanie C. elegans, Muszka owocówka oraz danio pręgowany

Obrazowanie zachowania i aktywności neuronalnej w długich skalach czasowych bez unieruchomienia zwierzęcia jest warunkiem wstępnym do zrozumienia zachowania. Obrazowanie komór mikroprzepływowych z agarozą (AMI) może być wykorzystywane do obrazowania aktywności i zachowania neuronów na wszystkich etapach życia Caenorhabditis elegans.

Mikrokomory agarozowe do długoterminowego obrazowania wapnia Caenorhabditis elegans

Użycie dostosowanego "chipa węchowego" do efektywnego obrazowania wapnia u samców C. elegans jest opisane tutaj. Pokazano również badania dotyczące narażenia mężczyzn na glicerol i feromon.

Wykorzystanie dostosowanego mikroprzepływowego chipa węchowego do obrazowania aktywności neuronalnej w odpowiedzi na feromony w męskich neuronach głowy C. elegans

Nowe narzędzia do badań mechanobiologii są potrzebne, aby zrozumieć, jak stres mechaniczny aktywuje szlaki biochemiczne i wywołuje reakcje biologiczne. W tym artykule prezentujemy nową metodę selektywnej stymulacji mechanicznej unieruchomionych zwierząt za pomocą pułapki mikroprzepływowej, umożliwiającej obrazowanie odpowiedzi komórkowych w wysokiej rozdzielczości.

Wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do stymulacji mechanicznej i obrazowania C. elegans w wysokiej rozdzielczości

W tym artykule demonstrujemy obrazowanie na żywo poszczególnych robaków za pomocą niestandardowego urządzenia mikroprzepływowego. W urządzeniu wiele robaków jest indywidualnie zamkniętych w oddzielnych komorach, co pozwala na wielokrotny nadzór podłużny nad różnymi procesami biologicznymi.

Platforma mikroprzepływowa do obrazowania podłużnego u Caenorhabditis elegans

Ustanowiono szereg metod unieruchamiania, aby umożliwić celowe napromienianie żywych osób Caenorhabditis elegans za pomocą niedawno opracowanego ultracienkiego mikroprzepływowego chipa polidimetylosiloksanowego z retencją wody. To nowatorskie unieruchomienie na chipie jest również odpowiednie do obserwacji obrazowych. Wyjaśniono szczegółowe przykłady obróbki i zastosowania chipa.

Unieruchomienie żywych osobników Caenorhabditis elegans przy użyciu ultracienkiego mikroprzepływowego chipa polidimetylosiloksanowego z retencją wody

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w mikrofabrykowanych urządzeniach wielodołkowych. Takie podejście pozwala na monitorowanie poszczególnych zwierząt przez całe życie pod kątem różnych fenotypów związanych ze starzeniem się i zdrowiem, w tym aktywności, wielkości i kształtu ciała, geometrii ruchu i przeżycia.

Długotrwała hodowla i monitorowanie izolowanych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych w urządzeniach wielodołkowych

Tutaj prezentujemy protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w celu śledzenia parametrów fizjologicznych przez całe życie i kwantyfikacji fluorescencji. Ten system hodowli obejmuje barierę kwasu palmitynowego wokół studni z pojedynczymi robakami, aby zapobiec ucieczce zwierząt, umożliwiając stosowanie interwencji awersyjnych, w tym bakterii chorobotwórczych i chemicznych czynników stresogennych.

Długotrwała hodowla poszczególnych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych do długotrwałego monitorowania fluorescencji i interwencji awersyjnych

Ten protokół opisuje obrazowanie poklatkowe C. elegans oparte na mikroprzepływach w całym rozwoju postembrionalnym.

Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

Poznaj metodę mikroprzepływową do długoterminowego wzrostu Caenorhabditis elegans z ciągłym dostarczaniem pokarmu i obrazowaniem wysokiej rozdzielczości. To podejście umożliwia badanie procesów komórkowych podczas rozwoju.

Prosty chip mikroprzepływowy do długoterminowego wzrostu i obrazowania Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów