DetectSyn: szybka, bezstronna metoda fluorescencyjna do wykrywania zmian w gęstości synaps
July 22nd, 2022
DetectSyn to bezstronny, szybki test fluorescencyjny, który mierzy zmiany we względnej liczbie synaps (zaangażowanie pre- i postsynaptyczne) w różnych terapiach lub stanach chorobowych. Technika ta wykorzystuje technikę ligacji zbliżeniowej, która może być stosowana zarówno w hodowanych neuronach, jak i w tkance stałej.
DetectSyn wykorzystuje technologię ligacji zbliżeniowej do szybkiej identyfikacji zmian w synapsach. Udostępniamy również protokół do analizy wyników. Główną zaletą DetectSyn jest to, jak szybko można uzyskać wyniki w dużych obszarach tkanki, które można analizować.
Na początek ostrożnie usuń roztwór blokujący za pomocą plastikowej pipety Pasteura, nie naruszając komórek. Następnie wyłóż dużą plastikową szalkę Petriego Parafilmem. I za pomocą kleszczy ostrożnie przenieś szkiełka nakrywkowe na Parafilm.
Dodać 60 mikrolitrów roztworu przeciwciał pierwszorzędowych na wierzch szkiełka nakrywkowego, upewniając się, że roztwór przeciwciała nie rozleje się na boki szkiełka nakrywkowego. Aby zapewnić wilgotność i zapobiec wysychaniu próbek podczas inkubacji, dodaj ultraczystą wodę do mniejszej szalki Petriego i ostrożnie umieść naczynie wokół szkiełek nakrywkowych. Następnie przykryj większą szalkę Petriego i inkubuj wyhodowane komórki przez godzinę w temperaturze pokojowej.
Po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym, za pomocą kleszczy ostrożnie strzepnąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego z szkiełek nakrywkowych na ręcznik papierowy i przenieść szkiełka nakrywkowe na oryginalną 24-dołkową płytkę wypełnioną 500 mikrolitrami PBS. Następnie przemyć próbki PBS trzy razy przez 10 minut każda, delikatnie mieszając na wytrząsarce orbitalnej. Po ostatnim umyciu przenieś szkiełka nakrywkowe z powrotem na dużą szalkę Petriego i dodaj 40 mikrolitrów roztworu przeciwciał wtórnych na wierzch szkiełka nakrywkowego.
Przykryć szalkę Petriego i inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. W przypadku ligacji, utrzymując ligazę na zimnym bloku, rozcieńczyć ligazę od 1 do 40 za pomocą podnośnika do ligacji i natychmiast dodać 40 mikrolitrów mieszanki ligazy do szkiełek nakrywkowych. Przykryć szalkę Petriego i inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.
W celu amplifikacji rozcieńczyć polimerazę 1280 na zimnym bloku za pomocą podstawki do amplifikacji. Następnie dodać 40 mikrolitrów mieszanki amplifikacyjnej do szkiełek nakrywkowych i inkubować próbki przez 100 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie, w celu montażu, upuść trzy mikrolitry nośnika montażowego na szkiełko.
Zetrząśnij nadmiar bufora myjącego z szkiełka nakrywkowego i umieść szkiełko nakrywkowe komórkami skierowanymi w dół w nośniku montażowym. Uszczelnij boki niewielką ilością przezroczystego lakieru do paznokci, aby utrzymać szkiełko nakrywkowe na miejscu. W celu zamontowania pokrojonej chusteczki ostrożnie przenieś plasterek chusteczki na przygotowane szkiełko i połóż go płasko.
Następnie upuść od 5 do 10 mikrolitrów podłoża montażowego na plasterek tkanki. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na plasterku chusteczki i uszczelnij szkiełko nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci, jak pokazano wcześniej. W przypadku obrazowania cyfrowego za pomocą mikroskopu konfokalnego dostosuj wzmocnienie, przesunięcie i moc lasera dla każdego kanału fluorescencyjnego, aby zmniejszyć szum tła i wzmocnić sygnał fluorescencyjny.
Upewnij się, że sygnał fluorescencyjny nie jest przesycony. W przypadku neuronów hodowlanych, na karcie Akwizycja ND, kliknij Zapisz do pliku. Następnie w obszarze Przeglądaj wybierz plik, aby zapisać obraz i wprowadź nazwę pliku.
Następnie na karcie Z wybierz opcję Tryb symetryczny zdefiniowany przez zakres. Ustaw ostrość na najlepszą mapę dwupłaszczyznową i kliknij przycisk Względnie, aby ustawić tę płaszczyznę ogniskową jako środek stosu z. Następnie ustaw zakres na pięć mikrometrów z krokami co jeden mikrometr i zaznacz opcję Zamknij aktywną migawkę podczas ruchu Z.
Na karcie Długość fali wybierz nazwę przycisku optycznego z wcześniej skonfigurowanymi ustawieniami akwizycji w obszarze Konfiguracja optyczna i kliknij Uruchom teraz. W przypadku tkanki pokrojonej w plasterki z menu pobierania wybierz opcję Skanuj duży obraz, a następnie w panelu przechwytywania wybierz przycisk optyczny z poprzednio skonfigurowanymi ustawieniami akwizycji. Wybierz również odpowiedni obiektyw w tym panelu.
Następnie, pod panelem obszaru i okularem, użyj strzałek, aby ustawić granice obszaru zainteresowania lub ROI. Następnie kliknij Zapisz duży obraz do pliku i utwórz nazwę pliku ścieżki zapisu dla obrazu. Na koniec w panelu ustawień upewnij się, że zaznaczona jest opcja Przechwytywanie wielokanałowe.
Następnie wybierz nazwę przycisku optycznego z poprzednio skonfigurowanymi ustawieniami akwizycji w obszarze Konfiguracja optyczna. W ImageJ otwórz opcję próg, przechodząc do menu obrazu, klikając Dostosuj, a następnie Próg. Wybierz opcję Ciemne tło, jeśli obraz ma ciemne tło.
Następnie dostosuj górną i dolną granicę progu zgodnie z wcześniej określonymi zoptymalizowanymi ustawieniami progu i kliknij Zastosuj. W przypadku hodowanych komórek użyj kanału MAP2 i narzędzia ROI z wolnej ręki, aby narysować ROI dla każdego neuronu, w tym dendrytów i somy. W przypadku pokrojonej tkanki narysuj odręczny zwrot ROI na obrazie plasterka, który obejmuje obszar zainteresowania.
Następnie uzyskaj obszar zwrotu z inwestycji, otwierając menu Analizuj i klikając Zmierz. Aby wykryć liczbę punta w każdym ROI, użyj narzędzia do automatycznego wykrywania, takiego jak analiza cząstek. Z menu Analizowane wybierz opcję Analizowane cząstki i zdefiniuj średnicę rozmiaru puncta.
Następnie z menu rozwijanego pokaż wybierz opcję Maski nakładki, a następnie zaznacz opcję Wyświetl wyniki i kliknij W porządku. Aby podzielić liczbę punta przez obszar indywidualnego ROI, skopiuj i wklej wyniki dla każdego obrazu z wyskakującego okienka wyników do arkusza kalkulacyjnego. Zidentyfikuj, z którego pliku i próbki danych uzyskaliśmy, a następnie podziel obszar zwrotu z inwestycji przez liczbę punta.
Na koniec, aby znormalizować wyniki dla próbek kontrolnych, należy uśrednić wyniki dla próbek kontrolnych i podzielić uzyskane wyniki wszystkich próbek przez średnią z kontroli. Agonista GABAB, baklofen, jest niezbędny do zapewnienia skuteczności in vitro szybkiego leku przeciwdepresyjnego Ro-256981. O wzroście tworzenia synaps świadczy wzrost białej punty.
Bez baklofenu nie obserwuje się wzrostu tworzenia synaps. In vivo, dootrzewnowe wstrzyknięcie szybkiego leku przeciwdepresyjnego powoduje zwiększenie tworzenia synaps w porównaniu z kontrolą soli fizjologicznej. Podczas gdy niektóre punty pojawiają się na obrazach kontroli technicznej, na ogół nie mają one tego samego rozmiaru, jak pokazano na białej specyfikacji w porównaniu z dużą puntą w innych panelach.
Co więcej, te punta nie znajdują się w tym samym miejscu, o czym świadczą niektóre punta pojawiające się w somie. DetectSyn może identyfikować zmiany w synapsach spowodowane stanem chorobowym lub leczeniem farmakologicznym. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu wglądu w dowolny obszar badań, który bada zaburzenia wpływające na rozwój lub rozpad synaps.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
DetectSyn to szybki fluorescencyjny test zaprojektowany do pomiaru zmian w zaangażowaniu synaps w różnych stanach leczenia lub chorobowych. Wykorzystując technikę ligacji zbliżeniowej, może być stosowany zarówno do hodowli neuronów, jak i do tkanki utrwalonej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Testy fluorescencyjne
Tło
- DetectSyn wykorzystuje technologię testu ligacji zbliżeniowej.
- Metoda pozwala na szybkie identyfikowanie zmian synaptycznych.
- Może być stosowana do dużych regionów tkanki.
- Dostarczany jest protokół analizy wyników.
Cel badania
- Pomiar zmian liczby synaps w różnych warunkach.
- Dostarczenie szybkiej i obiektywnej oceny zaangażowania synaps.
- Wspomagane badania nad biologią synaps i powiązanymi zaburzeniami.
Zastosowane metody
- Technologia testu ligacji zbliżeniowej.
- Techniki obrazowania fluorescencyjnego.
- Zastosowanie do hodowli neuronów i utrwalonych tkanek.
- Protokół analizy wyników.
Główne wyniki
- DetectSyn zapewnia szybkie wyniki.
- Może skutecznie analizować duże regiony tkanki.
- Zmiany w zaangażowaniu synaps można ilościowo określić.
- Wyniki mogą informować o efektach leczenia lub stanach chorobowych.
Wnioski
- DetectSyn jest cennym narzędziem do badań w dziedzinie neuronauki.
- Zwiększa zrozumienie zmian synaptycznych.
- Prędkość i efektywność metody są znaczącymi zaletami.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
DetectSyn addresses a critical bottleneck in neuroscience drug discovery by enabling rapid, unbiased quantification of synapse density changes across large tissue areas. This capability supports target validation and mechanistic de-risking for CNS therapeutics, particularly in depression and neurodegenerative disease programs where synaptic integrity is a key biomarker. The method’s accessibility and scalability enhance translational continuity from in vitro models to preclinical tissue analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying pre- and postsynaptic protein juxtaposition as a direct readout of synapse formation or elimination.
- Operational Value: Provides functional target validation through unbiased detection of synaptic changes induced by disease states or drug activity.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative, representative data on synaptic density that correlates with circuit-level functional outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline synapse density metrics in cultured neurons and fixed tissue.
- Reproducibility: Delivers standardized, quantitative puncta counts per unit area via threshold-based particle analysis, enabling reliable compound evaluation across experiments.
- Scalability: Facilitates high-content analysis of large tissue regions, increasing statistical power and reducing sampling bias compared to low-n electron microscopy approaches.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with synaptic pathology in models of major depressive disorder and Alzheimer’s disease, where synapse loss is a hallmark.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to ex vivo tissue analysis, supporting risk-adjusted advancement decisions through consistent synaptic density readouts.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypic effects involve actual synaptic remodeling versus indirect neuronal changes, improving target confidence.
Pipeline & Workflow Integration
DetectSyn fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, where synaptic density serves as a mechanistic biomarker of neuronal circuit integrity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by directly measuring synapse formation or elimination as a functional readout of target engagement.
- Screening: Enables assay readiness through quantitative, unbiased puncta detection that standardizes synaptic density measurements across multi-well formats.
- Analytics: Generates normalized synapse density values (puncta/area) relative to controls, providing a comparable metric for assessing treatment effects across conditions.
- Translational Research: Connects cultured neuron data to fixed tissue slices, preserving synaptic measurement continuity through preclinical validation stages.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability across neuroscience projects, reducing redundant method development and enabling cross-study data comparison.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity around synaptic effects of compounds or disease models.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through protocolized imaging, thresholding, and particle analysis steps accessible to most laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering early, biologically relevant synaptic data that de-risks later-stage investment in CNS programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on synaptic density changes, a translationally validated biomarker with relevance to MDD, Alzheimer’s, and other neuropsychiatric indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, proximity ligation assay handling, and fluorescent microscopy optimization.
- Dependent on access to confocal imaging systems and image analysis tools like ImageJ for threshold-based puncta detection.
- Necessitates standardization of antibody pairs, incubation conditions, and ROI definition across users and sites for reproducible results.
- Adaptation to different model systems (e.g., primary neurons, iPSC-derived neurons, tissue slices) requires validation of antigen accessibility and signal-to-noise ratios.
- Practical limitations include dependency on specific pre- and postsynaptic protein targets and potential steric hindrance in dense neuropil, as noted in source material regarding puncta size and localization controls.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Primary Antibody Incubation
1:29
Sample Washes, Secondary Antibody Incubation, Ligation, Amplification, and Mounting
3:49
Digital Imaging with a Confocal Microscope
5:49
Image Analysis
7:41
Results: Increased Synapse Formation by Rapid Antidepressants in the Presence of GABAB Agonists
8:42
Conclusion
