DetectSyn: szybka, bezstronna metoda fluorescencyjna do wykrywania zmian w gęstości synaps

DetectSyn wykorzystuje technologię ligacji zbliżeniowej do szybkiej identyfikacji zmian w synapsach. Udostępniamy również protokół do analizy wyników. Główną zaletą DetectSyn jest to, jak szybko można uzyskać wyniki w dużych obszarach tkanki, które można analizować.

Na początek ostrożnie usuń roztwór blokujący za pomocą plastikowej pipety Pasteura, nie naruszając komórek. Następnie wyłóż dużą plastikową szalkę Petriego Parafilmem. I za pomocą kleszczy ostrożnie przenieś szkiełka nakrywkowe na Parafilm.

Dodać 60 mikrolitrów roztworu przeciwciał pierwszorzędowych na wierzch szkiełka nakrywkowego, upewniając się, że roztwór przeciwciała nie rozleje się na boki szkiełka nakrywkowego. Aby zapewnić wilgotność i zapobiec wysychaniu próbek podczas inkubacji, dodaj ultraczystą wodę do mniejszej szalki Petriego i ostrożnie umieść naczynie wokół szkiełek nakrywkowych. Następnie przykryj większą szalkę Petriego i inkubuj wyhodowane komórki przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym, za pomocą kleszczy ostrożnie strzepnąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego z szkiełek nakrywkowych na ręcznik papierowy i przenieść szkiełka nakrywkowe na oryginalną 24-dołkową płytkę wypełnioną 500 mikrolitrami PBS. Następnie przemyć próbki PBS trzy razy przez 10 minut każda, delikatnie mieszając na wytrząsarce orbitalnej. Po ostatnim umyciu przenieś szkiełka nakrywkowe z powrotem na dużą szalkę Petriego i dodaj 40 mikrolitrów roztworu przeciwciał wtórnych na wierzch szkiełka nakrywkowego.

Przykryć szalkę Petriego i inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. W przypadku ligacji, utrzymując ligazę na zimnym bloku, rozcieńczyć ligazę od 1 do 40 za pomocą podnośnika do ligacji i natychmiast dodać 40 mikrolitrów mieszanki ligazy do szkiełek nakrywkowych. Przykryć szalkę Petriego i inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

W celu amplifikacji rozcieńczyć polimerazę 1280 na zimnym bloku za pomocą podstawki do amplifikacji. Następnie dodać 40 mikrolitrów mieszanki amplifikacyjnej do szkiełek nakrywkowych i inkubować próbki przez 100 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie, w celu montażu, upuść trzy mikrolitry nośnika montażowego na szkiełko.

Zetrząśnij nadmiar bufora myjącego z szkiełka nakrywkowego i umieść szkiełko nakrywkowe komórkami skierowanymi w dół w nośniku montażowym. Uszczelnij boki niewielką ilością przezroczystego lakieru do paznokci, aby utrzymać szkiełko nakrywkowe na miejscu. W celu zamontowania pokrojonej chusteczki ostrożnie przenieś plasterek chusteczki na przygotowane szkiełko i połóż go płasko.

Następnie upuść od 5 do 10 mikrolitrów podłoża montażowego na plasterek tkanki. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na plasterku chusteczki i uszczelnij szkiełko nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci, jak pokazano wcześniej. W przypadku obrazowania cyfrowego za pomocą mikroskopu konfokalnego dostosuj wzmocnienie, przesunięcie i moc lasera dla każdego kanału fluorescencyjnego, aby zmniejszyć szum tła i wzmocnić sygnał fluorescencyjny.

Upewnij się, że sygnał fluorescencyjny nie jest przesycony. W przypadku neuronów hodowlanych, na karcie Akwizycja ND, kliknij Zapisz do pliku. Następnie w obszarze Przeglądaj wybierz plik, aby zapisać obraz i wprowadź nazwę pliku.

Następnie na karcie Z wybierz opcję Tryb symetryczny zdefiniowany przez zakres. Ustaw ostrość na najlepszą mapę dwupłaszczyznową i kliknij przycisk Względnie, aby ustawić tę płaszczyznę ogniskową jako środek stosu z. Następnie ustaw zakres na pięć mikrometrów z krokami co jeden mikrometr i zaznacz opcję Zamknij aktywną migawkę podczas ruchu Z.

Na karcie Długość fali wybierz nazwę przycisku optycznego z wcześniej skonfigurowanymi ustawieniami akwizycji w obszarze Konfiguracja optyczna i kliknij Uruchom teraz. W przypadku tkanki pokrojonej w plasterki z menu pobierania wybierz opcję Skanuj duży obraz, a następnie w panelu przechwytywania wybierz przycisk optyczny z poprzednio skonfigurowanymi ustawieniami akwizycji. Wybierz również odpowiedni obiektyw w tym panelu.

Następnie, pod panelem obszaru i okularem, użyj strzałek, aby ustawić granice obszaru zainteresowania lub ROI. Następnie kliknij Zapisz duży obraz do pliku i utwórz nazwę pliku ścieżki zapisu dla obrazu. Na koniec w panelu ustawień upewnij się, że zaznaczona jest opcja Przechwytywanie wielokanałowe.

Następnie wybierz nazwę przycisku optycznego z poprzednio skonfigurowanymi ustawieniami akwizycji w obszarze Konfiguracja optyczna. W ImageJ otwórz opcję próg, przechodząc do menu obrazu, klikając Dostosuj, a następnie Próg. Wybierz opcję Ciemne tło, jeśli obraz ma ciemne tło.

Następnie dostosuj górną i dolną granicę progu zgodnie z wcześniej określonymi zoptymalizowanymi ustawieniami progu i kliknij Zastosuj. W przypadku hodowanych komórek użyj kanału MAP2 i narzędzia ROI z wolnej ręki, aby narysować ROI dla każdego neuronu, w tym dendrytów i somy. W przypadku pokrojonej tkanki narysuj odręczny zwrot ROI na obrazie plasterka, który obejmuje obszar zainteresowania.

Następnie uzyskaj obszar zwrotu z inwestycji, otwierając menu Analizuj i klikając Zmierz. Aby wykryć liczbę punta w każdym ROI, użyj narzędzia do automatycznego wykrywania, takiego jak analiza cząstek. Z menu Analizowane wybierz opcję Analizowane cząstki i zdefiniuj średnicę rozmiaru puncta.

Następnie z menu rozwijanego pokaż wybierz opcję Maski nakładki, a następnie zaznacz opcję Wyświetl wyniki i kliknij W porządku. Aby podzielić liczbę punta przez obszar indywidualnego ROI, skopiuj i wklej wyniki dla każdego obrazu z wyskakującego okienka wyników do arkusza kalkulacyjnego. Zidentyfikuj, z którego pliku i próbki danych uzyskaliśmy, a następnie podziel obszar zwrotu z inwestycji przez liczbę punta.

Na koniec, aby znormalizować wyniki dla próbek kontrolnych, należy uśrednić wyniki dla próbek kontrolnych i podzielić uzyskane wyniki wszystkich próbek przez średnią z kontroli. Agonista GABAB, baklofen, jest niezbędny do zapewnienia skuteczności in vitro szybkiego leku przeciwdepresyjnego Ro-256981. O wzroście tworzenia synaps świadczy wzrost białej punty.

Bez baklofenu nie obserwuje się wzrostu tworzenia synaps. In vivo, dootrzewnowe wstrzyknięcie szybkiego leku przeciwdepresyjnego powoduje zwiększenie tworzenia synaps w porównaniu z kontrolą soli fizjologicznej. Podczas gdy niektóre punty pojawiają się na obrazach kontroli technicznej, na ogół nie mają one tego samego rozmiaru, jak pokazano na białej specyfikacji w porównaniu z dużą puntą w innych panelach.

Co więcej, te punta nie znajdują się w tym samym miejscu, o czym świadczą niektóre punta pojawiające się w somie. DetectSyn może identyfikować zmiany w synapsach spowodowane stanem chorobowym lub leczeniem farmakologicznym. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu wglądu w dowolny obszar badań, który bada zaburzenia wpływające na rozwój lub rozpad synaps.