Name: DetectSyn: szybka, bezstronna metoda fluorescencyjna do wykrywania zmian w gęstości synaps (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-22T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Poznaj metodę DetectSyn do szybkiego wykrywania zmian w gęstości synaps przy użyciu techniki fluorescencyjnej z ligacją bliskościową. Ta technika umożliwia analizę zarówno hodowanych neuronów, jak i utrwalonej tkanki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health NINDS R01 NS105005 (KRG) i NS105005-03S1 (KRG), Departament Obrony USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH), oraz grant od FRAXA Research (CFH) i Alzheimer's Association, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG).

<ol><li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+an+understanding+of+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Towards an understanding of synapse formation.</a> Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).</li>
<li>Bliss, T. V., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synaptic+model+of+memory%3A+long-term+potentiation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus.</a> Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).</li>
<li>Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeaney%2C+CF+%22The+Oxford+Handbook+of+Neuronal+Protein+Synthesis%22">The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis</a>. , Oxford University Press. NY. 510-532 (2018).</li>
<li>Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+remodeling+during+aging+and+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 9, 91-99 (2006).</li>
<li>van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+pathology+in+psychiatric+and+neurologic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neurology+and+Neuroscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).</li>
<li>Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+FMRP+in+rapid+antidepressant+effects+and+synapse+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation.</a> Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).</li>
<li>Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines+shape+analysis-Classification+or+clusterization%3F+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31(2020).</li>
<li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).</li>
<li>Berry, K. P., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+Dynamics%3A+Are+they+all+the+same%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spine Dynamics: Are they all the same.</a> Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).</li>
<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1-dependent+protein+synthesis+underlying+rapid+antidepressant+effect+requires+GABABR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling.</a> Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR-dependent+synapse+formation+underlies+the+rapid+antidepressant+effects+of+NMDA+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists.</a> Science. 329 (5994), 959-964 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

DetectSyn to szybki test, który wykorzystuje test ligacji zbliżeniowej do wykrywania białek w odległości 40 nm od siebie, co pozwala na wykrycie tworzenia synaps. Technika ta ulepsza obecne testy fluorescencyjne, które służą jedynie jako pomiary zastępcze do tworzenia synaps. DetectSyn wykrywa mierzalne zmiany w białkach synaptycznych zlokalizowanych w promieniu 40 nm, tj. w obrębie szczeliny synaptycznej, od siebie. Co więcej, DetectSyn jest bardziej opłacalny i zajmuje mniej czasu niż techniki, takie jak mikroskopia el...

Synapsy są podstawową jednostką komunikacji między neuronami1. Wiele synaps między neuronami w tych samych regionach powoduje powstawanie obwodów, które pośredniczą w zachowaniu2. Synapsy składają się z zakończenia presynaptycznego z jednego neuronu, które uwalnia neuroprzekaźniki lub neuropeptydy, które przekazują informacje do receptorów postsynaptycznych innego neuronu. Suma sygnałów presynaptycznych określa, czy neuron postsynaptyczny wystrzeli potencjał czynnościowy i przekaże wiadomość do innych neuronów.
Synaptopatologia, rozpad synaps, występuje w chorobach i zaburzeniach charakteryzujących się zmniejszoną objętością neuronów, takich jak choroba Alzheimera i duże zaburzenie depresyjne, powodując powstawanie obwodów, które już nie działają optymalnie3,4,5. Przywrócenie gęstości synaps prawdopodobnie leży u podstaw skuteczności potencjalnych metod leczenia tych zaburzeń. Na przykład, niedawno wykazano, że zwiększenie liczby synaps leży u podstaw skuteczności behawioralnej szybkich leków przeciwdepresyjnych6. Aby szybko przeprowadzić badania przesiewowe możliwych metod leczenia synaptopatologicznego, naukowcy potrzebują technik, które szybko identyfikują zmiany liczby synaps.
Obecne metodologie są albo czasochłonne i kosztowne (mikroskopia elektronowa, tomografia matrycowa), albo badają tylko zmiany postsynaptyczne bez uwzględnienia zaangażowania presynaptycznego (analizy kręgosłupa, immunofluorescencja/kolokalizacja). Barwniki takie jak DiI lub białka fluorescencyjne, takie jak GFP, pomagają wizualizować neurony i charakteryzować kolce postsynaptyczne. Jednak analiza kręgosłupa wykorzystuje współczynniki zdefiniowane przez badacza do określenia morfologii, co może zmniejszyć odtwarzalność7. Co więcej, wciąż odkrywane, w jaki sposób różne klasy kręgosłupa odnoszą się do funkcjonalnych synaps8. Powstawanie kręgosłupa może być przejściowe i może odzwierciedlać plastyczność postsynaptyczną, ale te kolce mogą zostać wyeliminowane przed ustabilizowaniem się w synapsę z neuronem presynaptycznym9.
Kolokalizacja zapewnia lepsze zastępstwo dla synaps niż analiza kręgosłupa, ponieważ można immunobarwić białka presynaptyczne i postsynaptyczne. Jednak białka synaptyczne mogą dawać niskie wartości kolokalizacji, ponieważ białka są zestawione i mogą nie nakładać się na siebie konsekwentnie. Tak więc, ponieważ białka nie są całkowicie nałożone, techniki kolokalizacji mogą nie mierzyć dokładnie zmian w tworzeniu synaps z powodu brakujących informacji. Wreszcie, chociaż zarówno mikroskopia elektronowa (EM), jak i tomografia matrycowa dostarczają obrazów synaps o wysokiej rozdzielczości, są one czasochłonne. EM wymaga ponadto specjalistycznego sprzętu, a badacze są ograniczeni do małych objętości tkanek w danym eksperymencie. Podczas gdy tomografia matrycowa elegancko zapewnia możliwość badania przesiewowego wielu białek na ultracienkich skrawkach i może być łączona z EM10, technika ta może być zbyt pracochłonna i wykraczać poza zakres eksperymentów, które wymagają szybkiego skanowania w poszukiwaniu zmian w tworzeniu synaps.
DetectSyn to specyficzne zastosowanie testu ligacji zbliżeniowej Duolink. Test PLA pozwala na ogólne wykrycie oddziaływań białko-białko. DetectSyn łączy proxy miary postsynaptyczne poprzez wzmocnienie sygnału fluorescencyjnego emitowanego przez znakowane białka pre- i postsynaptyczne w odległości 40 nm od siebie. Jeśli białka synaptyczne znajdują się w odległości 40 nm, tak jak w szczelinie synaptycznej, wówczas przeciwciała drugorzędowe, które zawierają sondy DNA, zhybrydyzują się z kolistym DNA. To zhybrydyzowane koliste DNA wyraża sondę fluorescencyjną, która jest następnie amplifikowana i wykrywana za pomocą standardowych technik mikroskopii fluorescencyjnej (patrz <silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Co istotne, w przeciwieństwie do tomografii elektromagnetycznej i matrycowej, technika ta nie wymaga specjalistycznego sprzętu i zajmuje mniej więcej tyle samo czasu, co standardowa immunohistochemia. Dostępność tej techniki umożliwia zatem badaczom spoza instytucji prowadzących intensywne badania naukowe udział w badaniach synaptopatologicznych. Co więcej, technika ta może badać zmiany gęstości synaptycznej w wielu regionach mózgu w ramach jednego eksperymentu, oferując bardziej holistyczną reprezentację zmian synaptycznych spowodowanych chorobą lub leczeniem.

<table><tbody><tr><td>10x</td><td>PBS Fisher Scientific</td><td>BP39920</td><td>PBS również wykonane we własnym zakresie.</td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012929</td><td>W przypadku plastrów tkanek wstępnie wysterylizowane płytki mogą być zbędne.</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-078-290</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-MAP2 kurczaka</td><td>Abcam</td><td>ab5392</td><td></td></tr><tr><td>Bezbarwny lakier do paznokci</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1849418</td><td>Inne przezroczyste lakiery do paznokci również działają.</td></tr><tr><td>Zimny blok</td><td>Fisher Scientific</td><td>13131012</td><td></td></tr><tr><td>Komputerowa stacja robocza</td><td>HP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny lub fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>A1R HD25</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-kurczak FITC</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA1-72000</td><td></td></tr><tr><td>Duolink osioł anty-Myszy PLUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92001</td><td></td></tr><tr><td>Duolink osioł anty-Królik MINUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92005</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Odczynniki do wykrywania in situ Far Red</td><td>Sigma</td><td>DUO92013</td><td>Zawiera materiał do ligacji, zapas do amplifikacji, ligazę i polimerazę.</td></tr><tr><td>Duolink In Situ Medium montażowe z DAPI</td><td>Sigma</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td><td>Sigma</td><td>DUO82049</td><td>zawiera bufor do płukania A i bufor do płukania B; rozcieńczyć bufor do płukania B do 1% w diH20 dla 1% buforu do płukania B.</td></tr><tr><td>Pędzel z cienką końcówką</td><td>Fisher Scientific NC9691026</td><td></td><td>Włosy sobolowe, rozmiar 00 lub 000, można również znaleźć w sklepach rzemieślniczych</td></tr><tr><td>Fisherbrand Okulary przeciwsłoneczne: prostokąty</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545MP</td><td>Szkło nakrywkowe nie jest konieczne w przypadku hodowanych neuronów już na szklanych szkiełkach nakrywkowych.</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>1255015</td><td>W przypadku hodowanych neuronów już na szklanych szkiełkach nakrywkowych, szkiełka Superfrost mogą być niepotrzebne.</td></tr><tr><td>Zamrażarka, -20&deg; C</td><td>VWR</td><td>76449-108</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane</td><td>Fisher Scientific</td><td>125480</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td><td>, np. NIS Elements, Inkubator ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>15-015-2633</td><td></td></tr><tr><td>Duża szalka Petriego, 100mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy molekularnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24701</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-Synapsin1</td><td>Systemy synaptyczne</td><td>106-011</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-106-1013</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-025</td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td>Zakres objętości roboczej od 3 i mikro; L do 500 i mikro; L</td></tr><tr><td>Plastikowa pipeta Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-708-006</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjna pęseta/foreceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-PSD95</td><td>Abcam</td><td>ab18258</td><td>Inne pary przeciwciał mogą również działać z optymalizacją.</td></tr><tr><td>Lodówka</td><td>VWR</td><td>76470-402</td><td></td></tr><tr><td>Mała szalka Petriego, 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-649-17</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr></tbody></table>

detectsyn: szybka, bezstronna metoda fluorescencyjna do wykrywania zmian w gęstości synaps

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

Synapsy są miejscem komunikacji między neuronami. Siła obwodu neuronalnego jest związana z gęstością synaps, a rozpad synaps jest charakterystyczny dla stanów chorobowych, takich jak duże zaburzenie depresyjne (MDD) i choroba Alzheimera. Tradycyjne techniki badania liczby synaps obejmują ekspresję genetyczną markerów fluorescencyjnych (np. białka zielonej fluorescencji (GFP)), barwników wypełniających neuron (np. barwnik karbocyjaninowy, DiI) oraz immunofluorescencyjne wykrywanie markerów kręgosłupa (np. gęstość postsynaptyczna 95 (PSD95)). Głównym zastrzeżeniem do tych technik proxy jest to, że identyfikują one tylko zmiany postsynaptyczne. Jednak synapsa jest połączeniem między zakończeniem presynaptycznym a kręgosłupem postsynaptycznym. Złoty standard pomiaru powstawania/eliminacji synaps wymaga czasochłonnych technik mikroskopii elektronowej lub tomografii matrycowej. Techniki te wymagają specjalistycznego szkolenia i kosztownego sprzętu. Co więcej, tylko ograniczona liczba neuronów może być oceniona i jest używana do reprezentowania zmian w całym regionie mózgu. DetectSyn to szybka technika fluorescencyjna, która identyfikuje zmiany w tworzeniu lub eliminacji synaps spowodowane stanem chorobowym lub aktywnością leku. DetectSyn wykorzystuje szybki test ligacji zbliżeniowej do wykrywania zestawionych białek pre- i postsynaptycznych oraz standardową mikroskopię fluorescencyjną, technikę łatwo dostępną dla większości laboratoriów. Fluorescencyjna detekcja powstałych punktów pozwala na szybką i bezstronną analizę eksperymentów. DetectSyn zapewnia bardziej reprezentatywne wyniki niż mikroskopia elektronowa, ponieważ można analizować większe obszary niż ograniczona liczba neuronów fluorescencyjnych. Co więcej, DetectSyn działa w przypadku neuronów hodowanych in vitro i utrwalonych wycinków tkanki. Na koniec przedstawiono metodę analizy danych zebranych za pomocą tej techniki. Ogólnie rzecz biorąc, DetectSyn oferuje procedurę wykrywania względnych zmian gęstości synaps w różnych terapiach lub stanach chorobowych i jest bardziej dostępny niż tradycyjne techniki.

Dane zmodyfikowane na podstawie pracy Heaney i wsp.6 zostały przedstawione w celu zdemonstrowania eksperymentu, w którym oczekiwany jest wzrost tworzenia synaps (więcej informacji oraz bardziej szczegółową dyskusję nad mechanizmem można znaleźć w 6). Wcześniej wykazano, że szybkodziałające leki przeciwdepresyjne wymagają aktywacji hamującego receptora metabotropowego GABAB (podtyp B kwasu gamma-aminomasłowego), aby były skuteczne13. Ponadto wcześniej...

DetectSyn to bezstronny, szybki test fluorescencyjny, który mierzy zmiany we względnej liczbie synaps (zaangażowanie pre- i postsynaptyczne) w różnych terapiach lub stanach chorobowych. Technika ta wykorzystuje technikę ligacji zbliżeniowej, która może być stosowana zarówno w hodowanych neuronach, jak i w tkance stałej.

DetectSyn: szybka, bezstronna metoda fluorescencyjna do wykrywania zmian w gęstości synaps

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

DetectSyn wykorzystuje technologię ligacji zbliżeniowej do szybkiej identyfikacji zmian w synapsach. Udostępniamy również protokół do analizy wyników. Główną zaletą DetectSyn jest to, jak szybko można uzyskać wyniki w dużych obszarach tkanki, które można analizować.Na początek ostrożnie usuń roztwór blokujący za pomocą plastikowej pipety Pasteura, nie naruszając komórek. Następnie wyłóż dużą plastikową szalkę Petriego Parafilmem. I za pomocą kleszczy ostrożnie przenieś szkiełka nakrywkowe na Parafilm.Dodać 60 mikrolitrów roztworu przeciwciał pierwszorzędowych na wierzch szkiełka nakrywkowego, upewniając się, że roztwór przeciwciała nie rozleje się na boki szkiełka nakrywkowego. Aby zapewnić wilgotność i zapobiec wysychaniu próbek podczas inkubacji, dodaj ultraczystą wodę do mniejszej szalki Petriego i ostrożnie umieść naczynie wokół szkiełek nakrywkowych. Następnie przykryj większą szalkę Petriego i inkubuj wyhodowane komórki przez godzinę w temperaturze pokojowej.Po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym, za pomocą kleszczy ostrożnie strzepnąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego z szkiełek nakrywkowych na ręcznik papierowy i przenieść szkiełka nakrywkowe na oryginalną 24-dołkową płytkę wypełnioną 500 mikrolitrami PBS. Następnie przemyć próbki PBS trzy razy przez 10 minut każda, delikatnie mieszając na wytrząsarce orbitalnej. Po ostatnim umyciu przenieś szkiełka nakrywkowe z powrotem na dużą szalkę Petriego i dodaj 40 mikrolitrów roztworu przeciwciał wtórnych na wierzch szkiełka nakrywkowego.Przykryć szalkę Petriego i inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. W przypadku ligacji, utrzymując ligazę na zimnym bloku, rozcieńczyć ligazę od 1 do 40 za pomocą podnośnika do ligacji i natychmiast dodać 40 mikrolitrów mieszanki ligazy do szkiełek nakrywkowych. Przykryć szalkę Petriego i inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.W celu amplifikacji rozcieńczyć polimerazę 1280 na zimnym bloku za pomocą podstawki do amplifikacji. Następnie dodać 40 mikrolitrów mieszanki amplifikacyjnej do szkiełek nakrywkowych i inkubować próbki przez 100 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie, w celu montażu, upuść trzy mikrolitry nośnika montażowego na szkiełko.Zetrząśnij nadmiar bufora myjącego z szkiełka nakrywkowego i umieść szkiełko nakrywkowe komórkami skierowanymi w dół w nośniku montażowym. Uszczelnij boki niewielką ilością przezroczystego lakieru do paznokci, aby utrzymać szkiełko nakrywkowe na miejscu. W celu zamontowania pokrojonej chusteczki ostrożnie przenieś plasterek chusteczki na przygotowane szkiełko i połóż go płasko.Następnie upuść od 5 do 10 mikrolitrów podłoża montażowego na plasterek tkanki. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na plasterku chusteczki i uszczelnij szkiełko nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci, jak pokazano wcześniej. W przypadku obrazowania cyfrowego za pomocą mikroskopu konfokalnego dostosuj wzmocnienie, przesunięcie i moc lasera dla każdego kanału fluorescencyjnego, aby zmniejszyć szum tła i wzmocnić sygnał fluorescencyjny.Upewnij się, że sygnał fluorescencyjny nie jest przesycony. W przypadku neuronów hodowlanych, na karcie Akwizycja ND, kliknij Zapisz do pliku. Następnie w obszarze Przeglądaj wybierz plik, aby zapisać obraz i wprowadź nazwę pliku.Następnie na karcie Z wybierz opcję Tryb symetryczny zdefiniowany przez zakres. Ustaw ostrość na najlepszą mapę dwupłaszczyznową i kliknij przycisk Względnie, aby ustawić tę płaszczyznę ogniskową jako środek stosu z. Następnie ustaw zakres na pięć mikrometrów z krokami co jeden mikrometr i zaznacz opcję Zamknij aktywną migawkę podczas ruchu Z.Na karcie Długość fali wybierz nazwę przycisku optycznego z wcześniej skonfigurowanymi ustawieniami akwizycji w obszarze Konfiguracja optyczna i kliknij Uruchom teraz. W przypadku tkanki pokrojonej w plasterki z menu pobierania wybierz opcję Skanuj duży obraz, a następnie w panelu przechwytywania wybierz przycisk optyczny z poprzednio skonfigurowanymi ustawieniami akwizycji. Wybierz również odpowiedni obiektyw w tym panelu.Następnie, pod panelem obszaru i okularem, użyj strzałek, aby ustawić granice obszaru zainteresowania lub ROI. Następnie kliknij Zapisz duży obraz do pliku i utwórz nazwę pliku ścieżki zapisu dla obrazu. Na koniec w panelu ustawień upewnij się, że zaznaczona jest opcja Przechwytywanie wielokanałowe.Następnie wybierz nazwę przycisku optycznego z poprzednio skonfigurowanymi ustawieniami akwizycji w obszarze Konfiguracja optyczna. W ImageJ otwórz opcję próg, przechodząc do menu obrazu, klikając Dostosuj, a następnie Próg. Wybierz opcję Ciemne tło, jeśli obraz ma ciemne tło.Następnie dostosuj górną i dolną granicę progu zgodnie z wcześniej określonymi zoptymalizowanymi ustawieniami progu i kliknij Zastosuj. W przypadku hodowanych komórek użyj kanału MAP2 i narzędzia ROI z wolnej ręki, aby narysować ROI dla każdego neuronu, w tym dendrytów i somy. W przypadku pokrojonej tkanki narysuj odręczny zwrot ROI na obrazie plasterka, który obejmuje obszar zainteresowania.Następnie uzyskaj obszar zwrotu z inwestycji, otwierając menu Analizuj i klikając Zmierz. Aby wykryć liczbę punta w każdym ROI, użyj narzędzia do automatycznego wykrywania, takiego jak analiza cząstek. Z menu Analizowane wybierz opcję Analizowane cząstki i zdefiniuj średnicę rozmiaru puncta.Następnie z menu rozwijanego pokaż wybierz opcję Maski nakładki, a następnie zaznacz opcję Wyświetl wyniki i kliknij W porządku. Aby podzielić liczbę punta przez obszar indywidualnego ROI, skopiuj i wklej wyniki dla każdego obrazu z wyskakującego okienka wyników do arkusza kalkulacyjnego. Zidentyfikuj, z którego pliku i próbki danych uzyskaliśmy, a następnie podziel obszar zwrotu z inwestycji przez liczbę punta.Na koniec, aby znormalizować wyniki dla próbek kontrolnych, należy uśrednić wyniki dla próbek kontrolnych i podzielić uzyskane wyniki wszystkich próbek przez średnią z kontroli. Agonista GABAB, baklofen, jest niezbędny do zapewnienia skuteczności in vitro szybkiego leku przeciwdepresyjnego Ro-256981. O wzroście tworzenia synaps świadczy wzrost białej punty.Bez baklofenu nie obserwuje się wzrostu tworzenia synaps. In vivo, dootrzewnowe wstrzyknięcie szybkiego leku przeciwdepresyjnego powoduje zwiększenie tworzenia synaps w porównaniu z kontrolą soli fizjologicznej. Podczas gdy niektóre punty pojawiają się na obrazach kontroli technicznej, na ogół nie mają one tego samego rozmiaru, jak pokazano na białej specyfikacji w porównaniu z dużą puntą w innych panelach.Co więcej, te punta nie znajdują się w tym samym miejscu, o czym świadczą niektóre punta pojawiające się w somie. DetectSyn może identyfikować zmiany w synapsach spowodowane stanem chorobowym lub leczeniem farmakologicznym. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu wglądu w dowolny obszar badań, który bada zaburzenia wpływające na rozwój lub rozpad synaps.

detectsyn-rapid-unbiased-fluorescent-method-to-detect-changes-synapse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Synapsy glutaminergiczne mogą przełączać się z trybu aktywnego w tryb cichy. Wykazujemy, że status aktywności presynaptycznej w dysocjowanej kulturze neuronów gryzoni można zwizualizować, wykorzystując utrwalalną formę barwnika FM1-43 do obrazowania synaps aktywnych oraz immunobarwienie przeciwciałami przeciwko vGluT-1 w celu wizualizacji wszystkich synaps glutaminergicznych.

Badanie presynaptycznie cichych synaps z wykorzystaniem mikroskopii świetlnej

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.

Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Obfitość receptorów neurotransmiterów zgromadzonych w synapsach silnie wpływa na siłę synaptyczną. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie liczby znakowanych fluorescencyjnie receptorów neurotransmiterów w trzech wymiarach z rozdzielczością pojedynczej synapsy u C. elegans, co umożliwia szybką charakterystykę setek synaps w obrębie jednej próbki bez zniekształceń wynikających z projekcji płaszczyzny z.

Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans

Opisujemy użycie styrylowych barwników FM do obrazowania recyklingu pęcherzyków synaptycznych w funkcjonalnych zakończeniach nerwowych. Protokół ten może być stosowany nie tylko do wywołanych, ale także spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych. Protokół rozszerza różnorodność zdarzeń synaptycznych, które można skutecznie ocenić.<br...

Badanie recyklingu pęcherzyków synaptycznych za pomocą barwników FM podczas wywołanych, spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

Tutaj pokazujemy, jak określić ilościowo liczbę i rozkład przestrzenny aktywnych stref synaptycznych w fotoreceptorach Drosophila melanogaster, wyróżnionych genetycznie zakodowanym markerem molekularnym, oraz ich modulację po długotrwałej ekspozycji na światło.

Analiza modulacji synaptycznej fotoreceptorów Drosophila melanogaster po ekspozycji na przedłużone światło

Protokół do dokładnej identyfikacji i analizy synaps w wycinkach hipokampa za pomocą immunofluorescencji jest opisany w tym artykule.

Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie

Opisujemy optyczny test do recyklingu pęcherzyków synaptycznych (SV) w hodowanych neuronach. Połączenie tego protokołu z podwójną transfekcją w celu ekspresji markera presynaptycznego i białka będącego przedmiotem zainteresowania pozwala nam zlokalizować miejsca presynaptyczne, ich zdolność do recyklingu pęcherzyków synaptycznych i określić rolę białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Test optyczny do recyklingu pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach z nadekspresją białek presynaptycznych

Tutaj opisujemy ilościowe podejście do określania rozkładu białka synaptycznego względem białka markerowego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, mikroskopii konfokalnej i analizy komputerowej.

Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Przedstawiamy protokół do oceny równowagi między uwalnianiem glutaminianu a klirensem w pojedynczych synapsach glutaminergicznym korowo-prążkowych w ostrych wycinkach od dorosłych myszy. Protokół ten wykorzystuje czujnik fluorescencyjny iGluu do wykrywania glutaminianu, kamerę sCMOS do akwizycji sygnału oraz urządzenie do ogniskowego oświetlenia laserowego.

Wskaźniki uwalniania i wychwytu glutaminianu w pojedynczych synapsach w ostrych wycinkach mózgu od myszy normalnych i myszy z chorobą Huntingtona

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Poznaj metodę DetectSyn do szybkiego wykrywania zmian w gęstości synaps przy użyciu techniki fluorescencyjnej z ligacją bliskościową. Ta technika umożliwia analizę zarówno hodowanych neuronów, jak i utrwalonej tkanki.

DetectSyn: szybka, bezstronna metoda fluorescencyjna do wykrywania zmian w gęstości synaps

Przeglądaj więcej filmów