Izolowanie RNA specyficznych dla typu komórki z zatrzaskowo mrożonych próbek tkanek heterogenicznych bez sortowania komórek

Protokół ten ma na celu uzyskanie wysokiej jakości specyficznych dla typów komórek RNA z niewielkiej liczby komórek w złożonej tkance bez sortowania komórek. Wykorzystuje on niedawno dostępny model mysi, który pozwala naukowcom wyizolować RNA związane z rybosomem za pomocą ściągania GLP. Metoda nadaje się również do izolowania RNA związanych z rybosomami z dowolnych komórek wykazujących ekspresję EGFP.

Na początek dodaj dwa mililitry lodowatego buforu roboczego do homogenizacji do zestawu młynków do szklanych chusteczek. Szybko umieść zamrożoną próbkę w młynku i homogenizuj tkankę za pomocą 30 pociągnięć na lodzie za pomocą luźnego tłuczka. Przenieść homogenat do dwumililitrowej probówki z okrągłym dnem i odwirować przy 12 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie przenieś supernatant do nowej dwumililitrowej probówki bez naruszania osadu, rezerwując 100 mikrolitrów jako wejście. Inkubować supernatant z przeciwciałem anty-GFP w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze końca nad końcem przez noc. Przenieść mieszaninę homogenatu i przeciwciał do nowej dwumililitrowej probówki z okrągłym dnem zawierającej przemyte kulki białkowe g i inkubować w czterech stopniach Celsjusza na rotatorze przy 24 obr./min przez dwie godziny.

Oddzielić kulki magnetyczne od supernatantu za pomocą stojaka magnetycznego. Zachowaj supernatant jako frakcję ujemną, która zawiera RNA w komórkach ujemnych EGFP i RNA w komórkach dodatnich EGFP, które nie są związane z rybosomami. Dodaj jeden mililitr buforu do płukania o wysokiej zawartości soli do kulek i krótko przekręć rurkę, aby umyć kulki.

Następnie umieść rurkę w stojaku magnetycznym. Usuń bufor do płukania i powtórz etapy płukania jeszcze dwa razy, aby uzyskać kompleks rybosomowego RNA z kulek z komórek dodatnich EGFP. Inkubować kulki z 50 mikrolitrami buforu ekstrakcyjnego z zestawu do izolacji RNA w ThermoMixerze przez 30 minut, aby uwolnić RNA z kulek.

Oddziel kulki za pomocą stojaka magnetycznego i przenieś supernatant do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Odwirować probówkę o masie 3000 g przez dwie minuty. Następnie odpipetować supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Aby wstępnie przygotować kolumnę oczyszczającą RNA, należy odpipetować 250 mikrolitrów buforu kondycjonującego na kolumnę oczyszczającą i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odwirować kolumnę o masie 16 000 g przez jedną minutę. Odpipetować równą objętość 70% etanolu do ekstraktu komórkowego i dobrze wymieszać przez pipetowanie.

Odpipetować do 200 mikrolitrów mieszaniny do wstępnie kondycjonowanej kolumny oczyszczającej RNA. Aby zmniejszyć straty próbek, nie należy napełniać kolumny więcej niż 80% jej pojemności. Powtórz ten krok kilka razy, aż wszystkie RNA zostaną zebrane w tej samej kolumnie każdej frakcji.

Wirować kolumnę przez dwie minuty, aby związać RNA z membraną w kolumnie. Następnie kontynuuj wirowanie przez 30 sekund. Wylać przepływający płyn i odpipetować 100 mikrolitrów buforu płuczącego jeden do kolumny.

Wirować przez jedną minutę, a następnie odrzucić przepływ. Odpipetować 75 mikrolitrów roztworu DNA wymieszać bezpośrednio z membraną kolumny oczyszczającej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Następnie odpipetować 40 mikrolitrów buforu płuczącego do kolumny i odwirować przez kolejne 30 sekund. Odrzuć przepływ. Odpipetować 100 mikrolitrów buforu płuczącego dwa do kolumny i odwirować przy 8 000 g przez jedną minutę.

Odrzuć przepływ. Kup PET 100 mikrolitrów buforu płuczącego dwa do kolumny i odwiruj przy 16 000 g przez dwie minuty. Odrzucić przepływający przez nie płyn i ponownie odwirować tę samą kolumnę o stężeniu 16 000 g przez jedną minutę, aby usunąć wszelkie ślady buforu do przemywania wody.

Przenieś kolumnę do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Odpipetuj 12 mikrolitrów wody wolnej od RNaz bezpośrednio na membranę kolumny oczyszczającej, upewniając się, że końcówka pipety nie dotyka membrany. Inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną minutę i wirować przy 1000 g przez jedną minutę.

Następnie w temperaturze 16 000 G przez jedną minutę w celu elucji RNA. Użyj bioanalizatora, aby ocenić jakość i ilość wyekstrahowanego RNA. Przechowuj RNA w zamrażarce o temperaturze 80 stopni lub wyślij do dalszej analizy.

Myszom z oboma genetycznie modyfikowanymi allelami genów, Gli1-CreERT2 i NuTRAP, wstrzykuje się tamoksyfen raz dziennie, co drugi dzień przez trzy wstrzyknięcia. Analiza immunofluorescencyjna pobranych tkanek wykazała, że EGFP ulegał ekspresji w komórkach śródmiąższowych w jądrach. EGFP stwierdzono również w komórkach torebki nadnerczy u myszy Gli1-CreERT2, NuTRAP.

U myszy Sonic Hedgehog-CreERT2 NuTRAP Populacja komórek EGFP dodatnich znajduje się w zewnętrznej korze nadnerczy pod torebką, potwierdzając ekspresję komórek przed ekspresją EGFP. Po ekstrakcji RNA specyficznych dla typu komórki, wyekstrahowany RNA został wysłany do analizy mikromacierzy. Wyniki wykazały, że około 3000 genów zostało wzbogaconych we frakcji dodatniej, w porównaniu z genami we frakcji ujemnej, podczas gdy około 4 000 genów zostało wzbogaconych we frakcji ujemnej.

Spośród genów o zróżnicowanej ekspresji, geny związane z komórkami Leydiga Hsd11b1 i Hsd3b6 zostały wzbogacone we frakcję dodatnią. We frakcji ujemnej wzbogacono geny związane z komórkami Sertoliego Desert Hedgehog i Gstm6. Tylko kilka genów o zróżnicowanej ekspresji zostało zidentyfikowanych podczas porównywania frakcji ujemnej z danymi wejściowymi.

Ilościowy RT-PCR w czasie rzeczywistym został wykorzystany do potwierdzenia ekspresji kluczowych genów we frakcji dodatniej i ujemnej. Podobnie jak w teście mikromacierzy, enzymy steroidogenne dehydrogenaza 3-beta hydroksysteroidowa i enzym rozszczepienia łańcucha bocznego cholesterolu zostały wzbogacone we frakcję dodatnią. Tymczasem dziewiąty czynnik transkrypcyjny SRY box marker komórek Sertoliego i marker komórek rozrodczych białko kompleksu synaptonemalnego trzy zostały wzbogacone we frakcję ujemną.

Podczas prób stosowania tego protokołu ważne jest, aby przygotować świeży bufor roboczy do homogenizacji Dodać DTT, rekombinowaną rybonukleazę cykloheksymidu i koktajl inhibitorów proteinaz do roztworu podstawowego homogenizacji tylko przed użyciem. Ważne jest również, aby przed użyciem przygotować świeże do płukania o niskiej zawartości soli i o wysokiej zawartości soli.