Name: Izolowanie RNA specyficznych dla typu komórki z zatrzaskowo mrożonych próbek tkanek heterogenicznych bez sortowania komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj izolację RNA specyficznego dla typu komórki z tkanki heterogenicznej bez sortowania komórek. Ta metoda wykorzystuje model myszy NuTRAP i immunoprecypitację GLP do ekstrakcji RNA związanego z rybosomami z komórek EGFP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez NIH R00HD082686. Dziękujemy za stypendium Endocrine Society Summer Research Fellowship dla H.S.Z. Dziękujemy również dr Yuan Kang za hodowlę i utrzymanie kolonii myszy.

Wszystkie przeprowadzone eksperymenty na zwierzętach były zgodne z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Auburn.
UWAGA: Poniższy protokół wykorzystuje jedno jądro (około 100 mg) w P28 od Gli1-CreERT2; Myszy NuTRAP (Mus musculus). Może być konieczne dostosowanie objętości odczynników w zależności od rodzaju próbek i liczby tkanek.
1. Pobieranie tkanek
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji za pomocą komory CO2, zdezynfekuj powierzchnię brzucha 70% etanolem.</li>
	<li>Otwórz dolną część brzucha nożyczkami i usuń jądra. Użyj ciekłego azotu (LN2), aby natychmiast zamrozić jądra.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w fazie gazowej LN2 do czasu użycia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie odczynników i kulek
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy do homogenizacji: dodać 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 i 1 mg/ml heparyny. Roztwór przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia (do 1 miesiąca).</li>
	<li>Przygotować bufor roboczy do homogenizacji z roztworu podstawowego (krok 2.1) świeżo przed użyciem: dodać DTT (stężenie końcowe: 1 mM), cykloheksymid (stężenie końcowe: 100 μg/ml), rekombinowaną rybonukleazę (stężenie końcowe: 200 jednostek/ml) i koktajl inhibitora proteazy (stężenie końcowe: 1x) do roztworu podstawowego homogenizacji, aby uzyskać wymaganą ilość buforu roboczego do homogenizacji. Przechowuj świeżo przygotowany bufor roboczy na lodzie do czasu użycia.</li>
	<li>Przygotuj do płukania o niskiej zawartości soli i o wysokiej zawartości soli:
	<ol>
		<li>Aby przygotować bufor do płukania o niskiej zawartości soli, zmieszaj 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl i 1% NP-40. Przed użyciem dodać DTT (stężenie końcowe: 1 mM) i cykloheksymid (stężenie końcowe: 100 μg/ml).</li>
		<li>Aby przygotować bufor do płukania o wysokiej zawartości soli, wymieszaj 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. Przed użyciem dodać DTT (stężenie końcowe: 2 mM) i cykloheksymid (stężenie końcowe: 100 μg/ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj kulki białkowe G (Tabela Materiałów):
	<ol>
		<li>Każda próbka będzie potrzebowała 50 μl kulek białka G. Umieść wymaganą ilość kulek w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i oddziel kulki od roztworu za pomocą stojaka magnetycznego, pozostawiając probówkę na stojaku na 30-60 s.</li>
		<li>Usunąć szwadron przez pipetowanie. Umyj kulki trzykrotnie 1 ml lodowatego buforu do płukania o niskiej zawartości soli za każdym razem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Liza i homogenizacja tkanek
<ol>
	<li>Dodać 2 ml lodowatego buforu roboczego do homogenizacji (świeżo przygotowanego z kroku 2.2) do zestawu do mielenia tkanek szklanych. Szybko umieść zamrożoną próbkę w młynku i homogenizuj tkankę za pomocą 30 pociągnięć na lodzie za pomocą luźnego tłuczka.</li>
	<li>Przenieść homogenat do probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml i odwirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 2 ml. Zaoszczędź 100 μl w probówce o pojemności 1,5 ml jako "wejście".</li>
	<li>Inkubować supernatant w probówce o pojemności 2 ml z przeciwciałem anty-GFP (5 μg/ml; 1:400) w temperaturze 4 °C na rotatorze typu end-to-end (24 obr./min) przez noc.</li>
</ol>
4. Immunoprecypitacja
<ol>
	<li>Przenieść mieszaninę homogenatu/przeciwciała do nowej probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml zawierającej przemyte kulki białka G z kroku 2.4. Inkubować w temperaturze 4 °C na rotatorze typu "koniec po kroku" (24 obr./min) przez 2 godziny.</li>
	<li>Oddziel kulki magnetyczne od supernatantu za pomocą stojaka magnetycznego. Zachowaj supernatant jako "frakcję ujemną". Frakcja ujemna zawiera (1) RNA w komórkach EGFP-ujemnych i (2) RNA w komórkach EGFP-dodatnich, które nie są związane z rybosomami.</li>
	<li>Dodaj 1 ml buforu do płukania o wysokiej zawartości soli do kulek i krótko przekręć probówkę, aby umyć kulki. Umieść rurkę w stojaku na magnesy.</li>
	<li>Usuń bufor do mycia. Powtórz krok prania jeszcze dwa razy. Koraliki zawierają teraz kompleks koraliki-rybosom-RNA z komórek EGFP-dodatnich.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja RNA
UWAGA: Poniższe kroki są zaczerpnięte z zestawu do izolacji RNA (Tabela Materiałów). Traktuj każdą frakcję (tj. wejściową, dodatnią i ujemną) jako niezależną próbkę i niezależnie izoluj RNA.
<ol>
	<li>Inkubować kulki z kroku 4.4 z 50 μl buforu ekstrakcyjnego (z zestawu do izolacji RNA) w termomikserze (42 °C, 500 obr./min) przez 30 minut, aby uwolnić RNA z kulek.</li>
	<li>Oddziel kulki za pomocą stojaka magnetycznego, przenieś supernatant zawierający kompleks kulek-rybosom-RNA do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odwirować probówkę o masie 3000 x g przez 2 minuty, a następnie pipetować supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Ta probówka zawiera "frakcję dodatnią" kroku TRAP. 
	UWAGA: Dla frakcji wejściowej i ujemnej ekstrahować RNA z 25 μl próbek za pomocą 1 ml buforu ekstrakcyjnego. Inkubować w termomikserze (42 °C, 500 obr./min) przez 30 min.</li>
	<li>Wstępnie kondycjonuj kolumnę oczyszczającą RNA: Odpipetować 250 μl buforu kondycjonującego na kolumnie oczyszczającej. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Odwirować kolumnę przy 16 000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Odmierzyć pipetą równą objętość 70% EtOH do supernatantu z kroku 5.3 (około 50 μl 70% EtOH dla frakcji dodatniej i 1 ml 70% EtOH dla frakcji wejściowej i ujemnej). Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Odpipetować mieszaninę do kolumny z kroku 5.4.</li>
	<li>Odwirować kolumnę przy 100 x g przez 2 minuty, aby umożliwić związanie RNA z membraną w kolumnie, a następnie natychmiast kontynuować wirowanie przy 16 000 x g przez 30 s. Wyrzuć przepływ. 
	UWAGA: Dla frakcji wejściowej i ujemnej należy za każdym razem dodawać do kolumny 250 μL mieszaniny. Powtarzać kroki 5.6 i 5.7, aż wszystkie mieszaniny zostaną zużyte.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl buforu płuczącego 1 (W1) do kolumny i odwirować przy 8 000 x g przez 1 min. Wyrzucić przepływ.</li>
	<li>Odpipetować 75 μl roztworu DNazy wymieszać bezpośrednio z membraną kolumny oczyszczającej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Odpipetować 40 μl W1 do kolumny i odwirować przy 8 000 x g przez 30 s. Wyrzucić przepływ.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl buforu płuczącego 2 (W2) do kolumny i odwirować przy 8 000 x g przez 1 minutę. Wyrzucić przepływ.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl W2 do kolumny i odwirować przy 16 000 x g przez 2 minuty. Wyrzucić przepływ. Ponownie odwirować tę samą kolumnę przy 16 000 x g przez 1 minutę, aby usunąć wszelkie ślady buforu płuczącego przed etapem elucji.</li>
	<li>Przenieść kolumnę do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odpipetować 12 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio na membranę kolumny oczyszczającej. Końcówka pipety nie powinna dotykać membrany. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę i wirować przy 1000 x g przez 1 minutę. Następnie kontynuuj wirowanie przy 16 000 x g przez 1 minutę w celu elucji RNA.</li>
</ol>
6. Stężenie i jakość RNA
<ol>
	<li>Użyj bioanalizatora, aby ocenić jakość i ilość wyekstrahowanego RNA10.</li>
</ol>
7. Przechowywanie i dalsza analiza
<ol>
	<li>Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C (do 1 roku) do czasu dalszej analizy (np. mikromacierzy, ilościowego PCR (qPCR), sekwencjonowania RNA itp.). 
	UWAGA: Szczegółowe informacje na temat analizy qPCR, w tym syntezy cDNA, można znaleźć w Lyu et al.11. Startery do qPCR są wymienione w Tabeli Materiałów.</li>
</ol>

<ol><li>Yang, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+RNA+sequencing+reveals+dynamic+regulation+of+myocardial+noncoding+RNAs+in+failing+human+heart+and+remodeling+with+mechanical+circulatory+support%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support.</a> Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).</li>
<li>Soumillon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+source+and+mechanisms+of+high+transcriptome+complexity+in+the+mammalian+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis.</a> Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li>
<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li>
<li>Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAP-rc%2C+translating+ribosome+affinity+purification+from+rare+cell+populations+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985(2015).</li>
<li>Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+ribosome+affinity+purification+%28trap%29+to+investigate+Arabidopsis+thaliana+root+development+at+a+cell+type-specific+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919(2020).</li>
<li>Moran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29+for+RNA+isolation+from+endothelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624(2019).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Varjosalo, M., Taipale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog%3A+functions+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog: functions and mechanisms.</a> Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).</li>
<li>Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+integrity+number+%28RIN%29-standardization+of+RNA+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Agilent+Technologies%22%5BJournal%5D)">RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control.</a> Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).</li>
<li>Lyu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+reveals+sub-zones+in+mouse+adrenal+zona+fasciculata+and+the+sexually+dimorphic+responses+to+thyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone.</a> Endocrinology. 161 (9), (2020).</li>
<li>King, P., Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shh+signaling+regulates+adrenocortical+development+and+identifies+progenitors+of+steroidogenic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).</li>
<li>Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell+expansion+and+organ+size+of+mouse+adrenal+is+regulated+by+sonic+hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog.</a> Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).</li>
<li>Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+adult+Leydig+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of adult Leydig cells.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).</li>
<li>Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+11%CE%B2-hydroxysteroid+dehydrogenase.+Testicular+11%CE%B2-hydroxysteroid+dehydrogenase%3A+development+of+a+model+for+the+mediation+of+Leydig+cell+function+by+corticosteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids.</a> Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).</li>
<li>Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli+cell+signaling+by+Desert+hedgehog+regulates+the+male+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline.</a> Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).</li>
<li>Beverdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9-dependent+expression+of+Gstm6+in+Sertoli+cells+during+testis+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice.</a> Reproduction. 137 (3), 481(2009).</li>
<li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+single-cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Technologies for single-cell isolation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+considerations+for+single-cell+rna+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108(2018).</li>
<li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+cell-specific+mouse+models+for+paired+epigenetic+and+transcriptomic+studies+of+microglia+and+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia.</a> Communications Biology. 3 (1), 693(2020).</li>
<li>Barsoum, I., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+and+differential+roles+of+transcription+factors+Gli1+and+Gli2+in+the+development+of+mouse+fetal+Leydig+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells.</a> Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).</li>
<li>Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analysis+of+testicular+Leydig+cells+in+normal+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice.</a> The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przydatność analizy transkryptomu całej tkanki może być ograniczona, zwłaszcza podczas badania złożonych tkanek heterogenicznych. Sposób uzyskania RNA specyficznych dla typu komórki staje się pilną potrzebą uwolnienia potężnej techniki sekwencjonowania RNA. Izolacja RNA specyficznych dla typu komórki zwykle opiera się na pobraniu określonego typu komórek za pomocą mikromanipulacji, sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) lub mikrodysekcji wychwytywania laserowego (LCM)18. Opracowano r...

Podejścia wysokoprzepustowe, w tym sekwencjonowanie RNA (sekwencjonowanie RNA) i mikromacierze, umożliwiły badanie profili ekspresji genów na poziomie całego genomu. W przypadku tkanek złożonych, takich jak serce, mózg i jądra, dane specyficzne dla typu komórki dostarczą więcej szczegółów porównujących użycie RNA z całej tkanki1,2,3. Aby przezwyciężyć wpływ heterogeniczności komórkowej, od początku 2010 roku rozwijana jest metoda oczyszczania powinowactwa do rybosomów (TRAP)4. TRAP jest w stanie wyizolować RNA związane z rybosomami z określonych typów komórek bez dysocjacji tkanek. Metoda ta została wykorzystana do analizy translatomu (mRNA, które są rekrutowane do rybosomu w celu translacji) w różnych organizmach, w tym do celowania w niezwykle rzadką populację komórek mięśniowych w zarodkach Drosophila5, badania różnych komórek korzeniowych w roślinie modelowej Arabidopsis thaliana6, oraz przeprowadzania analizy transkryptomu komórek śródbłonka u ssaków7.
TRAP wymaga modyfikacji genetycznej, aby oznaczyć rybosom organizmu modelowego. Evan Rosen i jego koledzy opracowali niedawno mysi model o nazwie Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse8, który jest dostępny w Jackson Laboratory od 2017 roku. Krzyżując się z linią myszy Cre, naukowcy mogą wykorzystać ten mysi model NuTRAP do wyizolowania RNA i jąder komórkowych związanych z rybosomami z komórek wykazujących ekspresję Cre bez sortowania komórek. W komórkach z ekspresją Cre, które również przenoszą allel NuTRAP, rybosom znakowany EGFP / L10a umożliwia izolację translujących mRNA za pomocą testów obniżania powinowactwa. W tej samej komórce błona jądrowa znakowana peptydem rozpoznającym ligazę biotyny (BLRP), która jest również mCherry dodatnia, umożliwia izolację jądrową poprzez zastosowanie oczyszczania opartego na powinowactwie lub fluorescencji. Ten sam zespół badawczy wygenerował również podobną linię myszy, w której błona jądrowa jest oznaczona tylko mCherry bez biotyny8. Te dwie genetycznie zmodyfikowane linie myszy dają dostęp do scharakteryzowania sparowanych profili epigenomicznych i transkryptomicznych określonych typów komórek będących przedmiotem zainteresowania.
Szlak sygnałowy jeża (Hh) odgrywa kluczową rolę w rozwoju tkanek9. GLI1, członek rodziny GLI, działa jako aktywator transkrypcji i pośredniczy w sygnalizacji Hh. Komórki Gli1+ można znaleźć w wielu narządach wydzielających hormony, w tym w nadnerczach i jądrach. Aby wyizolować DNA i RNA specyficzne dla typu komórki z komórek Gli1+ przy użyciu modelu mysiego NuTRAP, myszy Gli1-CreERT2 skrzyżowano z myszami NuTRAP. Myszy Shh-CreERT2 skrzyżowano również z myszami NuTRAP w celu wyizolowania komórek eksprymujących jeża dźwiękowego (Shh). Poniższy protokół pokazuje, jak używać Gli1-CreERT2; Myszy NuTRAP do izolowania RNA związanych z rybosomami z komórek Gli1 + w jądrach dorosłych myszy.

<table><tbody><tr><td>Actb</td><td>eurofins</td><td>startery qPCR</td><td>ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (starter do przodu/starter do tyłu)</td></tr><tr><td>Bioanalizator</td><td>Agilent</td><td>2100 Bioanalyzer Instrument</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA</td><td>Millipore</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>cykloheksymid</td><td>Milipora</td><td>239764-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Cyp11a1</td><td>eurofins</td><td>startery qPCR</td><td>CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (starter do przodu/starter do tyłu)</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DTT, Dithiothreitol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>Magnes DynaMag-2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Falcon 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw młynków</td><td>do szkła DWK Nauki Przyrodnicze</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>heparyny</td><td>BEANTOWN CHEMICAL</td><td>139975-250MG</td><td></td></tr><<tr><td>em>Hsd3beurofins</td><td></td> <td>startery qPCR</td><td>GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTCTC (starter do przodu/starter do tyłu)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Biosciences</td><td>R005</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosciences</td><td>R004</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 2 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-707-354</td><td></td></tr><tr><td>Mysie mikromacierze testowe Clariom S</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Microarray</td></tr><tr><td>service NP-40</td><td>Milipor</td><td>492018-50 Ml</td><td></td></tr><tr><td>oligo (dT)20</td><td>Invitrogen</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNA PicoPure</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>Białko G Dynabead</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>Wolne od RNaz wodne</td><td>komórki do uprawy</td><td>NUPW-0500</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Rekombinowany inhibitor rybonukleazy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Sox9</td><td>eurofins startery</td><td>qPCR</td><td>TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (starter do przodu/starter wsteczny</td></tr><tr><td>Indeks górny IV odwrotna transkryptaza</td><td>Invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>Sycp3</td><td>eurofins startery</td><td></td> <td>qPCRGAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTTTGA (starter do przodu/starter do tyłu)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62848</td><td></td></tr></tbody></table>

izolowanie rna specyficznych dla typu komórki z zatrzaskowo mrożonych próbek tkanek heterogenicznych bez sortowania komórek

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Heterogeniczność komórkowa stanowi wyzwanie dla zrozumienia funkcji złożonych tkanek na poziomie transkryptomu. Stosowanie RNA specyficznych dla typu komórki pozwala uniknąć potencjalnych pułapek spowodowanych niejednorodnością tkanek i uwalnia potężną analizę transkryptomu. Opisany tutaj protokół pokazuje, jak wykorzystać metodę TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification) do wyizolowania RNA związanych z rybosomami z niewielkiej ilości komórek wykazujących ekspresję EGFP w złożonej tkance bez sortowania komórek. Protokół ten jest odpowiedni do izolowania RNA specyficznych dla typu komórki przy użyciu niedawno dostępnego modelu myszy NuTRAP i może być również używany do izolowania RNA z dowolnych komórek wykazujących ekspresję EGFP.

Gli1-CreERT2 myszy (numer katalogowy Jackson Lab: 007913) skrzyżowano najpierw z NuTRAP mysz reporterowa (numer stocku Jackson Lab: 029899) w celu wygenerowania myszy z podwójną mutacją. Myszy posiadające oba genetycznie zmodyfikowane allele genów (t. j. Gli1-CreERT2 i NuTRAP) wstrzykiwano tamoksyfen raz dziennie, co drugi dzień, w trzech zastrzykach. Próbki tkanek pobrano w 7.th dzień po 1.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. dzień wstrzyknięc...

Ten protokół ma na celu wyizolowanie specyficznych dla typu komórki translujących rybosomalnych mRNA za pomocą mysiego modelu NuTRAP.

Izolowanie RNA specyficznych dla typu komórki z zatrzaskowo mrożonych próbek tkanek heterogenicznych bez sortowania komórek

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

Protokół ten ma na celu uzyskanie wysokiej jakości specyficznych dla typów komórek RNA z niewielkiej liczby komórek w złożonej tkance bez sortowania komórek. Wykorzystuje on niedawno dostępny model mysi, który pozwala naukowcom wyizolować RNA związane z rybosomem za pomocą ściągania GLP. Metoda nadaje się również do izolowania RNA związanych z rybosomami z dowolnych komórek wykazujących ekspresję EGFP.Na początek dodaj dwa mililitry lodowatego buforu roboczego do homogenizacji do zestawu młynków do szklanych chusteczek. Szybko umieść zamrożoną próbkę w młynku i homogenizuj tkankę za pomocą 30 pociągnięć na lodzie za pomocą luźnego tłuczka. Przenieść homogenat do dwumililitrowej probówki z okrągłym dnem i odwirować przy 12 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie przenieś supernatant do nowej dwumililitrowej probówki bez naruszania osadu, rezerwując 100 mikrolitrów jako wejście. Inkubować supernatant z przeciwciałem anty-GFP w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze końca nad końcem przez noc. Przenieść mieszaninę homogenatu i przeciwciał do nowej dwumililitrowej probówki z okrągłym dnem zawierającej przemyte kulki białkowe g i inkubować w czterech stopniach Celsjusza na rotatorze przy 24 obr./min przez dwie godziny.Oddzielić kulki magnetyczne od supernatantu za pomocą stojaka magnetycznego. Zachowaj supernatant jako frakcję ujemną, która zawiera RNA w komórkach ujemnych EGFP i RNA w komórkach dodatnich EGFP, które nie są związane z rybosomami. Dodaj jeden mililitr buforu do płukania o wysokiej zawartości soli do kulek i krótko przekręć rurkę, aby umyć kulki.Następnie umieść rurkę w stojaku magnetycznym. Usuń bufor do płukania i powtórz etapy płukania jeszcze dwa razy, aby uzyskać kompleks rybosomowego RNA z kulek z komórek dodatnich EGFP. Inkubować kulki z 50 mikrolitrami buforu ekstrakcyjnego z zestawu do izolacji RNA w ThermoMixerze przez 30 minut, aby uwolnić RNA z kulek.Oddziel kulki za pomocą stojaka magnetycznego i przenieś supernatant do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Odwirować probówkę o masie 3000 g przez dwie minuty. Następnie odpipetować supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra.Aby wstępnie przygotować kolumnę oczyszczającą RNA, należy odpipetować 250 mikrolitrów buforu kondycjonującego na kolumnę oczyszczającą i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odwirować kolumnę o masie 16 000 g przez jedną minutę. Odpipetować równą objętość 70% etanolu do ekstraktu komórkowego i dobrze wymieszać przez pipetowanie.Odpipetować do 200 mikrolitrów mieszaniny do wstępnie kondycjonowanej kolumny oczyszczającej RNA. Aby zmniejszyć straty próbek, nie należy napełniać kolumny więcej niż 80% jej pojemności. Powtórz ten krok kilka razy, aż wszystkie RNA zostaną zebrane w tej samej kolumnie każdej frakcji.Wirować kolumnę przez dwie minuty, aby związać RNA z membraną w kolumnie. Następnie kontynuuj wirowanie przez 30 sekund. Wylać przepływający płyn i odpipetować 100 mikrolitrów buforu płuczącego jeden do kolumny.Wirować przez jedną minutę, a następnie odrzucić przepływ. Odpipetować 75 mikrolitrów roztworu DNA wymieszać bezpośrednio z membraną kolumny oczyszczającej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.Następnie odpipetować 40 mikrolitrów buforu płuczącego do kolumny i odwirować przez kolejne 30 sekund. Odrzuć przepływ. Odpipetować 100 mikrolitrów buforu płuczącego dwa do kolumny i odwirować przy 8 000 g przez jedną minutę.Odrzuć przepływ. Kup PET 100 mikrolitrów buforu płuczącego dwa do kolumny i odwiruj przy 16 000 g przez dwie minuty. Odrzucić przepływający przez nie płyn i ponownie odwirować tę samą kolumnę o stężeniu 16 000 g przez jedną minutę, aby usunąć wszelkie ślady buforu do przemywania wody.Przenieś kolumnę do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Odpipetuj 12 mikrolitrów wody wolnej od RNaz bezpośrednio na membranę kolumny oczyszczającej, upewniając się, że końcówka pipety nie dotyka membrany. Inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną minutę i wirować przy 1000 g przez jedną minutę.Następnie w temperaturze 16 000 G przez jedną minutę w celu elucji RNA. Użyj bioanalizatora, aby ocenić jakość i ilość wyekstrahowanego RNA. Przechowuj RNA w zamrażarce o temperaturze 80 stopni lub wyślij do dalszej analizy.Myszom z oboma genetycznie modyfikowanymi allelami genów, Gli1-CreERT2 i NuTRAP, wstrzykuje się tamoksyfen raz dziennie, co drugi dzień przez trzy wstrzyknięcia. Analiza immunofluorescencyjna pobranych tkanek wykazała, że EGFP ulegał ekspresji w komórkach śródmiąższowych w jądrach. EGFP stwierdzono również w komórkach torebki nadnerczy u myszy Gli1-CreERT2, NuTRAP.U myszy Sonic Hedgehog-CreERT2 NuTRAP Populacja komórek EGFP dodatnich znajduje się w zewnętrznej korze nadnerczy pod torebką, potwierdzając ekspresję komórek przed ekspresją EGFP. Po ekstrakcji RNA specyficznych dla typu komórki, wyekstrahowany RNA został wysłany do analizy mikromacierzy. Wyniki wykazały, że około 3000 genów zostało wzbogaconych we frakcji dodatniej, w porównaniu z genami we frakcji ujemnej, podczas gdy około 4 000 genów zostało wzbogaconych we frakcji ujemnej.Spośród genów o zróżnicowanej ekspresji, geny związane z komórkami Leydiga Hsd11b1 i Hsd3b6 zostały wzbogacone we frakcję dodatnią. We frakcji ujemnej wzbogacono geny związane z komórkami Sertoliego Desert Hedgehog i Gstm6. Tylko kilka genów o zróżnicowanej ekspresji zostało zidentyfikowanych podczas porównywania frakcji ujemnej z danymi wejściowymi.Ilościowy RT-PCR w czasie rzeczywistym został wykorzystany do potwierdzenia ekspresji kluczowych genów we frakcji dodatniej i ujemnej. Podobnie jak w teście mikromacierzy, enzymy steroidogenne dehydrogenaza 3-beta hydroksysteroidowa i enzym rozszczepienia łańcucha bocznego cholesterolu zostały wzbogacone we frakcję dodatnią. Tymczasem dziewiąty czynnik transkrypcyjny SRY box marker komórek Sertoliego i marker komórek rozrodczych białko kompleksu synaptonemalnego trzy zostały wzbogacone we frakcję ujemną.Podczas prób stosowania tego protokołu ważne jest, aby przygotować świeży bufor roboczy do homogenizacji Dodać DTT, rekombinowaną rybonukleazę cykloheksymidu i koktajl inhibitorów proteinaz do roztworu podstawowego homogenizacji tylko przed użyciem. Ważne jest również, aby przed użyciem przygotować świeże do płukania o niskiej zawartości soli i o wysokiej zawartości soli.

isolate-cell-type-specific-rnas-from-snap-frozen-heterogeneous-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym artykule opisujemy prostą metodę izolacji pojedynczych komórek z pierwotnych kultur neuronalnych szczura oraz późniejszą analizę transkryptomu z wykorzystaniem amplifikacji aRNA. Metoda ta może zostać zastosowana do każdego typu komórek.

Analiza transkryptomu pojedynczych komórek

Analiza ekspresji genów w podzbiorze komórek w określonej tkance stanowi duże wyzwanie. W tym artykule opisano, jak wyizolować wysokiej jakości całkowite RNA z określonej populacji komórek, łącząc metodę szybkiego znakowania immunologicznego z mikrodysekcją wychwytu laserowego.

Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym

Tutaj prezentujemy protokół do wspomaganej laserem mikrodysekcji określonych typów komórek roślinnych do profilowania transkrypcyjnego. Chociaż protokół jest odpowiedni dla różnych gatunków i typów komórek, nacisk kładziony jest na wysoce niedostępne komórki żeńskiej linii zarodkowej, ważne dla rozmnażania płciowego i apomiktycznego w rodzaju krzyżowych Boechera.

Mikrodysekcja wspomagana laserowo (LAM) jako narzędzie do profilowania transkrypcji poszczególnych typów komórek

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego izolowania wysokiej jakości jąder ze świeżej lub zamrożonej tkanki do dalszego masowo równoległego sekwencjonowania RNA. Uwzględniamy opcje detergencyjno-mechanicznego i hipotoniczno-mechanicznego rozbijania tkanek oraz lizy komórek, które można wykorzystać do izolacji jąder.

Izolacja dorosłych jąder rdzenia kręgowego do masowo równoległego sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Ten protokół opisuje procedurę ręcznego sortowania w celu izolacji pojedynczych, znakowanych fluorescencyjnie neuronów, a następnie amplifikacji mRNA opartej na transkrypcji in vitro w celu sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki o dużej głębokości.

Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki znakowanych fluorescencyjnie neuronów myszy przy użyciu ręcznego sortowania i podwójnej transkrypcji in vitro z sekwencjonowaniem bezwzględnym (DIVA-Seq)

Protokół mikrodysekcji laserowej (LCM) został opracowany w celu uzyskania wystarczającej ilości wysokiej jakości RNA do analizy ekspresji genów w komórkach kostnych. Obecne badanie koncentruje się na mysich odcinkach kości udowej. Jednak opisany tutaj protokół LCM może być wykorzystany do badania ekspresji genów w komórkach dowolnej tkanki twardej.

Protokół mikrodysekcji z wychwytem laserowym, który zapewnia wysokiej jakości RNA ze świeżo zamrożonych kości myszy

Ta publikacja opisuje protokół izolacji jąder z dojrzałych adipocytów, oczyszczania przez sortowanie aktywowane fluorescencją oraz transkryptomiki na poziomie pojedynczej komórki.

Izolacja jąder tkanki tłuszczowej do zastosowań genomicznych pojedynczych komórek

Izolacja pojedynczych jąder opiera się na dysocjacji i przenikaniu błony komórkowej za pomocą detergentów, etapach, które wymagają optymalizacji i są podatne na wprowadzanie artefaktów technicznych. Demonstrujemy bezdetergentowy i bezenzymatyczny protokół szybkiej izolacji nienaruszonych jąder bezpośrednio z całej tkanki, uzyskując jądra odpowiednie do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (snRNA-Seq) lub ATAC-seq.

Izolacja jąder z całej tkanki metodą bezdetergentową i enzymatyczną

Tutaj prezentujemy protokół izolacji jąder z błyskawicznie zamrożonych, zarchiwizowanych tkanek wątroby dla jednojądrowego sekwencjonowania RNA, sekwencji ATAC i multiomiki stawów (sekwencja RNA i sekwencja ATAC).

Izolacja jąder z zamrożonej tkanki wątroby w celu multiomiki jednokomórkowej

Tutaj prezentujemy protokół opisujący przygotowanie jąder komórkowych. Po mikrodysekcji i enzymatycznej dysocjacji tkanki serca na pojedyncze komórki, komórki progenitorowe zamrożono, a następnie wyizolowano czyste żywe komórki, które wykorzystano do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i testu pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z wysokoprzepustowymi analizami sekwencjonowania.

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Badanie opisuje prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych tkanek ssaków do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

Prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra

Poznaj izolację RNA specyficznego dla typu komórki z tkanki heterogenicznej bez sortowania komórek. Ta metoda wykorzystuje model myszy NuTRAP i immunoprecypitację GLP do ekstrakcji RNA związanego z rybosomami z komórek EGFP.

Izolowanie RNA specyficznych dla typu komórki z zatrzaskowo mrożonych próbek tkanek heterogenicznych bez sortowania komórek

Przeglądaj więcej filmów