Drosophila melanogaster (Drosophila melanogaster) Protokół wstrzyknięcia larw
19 października 2021
Dorosłe muchy Drosophila melanogaster były szeroko wykorzystywane jako organizmy modelowe do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wrodzonych odpowiedzi immunologicznych gospodarza i strategii infekcji mikrobiologicznej. Aby promować stadium larwy D. melanogaster jako dodatkowy lub alternatywny system modelowy, opisano technikę iniekcji larw.
Protokół ten odnosi się do trudności i wyzwań związanych z mikroiniekcją larw, opisując precyzyjną metodę, która pozwoli na wykorzystanie larw Drosophila melanogaster jako modelu do różnych badań immunologicznych i molekularnych. Jest to prosta technika iniekcji, która stanowi wydajną, opłacalną i szybką metodę wielokrotnego dostarczania różnych substancji w jednolity sposób, co pozwala na uzyskanie spójnych i wiarygodnych wyników. Zacznij od wybrania larw w trzecim stadium rozwoju i umycia ich roztworem Ringera na małej szalce Petriego.
Umieścić bibułę filtracyjną na szalce Petriego i zwilżyć ją 5 ml roztworu Ringera. Następnie umieść larwy na bibule filtracyjnej. Przygotuj kapilary za pomocą szklanych kapilar 3,5" w ściągaczu do mikropipet.
Otwórz szklaną kapilę za pomocą prostych, ząbkowanych, średnio punktowych kleszczy. Napełnij otwartą kapilarnę olejem mineralnym za pomocą plastikowej jednorazowej strzykawki. Następnie wyrzuć olej z rurki kapilarnej za pomocą nanolitrowego wtryskiwacza.
Wypełnij kapilę pożądanym preparatem bakteryjnym do wstrzykiwań. Przenieść znieczulone larwy na bibułę filtracyjną zwilżoną roztworem Ringera. Za pomocą kleszczy mocno dociśnij grzbietową stronę tylnego końca larw, gdzie widoczne są przetchlinki.
Następnie wbij igłę poziomo, w kierunku tylnego końca larw i wstrzyknij zapasy bakteryjne. Usuń kleszcze, aby uniknąć rozlania hemolimfy lub jelita. Następnie należy wyjąć igłę uprzednio wbitą w larwy.
Zainfekuj 20 larw na każdy warunek eksperymentalny. Za pomocą pędzla delikatnie przenieś wstrzyknięte larwy na osobną wilgotną bibułę filtracyjną. W razie potrzeby dodać roztwór Ringera, aby zapobiec wysuszeniu.
Inkubuj szalkę Petriego w inkubatorze w temperaturze 25 C. Larwy Drosophila melanogaster zakażone Photorhabdus asymbiotica wykazywały 57% przeżywalność przez 24 godziny po wstrzyknięciu, podczas gdy larwy, którym wstrzyknięto Escherichia coli, wykazywały 85% wskaźnik przeżycia w tym samym punkcie czasowym. Znaczenie tej metody polega na tym, że igła jest trzymana w przybliżeniu równolegle do larwy. Nacisk wywierany w celu utrzymania larwy jest bardzo mały, co zmniejsza możliwość wycieku hemolimfy, śmiertelnych obrażeń lub nieodpowiedniego dostarczania pożądanej substancji.
Tę technikę można doskonalić wraz z praktyką.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje technikę iniekcji larw Drosophila melanogaster, mającą na celu ułatwienie wykorzystania larw w badaniach immunologicznych i molekularnych. Metoda ta rozwiązuje problemy związane z mikroiniekcją larw i zapewnia niezawodne podejście do dostarczania substancji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Mikrobiologia
- Immunologia
Wstęp
- Drosophila melanogaster jest szeroko stosowanym organizmem modelowym.
- Zrozumienie wrodzonych odpowiedzi immunologicznych przeciwko drobnoustrojom ma kluczowe znaczenie.
- Stadia larwalne pozwalają na dodatkowe wglądy w strategie infekcji mikrobiologicznych.
- Techniki mikroiniekcji są niezbędne dla zapewnienia spójności eksperymentalnej.
Cel badania
- Promowanie larw D. melanogaster jako systemu modelowego.
- Przedstawienie szczegółowej metody mikroiniekcji larw.
- Zwiększenie wiarygodności badań immunologicznych i molekularnych.
Zastosowane metody
- Wybrać larwy w trzecim stadium rozwoju do iniekcji.
- Przemyć larwy roztworem Ringera.
- Przygotować kapilary, używając szklanych rurek kapilarnych.
- Wprowadzić substancje w sposób jednolity do larw.
Główne wyniki
- Technika ta umożliwia efektywne dostarczanie substancji.
- Wyniki są spójne i wiarygodne w różnych eksperymentach.
- Metoda kostoelekytywna, odpowiednia do różnych badań.
- Ułatwia badanie odpowiedzi immunologicznych u larw.
Wnioski
- Technika iniekcji larwalnej jest cennym narzędziem dla badaczy.
- Rozszerza ona użyteczność D. melanogaster w badaniach naukowych.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę do uzyskania głębszych wglądów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Larwy Drosophila melanogaster stanowią kostopektywny i podatny na manipulacje genetyczne model do badania odporności wrodzonej oraz oddziaływań między gospodarzem a patogenem, umożliwiając wczesną walidację punktów uchwytu przy zmniejszonym obciążeniu etycznym i finansowym. Protokół iniekcji larwalnych zwiększa powtarzalność w testach odpowiedzi immunologicznej, wspierając mechanistyczne ograniczanie ryzyka w przypadku kandydatów na leki przeciwmikrobowe i immunomodulujące. Podejście to łączy biologię odkrywczą z oceną przedkliniczną, dostarczając mierzalnych wyników przeżywalności i infekcji w systemie istotnym z punktu widzenia przebiegu choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych związanych z szlakami odporności wrodzonej i mechanizmami wirulencji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia skalowalny system walidacji funkcjonalnej celów z wykorzystaniem modeli z wyzwaniem mikrobiologicznym.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję portfolio poprzez generowanie ilościowych danych dotyczących infekcji i przeżywalności w celu oceny związków wiodących.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Zapewnia zestandaryzowane procedury przygotowania i iniekcji larw w celu uzyskania spójnej ekspozycji na substancje.
- Wyniki ilościowe: Umożliwia pomiar wskaźników przeżywalności oraz obciążenia patogenami jako zmiennych zależnych w kampaniach przesiewowych.
- Powtarzalność: Redukuje zmienność techniczną dzięki kontrolowanej mechanice iniekcji i warunkom środowiskowym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Modeluje istotne dla ludzi odpowiedzi odporności wrodzonej na patogeny bakteryjne, takie jak Photorhabdus asymbiotica i Escherichia coli.
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia przejście od walidacji trafienia w cel terapeutyczny do przedklinicznych testów skuteczności w kontekście całego organizmu.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia szlaki obronne gospodarza oraz wkład czynników wirulencji przed rozpoczęciem badań na ssakach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda iniekcji larwalnej wpisuje się w początkową fazę procesu odkrywania leków, wspierając walidację celów terapeutycznych w oparciu o postawione hipotezy oraz umożliwiając stworzenie powtarzalnych formatów testowych do przesiewu związków przed optymalizacją wiodących kandydatów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera walidację funkcjonalną celów związanych z odpornością poprzez kontrolowaną ekspozycję larw na patogeny.
- Przesiewy: Generuje dane dotyczące zależności dawka-odpowiedź oraz przeżywalności, odpowiednie do wysokoprzepustowych przesiewów środków immunomodulujących lub przeciwdrobnoustrojowych.
- Analityka: Dostarcza ilościowych wskaźników przeżywalności (np. wskaźniki przeżywalności po 24 godzinach), które umożliwiają porównania między różnymi warunkami eksperymentalnymi i terapiami.
- Badania translacyjne: Tworzy istotny w kontekście choroby system do oceny wpływu terapeutycznego na wyniki infekcji przed przejściem do modeli gryzoni.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi standaryzowaną, niskokosztową platformę, którą można zastosować w wielu projektach z zakresu immunologii i badań nad chorobami zakaźnymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w interakcjach gospodarz-patogen.
- Wartość operacyjna: zapewnia powtarzalność i standaryzację między laboratoriami dzięki określonym parametrom wstrzykiwania oraz kontroli środowiskowej.
- Wartość strategiczna: poprawia efektywność decyzji go/no-go poprzez dostarczanie wczesnych sygnałów dotyczących skuteczności i toksyczności w modelu całego zwierzęcia.
- Wpływ na portfolio: umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie danych o przeżywalności i eliminacji infekcji.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z larwami, stosowaniu znieczulenia oraz technik mikroiniekcji.
- Zależy od dostępu do wyciągaczy mikropipet, nanolitrowych injektorów oraz narzędzi do przygotowania kapilar szklanych.
- Wymaga standaryzowanego przygotowania roztworu Ringera oraz inkubacji w temperaturze 25°C w celu uzyskania spójnych wyników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania parametrów przy testowaniu różnych szczepów drobnoustrojów lub substancji o różnej lepkości.
- Jest ograniczone przez rozmiar larw oraz limity objętości iniekcji, co może utrudniać podawanie dużych cząsteczek lub cząstek.
