Name: Drosophila melanogaster (Drosophila melanogaster) Protokół wstrzyknięcia larw (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-19T14:45:00.000+00:00
Duration: 3 min 16 s
Description: Poznaj technikę mikroinjekcji larw Drosophila melanogaster do badań immunologicznych i molekularnych. Ta metoda umożliwia precyzyjne i powtarzalne podawanie substancji, zapewniając niezawodne wyniki eksperymentalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom Wydziału Nauk Biologicznych Uniwersytetu George'a Washingtona (GWU) za krytyczną lekturę manuskryptu. GT było wspierane przez letnie stypendium Harlana od GWU. Wszystkie figury graficzne zostały wykonane przy użyciu BioRender.

1. Hodowla much
UWAGA: Cykl życia D. melanogaster dzieli się na cztery etapy: zarodek, larwa, poczwarka i dorosły. Czas generacji przy optymalnych warunkach chowu w laboratorium (~25 °C, 60% wilgotności i wystarczająca ilość pokarmu) wynosi około 10 dni od zapłodnienia jaja do zamkniętego dorosłego osobnika. Samice składają ~100 zarodków dziennie, a embriogeneza trwa około 24 h22. Larwy przechodzą trzy etapy rozwojowe (stadium rozwojowe; L1-L3) w ciągu ~4 dni (L1 i L2: 24 h, a L3: 48 h). Pierwsze larwy w stadium rozwojowym zaczynają żerować natychmiast na powierzchni podłoża. Larwy w drugim stadium zagrzebują się w pożywce, podczas gdy larwy w trzecim stadium opuszczają pożywkę i wędrują po ściankach fiolek, szukając miejsca do przepoczwarzenia się przez 24-48 godzin. Linia D. melanogaster używana w tym protokole to Oregon R (FBsn0000276).
<ol>
	<li>Dodaj suchą karmę zawierającą dietę na bazie mąki kukurydzianej i soi do wąskiej fiolki z polistyrenu (25 mm x 95 mm) do objętości od 1/5 do 2/5. Następnie dodaj 9 ml wody i pozostaw fiolkę na 1 minutę, aż dieta będzie całkowicie nawodniona.</li>
	<li>Dodaj około 10 granulek suchych drożdży piekarskich do fiolki i umieść mieszaninę co najmniej 20 nowo pojawiających się samców i samic dorosłych much.</li>
	<li>Inkubować fiolkę w temperaturze 25 °C w czasie 12:12 godziny w jasnym: ciemnym cyklu fotoperiodycznym.</li>
	<li>Aby zapewnić postęp w cyklu życia, codziennie sprawdzaj fiolki muchowe i zapisuj początkowe etapy rozwoju.</li>
</ol>
2. Selekcja larw do infekcji
<ol>
	<li>Wybierz larwy cienkim pędzlem (najlepsza jest sierść wielbłąda), gdy osiągną wędrujące trzecie stadium rozwojowe w dniu, w którym zostanie przeprowadzona infekcja (<silna klasa="xfig">Ryc. 1).</li>
	<li>Przemyj wybrane larwy roztworem Ringera (100 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES pH 6,9) na małej szalce Petriego (60 mm x 15 mm) po wyjęciu z oryginalnej fiolki23.</li>
	<li>Umieść larwy na bibule filtracyjnej (średnica 150 mm), która jest lekko zwilżona około 5 ml roztworu Ringera na szalce Petriego (100 mm x 15 mm) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>W razie potrzeby dodawaj ~1 ml roztworu Ringera do bibuły filtracyjnej, aby uniknąć wysuszenia i wysuszenia larw.</li>
</ol>
3. Preparat bakteryjny
<ol>
	<li>Hodowla bakterii P. asymbiotica na podłożu agarowym Luria Bertani (LB) w temperaturze 28 °C przez 48 godzin.</li>
	<li>Użyj szafki poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2, aby przenieść pojedynczą kolonię P. asymbiotica w celu zaszczepienia płynnej kultury w 10 ml pożywki LB.</li>
	<li>Inkubować płynną kulturę P. asymbiotica przez noc w temperaturze 28 °C w wytrząsarce obrotowej ustawionej na 220 obr./min.</li>
	<li>Hodować bakterie E. coli w podobny sposób, ale początkowy wzrost przeprowadzić na podłożu agarowym i inkubacji kultur płynnych w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Odwirowywać każdą nocną hodowlę bakterii przez 3 minuty w temperaturze 13 000 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wyrzucić supernatant i przemyć powstałe granulki bakteryjne trzykrotnie 10 ml sterylnego PBS.</li>
	<li>Ponownie odwirować granulki przez 3 minuty w temperaturze 13 000 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć każdą osadkę sterylnym PBS, aby dostosować stężenie bakterii do gęstości optycznej (600 nm) 0,25 dla P. asymbiotica i 0,015 dla E. coli, co odpowiada 100-300 jednostkom tworzącym kolonie na larwę każdego preparatu bakteryjnego, za pomocą spektrofotometru.</li>
</ol>
4. Przygotowanie wtryskiwacza
<ol>
	<li>Przygotuj kapilary za pomocą szklanych kapilar 3,5" i ściągacza do mikropipet. Ustaw instrument w następujący sposób: ciepło: 580; uciąg: 143; prędkość: 25; opóźnienie: 1; Ciśnienie: 500.</li>
	<li>Użyj prostych, ząbkowanych, średnio punktowych kleszczyków, aby otworzyć szklaną kapilarnę w stopniu, który pozwoli na dostarczenie eksperymentalnych zabiegów, powodując minimalne uszkodzenie larw (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B). Aby zoptymalizować tę procedurę podczas ćwiczenia iniekcji, użyj roztworu błękitu trypanowego (rozcieńczyć bulion 0,4% z PBS do 0,2%), aby łatwo śledzić wyciek podczas wstrzykiwania i przeżywalność larw niebieskich.</li>
	<li>Napełnij kapilarę olejem mineralnym za pomocą plastikowej, jednorazowej strzykawki o pojemności 20 ml z igłą podskórną (22 G, długość 25 mm).</li>
	<li>Ustaw wtryskiwacz nanolitrowy i wyrzuć olej z kapilary (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2C).</li>
	<li>Wypełnij kapilę pożądanym preparatem bakteryjnym do wstrzykiwań. Weź roztwór z kropli (~20 μL) umieszczonej na parafilmie. W tym protokole wstrzyknięto 50,2 nL dwóch zapasów bakterii.</li>
</ol>
5. Wstrzyknięcie larw
<ol>
	<li>Znieczulenie larw D. melanogaster należy przeprowadzić za pomocą dwutlenku węgla na ~2 minuty przed zabiegiem.</li>
	<li>Delikatnie przenieść znieczulone larwy na bibułę filtracyjną zwilżoną roztworem Ringera w ramach przygotowań do wstrzyknięcia pod mikroskopem stereoskopowym. W tym momencie larwy będą ospałe lub pasywne.</li>
	<li>Aby wstrzyknąć larwy, należy mocno docisnąć grzbietową stronę tylnego końca (przetchlinki tchawicy są widoczne na tylnym końcu, w przeciwieństwie do czarnych aparatów gębowych na przednim końcu) za pomocą kleszczy (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2D).</li>
	<li>Wbić igłę poziomo w kierunku tylnego końca larwy, w pobliżu naskórka. Udane wstrzyknięcie nie spowoduje wycieku wstrzykniętego roztworu z larw (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Usuń kleszcze, które były używane do wywierania nacisku na ogon larw przed wyjęciem igły. Jeśli nie zostaną najpierw usunięte, kleszcze mogą wypchnąć hemolimfę i/lub jelito z larw z miejsca rany.</li>
	<li>Zainfekować odpowiednią liczbę larw do przeprowadzanego badania. W tym konkretnym protokole wstrzyknięto 20 larw dla każdego warunku eksperymentalnego.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy delikatnie przenieś wstrzyknięte larwy na oddzielną wilgotną bibułę filtracyjną na szalce Petriego (10 larw na szalkę) lub fiolce z pokarmem (w zależności od celu eksperymentu), aby umożliwić wyzdrowienie.</li>
	<li>Umieścić szalki Petriego lub fiolki z żywnością w inkubatorze w temperaturze 25 °C. Jeśli larwy są trzymane na szalce Petriego, należy w razie potrzeby dodać roztwór Ringera, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
</ol>
6. Rejestrowanie przeżycia/śmiertelności
<ol>
	<li>Zapisz liczbę martwych i żywych larw D. melanogaster zgodnie z ustalonymi punktami czasowymi doświadczenia. Żywe larwy będą nadal rozwijać się w poczwarki i dorosłe</li> osobniki.
	<li>Użyj programów statystycznych, takich jak Prism, aby wprowadzić surowe dane dotyczące przeżycia/śmiertelności, przeanalizować je za pomocą testu logarytmicznego (Mantela-Coxa) i przedstawić wyniki w postaci liczb.</li>
</ol>

<ol><li>Takehana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+a+pattern-recognition+receptor%2C+peptidoglycan-recognition+protein-LE%2C+activates+imd%2Frelish-mediated+antibacterial+defense+and+the+prophenoloxidase+cascade+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (21), 13705-13710 (2002).</li>
<li>Senger, K., Harris, K., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA+factors+participate+in+tissue-specific+immune+responses+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">GATA factors participate in tissue-specific immune responses in Drosophila larvae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (43), 15957-15962 (2006).</li>
<li>Kenmoku, H., Hori, A., Kuraishi, T., Kurata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mode+of+induction+of+the+humoral+innate+immune+response+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mech.anisms%22%5BJournal%5D)">A novel mode of induction of the humoral innate immune response in Drosophila larvae.</a> Disease Models & Mech.anisms. 10, 271-281 (2017).</li>
<li>Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterorhabditis+bacteriophora+excreted-secreted+products+enable+infection+by+Photorhabdus+luminescens+through+suppression+of+the+Imd+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Heterorhabditis bacteriophora excreted-secreted products enable infection by Photorhabdus luminescens through suppression of the Imd pathway.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2372(2019).</li>
<li>Cherry, S., Silverman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions+in+Drosophila%3A+New+tricks+from+an+old+friend%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions in Drosophila: New tricks from an old friend.</a> Nature Immunology. 7 (9), 911-917 (2006).</li>
<li>Younes, S., Al-Sulaiti, A., Nasser, E., Najjar, H., Kamareddine, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+organism+in+host-pathogen+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model organism in host-pathogen interaction studies.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 214(2020).</li>
<li>Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+virulence+factors+from+Heterorhabditis+bacteriophora+highlight+its+utility+as+a+model+parasite+among+Clade+V+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes.</a> International Journal for Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).</li>
<li>Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+immune+responses+to+nematode+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Insect immune responses to nematode parasites.</a> Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).</li>
<li>Leitão, A. B., Bian, X., Day, J. P., Pitton, S., Demir, E., Jiggins, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+effects+on+cellular+and+humoral+immune+responses+underlie+genotype-by-genotype+interactions+between+Drosophila+and+parasitoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Independent effects on cellular and humoral immune responses underlie genotype-by-genotype interactions between Drosophila and parasitoids.</a> PLoS Pathogens. 15 (10), 1008084(2019).</li>
<li>Ramroop, J. R., Heavner, M. E., Razzak, Z. H., Govind, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasitoid+wasp+of+Drosophila+employs+preemptive+and+reactive+strategies+to+deplete+its+host%27s+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Parasitoid wasp of Drosophila employs preemptive and reactive strategies to deplete its host's blood cells.</a> PLoS Pathogens. 17 (5), 1009615(2021).</li>
<li>Vlisidou, I., Wood, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+blood+cells+and+their+role+in+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Drosophila blood cells and their role in immune responses.</a> The FEBS Journal. 282 (8), 1368-1382 (2015).</li>
<li>Harnish, J. M., Link, N., Yamamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for infectious diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2724(2017).</li>
<li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annual Reviews of Immunology. 25, 697-743 (2007).</li>
<li>Garriga, A., Mastore, M., Morton, A., Pino, F. G., Brivio, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+of+Drosophila+suzukii+larvae+to+infection+with+the+nematobacterial+complex+Steinernema+carpocapsae-Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Immune response of Drosophila suzukii larvae to infection with the nematobacterial complex Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila.</a> Insects. 11 (4), 210(2020).</li>
<li>Trienens, M., Kraaijeveld, K., Wertheim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defensive+repertoire+of+Drosophila+larvae+in+response+to+toxic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Defensive repertoire of Drosophila larvae in response to toxic fungi.</a> Molecular Ecology. 26 (19), 5043-5057 (2017).</li>
<li>Tafesh-Edwards, G., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+immunity+against+natural+and+nonnatural+viral+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Drosophila immunity against natural and nonnatural viral pathogens.</a> Virology. 540, 165-171 (2020).</li>
<li>Gold, K. S., Brückner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+cellular+immunity+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster.</a> Seminars in Immunology. 27 (6), 357-368 (2015).</li>
<li>Dudzic, J. P., Kondo, S., Ueda, R., Bergman, C. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+innate+immunity%3A+regional+and+functional+specialization+of+prophenoloxidases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila innate immunity: regional and functional specialization of prophenoloxidases.</a> BMC Biology. 13, 81(2015).</li>
<li>Honti, V., Csordás, G., Kurucz, É, Márkus, R., Andó, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell-mediated+immunity+of+Drosophilamelanogaster%3A+hemocyte+lineages%2C+immune+compartments%2C+microanatomy+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+and+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">The cell-mediated immunity of Drosophilamelanogaster: hemocyte lineages, immune compartments, microanatomy and regulation.</a> Developmental and Comparative Immunology. 42 (1), 47-56 (2014).</li>
<li>Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+bacterial+infection+and+shedding+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Oral bacterial infection and shedding in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57676(2021).</li>
<li>Zabihihesari, A., Hilliker, A. J., Rezai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+microinjection+of+intact+Drosophila+melanogaster+larva+to+investigate+the+effect+of+serotonin+on+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Localized microinjection of intact Drosophila melanogaster larva to investigate the effect of serotonin on heart rate.</a> Lab on a Chip. 20 (2), 343-355 (2020).</li>
<li>Flatt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life-history+evolution+and+the+genetics+of+fitness+components+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Life-history evolution and the genetics of fitness components in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 214 (1), 3-48 (2020).</li>
<li>Ciche, T. A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+RNAi+in+Heterorhabditis+bacteriophora%3A+a+nematode+insect+parasite+and+host+for+insect+pathogenic+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: a nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts.</a> BMC Developmental Biology. 7, 101(2007).</li>
<li>Joyce, S. A., Watson, R. J., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+pathogenicity+and+mutualism+in+Photorhabdus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The regulation of pathogenicity and mutualism in Photorhabdus.</a> Current Opinion in Microbiology. 9 (2), 127-132 (2006).</li>
<li>Yang, G., Waterfield, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+TcdB+and+TccC+subunits+in+secretion+of+the+Photorhabdus+Tcd+toxin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The role of TcdB and TccC subunits in secretion of the Photorhabdus Tcd toxin complex.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), 1003644(2013).</li>
<li>Shokal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+co-occurring+Wolbachia+and+Spiroplasma+endosymbionts+on+the+Drosophila+immune+response+against+insect+pathogenic+and+non-pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effects of co-occurring Wolbachia and Spiroplasma endosymbionts on the Drosophila immune response against insect pathogenic and non-pathogenic bacteria.</a> BMC Microbiology. 16, 16(2016).</li>
<li>Tomoyasu, Y., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+RNAi+in+Tribolium+%28Coleoptera%29+for+analyzing+adult+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development.</a> Development Genes and Evolution. 214 (11), 575-578 (2004).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Drosophila melanogaster jest jednym z najcenniejszych, eksperymentalnie manipulowanych modeli wykorzystywanych do badań odporności wrodzonej i patogenezy różnych infekcji bakteryjnych. Wynika to z jego prostego i szybkiego cyklu życia, prostej konserwacji w laboratorium, dobrze ugruntowanej genetyki ewolucyjnej i różnorodnego zestawu narzędzi genetycznych. Poprzednie metody wstrzykiwania larw D. melanogaster, takie jak użycie hybrydowego urządzenia mikroprzepływowego lub mikromanipulatora Narishige, wym...

Drosophila melanogaster jest ogromnie wykorzystywana w badaniach biologicznych i biomedycznych od kilkudziesięciu lat, ponieważ wyrafinowany wachlarz narzędzi genetycznych i molekularnych stale ewoluował do analizy szerokiego zakresu badań1,2,3,4. Ewolucyjnie zachowane aspekty rozwoju, homeostazy i odporności wrodzonej u D. melanogaster sprawiły, że jest to cenny organizm modelowy do badania różnych chorób ludzi i owadów5,6. Warto zauważyć, że fundamentalna rola modelu D. melanogaster w badaniu odporności została w dużej mierze zilustrowana w badaniach nad dorosłymi muchami. Jednak badania nad larwami D. melanogaster również przyczyniły się do obecnej wiedzy i dotyczyły głównie komórkowych odpowiedzi immunologicznych, w szczególności infekcji osami i nicieniami, które występują przez naskórek owada7,8,9,10. Larwy Drosophila melanogaster posiadają trzy różne typy komórek krwi, zwane zbiorczo hemocytami: plazmatocyty, komórki kryształowe i lamellocyty11,12,13. Komórki te mogą wytwarzać szereg odpowiedzi immunologicznych, gdy larwy D. melanogaster są zakażone patogenami, takimi jak bakterie, grzyby, wirusy i pasożyty14,15,16. Komórkowe odpowiedzi immunologiczne obejmują bezpośrednie pochłanianie (fagocytozę) małych cząsteczek lub bakterii, melanizację, enkapsulację większych patogenów, takich jak jaja pasożytnicze, oraz produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) i syntaz tlenku azotu (NOS)17,18,19.
Przeciwnie, opublikowano mniej badań na temat wykorzystania modelu larwalnego D. melanogaster do analizy humoralnej odpowiedzi immunologicznej. Wynika to głównie z zastosowania testów żywieniowych w kierunku zakażenia jamy ustnej larw D. melanogaster i kilku wyzwań związanych z larwami mikroiniekcji, w tym precyzyjnego obchodzenia się z larwami i prawidłowego użycia mikroigły, zwłaszcza podczas penetracji20,21. W związku z tym ograniczona wiedza na temat infekcji larwalnych i trudności techniczne (tj. wysoka śmiertelność) często utrudniały stosowanie modelu larwalnego D. melanogaster. Model larwalny będzie miał potencjał do zidentyfikowania nowych mechanizmów molekularnych, które dostarczą dalszych informacji na temat interakcji gospodarz-patogen oraz indukcji specyficznych wrodzonych odpowiedzi immunologicznych gospodarza przeciwko infekcjom patogennym.
Tutaj szczegółowo opisano prosty i skuteczny protokół, który może być użyty do wstrzykiwania larw D. melanogaster z różnymi patogenami, takimi jak bakterie. W szczególności larwy D. melanogaster są wykorzystywane do wstrzykiwań z ludzkim patogenem Photorhabdus asymbiotica i niepatogennymi bakteriami Escherichia coli. Metoda ta może być stosowana do manipulacji i analizy odpowiedzi immunologicznej D. melanogaster na różne infekcje bakteryjne.

<table><tbody><tr><td>Fly Food B (Bloomington Recipe)</td><td>LabExpress</td><td>7001-NV</td><td>Food B, w wąskich fiolkach, 100 fiolek/taca</td></tr><tr><td>100 x 15, Mono szalki Petriego w pełni sztaplowane</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>Średnica 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>60 x 15, Mono szalki Petriego W pełni sztaplowane</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>Średnica 60 x 15 mm</td></tr><tr><td>Kapilary szklane</td><td>VWR</td><td>53440-186</td><td></td></tr><tr><td>Jakościowa bibuła filtracyjna klasy 1 klasy standardowej, okrąg</td><td>VWR</td><td>28450-150</td><td>Średnica 150 mm</td></tr><tr><td>Kultura laboratoryjna Klasa II Typ A2 Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>ESCO</td><td>LA2-4A2-E</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td>LB proszek młynarski agarowy 500 g</td></tr><tr><td>LB Bulion</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td>LB młynek do bulionu w proszku 500 g</td></tr><tr><td>Olej</td> <td>mineralnyAlfa Aesar, Thermo Fisher Scientific</td><td>31911-A1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000C Spektrofotometr</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject III Programowalny wtryskiwacz nanolitrowy</td><td>Drummond</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>Wąskie fiolki Drosophila, polistyren</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-109</td><td></td></tr><tr><td>Igły, podskórne</td><td>VWR</td><td>89219-316</td><td>22 G, </td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet nowej generacji</td> 25 mm <td>World Precision Instruments</td><td>SU-P1000</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>97062-732</td><td>Bufor PBS Tabletki biotech grade 200tab</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>wersja 8</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki - plastikowe, jednorazowe</td><td>VWR</td><td>76124-652</td><td>20 ml</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila melanogaster (drosophila melanogaster) protokół wstrzyknięcia larw

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

Wykorzystanie niekonwencjonalnych modeli do badania odporności wrodzonej i zjadliwości patogenów stanowi cenną alternatywę dla modeli ssaków, które mogą być kosztowne i rodzić problemy etyczne. Niekonwencjonalne modele są notorycznie tanie, łatwe w obsłudze i kulturze oraz nie zajmują dużo miejsca. Są genetycznie podatne i posiadają kompletne sekwencje genomu, a ich stosowanie nie wiąże się z żadnymi względami etycznymi. Muszka owocowa Drosophila melanogaster, na przykład, dostarczyła wielu informacji na temat różnych badań nad zachowaniem, rozwojem, metabolizmem i odpornością. Mówiąc dokładniej, dorosłe muchy i larwy D. melanogaster posiadają kilka wrodzonych reakcji obronnych, które są wspólne dla kręgowców. Mechanizmy regulujące odpowiedź immunologiczną zostały w większości ujawnione dzięki badaniom genetycznym i molekularnym w modelu D. melanogaster. W tym celu opracowano nowatorską technikę wstrzykiwania larw, która przyczyni się do dalszych badań nad wrodzonymi procesami immunologicznymi u larw D. melanogaster i zbadania patogenezy szerokiego zakresu infekcji bakteryjnych.

W przypadku prawidłowego wykonania, iniekcje u larw D. melanogaster wykazują efekt specyficzny dla konkretnej bakterii. Dane dotyczące przeżywalności zbierano w kilku punktach czasowych po zakażeniach P. asymbiotica (szczep ATCC43943), E. coli (szczep K12) oraz PBS (Rycina 4). Podczas gdy larwy D. melanogaster są podatne na P. asymbiotica, co szybko obniża ich przeżywalność, larwy poddane iniekcjom E. coli lub kontrolnym iniekcjom PBS wy...

Dorosłe muchy Drosophila melanogaster były szeroko wykorzystywane jako organizmy modelowe do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wrodzonych odpowiedzi immunologicznych gospodarza i strategii infekcji mikrobiologicznej. Aby promować stadium larwy D. melanogaster jako dodatkowy lub alternatywny system modelowy, opisano technikę iniekcji larw.

Drosophila melanogaster (Drosophila melanogaster) Protokół wstrzyknięcia larw

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly ...

Protokół ten odnosi się do trudności i wyzwań związanych z mikroiniekcją larw, opisując precyzyjną metodę, która pozwoli na wykorzystanie larw Drosophila melanogaster jako modelu do różnych badań immunologicznych i molekularnych. Jest to prosta technika iniekcji, która stanowi wydajną, opłacalną i szybką metodę wielokrotnego dostarczania różnych substancji w jednolity sposób, co pozwala na uzyskanie spójnych i wiarygodnych wyników. Zacznij od wybrania larw w trzecim stadium rozwoju i umycia ich roztworem Ringera na małej szalce Petriego.Umieścić bibułę filtracyjną na szalce Petriego i zwilżyć ją 5 ml roztworu Ringera. Następnie umieść larwy na bibule filtracyjnej. Przygotuj kapilary za pomocą szklanych kapilar 3,5" w ściągaczu do mikropipet.Otwórz szklaną kapilę za pomocą prostych, ząbkowanych, średnio punktowych kleszczy. Napełnij otwartą kapilarnę olejem mineralnym za pomocą plastikowej jednorazowej strzykawki. Następnie wyrzuć olej z rurki kapilarnej za pomocą nanolitrowego wtryskiwacza.Wypełnij kapilę pożądanym preparatem bakteryjnym do wstrzykiwań. Przenieść znieczulone larwy na bibułę filtracyjną zwilżoną roztworem Ringera. Za pomocą kleszczy mocno dociśnij grzbietową stronę tylnego końca larw, gdzie widoczne są przetchlinki.Następnie wbij igłę poziomo, w kierunku tylnego końca larw i wstrzyknij zapasy bakteryjne. Usuń kleszcze, aby uniknąć rozlania hemolimfy lub jelita. Następnie należy wyjąć igłę uprzednio wbitą w larwy.Zainfekuj 20 larw na każdy warunek eksperymentalny. Za pomocą pędzla delikatnie przenieś wstrzyknięte larwy na osobną wilgotną bibułę filtracyjną. W razie potrzeby dodać roztwór Ringera, aby zapobiec wysuszeniu.Inkubuj szalkę Petriego w inkubatorze w temperaturze 25 C. Larwy Drosophila melanogaster zakażone Photorhabdus asymbiotica wykazywały 57% przeżywalność przez 24 godziny po wstrzyknięciu, podczas gdy larwy, którym wstrzyknięto Escherichia coli, wykazywały 85% wskaźnik przeżycia w tym samym punkcie czasowym. Znaczenie tej metody polega na tym, że igła jest trzymana w przybliżeniu równolegle do larwy. Nacisk wywierany w celu utrzymania larwy jest bardzo mały, co zmniejsza możliwość wycieku hemolimfy, śmiertelnych obrażeń lub nieodpowiedniego dostarczania pożądanej substancji.Tę technikę można doskonalić wraz z praktyką.

drosophila-melanogaster-larva-injection-protocol

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikroiniekcji i obrazowania o wysokiej rozdzielczości w zarodku syncytialnym Drosophila melanogaster w celu badania mitozy.

Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w embrionie syncytialnym Drosophila melanogaster

Wykazano, że interferencja RNA jest bardzo skuteczną metodą analizy funkcji genów w rozwoju tchawki Drosophila. Przedstawiono szczegółowy protokół stosowany w laboratorium Jiang do wstrzykiwania dsRNA do embrionów muchy w celu wyciszenia ekspresji genów. Technika ta daje możliwość przesiewania genów niezbędnych do rozwoju tkanek i narządów u Drosophila.

Interferencja RNAi poprzez wstrzykiwanie dsRNA do embrionów Drosophila

Zasobniki konserwowanych szlaków sygnalizacji insulinowej występujące u muszki owocówki Drosophila melanogaster sprawiają, że organizm ten jest potencjalnym narzędziem do modelowania zaburzeń metabolicznych, w tym cukrzycy typu II. W związku z tym kluczowe jest opracowanie testów fizjologicznych pozwalających na skuteczne pomiary ogólnoustrojowego działania insuliny w zakresie obwodowej utylizacji glukozy u dorosłych much.

Wstrzykiwanie insuliny i pobieranie hemolimfy w celu pomiaru wrażliwości na insulinę u dorosłych Drosophila melanogaster

Aby zrozumieć związek między odpowiedzią immunologiczną a zachowaniem, opisujemy metodę pomiaru aktywności lokomotorycznej Drosophila podczas infekcji bakteryjnej, a także zdolność much do wywołania odpowiedzi immunologicznej poprzez monitorowanie przeżywalności, obciążenia bakteryjnego oraz aktywności w czasie rzeczywistym kluczowego regulatora odporności wrodzonej, NFκB.

Ilościowy pomiar odpowiedzi immunologicznej i snu u Drosophila

Ten film opisuje, jak wykonać zastrzyk żywym dorosłym muchom i zawiera przykładowy protokół, w którym oznaczone cząstki i błękit trypanowy są wstrzykiwane do brzuchów muchy w celu zbadania fagocytozy.

Wstrzyknięcie dorosłych much Drosophila: metoda dostarczania związku lub etykiety

Ten film opisuje, jak wykonywać mikrozastrzyki, które dostarczają odczynniki do żywych zarodków Drosophila. Naukowcy mogą wykorzystać tę metodę do wprowadzenia związków egzogennych, takich jak kwasy nukleinowe i białka, we wczesnych stadiach rozwoju zarodka. Przedstawiony protokół pokazuje, jak skonfigurować i wykonać procedurę wstrzykiwania dowolnego rozpuszczalnego odczynnika - w tym przypadku białka fluorescencyjnego do eksperymentów z obrazowaniem na żywo.

Mikroiniekcja żywych zarodków Drosophila: wczesne dostarczenie odczynników do rozwijającego się zarodka

Drosophila melanogaster to wybitny organizm modelowy do badania wrodzonego układu odpornościowego oraz fizjologicznych konsekwencji infekcji i chorób. Protokół ten opisuje, w jaki sposób dostarczyć D. melanogaster solidne i ilościowo powtarzalne infekcje bakteryjne, a następnie jak zmierzyć nasilenie infekcji i określić ilościowo odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Ogólnoustrojowe infekcje bakteryjne i fenotypy obrony immunologicznej u Drosophila melanogaster

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) jest światowym szkodnikiem rolnictwa. Głębsze zrozumienie jego biologii jest kluczem do kontrolowania populacji medfly, a tym samym zmniejszenia wpływu na gospodarkę. Mikroiniekcja zarodka jest podstawowym narzędziem umożliwiającym zarówno transformację linii zarodkowej, jak i odwrotne badania genetyczne u tego gatunku.

Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

Opisujemy protokół preparacji, utrwalania i barwienia immunologicznego organów steroidogennych u larw Drosophila i dorosłych samic w celu zbadania biosyntezy hormonów steroidowych i ich mechanizmu regulacyjnego. Oprócz narządów steroidogennych wizualizujemy unerwienie narządów steroidogennych, a także steroidogennych komórek docelowych, takich jak komórki macierzyste linii rozrodczej.

Protokoły wizualizacji narządów steroidogennych i ich interaktywnych narządów z barwieniem immunologicznym u muszki owocowej Drosophila melanogaster

Integralność bariery krew-mózg jest kluczowa dla funkcjonowania układu nerwowego. U Drosophila melanogaster bariera krew-mózg jest tworzona przez komórki glejowe podczas późnej embriogenezy. Protokół ten opisuje metody oznaczania tworzenia i utrzymywania bariery krew-mózg w zarodkach D. melanogaster i larwach trzeciego stadium rozwojowego.

Test integralności bariery krew-mózg u Drosophila melanogaster

Ten artykuł bierze za przykład transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u Drosophila i przedstawia zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodka, kluczowy krok do tworzenia transgenicznych muszek.

Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila

Poznaj technikę mikroinjekcji larw Drosophila melanogaster do badań immunologicznych i molekularnych. Ta metoda umożliwia precyzyjne i powtarzalne podawanie substancji, zapewniając niezawodne wyniki eksperymentalne.

Drosophila melanogaster (Drosophila melanogaster) Protokół wstrzyknięcia larw

Przeglądaj więcej filmów