Spektroskopia CD do badania interakcji DNA-białko

Protokół pozwala nam na wizualizację zmian w drugiej restrukturyzacji DNA indukowanej przez białka remodelujące chromatynę zależne od ATP. Zmiana w strukturze DNA może być skorelowana z regulacją transkrypcji. Jest to łatwa i bardzo czuła technika, która wykorzystuje bardzo małą ilość czystego DNA do rejestrowania zmian strukturalnych w oligonukleotydzie.

Metoda ta może dostarczyć informacji na temat regulacji transkrypcji, w której pośredniczą białka remodelujące chromatynę zależne od ATP. Na początek należy przygotować stężenia robocze i innych składników reakcji na świeżo i utrzymywać je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed rozpoczęciem reakcji, a następnie zmierzyć aktywność ATPazy białka w obecności różnych cząsteczek DNA za pomocą testu utleniania sprzężonego z NADH. Wymieszaj 0,1 milimola ADAAD, dwa milimolowe ATP, 10 nanomolowe DNA i bufor 1X REG w 96-dołkowej płytce do końcowej objętości 250 mikrolitrów.

Następnie inkubuj reakcję przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie zmierz ilość NAD+ za pomocą oprogramowania dostarczonego wraz z czytnikiem mikropłytek. Aby zmierzyć absorbancję przy 340 nanometrach, kliknij test NADH i umieść 96-dołkową płytkę na uchwycie płytki w urządzeniu, a następnie kliknij przycisk odczytu płytki, aby zapisać absorbancję. Zbierz widma CD w kuwetach kwarcowych o wysokiej przezroczystości.

Używaj kuwet prostokątnych lub cylindrycznych. Aby wyczyścić kuwety, umyj je kilkakrotnie wodą, a następnie wykonaj skan wody lub bufora w kuwecie, aby sprawdzić, czy jest czysta. Do reakcji użyj oligonukleotydów DNA oczyszczonych przez PAGE.

Aby uzyskać szybkie chłodzenie, podgrzej DNA w temperaturze 94 stopni Celsjusza przez trzy minuty na bloku grzewczym i natychmiast schłodzić je na lodzie. W celu powolnego chłodzenia, po podgrzaniu DNA do 94 stopni Celsjusza przez trzy minuty, pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej z szybkością jednego stopnia Celsjusza na minutę. Aby zarejestrować widma podstawowe, ustaw łącznie pięć reakcji kontrolnych jedna po drugiej w 1,5 mililitrowych probówkach wirówkowych.

Utrzymuj objętość reakcji na poziomie 300 mikrolitrów we wszystkich reakcjach. Aby zarejestrować widma CD, należy ustawić w sumie pięć reakcji eksperymentalnych jedna po drugiej w 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych. Aby nagrać skan, włącz gaz i włącz spektrometr CD.

Po 10 do 15 minutach włącz lampę, włącz łaźnię wodną i ustaw temperaturę oprawki na 37 stopni Celsjusza. Następnie otwórz oprogramowanie widma CD i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza, zakres długości fali od 180 do 300 nanometrów, czas na punkt na 0,5 sekundy, a liczbę skanowania na pięć, a następnie kliknij przeglądarkę danych pro, utwórz nowy plik i zmień jego nazwę, podając szczegóły eksperymentu i datę. Następnie wymieszać linię podstawową i reakcje eksperymentalne przez pipetowanie i ostrożnie przenieść mieszaniny reakcyjne jedna po drugiej do kuwety, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza.

Jeśli wykonujesz eksperyment w czasie, inkubuj reakcje w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez wymagany czas, a następnie wykonaj skanowanie. Dodaj EDTA do buforu zawierającego DNA, ATP, magnez i białko, aby zatrzymać hydrolizę ATP. Aby całkowicie zahamować aktywność ATPazy, należy zwiększyć stężenie EDTA i czas inkubacji.

Odejmij linie podstawowe od odpowiednich reakcji w oprogramowaniu i wygładź dane w oprogramowaniu widma CD lub w oprogramowaniu do wykreślania danych, a następnie wykreśl wykres długości fali w stosunku do średniej eliptyczności reszty i przeanalizuj piki. Fałdy M wykazały, że obie nici DNA MYC mogą tworzyć strukturę przypominającą pętlę macierzystą. Pokazano tutaj struktury fałdu M przedniej i odwrotnej sekwencji DNA zawierającej G quadruplex GECE.

Widma CD szybko schłodzonego GECE przy braku i obecności ATP i ADAAD wykazały, że ADAAD indukuje dwa dodatnie piki, jeden przy 258 nanometrach, a drugi przy 210 nanometrach. Dodanie EDTA znosi tę zmianę konformacyjną. Widma CD mają teraz ujemny pik 210 nanometrów i szerokie dodatnie pasmo z pikami na 230 i 250 nanometrach.

Mapowanie QGRS i analiza M-krotności wykazały, że regiony promotorowe DROSHA, DGCR8 i DICER mają potencjał do tworzenia G, kwadrupleksu i struktur podobnych do łodyg. Widma CD piątej pary DROSHA pokazały, że ADAAD indukuje ujemny pik przy 210 nanometrach i dodatni pik przy 260 nanometrach. To spektrum jest cechą charakterystyczną ADNA.

Widma CD DGCR8 z pierwszej pary wykazały dodatni pik przy 210 nanometrach i szeroki ujemny pik przy 260 nanometrach. Widmo to jest charakterystyczne dla przejścia B do X. Dla siódmej pary DGCR8 zaobserwowano silne dodatnie piki na 210 i 270 nanometrach oraz ujemny pik na 250 nanometrach.

Widmo to jest charakterystyczne dla równoległych struktur DNA kwadrupleksu G. Wreszcie, dla pierwszej pary DICER, zaobserwowano dodatni pik na 210 nanometrach i dwa ujemne piki, jeden na 230 nanometrach, a drugi na 260 nanometrach. Te piki są charakterystyczne dla przejścia DNA A do X.

Upewnij się, że czystość DNA i białka wynosi 99% lub więcej. Kuweta powinna być czysta, a linia bazowa powinna być mniejsza niż jeden milistofel. Wszystkie odczynniki powinny być czyste, aby tło było mniejsze niż jeden milistopień.