Name: Spektroskopia CD do badania interakcji DNA-białko (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Odkryj spektroskopię CD do badania interakcji DNA z białkami remodelującymi chromatynę. Ta metoda pozwala wizualizować zmiany konformacyjne DNA i korelować je z regulacją transkrypcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, za spektrofotometr CD. V.J. i A.D. byli wspierani przez stypendium z CSIR.

1. Stężenie robocze składników reakcji
<ol>
	<li>Przygotować świeżo robocze stężenia buforów do CD oraz pozostałych komponentów reakcji (patrz Tabela 1) i przechowywać je w temperaturze 4 °C przed rozpoczęciem reakcji. 
	UWAGA: Dla opisanych w niniejszej pracy reakcji CD robocze stężenia komponentów są następujące: bufor fosforanowy sodu (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, białko 1 µM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 µM.</li>
</ol>
2. Aktywność ATPazy
<ol>
	<li>Przed przeprowadzeniem spektroskopii CD należy określić aktywność ATPase białka w obecności cząsteczek DNA, aby upewnić się, że białko użyte w spektroskopii CD jest aktywne oraz aby zidentyfikować cząsteczki DNA, które najskuteczniej indukują hydrolizę ATP.</li>
	<li>Aktywność ATPase białka w obecności różnych cząsteczek DNA należy zmierzyć za pomocą testu utleniania sprzężonego z NADH, składającego się z następujących dwóch reakcji.
	<ol>
		<li>W płytce 96-dołkowej wymieszać 0.1 µM ADAAD, 2 mM ATP, 10 nM DNA oraz 1x bufor REG do końcowej objętości 250 µL. 
		UWAGA: Enzym kinaza pirogronianowa wykorzystuje ADP i Pi do przekształcenia fosfoenolopirogronianu w pirogronian, regenerując tym samym ATP. Zapewnia to stałe, nasycające stężenie ATP w reakcji. W drugiej reakcji pirogronian powstały w wyniku działania kinazy pirogronianowej jest przekształcany przez dehydrogenazę mleczanową w mleczan. W tej reakcji jedna cząsteczka NADH zostaje utleniona do NAD+. Zużycie NADH mierzy się poprzez pomiar absorbancji tej cząsteczki przy 340 nm.</li>
		<li>Inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze.</li>
		<li>Zmierzyć ilość NAD+ przy 340 nm za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
		<li>W celu pomiaru ilości NAD+ należy użyć oprogramowania dostarczonego wraz z czytnikiem mikropłytek.
		<ol>
			<li>Kliknąć NADH assay , aby zmierzyć absorbancję przy 340 nm.</li>
			<li>Umieścić płytkę 96-dołkową w uchwycie na płytki w urządzeniu. Kliknąć przycisk Read Plate, aby zarejestrować absorbancję. 
			UWAGA: Stężenie NAD+ jest obliczane na podstawie molowego współczynnika ekstynkcji NADH wynoszącego 6.3 mM−1 zgodnie z równaniem (1). 
			A = εcl (1) 
			 
			Gdzie A = Absorbancja 
			ε = Molowy współczynnik ekstynkcji 
			c = Stężenie molowe 
			l = Długość drogi optycznej w cm</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wybór i przygotowanie kuwet CD
<ol>
	<li>Rejestruj widma CD w kuwetach kwarcowych o wysokiej przejrzystości. Stosuj kuwety prostokątne lub cylindryczne. 
	UWAGA: Do wszystkich reakcji opisanych w niniejszej pracy użyto kwarcowej kuwety do CD (objętość nominalna 0,4 mL, droga optyczna 1 mm).</li>
	<li>Użyj roztworu do czyszczenia kuwet w celu ich oczyszczenia. Przygotuj 400 µL 1% roztworu do czyszczenia kuwet w wodzie, wlej go do kuwety i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 1 h.</li>
	<li>Kilkukrotnie przemyj kuwetę wodą, aby ją oczyścić. Wykonaj skan wody lub buforu w kuwecie, aby sprawdzić, czy jest ona czysta. 
	UWAGA: Odczyt dla wody lub buforu musi mieścić się w zakresie od 0 do 1 mdeg.</li>
</ol>
4. Przygotowanie białek i oligonukleotydów DNA
<ol>
	<li>Aby zminimalizować ilość składników buforu, które mogą powodować powstawanie niejednoznacznych pików, należy utrzymać objętość białka w reakcji poniżej 50 µL. Przez cały czas trwania eksperymentu białko powinno znajdować się na lodzie, aby uniknąć jego degradacji.</li>
	<li>W reakcjach należy stosować oligonukleotydy DNA oczyszczane metodą PAGE. 
	UWAGA: W opisanych tutaj reakcjach DNA stosowano zarówno w formie natywnej, jak i w formach chłodzonych termicznie (szybko chłodzonych (FC) oraz wolno chłodzonych (SC)). Szybkie chłodzenie sprzyja tworzeniu wiązań wewnątrzmolekularnych w DNA, co prowadzi do powstania większej liczby struktur drugorzędowych. Z kolei wolne chłodzenie sprzyja tworzeniu wiązań międzymolekularnych w DNA, co skutkuje mniejszą liczbą struktur drugorzędowych.</li>
	<li>W przypadku szybkiego chłodzenia należy podgrzać DNA w temperaturze 94 °C przez 3 min w bloku grzejnym, a następnie natychmiast schłodzić na lodzie. W przypadku wolnego chłodzenia należy podgrzać DNA w temperaturze 94 °C przez 3 min i pozwolić mu ostygnąć do temperatury pokojowej w tempie 1 °C na minutę.</li>
</ol>
5. Przygotowanie eksperymentów kontrolnych w celu zarejestrowania widm bazowych
<ol>
	<li>Zachowaj objętość reakcji na poziomie 300 µL we wszystkich reakcjach. Przygotuj łącznie 5 reakcji bazowych w probówkach wirówkowych o pojemności 1.5 mL, jedna po drugiej, w następujący sposób: i) bufor + woda; ii) bufor + MgCl2 + ATP + woda; iii) bufor + MgCl2 + ATP + białko + woda; iv) iii + EDTA lub ADAADiN; v) bufor + białko + woda.</li>
</ol>
6. Przygotowanie eksperymentów do rejestracji widm CD
<ol>
	<li>Przygotować łącznie 5 reakcji, jedna po drugiej, w probówkach wirówkowych o pojemności 1.5 mL w następujący sposób: i) bufor + DNA + woda; ii) bufor + DNA + MgCl2 + ATP + woda; iii) bufor + DNA + MgCl2 + ATP + białko + woda; iv) iii + EDTA lub ADAADiN; v) bufor + DNA + białko + woda.</li>
</ol>
7. Rejestracja skanu
<ol>
	<li>Włączyć dopływ gazu i uruchomić spektrometr CD.</li>
	<li>Włączyć lampę po 10-15 min. Włączyć łaźnię wodną i ustawić temperaturę uchwytu na 37 °C.</li>
	<li>Otworzyć oprogramowanie CD spectrum.
	<ol>
		<li>Ustawić temperaturę na 37 °C.</li>
		<li>Ustawić zakres długości fali na 180 - 300 nm.</li>
		<li>Ustawić czas na punkt na 0.5 s.</li>
		<li>Ustawić liczbę skanów na 5.</li>
		<li>Kliknąć Pro-Data Viewer, utworzyć nowy plik i zmienić jego nazwę, dodając szczegóły dotyczące eksperymentu oraz datę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wszystkie komponenty reakcji przechowywać w lodzie, aby uniknąć ich degradacji. Przygotować próbki baseline oraz mieszaniny reakcyjne, jedna po drugiej, w probówkach wirówkowych i wymieszać je poprzez pipetowanie. Ostrożnie przenieść mieszaninę reakcyjną do kuwety, upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>W przypadku przeprowadzania eksperymentu kinetycznego inkubować reakcje w 37 °C przez wymagany czas, a następnie wykonać skan. Dodać EDTA do buforu zawierającego DNA, ATP, Mg+2 i białko, aby zatrzymać hydrolizę ATP.</li>
	<li>Zwiększyć stężenie EDTA oraz czas inkubacji, aby całkowicie zahamować aktywność ATPazy.</li>
	<li>W oprogramowaniu odjąć sygnały baseline od odpowiadających im reakcji (np. odjąć reakcję 1 od baseline 1). Wygładzić dane w oprogramowaniu CD spectrum lub w programie do wykresów. Wykreślić dane w programie do wykresów. 
	UWAGA: Odjęcie sygnałów baseline od odpowiadających im reakcji pozwoli uzyskać netto widma CD samego DNA.</li>
</ol>
8. Analiza i interpretacja danych
<ol>
	<li>Użyj wzoru podanego w równaniu (2), aby przeliczyć wartości uzyskane w milostopniach na średnią eliptyczność pozostałości. 
	<img alt="Wzór równowagi statycznej [θ]=(S×mRw)/(10cL), równanie matematyczne do analizy naukowej." src="/files/ftp_upload/63147/63147eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">  (2) 
	Gdzie S to sygnał CD w milostopniach, c to stężenie DNA w mg/mL, mRw to średnia masa pozostałości, a l to długość drogi optycznej w cm.</li>
	<li>Wykorzystując oprogramowanie do wykresów, sporządź wykres zależności średniej eliptyczności pozostałości od długości fali i przeanalizuj piki.</li>
	<li>Aby sporządzić wykres, wybierz średnią eliptyczność pozostałości na osi Y oraz długość fali na osi X i wykreśl linię. 
	UWAGA: Wykres ten pozwoli określić charakterystyczne piki różnych form DNA. Formy DNA odpowiadające poszczególnym pikom można zidentyfikować na podstawie istniejącej literatury6.</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Celem tego artykułu jest przedstawienie techniki spektroskopii CD jako podejścia do badania zmian konformacyjnych zachodzących w DNA w obecności białek remodelujących chromatynę zależnych od ATP oraz powiązanie tych zmian konformacyjnych z ekspresją genów. Spektroskopia CD zapewnia szybką i łatwo dostępną metodę badania zmian konformacyjnych w DNA.

Kluczowym punktem, który należy wziąć pod uwagę w przypadku tej techniki, jest czystość DNA i białka. Wskazane jest, aby zarówno DNA, jak i...

Dichroizm kołowy (CD) to technika spektroskopowa, która opiera się na wrodzonej chiralności makrocząsteczek biologicznych, co prowadzi do zróżnicowanej absorpcji prawoskrętnego i lewoskrętnego światła spolaryzowanego kołowo. Ta absorpcja różnicowa jest znana jako dichroizm kołowy. Technika ta może być zatem wykorzystana do nakreślenia konformacji makrocząsteczek biologicznych, takich jak białka i DNA, z których oba zawierają centra chiralne1,2.
Fale elektromagnetyczne zawierają zarówno elementy elektryczne, jak i magnetyczne. Zarówno pole elektryczne, jak i magnetyczne oscylują prostopadle do kierunku rozchodzenia się fali. W przypadku światła niespolaryzowanego pola te oscylują w wielu kierunkach. Gdy światło jest spolaryzowane kołowo, uzyskuje się dwa pola elektromagnetyczne o różnicy faz 90°. Cząsteczki chiralne wykazują kołową skręcalność optyczną (dwójłomność) tak, że w różnym stopniu absorbują prawoskrętne światło spolaryzowane kołowo i lewoskrętne światło spolaryzowane kołowo3. Powstałe pole elektryczne zostanie prześledzone jako elipsa, w funkcji długości fali. Widmo CD jest zatem rejestrowane jako eliptyczność (q), a dane są prezentowane jako średnia eliptyczność pozostałości w funkcji długości fali.
W przypadku białek, Cα aminokwasów (z wyjątkiem glicyny) jest chiralne, co jest wykorzystywane przez spektroskopię CD do określenia drugorzędowej struktury tej makrocząsteczki4. Widma CD cząsteczek białek są zwykle rejestrowane w zakresie dalekiego promieniowania UV. Białka α-helisowe mają dwa ujemne pasma przy 222 nm i 208 nm oraz jeden dodatni pik przy 193 nm4. Białka o antyrównoległej strukturze drugorzędowej β-arkuszowej wykazują ujemny pik przy 218 nm i dodatni pik przy 195 nm4. Białka o nieuporządkowanej strukturze wykazują niską eliptyczność w pobliżu 210 nm i ujemny pik przy 195 nm4. W ten sposób dobrze zdefiniowane piki/prążki dla różnych struktur drugorzędowych sprawiają, że CD jest wygodnym narzędziem do wyjaśniania zmian konformacyjnych zachodzących w drugorzędowej strukturze białek podczas denaturacji, a także wiązania ligandów.
Kwasy nukleinowe mają trzy źródła chiralności: cząsteczkę cukru, spiralność struktury drugorzędowej oraz trzeciorzędowe uporządkowanie DNA w środowisku o dużym zasięgu5,6. Widma CD kwasów nukleinowych są zwykle rejestrowane w zakresie od 190 do 300 nm5,6. Każda konformacja DNA, podobnie jak białka, daje charakterystyczne spektrum, chociaż piki/prążki mogą różnić się o pewien stopień ze względu na warunki rozpuszczalnika i różnice w sekwencjach DNA7. B-DNA, najpowszechniejsza forma, charakteryzuje się dodatnim pikiem około 260-280 nm i ujemnym pikiem około 245 nm6. Piki/prążki DNA w formie B są na ogół małe, ponieważ pary zasad są prostopadłe do podwójnej helisy, nadając cząsteczce słabą chiralności. A-DNA daje dominujący pik dodatni przy 260 nm i pik ujemny około 210 nm6. Z-DNA, lewoskrętna helisa, daje ujemne pasmo przy 290 nm i dodatni pik około 260 nm6. To DNA daje również skrajnie ujemny pik przy 205 nm6.
Oprócz tych konformacji, DNA może również tworzyć tripleksy, kwadrupleksy i spinki do włosów, z których wszystkie można rozróżnić za pomocą spektroskopii CD. Równoległy G-quadruplex daje dominujące pasmo dodatnie przy 260 nm, podczas gdy antyrównoległy G-quadruplex daje pasmo ujemne przy 260 nm i dodatni szczyt przy 290 nm, co ułatwia rozróżnienie między dwiema formami struktur kwadrupleksu6. Tripleksy nie dają charakterystycznego spektrum8. Na przykład widma DNA o długości 36 nukleotydów, które mogą tworzyć wewnątrzcząsteczkową potrójną helisę zawierającą pary zasad G.G.C i T.A.T w obecności Na+, wykazują silne pasmo ujemne przy 240 nm i szeroki dodatni pik. Szeroki dodatni pik pokazuje wkłady przy 266, 273 i 286 nm. Ten sam oligonukleotyd w obecności Na+ i Zn+ wykazuje cztery pasma ujemne (213, 238, 266 i 282 nm) oraz dodatni pik przy 258 nm. Tak więc widma potrójnego DNA mogą się różnić w zależności od warunków soli8.
Oprócz tych konformacji, widma CD umożliwiły identyfikację innej formy DNA zwanej X-DNA. X-DNA powstaje, gdy sekwencja DNA zawiera naprzemienne reszty adeniny i tyminy. Widma CD X-DNA zawierają dwa ujemne piki przy 250 i 280 nm. Dostępnych jest bardzo niewiele informacji na temat X-DNA, chociaż spekuluje się, że funkcjonuje ono jako zlew dla dodatniego superzwijania6,9. Zmiany w widmach CD mogą również ujawnić szczegóły dotyczące interakcji ligand-białko i dlatego zostały dodane do arsenału metod molekularnych do wykrywania interakcji lek-białko10,11,12,13,14. Widma CD zostały również wykorzystane do monitorowania zmian w drugorzędowej strukturze białek podczas procesu fałdowania15. Podobnie, widma CD mogą być również używane do sondowania interakcji ligand-DNA16,17.
Spektroskopia CD, jest zatem łatwą i tanią metodą rozróżniania różnych form konformacji DNA, pod warunkiem, że istnieje dostęp do nie tak taniego sprzętu i oprogramowania. Metoda jest niezwykle czuła i szybka. Wymaga tylko niewielkiej ilości DNA, co daje mu przewagę nad alternatywną techniką spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Miareczkowanie ligandami i substratami jest również łatwe do wykonania. Głównym ograniczeniem jest to, że DNA powinno być bardzo czyste. Zaleca się stosowanie DNA oczyszczonego z elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (PAGE).
Informacje uzyskane przez widma CD były głównie wykorzystywane do dedukowania cech strukturalnych białek i identyfikacji odrębnych konformerów DNA. W tym badaniu widma CD wykorzystano do zintegrowania wyników uzyskanych z eksperymentu immunoprecypitacji chromatyny in vivo (ChIP) w celu określenia, czy białko będące przedmiotem zainteresowania / przewidywany czynnik transkrypcyjny może powodować zmianę konformacyjną w regionie promotorowym swoich genów efektorowych. Współpraca ta pomaga w postępie tradycyjnych technik spektroskopowych CD poprzez przewidywanie mechanizmu regulacji transkrypcji przez przewidywany czynnik transkrypcyjny na i wokół miejsca rozpoczęcia transkrypcji (TSS) promotora.
Przebudowa chromatyny to dobrze zdefiniowany mechanizm regulujący procesy metaboliczne DNA poprzez udostępnianie ciasno upakowanej chromatyny różnym czynnikom regulacyjnym, takim jak czynniki transkrypcyjne, składniki replikacji DNA lub białka naprawiające uszkodzenia. Zależne od ATP remodelery chromatyny, znane również jako rodzina białek SWI/SNF, są kluczowymi białkami remodelującymi obecnymi w komórkach eukariotycznych18,19. Grupowanie filogenetyczne podzieliło rodzinę białek SWI/SNF na 6 podgrup20: podobne do Snf2, podobne do Swr1, podobne do SSO1653, podobne do Rad54, podobne do Rad5/16 i odległe. SMARCAL1, białko będące przedmiotem zainteresowania w tym badaniu, należy do odległej podgrupy20. Białko to zostało wykorzystane do zbadania jego sposobu regulacji transkrypcji za pomocą spektroskopii CD.
>jove_content<Wykazano, że większość członków białek przebudowujących chromatynę zależnych od ATP zmienia lub eksmituje nukleosomy lub pośredniczy w wymianie wariantów histonów w sposób zależny od ATP21,22. Jednak nie wykazano, aby niektórzy członkowie tej rodziny przebudowywali nukleosomy, np. SMARCAL1. Mimo że badania wykazały, że SMARCAL1 wiąże się z chromosomami politenowymi, brakuje eksperymentalnych dowodów dotyczących jego zdolności do przebudowy nukleosomów23. W związku z tym postulowano, że SMARCAL1 może regulować transkrypcję poprzez zmianę konformacji DNA24. Spektroskopia CD dostarczyła łatwej i łatwo dostępnej metody walidacji tej hipotezy.
SMARCAL1 jest zależnym od ATP białkiem remodelującym chromatynę, które przede wszystkim pełni funkcję helikazy wyżarzającej25,26,27. Postuluje się modulację transkrypcji poprzez przebudowę konformacji DNA24. Aby przetestować tę hipotezę, zbadano rolę SMARCAL1 w regulacji transkrypcji genów podczas uszkodzeń DNA wywołanych doksorubicyną. W tych badaniach SMARCAL1 wykorzystano do analizy in vivo i ADAAD do testów in vitro28,29. Wcześniejsze badania wykazały, że ADAAD może rozpoznawać DNA w sposób zależny od struktury, ale niezależny od sekwencji30,31. Białko wiąże się optymalnie z cząsteczkami DNA posiadającymi dwuniciowe do jednoniciowych regionów przejściowych, podobnie jak DNA pętli macierzystej, i hydrolizuje ATP 30,31.
Eksperymenty in vivo wykazały, że SMARCAL1 reguluje ekspresję MYC, DROSHA, DGCR8 i DICER poprzez wiązanie się z regionami promotora28,29. Region interakcji został zidentyfikowany za pomocą eksperymentów ChIP28,29. Technika ChIP służy do analizy interakcji białka z pokrewnym DNA w komórce. Jego celem jest ustalenie, czy określone białka, takie jak czynniki transkrypcyjne na promotorach lub innych miejscach wiązania DNA, są związane z określonymi obszarami genomu. Białko związane z DNA jest najpierw sieciowane za pomocą formaldehydu. Następnie następuje izolacja chromatyny. Wyizolowana chromatyna jest ścinana do fragmentów o długości 500 pz za pomocą sonikacji lub trawienia nukleazy, a białko związane z DNA jest immunoprecypitowane przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka. Sieciowanie jest odwrócone, a DNA jest analizowane za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) lub ilościowego PCR w czasie rzeczywistym.
Wyniki ChIP doprowadziły do hipotezy, że SMARCAL1 prawdopodobnie pośredniczy w regulacji transkrypcji, wywołując zmianę konformacyjną w regionach promotorowych tych genów. Mapper QGRS i oprogramowanie Mfold zostały wykorzystane do zidentyfikowania potencjału tych regionów promotora do tworzenia struktur drugorzędowych28,29. Mapper QGRS służy do przewidywania G-quadruplexes32, podczas gdy Mfold33 analizuje zdolność sekwencji do tworzenia drugorzędnych struktur, takich jak pętle macierzyste.
Po analizie struktury drugorzędowej, przeprowadzono dalsze eksperymenty in vitro z rekombinowaną 6-krotnie znakowaną aktywną domeną ATPazy A zależnej od DNA (ADAAD), bydlęcym homologiem SMARCAL1, oczyszczonym z Escherichia coli34. Testy ATPazy przeprowadzono przy użyciu ADAAD w celu ustalenia, że zidentyfikowane sekwencje DNA mogą działać jako efektory28,29. Na koniec przeprowadzono spektroskopię CD w celu monitorowania zmian konformacyjnych indukowanych w cząsteczce DNA przez ADAAD28,29.
Aby udowodnić, że aktywność ATPazy białka była niezbędna do wywołania zmiany konformacyjnej w cząsteczce DNA, dodano albo kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) do chelatu Mg+2, albo dodano aktywny inhibitor domeny ATPazy A Neomycyny (ADAADiN), specyficzny inhibitor białka SWI/SNF35,36. Ta technika spektroskopowa CD może być stosowana z dowolnym oczyszczonym białkiem, które zostało wykazane przez ChIP lub inny odpowiedni test, aby wiązać się z przewidywanym regionem genomu promotora.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Fisher scientific</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli disodowej 5&prime;-trifosforanu adenozyny</td><td>Sigmaaldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>CD Kuweta kwarcowa</td><td>STARNA</td><td>21-Q-1</td><td></td></tr><tr><td>Chirascan V100</td><td>CD Fizyka stosowana</td><td>Niedostępne</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sól disodowa Dihydrat</td><td>SRL</td><td>43272</td><td></td></tr><tr><td>Sefroza glutationu 4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-01</td><td>Chromatografia powinowactwa glutationu</td></tr><tr><td>Roztwór czyszczący Hellmanex III</td><td>Hellma</td><td>9-307-011-4-507</td><td></td></tr><tr><td>Dehydrogenaza L-mlekowa</td><td>Sigmaaldrich</td><td>&nbsp; L2625</td><td></td></tr><tr><td>Octan magnezu czterowodny</td><td>Fisher scientific</td><td>BP215-500</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Fisher scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NADH sól disodowa</td><td>Sigmaaldrich</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoenolopirogronian Sól monocykloheksyloamoniowa</td><td>SRL</td><td>40083</td><td></td></tr><tr><td>Octan potasu</td><td>Fisher scientific</td><td>P178-3</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza pirogronianowa</td><td>Sigmaaldrich</td><td>P1506</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny</td><td>Fisher scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednowodny monohydrat</td><td>Fisher scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HT czytnik mikropłytek</td><td>BioTek</td><td>Niedostępny</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher scientific</td><td>Zobacz materiał BP152-500</td><td></td></tr></tbody></table>

spektroskopia cd do badania interakcji dna-białko

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Spektroskopia dichroizmu kołowego (CD) jest prostą i wygodną metodą badania drugorzędowej struktury i interakcji biomolekuł. Ostatnie postępy w spektroskopii CD umożliwiły szczegółowe badanie interakcji DNA-białko i dynamiki konformacyjnej DNA w różnych mikrośrodowiskach w celu lepszego zrozumienia regulacji transkrypcji in vivo. Obszar wokół potencjalnej strefy transkrypcji musi zostać rozwinięty, aby nastąpiła transkrypcja. Jest to złożony proces wymagający koordynacji modyfikacji histonów, wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA i innych czynności związanych z przebudową chromatyny. Za pomocą spektroskopii CD możliwe jest badanie zmian konformacyjnych w regionie promotora spowodowanych przez białka regulatorowe, takie jak zależne od ATP remodelery chromatyny, w celu promowania transkrypcji. Można również monitorować zmiany konformacyjne zachodzące w białku. Ponadto pytania dotyczące powinowactwa białka do docelowego DNA i swoistości sekwencji można rozwiązać poprzez włączenie mutacji w docelowym DNA. Krótko mówiąc, unikalne zrozumienie tej czułej i niedrogiej metody może przewidywać zmiany w dynamice chromatyny, poprawiając w ten sposób zrozumienie regulacji transkrypcji.

ADAAD stabilizuje strukturę przypominającą pętlę spinkową na MYC promotor 
Wcześniejsze dowody eksperymentalne wykazały, że SMARCAL1 jest negatywnym regulatorem MYC29Analiza regionu promotorowego o długości 159 bp MYC mapowanie genu za pomocą programu QGRS mapper wykazało, że nić prowadząca posiada potencjał do tworzenia G-kwadrupleksu (Tabela 2). Program Mfold wykazał, że obie nici MYC DNA m...

Interakcja zależnego od ATP czynnika remodelującego chromatynę z ligandem DNA jest opisana za pomocą spektroskopii CD. Indukowane zmiany konformacyjne na promotorze genu analizowane przez wygenerowane piki można wykorzystać do zrozumienia mechanizmu regulacji transkrypcji.

Spektroskopia CD do badania interakcji DNA-białko

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Protokół pozwala nam na wizualizację zmian w drugiej restrukturyzacji DNA indukowanej przez białka remodelujące chromatynę zależne od ATP. Zmiana w strukturze DNA może być skorelowana z regulacją transkrypcji. Jest to łatwa i bardzo czuła technika, która wykorzystuje bardzo małą ilość czystego DNA do rejestrowania zmian strukturalnych w oligonukleotydzie.Metoda ta może dostarczyć informacji na temat regulacji transkrypcji, w której pośredniczą białka remodelujące chromatynę zależne od ATP. Na początek należy przygotować stężenia robocze i innych składników reakcji na świeżo i utrzymywać je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed rozpoczęciem reakcji, a następnie zmierzyć aktywność ATPazy białka w obecności różnych cząsteczek DNA za pomocą testu utleniania sprzężonego z NADH. Wymieszaj 0,1 milimola ADAAD, dwa milimolowe ATP, 10 nanomolowe DNA i bufor 1X REG w 96-dołkowej płytce do końcowej objętości 250 mikrolitrów.Następnie inkubuj reakcję przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie zmierz ilość NAD+ za pomocą oprogramowania dostarczonego wraz z czytnikiem mikropłytek. Aby zmierzyć absorbancję przy 340 nanometrach, kliknij test NADH i umieść 96-dołkową płytkę na uchwycie płytki w urządzeniu, a następnie kliknij przycisk odczytu płytki, aby zapisać absorbancję. Zbierz widma CD w kuwetach kwarcowych o wysokiej przezroczystości.Używaj kuwet prostokątnych lub cylindrycznych. Aby wyczyścić kuwety, umyj je kilkakrotnie wodą, a następnie wykonaj skan wody lub bufora w kuwecie, aby sprawdzić, czy jest czysta. Do reakcji użyj oligonukleotydów DNA oczyszczonych przez PAGE.Aby uzyskać szybkie chłodzenie, podgrzej DNA w temperaturze 94 stopni Celsjusza przez trzy minuty na bloku grzewczym i natychmiast schłodzić je na lodzie. W celu powolnego chłodzenia, po podgrzaniu DNA do 94 stopni Celsjusza przez trzy minuty, pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej z szybkością jednego stopnia Celsjusza na minutę. Aby zarejestrować widma podstawowe, ustaw łącznie pięć reakcji kontrolnych jedna po drugiej w 1,5 mililitrowych probówkach wirówkowych.Utrzymuj objętość reakcji na poziomie 300 mikrolitrów we wszystkich reakcjach. Aby zarejestrować widma CD, należy ustawić w sumie pięć reakcji eksperymentalnych jedna po drugiej w 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych. Aby nagrać skan, włącz gaz i włącz spektrometr CD.Po 10 do 15 minutach włącz lampę, włącz łaźnię wodną i ustaw temperaturę oprawki na 37 stopni Celsjusza. Następnie otwórz oprogramowanie widma CD i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza, zakres długości fali od 180 do 300 nanometrów, czas na punkt na 0,5 sekundy, a liczbę skanowania na pięć, a następnie kliknij przeglądarkę danych pro, utwórz nowy plik i zmień jego nazwę, podając szczegóły eksperymentu i datę. Następnie wymieszać linię podstawową i reakcje eksperymentalne przez pipetowanie i ostrożnie przenieść mieszaniny reakcyjne jedna po drugiej do kuwety, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza.Jeśli wykonujesz eksperyment w czasie, inkubuj reakcje w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez wymagany czas, a następnie wykonaj skanowanie. Dodaj EDTA do buforu zawierającego DNA, ATP, magnez i białko, aby zatrzymać hydrolizę ATP. Aby całkowicie zahamować aktywność ATPazy, należy zwiększyć stężenie EDTA i czas inkubacji.Odejmij linie podstawowe od odpowiednich reakcji w oprogramowaniu i wygładź dane w oprogramowaniu widma CD lub w oprogramowaniu do wykreślania danych, a następnie wykreśl wykres długości fali w stosunku do średniej eliptyczności reszty i przeanalizuj piki. Fałdy M wykazały, że obie nici DNA MYC mogą tworzyć strukturę przypominającą pętlę macierzystą. Pokazano tutaj struktury fałdu M przedniej i odwrotnej sekwencji DNA zawierającej G quadruplex GECE.Widma CD szybko schłodzonego GECE przy braku i obecności ATP i ADAAD wykazały, że ADAAD indukuje dwa dodatnie piki, jeden przy 258 nanometrach, a drugi przy 210 nanometrach. Dodanie EDTA znosi tę zmianę konformacyjną. Widma CD mają teraz ujemny pik 210 nanometrów i szerokie dodatnie pasmo z pikami na 230 i 250 nanometrach.Mapowanie QGRS i analiza M-krotności wykazały, że regiony promotorowe DROSHA, DGCR8 i DICER mają potencjał do tworzenia G, kwadrupleksu i struktur podobnych do łodyg. Widma CD piątej pary DROSHA pokazały, że ADAAD indukuje ujemny pik przy 210 nanometrach i dodatni pik przy 260 nanometrach. To spektrum jest cechą charakterystyczną ADNA.Widma CD DGCR8 z pierwszej pary wykazały dodatni pik przy 210 nanometrach i szeroki ujemny pik przy 260 nanometrach. Widmo to jest charakterystyczne dla przejścia B do X. Dla siódmej pary DGCR8 zaobserwowano silne dodatnie piki na 210 i 270 nanometrach oraz ujemny pik na 250 nanometrach.Widmo to jest charakterystyczne dla równoległych struktur DNA kwadrupleksu G. Wreszcie, dla pierwszej pary DICER, zaobserwowano dodatni pik na 210 nanometrach i dwa ujemne piki, jeden na 230 nanometrach, a drugi na 260 nanometrach. Te piki są charakterystyczne dla przejścia DNA A do X.Upewnij się, że czystość DNA i białka wynosi 99% lub więcej. Kuweta powinna być czysta, a linia bazowa powinna być mniejsza niż jeden milistofel. Wszystkie odczynniki powinny być czyste, aby tło było mniejsze niż jeden milistopień.

cd-spectroscopy-to-study-dna-protein-interactions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie opisujemy metodę immunofluorescencji, aby zobrazować lokalizację białek naprawy DNA γH2AX i 53BP1 w miejscach pęknięć dwuniciowego DNA w napromieniowanych jądrach komórkowych.

Oparta na immunofluorescencji wizualizacja interakcji białek naprawy DNA

Ten film demonstruje technikę spektroskopii dichroizmu kołowego (CD) do badania zmian konformacyjnych zachodzących w DNA w obecności białka remodelującego chromatynę zależnego od ATP. Zmiany w widmach CD mierzone w obecności i braku hydrolizy ATP wskazują na znaczenie ATP w zdolności przebudowywacza do indukowania zmian konformacyjnych w związanym DNA.

Technika spektroskopii dichroizmu kołowego do badania interakcji DNA-białko

Różnicowa fluorymetria skaningowa jest powszechnie stosowaną metodą badania bibliotek małych cząsteczek pod kątem interakcji z białkami. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę rozszerzenia tych analiz w celu oszacowania stałej dysocjacji między małą cząsteczką a jej białkiem partnera.

Oznaczanie oddziaływań białko-ligand za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji DNA-białko za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z pełnym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) przy użyciu specyficznie zmodyfikowanego substratu DNA λ i białka znakowanego kropkami kwantowymi.

Wizualizacja interakcji między białkiem znakowanym Qdot a specyficznie modyfikowanym λ DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Kurtyna DNA, wysokoprzepustowa technika obrazowania pojedynczych cząsteczek, stanowi platformę do wizualizacji w czasie rzeczywistym różnych interakcji białko-DNA. Niniejszy protokół wykorzystuje technikę kurtyny DNA do zbadania biologicznej roli i mechanizmu molekularnego Abo1, ATPazy AAA + zawierającej bromodomenę Schizosaccharomyces pombe.

Rozszyfrowanie molekularnego mechanizmu składania histonów za pomocą techniki kurtyny DNA

Ten artykuł opisuje protokół badania interakcji DNA-białko za pomocą systemu interferometrii biowarstwowej (BLI) opartego na streptawidynie. Przedstawiono w nim podstawowe kroki i rozważania dotyczące wykorzystania podstawowej lub zaawansowanej kinetyki wiązania w celu określenia powinowactwa wiązania równowagi (KD) oddziaływania.

Analiza interakcji DNA-białko za pomocą interferometrii biowarstwowej opartej na streptawidynie

Ten protokół opisuje unikalną metodę wykrywania wiązania między związkami a cząsteczkami białka, oferując korzyści w postaci minimalnej utraty próbki białka i wysokiej dokładności danych.

Wykrywanie interakcji białko-baldaszek CD40 za pomocą różnicowej fluorescencji skaningowej

Ten protokół opisuje test replikacji pojedynczej cząsteczki DNA oparty na mikroskopii fluorescencyjnej, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym interakcji między polimerazami DNA a przeszkodami, takimi jak struktury G-quadruplex.

Wizualizacja fluorescencji pojedynczej cząsteczki dynamiki polimerazy DNA w G-kwadrupleksach

Protokół ten zapewnia szczegółowe operacje dotyczące przygotowania próbek, zbierania danych oraz analizy widm fluorescencji wewnętrznej DNA.

Spektroskopowe obrazowanie cząsteczek DNA z użyciem kontrastu wewnętrznego

Odkryj spektroskopię CD do badania interakcji DNA z białkami remodelującymi chromatynę. Ta metoda pozwala wizualizować zmiany konformacyjne DNA i korelować je z regulacją transkrypcji.

Spektroskopia CD do badania interakcji DNA-białko

Przeglądaj więcej filmów