Name: Częściowo ukierunkowana ultrawysokosprawna chromatografia sprzężona ze spektrometrią mas Analiza metabolitów fenolowych w osoczu osób w podeszłym wieku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Poznaj metodę półukierunkowanej analizy UPLC-MS/MS do wykrywania metabolitów fenolowych w osoczu. Protokół obejmuje wytrącanie białek etanolem, identyfikację związków za pomocą biblioteki PCDL oraz ocenę interwencji żywieniowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni za wsparcie finansowe od CONACYT, Meksyk (CB- 2016-01-286449) i UACJ-PIVA (Projekty 313-17-16 i 335-18-13). OAMB pragnie podziękować CONACYT za stypendium doktoranckie. Dziękujemy za wsparcie techniczne ze strony Biura Produkcji Multimedialnej UACJ.

Próbki osocza wykorzystane w niniejszym protokole zostały pobrane w poprzednim badaniu zgodnie ze wszystkimi wytycznymi etycznymi i zatwierdzone przez Komisję Etyki i Bioetyki (CIEB-2018-1-37) Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Pełny protokół ekstrakcji i identyfikacji związków fenolowych oraz metabolitów w osoczu metodą UPLC-MS/MS przedstawiono na Rysunku 1.
<img alt="Schemat wytrącania i ekstrakcji białek, analiza UPLC-QTOF w celu identyfikacji metabolitów w osoczu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63164/63164fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie ekstrakcji i identyfikacji związków fenolowych oraz metabolitów w osoczu przy użyciu półcelowanej metody UPLC-MS/MS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63164/63164fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
1. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Próbki osocza przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy.</li>
	<li>Próbki osocza rozmrozić w temperaturze pokojowej przez 15 min. 
	UWAGA: W celu przyspieszenia procesu (5 min) próbki można umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Do mikroprobówki o pojemności 2 mL przenieść 200 µL próbki osocza i wymieszać z 1 000 µL czystego etanolu. Próbkę osocza mieszać na wortexie przez 30 s. 
	UWAGA: Podczas pracy z próbkami osocza zawsze należy używać rękawiczek.</li>
	<li>Wirować próbkę przy 6 580 x g przez 5 min. Po wirowaniu zebrać nadosad za pomocą mikropipety lub pipety Pasteura i przenieść go do nowej mikroprobówki. Nadosad przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Osad z poprzedniego etapu wymieszać z 1 000 µL 100% etanolu, mieszać na wortexie przez 30 s, a następnie wirować przy 6 580 x g przez 5 min. 
	UWAGA: Osad jest silnie zbity i wymaga dokładnego resuspensowania, aby zapewnić kontakt próbki z czystym etanolem. Zaleca się użycie mikropipety do wypłukania osadu etanolem.</li>
	<li>Po wirowaniu zebrać nadosad i wymieszać go z nadosadem uzyskanym wcześniej w kroku 1.4. w mikroprobówce o pojemności 2 mL.</li>
	<li>Usunąć etanol z próbki za pomocą czystego azotu (99,997%) pod ciśnieniem 135 psi. Igłę należy trzymać 1 cm od górnej krawędzi mikroprobówki, aby zapobiec utracie próbki, i przepłukiwać aż do wysuszenia próbki. Odparowanie etanolu nie wymaga podgrzewania. 
	UWAGA: Przepływ azotu musi być niski, aby zapobiec utracie próbki. Po odparowaniu etanolu należy kontynuować przepływ azotu przez co najmniej 5 min, aby zapewnić całkowite wysuszenie próbki. Na tym etapie można przerwać protokół; próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Należy unikać przechowywania próbek przez więcej niż 12 h.</li>
	<li>Wysuszone próbki resuspensować w 100 µL mieszaniny acetonitrylu i wody w proporcji 50:50 (v:v).</li>
	<li>Próbkę przefiltrować przez nylonową membranę strzykawkową 0,45 µm bezpośrednio do mikroinsertu w fiolce HPLC. 
	UWAGA: Próbki w fiolkach można przechowywać w temperaturze -20 °C przed analizą. Próbki przechowywać nie dłużej niż przez 8 h. Zaleca się wstrzyknięcie próbek do systemu UPLC bezpośrednio po filtracji.</li>
</ol>
2. Analiza UPLC-MS/MS
<ol>
	<li>Wstrzyknij 3 µL próbki do układu UPLC wyposażonego w kolumnę odwrotnej fazy C18 (50 mm x 2.1 mm; 1.8 µm). Ustaw temperaturę autosamplera na 20 °C oraz termostatu kolumny na 25 °C. Każdą próbkę wstrzyknij w trzech powtórzeniach.</li>
	<li>Jako rozpuszczalnik A zastosuj 0,1% (v:v) kwasu mrówkowego w wodzie, a jako rozpuszczalnik B 100% acetonitrylu. Ustaw przepływ na 0,4 mL/min oraz program gradientowy w następujący sposób: 0-1 min 10% B, 1-4 min 30% B, 4-6 min 38% B, 6-8 min 60% B, 8-8,5 min 60% B, 8,5-9 min 10% B (Tabela 1).</li>
	<li>Ustaw spektrometr mas na tryb jonizacji ujemnej. Jako gaz osuszający zastosuj azot w temperaturze 340 °C i przy przepływie 13 L/min. Ustaw ciśnienie nebulizatora na 60 psi. Napięcie kapilary ustaw na 4,000 V, napięcie fragmentora na 175 V, a napięcie skimmera na 65 V. Zastosuj energię kolizyjną 20 V (Tabela 2).</li>
	<li>Skanuj masy w zakresie stosunku masy do ładunku (m/z) od 100 do 1100, a dla MS/MS skanuj masy w zakresie 50-1000 m/z (Tabela 2). Ustaw akwizycję danych w trybie Auto MS/MS. Jako masy referencyjne zastosuj: 119,036 oraz 966,0007.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Czas (min)</td>
			<td>Rozpuszczalnik A (0,1% kwasu mrówkowego w wodzie do HPLC)</td>
			<td>Rozpuszczalnik B (100% acetonitrylu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 do 1</td>
			<td>90</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 do 4</td>
			<td>70</td>
			<td>30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>od 4 do 6</td>
			<td>62</td>
			<td>38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>od 6 do 8</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 do 8,5</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8,5 do 9</td>
			<td>90</td>
			<td>10</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Gradient fazy ruchomej zastosowany do rozdziału związków fenolowych metodą UPLC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryb jonizacji</td>
			<td>Ujemny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gaz osuszający</td>
			<td>Azot w 340 °C, przepływ 13 L/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciśnienie nebulizatora</td>
			<td>60 psi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napięcie kapilary</td>
			<td>175 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zakres mas skanowania MS</td>
			<td>100-1100 m/z</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zakres mas skanowania MS/MS</td>
			<td>50-1000 m/z</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Parametry jonizacji dla analizy MS/MS.
3. Konstrukcja bazy danych
<ol>
	<li>Wyszukaj związki fenolowe, metabolity fenolowe lub inne interesujące związki w literaturze naukowej.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do zarządzania bazami danych dołączone do systemu UPLC. Wybierz File | New Personal Database Compound Library (PCDL) | Create New PCDL. Wybierz typ PCDL: LC/MS Metabolomics. Nadaj nazwę bibliotece PCDL. Następnie wybierz Create.</li>
	<li>Na pasku narzędzi wybierz PCDL , a następnie opcję Allow editing. Następnie kliknij przycisk Find compounds. 
	UWAGA: Ponieważ jest to nowa biblioteka PCDL, tabela wyników będzie pusta. Zmieni się to po dodaniu nowych związków do PCDL.
	<ol>
		<li>Dodaj związki do specjalistycznej osobistej biblioteki związków w bazie danych, kopiując je z ogólnej biblioteki instrumentu. Otwórz istniejącą bazę danych instrumentu zawartą w oprogramowaniu do zarządzania bazami danych. Kliknij przycisk Find compounds. W opcji Single search wprowadź kryteria wyszukiwania, aby znaleźć interesujący związek. 
		UWAGA: Związki można wyszukiwać według nazwy, wzoru cząsteczkowego, masy dokładnej oraz czasu retencji.</li>
		<li>W tabeli wyników wyszukiwania związków wybierz interesujący związek. Aby wybrać więcej niż jeden związek, kliknij pierwszy związek, przytrzymaj klawisz CTRL , a następnie klikaj kolejne interesujące związki. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy na wszystkie zaznaczone związki i wybierz Append to PCDL.</li>
		<li>W nowym oknie wyszukaj i wybierz plik specjalistycznej osobistej bazy danych. Zaznacz pola Include spectra for compounds if present oraz Include ion mobility info for compounds if present. Kliknij przycisk Append . W nowym oknie dialogowym wybierz Yes , aby sprawdzić nowo dodane związki. Wybierz No , aby kontynuować wyszukiwanie kolejnych interesujących związków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli interesujące związki nie są dostępne w ogólnej bibliotece instrumentu, dodaj nowe związki ręcznie.
	<ol>
		<li>Otwórz specjalistyczną osobistą bazę danych. Po otwarciu postępuj zgodnie z krokiem 3.3. Wybierz opcję Edit compounds. Kliknij przycisk Add new.</li>
		<li>W górnej sekcji okna uzupełnij informacje dotyczące nowego związku. Wprowadź wzór, nazwę, nazwę IUPAC, numer CAS, identyfikator Chemspider oraz inne identyfikatory.</li>
		<li>Skorzystaj z informacji dostępnych w bezpłatnych bibliotekach internetowych (Chemspider, PubChem i Phenol Explorer), aby uzupełnić dane dla nowego, interesującego związku. Po zakończeniu kliknij przycisk Save as new, aby zapisać informacje o nowym związku w specjalistycznej osobistej bazie danych. 
		UWAGA: Podczas dodawania informacji z bezpłatnych bibliotek upewnij się, że wprowadzasz dane o związku bez uwzględnienia obecności jonów chlorkowych lub jodkowych. Może to zmienić masę dokładną i wzór cząsteczkowy interesującego związku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz proces dla wszystkich interesujących związków, aby uzupełnić specjalistyczną osobistą bazę danych.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Użyj oprogramowania do analizy jakościowej instrumentu, aby zidentyfikować związki fenolowe i metabolity fenolowe obecne w próbkach.</li>
	<li>Otwórz plik próbki. W panelu Chromatogram wybierz Define Chromatograms i wyodrębnij całkowity chromatogram jonowy (TIC), wyodrębniony chromatogram jonowy MS (EIC) oraz EIC MS/MS. Wybierz opcję całkowania chromatogramu.</li>
	<li>W panelu Find Compounds wybierz Find by Formula-Options. W nowym oknie wybierz Formula Source, a następnie opcję Database/Library. Znajdź wcześniej utworzoną osobistą bazę danych i kliknij Open.</li>
	<li>Wybierz opcję Formula Matching i ustaw tolerancję dopasowania masy na 5 ppm. 
	UWAGA: Można ustawić inną tolerancję dopasowania mas, np. 10 ppm; różnica ta zależy od zastosowanego spektrometru mas.</li>
	<li>Wybierz opcję Negative Ions i zaznacz tylko pole dialogowe -H. W opcji Results zaznacz pola Extract EIC, Extract Cleaned Spectrum, Extract Raw Spectrum oraz include Structure.</li>
	<li>Wybierz opcję Result Filters. Zaznacz Warn if score is i ustaw wartość dopasowania wyniku na 80,00%. Zaznacz Do not match if the score is i ustaw wynik na 75,00%. 
	UWAGA: W razie potrzeby wartości dopasowania/braku dopasowania można zmienić na niższe. Zmniejszy to jednak dokładność identyfikacji.</li>
	<li>Kliknij Find Compounds by Formula , aby zidentyfikować interesujące związki w próbce.</li>
</ol>

<ol><li>Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+incidence%2C+and+clinical+impact+of+sarcopenia%3A+facts%2C+numbers%2C+and+epidemiology-update+2014%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cachexia%2C+Sarcopenia+and+Muscle%22%5BJournal%5D)">Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).</li>
<li>Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcopenia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Sarcopenia.</a> The Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).</li>
<li>Beaudart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrition+and+physical+activity+in+the+prevention+and+treatment+of+sarcopenia%3A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporosis+International%22%5BJournal%5D)">Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review.</a> Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).</li>
<li>Ozer, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenolic+compositions+and+antioxidant+activities+of+Maya+nut+%28Brosimum+alicastrum%29%3A+Comparison+with+commercial+nuts%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Properties%22%5BJournal%5D)">Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts.</a> International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).</li>
<li>Subiria-Cueto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brosimum+alicastrum+Sw.+%28Ram%C3%B3n%29%3A+An+alternative+to+improve+the+nutritional+properties+and+functional+potential+of+the+wheat+flour+tortilla%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla.</a> Foods. 8 (12), 1-18 (2019).</li>
<li>Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bebida+adicionada+con+Brosimum+alicastrum+sw.%3A+Una+alternativa+para+requerimientos+dietarios+especiales%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Salud+P%C3%BAblica+y+Nutrici%C3%B3n%22%5BJournal%5D)">Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales.</a> Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).</li>
<li>Rodríguez-Tadeo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionality+of+bread+and+beverage+added+with+brosimum+alicastrum+sw.+Seed+flour+on+the+nutritional+and+health+status+of+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly.</a> Foods. 10 (8), 1-21 (2021).</li>
<li>Muñoz-Bernal, ÓA., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuevo+acercamiento+a+la+interacci%C3%B3n+del+reactivo+de+Folin-Ciocalteu+con+az%C3%BAcares+durante+la+cuantificaci%C3%B3n+de+polifenoles+totales%5BTitle%5D)+AND+%22TIP+Revista+Especializada+en+Ciencias+Qu%C3%ADmico-Biol%C3%B3gicas%22%5BJournal%5D)">Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales.</a> TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).</li>
<li>Luca, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactivity+of+dietary+polyphenols%3A+The+role+of+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).</li>
<li>Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+intestinal+microbiota+in+the+bioavailability+and+physiological+functions+of+dietary+polyphenols%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols.</a> Molecules. 24 (2), (2019).</li>
<li>de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranberry+polyphenols+and+prevention+against+urinary+tract+Infections%3A+Relevant+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations.</a> Molecules. 25 (15), (2020).</li>
<li>Alsaleh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry%3A+A+guide+for+the+clinician%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Experimental+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry: A guide for the clinician.</a> Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).</li>
<li>Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-performance+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry+as+a+sensitive+and+powerful+technology+for+metabolomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies.</a> Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).</li>
<li>Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorption%2C+metabolism+and+excretion+of+cranberry+%28poly%29phenols+in+humans%3A+A+dose+response+study+and+assessment+of+inter-individual+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability.</a> Nutrients. 9 (3), (2017).</li>
<li>Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+metabolism+of+hydroxycinnamic+acids+%28chlorogenic%2C+caffeic%2C+and+ferulic+acids%29+by+HepG2+cells+as+a+model+of+the+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).</li>
<li>Rodriguez Lanzi,, Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenolic+metabolites+in+plasma+and+tissues+of+rats+fed+with+a+grape+pomace+extract+as+assessed+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).</li>
<li>Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+detection+and+identification+strategy+for+untargeted+metabolomics+based+on+UPLC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531(2020).</li>
<li>Nagy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+identification+of+dimethoxycinnamic+acids+in+human+plasma+after+coffee+intake+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).</li>
<li>Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+phenolic+acids+and+their+methylates%2C+glucuronides%2C+sulfates+and+lactones+metabolites+in+human+plasma+by+LC-MS%2FMS+after+oral+ingestion+of+soluble+coffee%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).</li>
<li>McCord, J., Strynar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+per-and+polyfluorinated+chemical+species+with+a+combined+targeted+and+non-targeted-screening+high-resolution+mass+spectrometry+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow.</a> Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).</li>
<li>Muñoz-Bernal, ÓA., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytochemical+characterization+and+antiplatelet+activity+of+Mexican+red+wines+and+their+by-products%5BTitle%5D)+AND+%22South+African+Journal+of+Enology+and+Viticulture%22%5BJournal%5D)">Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products.</a> South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).</li>
<li>Muñoz-Bernal, ÓA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriquecimiento+de+un+vino+tinto+con+un+extracto+de+compuestos+fen%C3%B3licos+provenientes+de+orujo+de+uva%3A+bioaccesibilidad%2C+an%C3%A1lisis+sensorial+y+respuesta+biol%C3%B3gica%5BTitle%5D)+AND+%22Universidad+Aut%C3%B3noma+de+Ciudad+Ju%C3%A1rez%22%5BJournal%5D)">Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica.</a> Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).</li>
<li>Low, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+sharing+in+PredRet+for+accurate+prediction+of+retention+time%3A+Application+to+plant+food+bioactive+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds.</a> Food Chemistry. , 357(2021).</li>
<li>Sánchez-Patán, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbial+catabolism+of+grape+seed+flavan-3-ols+by+human+faecal+microbiota.+Targeted+analysis+of+precursor+compounds%2C+intermediate+metabolites+and+end-products%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products.</a> Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+and+urinary+%28poly%29phenolic+profiles+after+4-week+red+raspberry+%28Rubus+idaeus+L.%29+intake+with+or+without+fructo-oligosaccharide+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation.</a> Molecules. 25 (20), (2020).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Identyfikacja i kwantyfikacja bioaktywnych fitochemikaliów, które są wchłaniane po spożyciu żywności lub suplementu diety, mają kluczowe znaczenie dla wykazania i zrozumienia korzyści zdrowotnych tych związków i żywności, która je zawiera. W niniejszej pracy opracowano metodę UPLC-MS/MS, mającą na celu wyłącznie identyfikację głównych związków fenolowych i ich metabolitów, których stężenie w osoczu wzrosło po 30-dniowej interwencji żywieniowej dwoma produktami spożywczymi opracowanymi specjalnie dla osób starszych. Założ...

Sarkopenia to postępująca choroba szkieletowa związana z przyspieszoną utratą mięśni w populacji osób starszych. Stan ten zwiększa ryzyko upadków i prowadzi do ograniczonej aktywności życia codziennego. Sarkopenia występuje u około 5%-10% osób w wieku powyżej 65 lat i około 50% osób w wieku 80 lat lub starszych1. Żadne specyficzne leki nie zostały zatwierdzone do leczenia sarkopenii, dlatego ważna jest profilaktyka poprzez aktywność fizyczną i dobrze zbilansowaną dietę1,2. Interwencje żywieniowe ze specjalnie opracowanymi pokarmami wzbogaconymi białkiem mlecznym i niezbędnymi aminokwasami wykazały pozytywne wyniki w zapobieganiu sarkopenii2. W innych badaniach autorzy włączyli do diety witaminy i przeciwutleniacze, takie jak witamina E i izoflawony, zwiększając korzyści dla przyrostu masy mięśniowej w talii i biodrach3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) to drzewo, które rośnie w tropikalnych regionach Meksyku; było spożywane przez kultury Majów ze względu na wysoką wartość odżywczą4. Jest dobrym źródłem białka, błonnika, minerałów i przeciwutleniaczy fenolowych, takich jak kwas chlorogenowy5. Ponieważ można ją zmielić na proszek i stosować w produktach do pieczenia lub spożywać w napojach, ostatnie badania oceniały włączenie mąki z nasion Ramón (RSF) do różnych produktów spożywczych w celu poprawy ich wartości odżywczej. Opracowano napój o smaku cappuccino uzupełniony RSF, który był bogaty w błonnik pokarmowy i zawierał ponad 6 g białka na porcję i był wysoce akceptowany przez konsumentów; W związku z tym uznano go za potencjalną alternatywę dla spełnienia specjalnych wymagań dietetycznych<klasa SUP="xref">6. W kolejnym badaniu RSF wykorzystano również do sformułowania muffinki i nowego napoju bogatego w białko, błonnik pokarmowy, mikroelementy i przeciwutleniacze fenolowe. Muffinka i napój były używane w interwencji dietetycznej dla osób starszych, które spożywały oba produkty dwa razy dziennie przez 30 dni. Po tym okresie stan odżywienia i sarkopenii uczestników poprawił się, a całkowita zawartość fenoli w osoczu wzrosła7. Jednak oznaczanie całkowitych związków fenolowych w osoczu przeprowadzono metodą spektrofotometryczną, więc identyfikacja rzeczywistych związków fenolowych, które zostały wchłonięte, nie była możliwa; Co więcej, metoda ta nie jest całkowicie specyficzna dla związków fenolowych, więc może wystąpić pewne przeszacowanie<Klasa SUP="xref">8.
Identyfikacja i kwantyfikacja związków fenolowych, które są wchłaniane po spożyciu pokarmów bogatych w te przeciwutleniacze, jest trudnym zadaniem, ale jest niezbędne do wykazania biologicznej aktywności tych fitochemikaliów. Biodostępność większości związków fenolowych jest niska; Mniej niż 5% z nich można znaleźć bez przemian strukturalnych w osoczu. Związki fenolowe ulegają kilku biotransformacjom, takim jak metylacja, sulfonacja lub glukuronidacja, które są przeprowadzane przez enterocyty i hepatocyty9. Związki fenolowe są również biotransformowane przez mikrobiotę w katabolity bakteryjne, które mogą wywierać korzystne działanie w organizmie po wchłonięciu do osocza10. Na przykład kwas fenylooctowy jest produktem bakteryjnej przemiany flawonoidów i oligomerycznych proantocyjanidyn, które mogą hamować do 40% adhezji bakterii (Escherichia coli) w drogach moczowych po spożyciu żurawiny11.
Różnorodność strukturalna naturalnie występujących związków fenolowych, w połączeniu z różnorodnością ich metabolitów i niską biodostępnością, sprawia, że ich identyfikacja w osoczu jest jeszcze trudniejsza. Profilowanie metabolomiczne z wykorzystaniem platform analizy spektroskopowej, takich jak magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) i tandemowa spektroskopia mas (MS/MS), jest prawdopodobnie najlepszym podejściem do osiągnięcia tego celu; Niestety, sprzęt nie jest łatwo dostępny, a rozwój protokołów analizy jest nadal ograniczony12. W kilku badaniach wykazano, że MS/MS w połączeniu z systemem separacji (takim jak chromatografia cieczowa) jest strategią zmniejszania złożoności widm masowych w badaniach metabolomicznych. Niedawne wprowadzenie metod separacji ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) skróciło czas analizy oraz zwiększyło rozdzielczość i czułość w porównaniu z konwencjonalnymi protokołami cieczowymi o wysokiej wydajności, dzięki czemu systemy UPLC-MS/MS szybko zostały szeroko zaakceptowane przez społeczność metabolomiki analitycznej13. W ten sposób niektóre badania dotyczyły metabolitów fenolowych i wykrywały glukuronowe pochodne kwasu kawowego, kwercetyny i kwasu ferulowego, a także sulfonowane pochodne kwasu syrynginowego i wanilinowego w osoczu osób po spożyciu żurawiny14. Poprzednie protokoły miały na celu znalezienie związków fenolowych i metabolitów fenolowych w płynach biologicznych, takich jak osocze. Protokoły te opierały się na identyfikacji i kwantyfikacji za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) sprzężonej z detektorem UV-vis 15. Niemniej jednak takie protokoły wymagają stosowania autentycznych standardów w celu oceny bezwzględnej identyfikacji i dokładnej kwantyfikacji. Szeroki zakres badań zidentyfikował najczęstsze metabolity w płynach biologicznych (formy sulfonowane, glukuronidowane i metylowane) przez UPLC-MS i UPLC-MS/MS; Jednak duża część metabolitów bakteryjnych nie została zgłoszona ze względu na brak baz danych zawierających ich pełne informacje16. Identyfikacja metabolitów jest skomplikowana ze względu na koszt i komercyjną dostępność wzorców metabolitów. Dlatego najlepszą strategią może być nieukierunkowana lub częściowo ukierunkowana analiza metabolitów MS/MS, która opiera się na wykorzystaniu informacji o cechach molekularnych (m/z, dokładna masa monoizotopowa, rozkład izotopowy i wzór fragmentacji) w celu określenia tożsamości chemicznej i porównania jej z ogólnodostępnymi internetowymi bazami danych, które zawierają metabolity polifenoli zidentyfikowane w płynach biologicznych po spożyciu polypolyphenol-richts12. Najważniejszymi bazami danych wykorzystywanymi w badaniach UPLC-MS/MS do identyfikacji związków fenolowych i ich metabolitów są Baza Danych Metabolomu Człowieka (HMDB), Biblioteka LipidBlast i inne uzupełniające bazy danych, takie jak PubChem, ChemSpider i Phenol Explorer17.
W niniejszym badaniu, częściowo ukierunkowana metoda UPLC-MS/MS została opracowana do analizy próbek osocza grupy osób starszych biorących udział w badaniu konsumpcji muffinek i napojów zawierających RSF7. Zebrano dane z różnych bezpłatnych internetowych baz danych metabolitów w osoczu i zintegrowano je ze specjalistyczną bazą danych. Dostęp do tej bazy danych można uzyskać automatycznie za pomocą oprogramowania sprzętowego w celu identyfikacji metabolitów polifenolowych w pięciu próbkach osocza przed i po 30-dniowej interwencji żywieniowej. Ma to na celu zidentyfikowanie głównych związków fenolowych lub ich metabolitów, które są wchłaniane ze specjalnie opracowanej żywności funkcjonalnej przeznaczonej do zapobiegania sarkopenii.

<table><tbody><tr><td>Acetonitryl</td><td>Tedia</td><td>Al1129-001</td><td>LC Spektrometria mas</td></tr><tr><td>Autosampler</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4226A</td><td>1290 Infinity series</td></tr><tr><td>C18 kolumna z odwróconymi fazami</td><td>Agilent Technologies</td><td>959757-902</td><td>Zorbax Eclipse plus C18 2,1x50 mm, 1,8 &mu; m; Wirówka HD o szybkiej rozdzielczości</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5452000018</td><td>Mini Spin; Rotor F-45-12-11</td></tr><tr><td>Komora kolumny z termostatem</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1316C</td><td>1290 Detektor</td></tr><tr><td>diodowy serii Infinity (UV-Vis)</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4212B</td><td>Seria 1260 Infinity</td></tr><tr><td>Źródło jonizacji elektrorozpylania</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3251B</td><td>Podwójny opryskiwacz Źródło ESI</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>J.T. Baker</td><td>0128-02</td><td>Odczynnik Baker, ACS</td></tr><tr><td>Mass Hunter Data Acquisition</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>Mass Hunter Analiza jakościowa</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek</td><td>marki</td><td>BR780546</td><td>Probówka do mikrowirówek, 2 ml z pokrywką</td></tr><tr><td>Pure etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-1L</td><td>200 proof, do biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Q-TOF LC/MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>G6530B</td><td>6530</td></tr><tr><td>Pompa czwartorzędowa</td> o dokładnej masie <td>Agilent Technologies</td><td>G4204A</td><td>1290 Seria Infinity</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>44514-NN</td><td>17 mm, 0,45 &mu; m, nylonowa membrana</td></tr><tr><td>Termostat</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1330B</td><td>1290 Seria Infinity</td></tr><tr><td>Fiolka</td><td>Agilent Technologies</td><td>8010-0199</td><td>Bursztyn, PFTE czerwony silikon 2 ml z zakrętką i niebieskimi nakrętkami</td></tr><tr><td>Wkładka do fiolki</td><td>Agilent Technologies</td><td>5183-2089</td><td>Wkładka do fiolki 200 &mu; L do standardowego otwarcia 2 ml, stożkowy</td></tr><tr><td>Water</td><td>Tedia</td><td>WL2212-001</td><td>LC Spektrometria mas</td></tr></tbody></table>

częściowo ukierunkowana ultrawysokosprawna chromatografia sprzężona ze spektrometrią mas analiza metabolitów fenolowych w osoczu osób w podeszłym wieku

Semi-Targeted Ultra-High-Performance Chromatography Coupled to Mass Spectrometry Analysis of Phenolic Metabolites in Plasma of Elderly Adults

Grupa 23 starszych osób otrzymała funkcjonalne posiłki (napój i muffinkę) specjalnie opracowane w celu zapobiegania sarkopenii (utrata masy mięśniowej związana z wiekiem). Próbki osocza pobrano na początku interwencji i po 30 dniach od spożywania posiłków funkcjonalnych. Przeprowadzono częściowo ukierunkowaną ultrawysokosprawną chromatografię sprzężoną z analizą masy tandemowej (UPLC-MS/MS) w celu identyfikacji związków fenolowych i ich metabolitów. Białka osocza wytrącono etanolem, a próbki zagęszczono i ponownie zawieszono w fazie ruchomej (acetonitryl 1:1: woda) przed wstrzyknięciem do instrumentu UPLC-MS/MS. Separację przeprowadzono za pomocą kolumny z odwróconymi fazami C18, a związki zidentyfikowano na podstawie ich masy eksperymentalnej, rozkładu izotopowego i wzoru fragmentów. Interesujące nas związki porównano z tymi pochodzącymi z banków danych i wewnętrznej biblioteki częściowo ukierunkowanej. Wstępne wyniki wykazały, że głównymi metabolitami zidentyfikowanymi po interwencji były kwas fenylooctowy, glicytyna, kwas 3-hydroksyfenylowalerinowy i gomisyna M2.

Proces krok po kroku służący do identyfikacji metabolitów fenolowych za pomocą półcelowej analizy UPLC-MS/MS próbek osocza w trybie ujemnym przedstawiono na Rycini 2. Najpierw za pomocą oprogramowania jakościowego instrumentu uzyskano całkowity chromatogram jonowy (TIC) z ekstraktu związków fenolowych osocza (otrzymanego po wytrąceniu białek z całkowitej próbki osocza). Następnie wykorzystano chromatogram wyekstrahowanych jonów, a dokładną masę i wzór fragmentacji (anal...

Celem tego protokołu jest wykrywanie metabolitów fenolowych w osoczu za pomocą metody częściowo ukierunkowanej chromatografii i spektrometrii mas.

Częściowo ukierunkowana ultrawysokosprawna chromatografia sprzężona ze spektrometrią mas Analiza metabolitów fenolowych w osoczu osób w podeszłym wieku

A group of 23 elderly persons was given functional meals (a beverage and a muffin) specially formulated for the prevention of sarcopenia (age-related loss ...

Celem tego protokołu jest wykrycie metabolitów fenolowych w osoczu za pomocą częściowo ukierunkowanej metody UPLC-MS/MS. Białka osocza wytrącono etanolem i zagęszczono próbki, a następnie ponownie zawieszono w fazie ruchomej przed wstrzyknięciem do sprzętu UPLC. Związki zidentyfikowano za pomocą częściowo ukierunkowanej biblioteki zgromadzonej w laboratorium, przy użyciu menedżera PCDL do metabolomiki, oprogramowania i różnych bezpłatnych baz danych online.Wdrożyliśmy interwencję żywieniową z formułą muffinek i napojów z mąką z nasion brosimum alicastrum. Pod koniec interwencji stan odżywienia i sarkopeniczny uczestników uległ poprawie, a całkowita zawartość fenoli w osoczu wzrosła. Musimy jednak zidentyfikować, które związki fenolowe zostały wchłonięte i przyczyniły się do pozytywnego efektu.Identyfikacja i kwantyfikacja związków fenolowych, które są wchłaniane po spożyciu żywności bogatej w te przeciwutleniacze, jest zadaniem trudnym, ale koniecznym, jeśli chce się wykazać aktywność biologiczną tych fitochemikaliów. Biodostępność większości składników fenolowych jest niska, ponadto mniej niż 5% z nich dostaje się bez strukturalnej transformacji do osocza. Większość z nich przechodzi kilka biotransformacji, takich jak metylacja, sulfonacja lub glukuronidacja.W szerokim zakresie badań zidentyfikowano najczęstsze metabolity w płynach biologicznych według UPLC-MS i UPLC-MS/MS. Jednak duża część metabolitów bakterii nie jest zgłaszana z powodu braku baz danych, które zawierają ich pełne informacje. Identyfikacja metabolitów jest skomplikowana ze względu na koszt i komercyjną dostępność wzorców metabolitów.Dlatego najlepszą strategią może być nieukierunkowana lub częściowo ukierunkowana analiza metabolitów SM/MS. Analiza ta opiera się na wykorzystaniu informacji o cechach molekularnych, stosunku masy do ładunku, monoizotopowej dokładnej masie, rozkładzie izotopowym i wzorcu fragmentacji. Określenie tożsamości chemicznej i porównanie jej z dostępnymi bezpłatnie internetowymi bazami danych, które zawierają metabolity polifenoli zidentyfikowane w płynach biologicznych po spożyciu diety bogatej w polifenole.W niniejszym badaniu opracowaliśmy częściowo ukierunkowaną metodę UPLC-MS/MS do analizy próbek osocza grupy osób starszych zaangażowanych w interwencję żywieniową. Próbki osocza należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy. Próbki osocza rozmrażać w temperaturze pokojowej przez 15 minut lub w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.Umieść 200 mikrolitrów próbki osocza w dwumilimetrowej mikroprobówce i wymieszaj z 1000 mikrolitrami czystego etanolu. Wiruj próbkę plazmy przez 30 sekund. Odwirować próbkę przy sile odśrodkowej 6,580 przez pięć minut.Po odwirowaniu zebrać supernatant za pomocą mikropipety lub pipety Pasteura i umieścić go w nowej mikroprobówce. Zarezerwować supernatant. Wymieszaj osad z 1000 mikrolitrów czystego etanolu, wierzchołkuj przez 30 sekund, a następnie odwiruj w tych samych warunkach.Zebrać supernatant i wymieszać z pierwszym supernatantem. Usunąć etanol z próbki, używając czystego azotu o ciśnieniu 135 psi. Trzymaj igłę w odległości jednego centymetra od górnej części mikroprobówki, aby zapobiec utracie próbki i spłukuj, aż próbka wyschnie.Zawiesić suche próbki w 100 mikrolitrach jednego jest do jednej mieszaniny acetonitrylu z wodą. Przefiltrować przez 45 mikronylonową membranę strzykawki bezpośrednio do mikrowkładki do fiolki HPLC Wstrzyknąć trzy mikrolitry próbki na UPLC wyposażony w kolumnę z odwróconymi fazami C 18. Ustaw temperaturę automatycznego podajnika próbek na 20 stopni Celsjusza, a termostat kolumny na 25 stopni Celsjusza.Wstrzyknąć każdą próbkę w trzech egzemplarzach. Użyj 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie jako rozpuszczalnika A i 100% acetonitrylu jako rozpuszczalnika B. Ustaw natężenie przepływu na 0,4 milimetra na minutę i program gradientu w następujący sposób, od zera do jednej minuty 10% B, od jednej do czterech minut 30% B, od czterech do sześciu minut 38% B, od sześciu do ośmiu minut 60% B, od ośmiu do 8,5 minuty 60% B, 8,5 do dziewięciu minut 10%B. Ustaw spektrometr masowy w jonizacji w trybie ujemnym.Użyj azotu jako gazu suszącego w temperaturze 300 stopni Celsjusza i natężeniu przepływu 13 litrów na minutę. Ustaw ciśnienie nebulizatora na 30 psi. Ustaw napięcie kapilarne na 4 000 woltów, napięcie fragmentora na 175 woltów, a napięcie skimmera na 65 woltów.Skanuj masy w zakresie od 100 do 1100 m/z, a w przypadku spektrometrii mas skanuj masy w zakresie od 50 do 1000 m/z. Ustaw akwizycję danych w trybie Auto MS/MS. Użyć następującej masy odniesienia: 119.036 i 966.0007.Poszukiwanie związków fenolowych, metabolitów fenolowych i innych interesujących związków w literaturze naukowej. Otwórz oprogramowanie do zarządzania bazą danych zawarte w systemie UPLC. Wybierz plik, a następnie wybierz nową bibliotekę złożoną osobistej bazy danych, PCDL.Następnie wybierz, utwórz nową nazwę PCDL. Wybierz typ metabolomiki PCDL LC/MS. Ustaw nazwę dla PCDL.Następnie wybierz pozycję Utwórz. Na pasku narzędzi wybierz opcję PCDL, a następnie opcję zezwalaj na edycję. Następnie kliknij przycisk znajdź związki.Związki można dodawać do biblioteki osobistej na dwa sposoby, najpierw kopiując je z ogólnej biblioteki instrumentu. W tym celu należy otworzyć istniejącą bazę danych instrumentów, która do tej pory była częścią zarządzania danymi. Kliknij przycisk znajdź związki.W opcji pojedynczego wyszukiwania wprowadź kryteria wyszukiwania złożonego, aby znaleźć procentową składankę. W tabeli wyników złożonych wybierz procentową składankę. Aby zaznaczyć więcej niż jeden związek, kliknij pierwszy związek, a następnie przytrzymaj naciśnięty CTRL, a następnie kliknij każdy interesujący go związek.Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy wszystkie podświetlone związki i wybierz Dołącz do PCDL. W nowym oknie wyszukaj i wybierz wyspecjalizowany plik osobistej bazy danych. Zaznacz pudełko, w tym widma dla związku, jeśli są obecne.Kliknij przycisk Dołącz. W nowym oknie dialogowym wybierz opcję Tak, aby sprawdzić dodane nowe związki. Wybierz pozycję Nie, aby kontynuować wyszukiwanie kolejnych związków zainteresowania.Po drugie, nowe związki mogą być dodawane ręcznie, jeśli nie są dostępne w ogólnej bibliotece instrumentu. W tym celu otwórz specjalistyczną bazę danych osobowych. Po otwarciu wybierz PCDL, a następnie opcję zezwalaj na edycję.Wybierz opcję edycji związków. Kliknij przycisk Dodaj nowy. W górnej części okna uzupełnij informacje o nowym związku.Wypełnij formułę, nazwę, nazwę IUPAC, numer CAS, identyfikator Chemspider i inne identyfikatory. Korzystając z informacji dostępnych w bezpłatnych bibliotekach internetowych, Chemspider, PubChem i Phenol Explorer w celu wypełnienia informacji o nowym związku zainteresowania. Po zakończeniu kliknij przycisk Zapisz jako nowy, aby zapisać nowe informacje o związku w specjalistycznej osobistej bazie danych.Powtórz ten proces ze wszystkimi interesującymi związkami, aby uzupełnić wyspecjalizowaną osobistą bazę danych. Użyj oprogramowania do zarządzania jakością urządzenia, aby zidentyfikować związki fenolowe i metabolity fenolowe. Otwórz przykładowy plik.W panelu Chromatogram wybierz opcję Zdefiniuj chromatogramy i wyodrębnij chromatogram jonowy całkowity TIC, wyekstrahowany chromatogram jonowy MS EIC i EIC MS/MS. Wybierz opcję chromatogramu całkowania. W panelu znajdowania związków wybierz opcje wyszukiwania według formuły.W nowym oknie wybierz źródło formuły, a następnie opcję biblioteki ukośnika bazy danych. Znajdź wcześniej utworzoną osobistą bazę danych i kliknij otwórz. Wybierz opcję dopasowania formuły i ustaw tolerancję dopasowania masy na pięć części na milion, ppm.Wybierz opcję jonów ujemnych i wybierz tylko okno dialogowe minus H. W opcji wyników zaznacz wyodrębnij EIC, wyodrębnij oczyszczone widmo, wyodrębnij surowe widmo i dołącz strukturalne okna dialogowe. Wybierz opcję filtrów wyników.A następnie zaznacz ostrzeżenie, jeśli wynik jest, a następnie ustaw dopasowanie wyniku na 80%Następnie zaznacz nie pasuj, jeśli wynik jest i ustaw wynik na 75%Następnie kliknij znajdź związki według formuły, aby zidentyfikować związki będące przedmiotem zainteresowania w próbce. Na następnym rysunku przedstawiono krok po kroku proces identyfikacji metabolitów fenolowych za pomocą częściowo ukierunkowanej analizy UPLC MS/MS próbek osocza. Po pierwsze, całkowity chromatogram jonowy uzyskano przy użyciu samodzielnie utworzonej bazy danych PCDL, która zawierała 645 związków fenolowych i ich metabolitów, uzyskanych z bezpłatnych internetowych baz danych.Następnie uzyskano wyekstrahowany chromatogram jonowy i wzór fragmentacji, czyli jony o masie mniejszej niż 5 ppm, tolerancję dopasowania. Na koniec porównano rozkład izotopowy wykrytych pików z rozkładem związków teoretycznych. Na podstawie tej analizy zidentyfikowano łącznie 25 związków fenolowych i metabolitów w próbkach osocza.W celu oceny skuteczności metody projektowania w identyfikacji absorbujących związków fenolowych lub ich metabolitów przeanalizowano pięć próbek uczestników badania uzyskanych przed i po 30-dniowej interwencji. Względną obfitość każdego związku obliczono, dzieląc obszar pod krzywą po leczeniu przez AUC przed leczeniem. Tabela czwarta przedstawia listę 12 związków fenolowych, które wykazały wzrost stężenia w osoczu po 30-dniowym spożyciu mąki zawierającej brosimum alicastrum.Kwas fenylooctowy był jedynym metabolitem wykrywanym konsekwentnie w wyższym stężeniu po leczeniu. Stężenie glicytyny, glikozylowanego izoflawonu i kwasu trzech hydroksyfenylowalerian wzrosło w trzech z pięciu próbek, ale zmniejszyło się w pozostałych dwóch. Gomisyna M2, lignan, została wykryta w trzech z pięciu próbek dopiero po interwencji żywieniowej.Pozostałe związki fenolowe i metabolity stwierdzono tylko w jednej próbce i tylko po poddaniu działaniu substancji. Z metody opracowanej w niniejszym artykule wynika, że w większości przypadków była ona dobrze dopasowana do celu, dla którego została stworzona. Próbka na zabieg była prosta i skuteczna.Udało się oddzielić UPLC i częściowo ukierunkowaną identyfikację metabolitów fenolowych za pomocą MS/MS.

semi-targeted-ultra-high-performance-chromatography-coupled-to-mass

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu.  W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Profilowanie metabolitów było cennym atutem w badaniach nad metabolizmem w zdrowiu i chorobie. Wykorzystując chromatografię cieczową z fazami normalnymi sprzężoną ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości ze zmianą polaryzacji i szybkim cyklem pracy, opisujemy protokół analizy polarnego składu metabolicznego materiału biologicznego z wysoką czułością, dokładnością i rozdzielczością.

Strategia dla wrażliwej, wielkoskalowej metabolomiki ilościowej

Wiarygodność wyników eksperymentów metabolomicznych zależy od skuteczności i powtarzalności przygotowania próbki. Opisana jest rygorystyczna i dogłębna metoda, która umożliwia ekstrakcję metabolitów z płynów biologicznych z możliwością późniejszej analizy do tysięcy związków lub tylko klas związków będących przedmiotem zainteresowania.

Wieloetapowa technika przygotowania do odzyskiwania wielu klas związków metabolitów w celu dogłębnej i pouczającej analizy metabolomicznej

Tutaj opisujemy wysokoprzepustową metodę kompleksowego nadzoru nad narkotykami, która pozwala na lepszą rozdzielczość i wykrywanie dużych paneli nadużywanych narkotyków i ich metabolitów, z kontrolą jakości opartą na wielosegmentowej elektroforezie kapilarnej i spektrometrii mas.

Wysokowydajny i kompleksowy nadzór nad lekami za pomocą wielosegmentowej elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas

Przedstawiono metodę nieukierunkowanej analizy metabolitów i lipidów w ziarnie pszenicy. Protokół obejmuje metodę ekstrakcji metabolitu acetonitrylu oraz metodologię chromatografii cieczowej z odwróconą fazą i spektrometrią mas, z akwizycją w dodatnich i ujemnych trybach jonizacji elektrorozpylanej.

Nieukierunkowana chromatografia cieczowa i analiza metabolomiczna ziarna pszenicy oparta na spektrometrii mas

Kwasy fenolowe są ważnymi substancjami fitochemicznymi, które są obecne w pełnych ziarnach. Posiadają właściwości bioaktywne, takie jak przeciwutleniające funkcje ochronne. Prace te miały na celu przedstawienie informacji na temat uogólnionej metody identyfikacji HPLC, szacowania całkowitej zawartości fenoli oraz oznaczania zdolności przeciwutleniającej kwasów fenolowych w zbożach i roślinach strączkowych.

Uogólniona metoda oznaczania składu swobodnie rozpuszczalnych kwasów fenolowych i zdolności przeciwutleniających zbóż i roślin strączkowych

Ten protokół opisuje proces metabolicznego znakowania starzejących się i niedzielących się komórek za pomocą pulsacyjnego SILAC, nieukierunkowaną analizę spektrometrii mas i uproszczone obliczanie okresów półtrwania białek.

Pomiar szybkości obrotu białek w starzejących się i niedzielących się hodowanych komórkach z etykietowaniem metabolicznym i spektrometrią mas

Opisujemy ogólny protokół, który integruje analizę spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości i dokowanie molekularne w badaniach tradycyjnej medycyny chińskiej.

Tandemowa spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości do badania składników chemicznych Gynura bicolor DC

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Poznaj metodę półukierunkowanej analizy UPLC-MS/MS do wykrywania metabolitów fenolowych w osoczu. Protokół obejmuje wytrącanie białek etanolem, identyfikację związków za pomocą biblioteki PCDL oraz ocenę interwencji żywieniowej.

Częściowo ukierunkowana ultrawysokosprawna chromatografia sprzężona ze spektrometrią mas Analiza metabolitów fenolowych w osoczu osób w podeszłym wieku (Wideo) | JoVE Journal

Częściowo ukierunkowana ultrawysokosprawna chromatografia sprzężona ze spektrometrią mas Analiza metabolitów fenolowych w osoczu osób w podeszłym wieku

Przeglądaj więcej filmów