Częściowo ukierunkowana ultrawysokosprawna chromatografia sprzężona ze spektrometrią mas Analiza metabolitów fenolowych w osoczu osób w podeszłym wieku

Celem tego protokołu jest wykrycie metabolitów fenolowych w osoczu za pomocą częściowo ukierunkowanej metody UPLC-MS/MS. Białka osocza wytrącono etanolem i zagęszczono próbki, a następnie ponownie zawieszono w fazie ruchomej przed wstrzyknięciem do sprzętu UPLC. Związki zidentyfikowano za pomocą częściowo ukierunkowanej biblioteki zgromadzonej w laboratorium, przy użyciu menedżera PCDL do metabolomiki, oprogramowania i różnych bezpłatnych baz danych online.

Wdrożyliśmy interwencję żywieniową z formułą muffinek i napojów z mąką z nasion brosimum alicastrum. Pod koniec interwencji stan odżywienia i sarkopeniczny uczestników uległ poprawie, a całkowita zawartość fenoli w osoczu wzrosła. Musimy jednak zidentyfikować, które związki fenolowe zostały wchłonięte i przyczyniły się do pozytywnego efektu.

Identyfikacja i kwantyfikacja związków fenolowych, które są wchłaniane po spożyciu żywności bogatej w te przeciwutleniacze, jest zadaniem trudnym, ale koniecznym, jeśli chce się wykazać aktywność biologiczną tych fitochemikaliów. Biodostępność większości składników fenolowych jest niska, ponadto mniej niż 5% z nich dostaje się bez strukturalnej transformacji do osocza. Większość z nich przechodzi kilka biotransformacji, takich jak metylacja, sulfonacja lub glukuronidacja.

W szerokim zakresie badań zidentyfikowano najczęstsze metabolity w płynach biologicznych według UPLC-MS i UPLC-MS/MS. Jednak duża część metabolitów bakterii nie jest zgłaszana z powodu braku baz danych, które zawierają ich pełne informacje. Identyfikacja metabolitów jest skomplikowana ze względu na koszt i komercyjną dostępność wzorców metabolitów.

Dlatego najlepszą strategią może być nieukierunkowana lub częściowo ukierunkowana analiza metabolitów SM/MS. Analiza ta opiera się na wykorzystaniu informacji o cechach molekularnych, stosunku masy do ładunku, monoizotopowej dokładnej masie, rozkładzie izotopowym i wzorcu fragmentacji. Określenie tożsamości chemicznej i porównanie jej z dostępnymi bezpłatnie internetowymi bazami danych, które zawierają metabolity polifenoli zidentyfikowane w płynach biologicznych po spożyciu diety bogatej w polifenole.

W niniejszym badaniu opracowaliśmy częściowo ukierunkowaną metodę UPLC-MS/MS do analizy próbek osocza grupy osób starszych zaangażowanych w interwencję żywieniową. Próbki osocza należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy. Próbki osocza rozmrażać w temperaturze pokojowej przez 15 minut lub w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Umieść 200 mikrolitrów próbki osocza w dwumilimetrowej mikroprobówce i wymieszaj z 1000 mikrolitrami czystego etanolu. Wiruj próbkę plazmy przez 30 sekund. Odwirować próbkę przy sile odśrodkowej 6,580 przez pięć minut.

Po odwirowaniu zebrać supernatant za pomocą mikropipety lub pipety Pasteura i umieścić go w nowej mikroprobówce. Zarezerwować supernatant. Wymieszaj osad z 1000 mikrolitrów czystego etanolu, wierzchołkuj przez 30 sekund, a następnie odwiruj w tych samych warunkach.

Zebrać supernatant i wymieszać z pierwszym supernatantem. Usunąć etanol z próbki, używając czystego azotu o ciśnieniu 135 psi. Trzymaj igłę w odległości jednego centymetra od górnej części mikroprobówki, aby zapobiec utracie próbki i spłukuj, aż próbka wyschnie.

Zawiesić suche próbki w 100 mikrolitrach jednego jest do jednej mieszaniny acetonitrylu z wodą. Przefiltrować przez 45 mikronylonową membranę strzykawki bezpośrednio do mikrowkładki do fiolki HPLC Wstrzyknąć trzy mikrolitry próbki na UPLC wyposażony w kolumnę z odwróconymi fazami C 18. Ustaw temperaturę automatycznego podajnika próbek na 20 stopni Celsjusza, a termostat kolumny na 25 stopni Celsjusza.

Wstrzyknąć każdą próbkę w trzech egzemplarzach. Użyj 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie jako rozpuszczalnika A i 100% acetonitrylu jako rozpuszczalnika B. Ustaw natężenie przepływu na 0,4 milimetra na minutę i program gradientu w następujący sposób, od zera do jednej minuty 10% B, od jednej do czterech minut 30% B, od czterech do sześciu minut 38% B, od sześciu do ośmiu minut 60% B, od ośmiu do 8,5 minuty 60% B, 8,5 do dziewięciu minut 10%B. Ustaw spektrometr masowy w jonizacji w trybie ujemnym.

Użyj azotu jako gazu suszącego w temperaturze 300 stopni Celsjusza i natężeniu przepływu 13 litrów na minutę. Ustaw ciśnienie nebulizatora na 30 psi. Ustaw napięcie kapilarne na 4 000 woltów, napięcie fragmentora na 175 woltów, a napięcie skimmera na 65 woltów.

Skanuj masy w zakresie od 100 do 1100 m/z, a w przypadku spektrometrii mas skanuj masy w zakresie od 50 do 1000 m/z. Ustaw akwizycję danych w trybie Auto MS/MS. Użyć następującej masy odniesienia: 119.036 i 966.0007.

Poszukiwanie związków fenolowych, metabolitów fenolowych i innych interesujących związków w literaturze naukowej. Otwórz oprogramowanie do zarządzania bazą danych zawarte w systemie UPLC. Wybierz plik, a następnie wybierz nową bibliotekę złożoną osobistej bazy danych, PCDL.

Następnie wybierz, utwórz nową nazwę PCDL. Wybierz typ metabolomiki PCDL LC/MS. Ustaw nazwę dla PCDL.

Następnie wybierz pozycję Utwórz. Na pasku narzędzi wybierz opcję PCDL, a następnie opcję zezwalaj na edycję. Następnie kliknij przycisk znajdź związki.

Związki można dodawać do biblioteki osobistej na dwa sposoby, najpierw kopiując je z ogólnej biblioteki instrumentu. W tym celu należy otworzyć istniejącą bazę danych instrumentów, która do tej pory była częścią zarządzania danymi. Kliknij przycisk znajdź związki.

W opcji pojedynczego wyszukiwania wprowadź kryteria wyszukiwania złożonego, aby znaleźć procentową składankę. W tabeli wyników złożonych wybierz procentową składankę. Aby zaznaczyć więcej niż jeden związek, kliknij pierwszy związek, a następnie przytrzymaj naciśnięty CTRL, a następnie kliknij każdy interesujący go związek.

Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy wszystkie podświetlone związki i wybierz Dołącz do PCDL. W nowym oknie wyszukaj i wybierz wyspecjalizowany plik osobistej bazy danych. Zaznacz pudełko, w tym widma dla związku, jeśli są obecne.

Kliknij przycisk Dołącz. W nowym oknie dialogowym wybierz opcję Tak, aby sprawdzić dodane nowe związki. Wybierz pozycję Nie, aby kontynuować wyszukiwanie kolejnych związków zainteresowania.

Po drugie, nowe związki mogą być dodawane ręcznie, jeśli nie są dostępne w ogólnej bibliotece instrumentu. W tym celu otwórz specjalistyczną bazę danych osobowych. Po otwarciu wybierz PCDL, a następnie opcję zezwalaj na edycję.

Wybierz opcję edycji związków. Kliknij przycisk Dodaj nowy. W górnej części okna uzupełnij informacje o nowym związku.

Wypełnij formułę, nazwę, nazwę IUPAC, numer CAS, identyfikator Chemspider i inne identyfikatory. Korzystając z informacji dostępnych w bezpłatnych bibliotekach internetowych, Chemspider, PubChem i Phenol Explorer w celu wypełnienia informacji o nowym związku zainteresowania. Po zakończeniu kliknij przycisk Zapisz jako nowy, aby zapisać nowe informacje o związku w specjalistycznej osobistej bazie danych.

Powtórz ten proces ze wszystkimi interesującymi związkami, aby uzupełnić wyspecjalizowaną osobistą bazę danych. Użyj oprogramowania do zarządzania jakością urządzenia, aby zidentyfikować związki fenolowe i metabolity fenolowe. Otwórz przykładowy plik.

W panelu Chromatogram wybierz opcję Zdefiniuj chromatogramy i wyodrębnij chromatogram jonowy całkowity TIC, wyekstrahowany chromatogram jonowy MS EIC i EIC MS/MS. Wybierz opcję chromatogramu całkowania. W panelu znajdowania związków wybierz opcje wyszukiwania według formuły.

W nowym oknie wybierz źródło formuły, a następnie opcję biblioteki ukośnika bazy danych. Znajdź wcześniej utworzoną osobistą bazę danych i kliknij otwórz. Wybierz opcję dopasowania formuły i ustaw tolerancję dopasowania masy na pięć części na milion, ppm.

Wybierz opcję jonów ujemnych i wybierz tylko okno dialogowe minus H. W opcji wyników zaznacz wyodrębnij EIC, wyodrębnij oczyszczone widmo, wyodrębnij surowe widmo i dołącz strukturalne okna dialogowe. Wybierz opcję filtrów wyników.

A następnie zaznacz ostrzeżenie, jeśli wynik jest, a następnie ustaw dopasowanie wyniku na 80%Następnie zaznacz nie pasuj, jeśli wynik jest i ustaw wynik na 75%Następnie kliknij znajdź związki według formuły, aby zidentyfikować związki będące przedmiotem zainteresowania w próbce. Na następnym rysunku przedstawiono krok po kroku proces identyfikacji metabolitów fenolowych za pomocą częściowo ukierunkowanej analizy UPLC MS/MS próbek osocza. Po pierwsze, całkowity chromatogram jonowy uzyskano przy użyciu samodzielnie utworzonej bazy danych PCDL, która zawierała 645 związków fenolowych i ich metabolitów, uzyskanych z bezpłatnych internetowych baz danych.

Następnie uzyskano wyekstrahowany chromatogram jonowy i wzór fragmentacji, czyli jony o masie mniejszej niż 5 ppm, tolerancję dopasowania. Na koniec porównano rozkład izotopowy wykrytych pików z rozkładem związków teoretycznych. Na podstawie tej analizy zidentyfikowano łącznie 25 związków fenolowych i metabolitów w próbkach osocza.

W celu oceny skuteczności metody projektowania w identyfikacji absorbujących związków fenolowych lub ich metabolitów przeanalizowano pięć próbek uczestników badania uzyskanych przed i po 30-dniowej interwencji. Względną obfitość każdego związku obliczono, dzieląc obszar pod krzywą po leczeniu przez AUC przed leczeniem. Tabela czwarta przedstawia listę 12 związków fenolowych, które wykazały wzrost stężenia w osoczu po 30-dniowym spożyciu mąki zawierającej brosimum alicastrum.

Kwas fenylooctowy był jedynym metabolitem wykrywanym konsekwentnie w wyższym stężeniu po leczeniu. Stężenie glicytyny, glikozylowanego izoflawonu i kwasu trzech hydroksyfenylowalerian wzrosło w trzech z pięciu próbek, ale zmniejszyło się w pozostałych dwóch. Gomisyna M2, lignan, została wykryta w trzech z pięciu próbek dopiero po interwencji żywieniowej.

Pozostałe związki fenolowe i metabolity stwierdzono tylko w jednej próbce i tylko po poddaniu działaniu substancji. Z metody opracowanej w niniejszym artykule wynika, że w większości przypadków była ona dobrze dopasowana do celu, dla którego została stworzona. Próbka na zabieg była prosta i skuteczna.

Udało się oddzielić UPLC i częściowo ukierunkowaną identyfikację metabolitów fenolowych za pomocą MS/MS.