Name: Model rany kłutej dorosłego nerwu wzrokowego z wykorzystaniem danio pręgowanego i medaka do analizy porównawczej zdolności regeneracyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Poznaj model rany kłutej dorosłego nerwu wzrokowego w danio pręgowanym i medaka do analizy porównawczej zdolności regeneracyjnych. Ta metoda pozwala badać mechanizmy molekularne regeneracji neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez JSPS KAKENHI Grant Number 18K14824 i 21K15195 oraz wewnętrzny grant AIST, Japan.

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Narodowym Instytucie Zaawansowanej Nauki i Technologii Przemysłowej. Danio pręgowany i medaka były utrzymywane zgodnie ze standardowymi procedurami28.
1. Rana kłuta w osłonie wzrokowej dla dorosłych
<ol>
	<li>Przygotować 0,4% (w/v) roztwór podstawowy trikainy do znieczulenia. Dla 100 ml roztworu podstawowego rozpuścić 400 mg metanosulfonianu trikainy (patrz tabela materiałów) w 90 ml wody destylowanej i dostosować pH do 7,0 przy użyciu 1 M buforu Tris HCl (pH 9,0). Po dostosowaniu pH dodaj wodę do 100 ml, a następnie przygotuj odpowiednie porcje i przechowuj je w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>W celu znieczulenia dorosłego ryba danio pręgowanego lub medaki należy przygotować 0,02% (m/v) roztwór trikainy, rozcieńczając 0,4% roztwór podstawowy tricainy wodą z obiektu rybnego.</li>
	<li>Znieczulenie ryb należy użyć 0,02% roztworu tricainy; stają się one znieczulone, gdy nie poruszają się lub nie reagują na dotyk (1-2 min).</li>
	<li>Umieść znieczuloną rybę na styropianowej tacy (patrz tabela materiałów) i zamocuj rybę pionowo między dwiema igłami 30 G włożonymi pionowo w styropian.</li>
	<li>Przytrzymaj ciało ryby, aby zapobiec przesuwaniu się głowy ryby i wbij pionowo igłę 30 G przez czaszkę w przyśrodkową część jednej z półkul tektum wzrokowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A,B). Głębokość wsunięcia wynosi ~0,75 mm, czyli prawie równie połowie długości skosu 30 G. Ta głębokość wkłucia indukuje uszkodzenie mózgu u zebry pręgowanego i medaka ze względu na podobny rozmiar ciała tych ryb. 
	UWAGA: Medaka ma łuski na czaszce. Zdrap i usuń łuski za pomocą igły 30 G, aby skutecznie i dokładnie wywołać ranę kłutą (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Przenieś zranione ryby do akwarium ze świeżą wodą w pomieszczeniu dla ryb i przenieś zbiornik do systemu hodowli ryb, gdy w pełni wyzdrowieją ze znieczulenia. 
	UWAGA: Ryby wyzdrowieją i zaczną się swobodnie poruszać w ciągu kilku minut.</li>
	<li>Do analizy pochodzenia po urazie należy przygotować świeżą wodę z pomieszczenia dla ryb zawierającą 5 mM bromodeoksyurydyny (BrdU) (patrz Tabela Materiałów), a następnie inkubować ryby z tym roztworem 5 mM BrdU przez z góry określony czas13,19 (zgodnie z projektem eksperymentalnym). Następnie przeprowadź sekcję tych ryb zgodnie z krokiem 2 i oceń inkorporację BrdU i tożsamość linii komórkowej, jeśli to konieczne. 
	UWAGA: Ten krok jest opcjonalnym krokiem analizy pochodzenia komórek. Aby wykryć sygnały BrdU, wykonaj pobieranie antygenu, jak pokazano w kroku 4.3.</li>
</ol>
2. Sekcja mózgu
<ol>
	<li>Przygotować 0,02% roztwór trykainy, styropianową tackę do rozwarstwienia oraz 10 ml strzykawki zawierającej sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (1x PBS) z rurką przedłużającą i igłami 30 G (patrz Tabela materiałów) do perfuzji wewnątrzsercowej.</li>
	<li>Znieczul ranną rybę w wybranych punktach czasowych.</li>
	<li>Połóż ręczniki papierowe na tacce styropianowej i ułóż znieczuloną rybę na ręcznikach papierowych.</li>
	<li>Przytrzymaj ciało ryby na miejscu, wkładając pionowo dwie igły 30 G po obu stronach płetwy odbytowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Wykonaj brzuszne nacięcie od odbytu do serca (<silna klasa="xfig">Ryc. 2B) i utrzymuj serce w widocznym miejscu, wkładając kolejne dwie igły 30 G po każdej stronie tego narządu (<silna klasa="xfig">Ryc. 2C). 
	UWAGA: Serce jest pokryte srebrzystą warstwą nabłonka tkanki podskórnej zarówno u danio pręgowanego, jak i medaka (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 2C).</li>
	<li>Delikatnie usuń srebrną warstwę nabłonka końcówką kleszczy (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Włóż igłę 30 G do komory, trzymając skos do góry, i wykonaj nacięcie w przedsionku za pomocą kleszczy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2E). Ostrożnie dociśnij strzykawkę, aby wepchnąć 1x PBS i upewnij się, że przedsionek wypłukał krew. 
	UWAGA: Aby zapobiec przebiciu igły przez komorę, ostrożnie włóż igłę na głębokość półskosu, a następnie wyreguluj głębokość wkłucia. Jeśli perfuzja jest dobrze wykonana, skrzela stają się białe (<silna klasa="xfig">Rysunek 2F,G).</li>
	<li>Zatrzymaj perfuzję po odsączeniu krwi i zbieleniu skrzeli.</li>
	<li>Usuń igły mocujące ciało ryby na miejscu i przymocuj rybę brzuszną stroną do dołu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2H). Przetnij rdzeń kręgowy i usuń czaszkę z tektum nerwu wzrokowego i kresomózgowia (<silna klasa="xfig">Ryc. 2I). Następnie przetnij nerwy wzrokowe i dokładnie przeprowadź sekcję mózgu. 
	UWAGA: Uważaj na nerwy wzrokowe podczas sekcji, ponieważ nerwy są połączone z tectum. Kiedy nerw wzrokowy jest ciągnięty, tektum wzrokowe może zostać odłączone od mózgu. Jeśli usuwanie krwi nie jest zakończone, mózg wygląda na jasnoróżowy (prawa półkula w <silna klasa="xfig">Rysunek 2J).</li>
	<li>Przenieść mózgi do probówek o pojemności 1,5 ml z 1 ml 4% paraformaldehydu w 1x PBS i utrwalić je na noc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zamrożonych sekcji
<ol>
	<li>Umyj utrwalone mózgi trzy razy w 1x PBS przez 5 minut każdy.</li>
	<li>W celu krioochrony mózgów należy przenieść je do probówek o pojemności 1,5 ml z 1 ml 30 % (w/v) sacharozy w 1 x PBS i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Przygotować związek do zatapiania (mieszanina 2:1 związku OCT i 30% sacharozy, patrz tabela materiałów) przez połączenie 30 ml OCT i 15 ml 30 % sacharozy. Przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Aby usunąć pęcherzyki z zmieszanego związku, odwiruj probówki o pojemności 50 ml o stężeniu 10 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej lub umieść probówki pionowo na noc.</li>
	<li>Inkubować blok aluminiowy przez noc w temperaturze -80 °C w celu schłodzenia kriomoldu (patrz Tabela Materiałów) natychmiast po tym, jak wypreparowany mózg zostanie osadzony w kriomold za pomocą związku zatapiającego. 
	UWAGA: Ciekły azot może być również używany do chłodzenia bloku aluminiowego. W takim przypadku blok aluminiowy należy umieścić w styropianowym pudełku wypełnionym wystarczającą ilością ciekłego azotu, aby pokryć blok aluminiowy tuż przed osadzeniem. Po potwierdzeniu sublimacji ciekłego azotu umieść kriomold na wstępnie schłodzonym bloku aluminiowym. Lepiej jest potwierdzić, ile krioform można jednocześnie umieścić na aluminiowym bloku. Zaleca się użycie ciekłego azotu lub dodatkowego wstępnie schłodzonego bloku, aby zapewnić wystarczająco dużo miejsca do szybkiego schłodzenia wszystkich próbek.</li>
	<li>Umieść wstępnie schłodzony blok aluminiowy w styropianowym pudełku. Użyj styropianowego pudełka z pokrywką, aby zapobiec nagrzewaniu się aluminiowego bloku.</li>
	<li>W przypadku przekrojów koronalnych osadź mózg w kriomold i dostosuj orientację za pomocą kleszczy pod mikroskopem (<silna klasa="xfig">Ryc. 3A).</li>
	<li>Umieść kriomold na wstępnie schłodzonym bloku aluminiowym w styropianowym pudełku i poczekaj, aż związek OCT zamarznie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Kiedy związek OCT zaczyna zamarzać, staje się biały.</li>
	<li>Nałóż mały okrąg związku OCT na krążek próbki i zamontuj krioblok, aby przymocować krioblok do krążka próbki.</li>
	<li>Umieścić krążek z próbką w kriostacie i całkowicie zamrozić związek OCT.</li>
	<li>Umieść krążek z próbką na głowicy próbki w kriostacie.</li>
	<li>Ustaw orientację kriobloku i przytnij OCT, aby usunąć wszelkie dodatkowe regiony. 
	UWAGA: Dostosuj orientację płaszczyzny cięcia podczas przecinania kresomózgowia. Ostrze wyposażone jest w kriostat. Możliwe jest dostosowanie orientacji płaszczyzny cięcia poprzez zmianę kąta nachylenia głowicy próbki.</li>
	<li>Wytnij odcinki szeregowe o grubości 14 μm przez całą powłokę optyczną za pomocą kriostatu. Przechowywać szkiełka w temperaturze -25 °C. 
	UWAGA: Długotrwałe przechowywanie powinno odbywać się w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
4. Barwienie immunologiczne fluorescencyjne
<ol>
	<li>Suche szkiełka w stojaku na szkiełka przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT). Myj szkiełka w 1x PBS przez 30 minut w RT. Jeśli ma być przeprowadzone barwienie immunologiczne przeciwciałami anty-PCNA lub BrdU, przejdź do kroku 4.2 lub kroku 4.3.</li>
	<li>Przygotować 500 ml 10 ml cytrynianu sodu w zlewce o pojemności 500 ml i ogrzać bufor cytrynianu do temperatury 85 °C na mieszadle magnetycznym na płycie grzejnej, następnie umieścić szkiełka w stojaku do barwienia szkiełek i inkubować ruszt w buforze cytrynianowym w temperaturze 85 °C przez 30 minut. Aby uniknąć wrzenia, utrzymuj temperaturę około 85 °C. Po pobraniu antygenu umyć szkiełka trzykrotnie w 0,1 % Tritonie w 1x PBS (PBSTr), przy czym każde płukanie trwa 5 minut w temperaturze RT. 
	UWAGA: Ten krok jest opcjonalnym krokiem pobierania antygenu jądrowego proliferacji komórek (PCNA).</li>
	<li>Przygotować roztwór 2 N HCl, rozcieńczając 12 N HCl w wodzie destylowanej. Za pomocą blokera cieczy (patrz Tabela materiałów) narysuj linię jako barierę hydrofobową, aby utrzymać roztwór 2 N HCl wokół sekcji.
	<ol>
		<li>Umieść szkiełka na tackach do barwienia immunologicznego i nałóż 200-300 μl roztworu 2N HCl. Inkubować tace w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po pobraniu antygenu przemyć trzy razy w 0,1 % PBSTr, przy czym każde płukanie trwa 5 minut w temperaturze RT. 
		UWAGA: Ten krok jest opcjonalnym krokiem pobierania antygenu BrdU.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wchłonąć i usunąć pozostały roztwór za pomocą ręczników papierowych. Następnie użyj blokera cieczy, aby narysować barierę hydrofobową, aby w razie potrzeby utrzymać roztwór przeciwciała wokół sekcji.</li>
	<li>Umieścić szkiełka na tacach i nanieść 200-300 μl roztworu blokującego, 3% (v/v) surowicy końskiej w PBSTr) na każde szkiełko i inkubować szkiełka przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj skrawki PBSTr przez 5 minut w temperaturze pokojowej i powtórz trzy razy.</li>
	<li>Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe (patrz tabela materiałów) przy użyciu roztworu blokującego (200-300 μl roztworu przeciwciał na każde szkiełko). Usuń pozostały PBSTr ręcznikami papierowymi i umieść szkiełka na tacach do barwienia immunologicznego. Roztwór przeciwciała pierwotnego nanieść na każde szkiełko podstawowe i inkubować tace przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj skrawki PBSTr przez 5 minut w temperaturze pokojowej i powtórz trzy razy.</li>
	<li>Przygotować fluorescencyjny roztwór przeciwciał drugorzędowych (patrz tabela materiałów) przy użyciu buforu blokującego (1:500). Usuń pozostały PBSTr ręcznikami papierowymi i umieść szkiełka na tacach do barwienia immunologicznego. Nałóż wtórny roztwór przeciwciała na każde szkiełko podstawowe i tacki zacieniające za pomocą folii aluminiowej. Inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć skrawki PBSTr przez 5 minut w temperaturze pokojowej trzy razy, nie wystawiając ich na działanie światła.</li>
	<li>Przygotować roztwór Hoechsta (rozcieńczenie 1:500 w 1x PBS, patrz Tabela Materiałów) do barwienia jądrowego. Usuń pozostały PBSTr ręcznikami papierowymi i umieść szkiełka na tacach do barwienia immunologicznego. Nałóż roztwór Hoechst na każde szkiełko podstawowe i przykryj tace folią aluminiową. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj sekcje 1x PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez wystawiania ich na działanie światła.</li>
	<li>Wchłonąć i usunąć pozostały 1x PBS za pomocą ręczników papierowych i zamontować sekcje na szkiełkach za pomocą rozpuszczalnego w wodzie medium montażowego (patrz Tabela materiałów) do fluorescencyjnego barwienia immunologicznego. Powoli nałóż szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 x 45 mm na sekcje. Przechowywać w temperaturze 4 °C, nie wystawiając szkiełek na działanie światła.</li>
	<li>Obserwuj i obrazuj skrawki pod mikroskopią fluorescencyjną lub mikroskopią konfokalną.</li>
</ol>

<ol><li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li>
<li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> BMC Developmental Biology. 6, 36(2006).</li>
<li>März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li>
<li>Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+tissue+repair+by+regeneration+enhancer+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements.</a> Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).</li>
<li>Simões, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+directly+contribute+collagen+to+scar+formation+during+zebrafish+heart+regeneration+and+mouse+heart+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair.</a> Nature Communications. 11 (1), 600(2020).</li>
<li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370 (6519), (2020).</li>
<li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li>
<li>Diotel, N., Lübke, L., Strähle, U., Rastegar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+and+distinct+features+of+adult+neurogenesis+and+regeneration+in+the+telencephalon+of+zebrafish+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 568930(2020).</li>
<li>Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+divergent+features+of+adult+neurogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525(2020).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+reparative+phenotypes+between+zebrafish+and+medaka+after+cardiac+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury.</a> Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).</li>
<li>Lai, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+analyses+in+zebrafish+and+medaka+reveal+that+harnessing+the+immune+response+promotes+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration.</a> eLife. 6, 25605(2017).</li>
<li>Lust, K., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+the+regenerative+potential+of+M%C3%BCller+glia+cells+in+a+regeneration-deficient+retina%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Activating the regenerative potential of Müller glia cells in a regeneration-deficient retina.</a> eLife. 7, 32319(2018).</li>
<li>Shimizu, Y., Kawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regenerative+capacity+of+the+optic+tectum+of+adult+medaka+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755(2021).</li>
<li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).</li>
<li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain%3A+origin%2C+proliferation+dynamics%2C+migration+and+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).</li>
<li>Alunni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+neural+stem+cells+in+the+medaka+optic+tectum+proliferation+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones.</a> Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).</li>
<li>Kuroyanagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+zones+in+adult+medaka+%28Oryzias+latipes%29+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain.</a> Brain Research. 1323, 33-40 (2010).</li>
<li>Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).</li>
<li>Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+regulates+proliferation+and+differentiation+of+radial+glia+in+regenerative+processes+after+stab+injury+in+the+optic+tectum+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish.</a> Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).</li>
<li>Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+sonic+hedgehog+and+notch+signaling+in+regenerative+neurogenesis+in+adult+zebrafish+optic+tectum+after+stab+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury.</a> Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).</li>
<li>Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibition+promotes+regenerative+neurogenesis+after+stab+wound+injury+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).</li>
<li>Shimizu, Y., Kawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetyltransferase+EP300+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+neural+stem+cells+during+adult+neurogenesis+and+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum.</a> Neuroscience Letters. 756, 135978(2021).</li>
<li>Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analyses+reveal+IL6%2FStat3+signaling+involvement+in+radial+glia+proliferation+after+stab+wound+injury+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408(2021).</li>
<li>Lindsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+tectal+stem+cells+display+diverse+regenerative+capacities+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4420(2019).</li>
<li>Yu, S., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+cell-cycle+entry+and+cell-state-dependent+fate+outputs+of+injury-reactivated+tectal+radial+glia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish.</a> eLife. 8, 48660(2019).</li>
<li>Bisese, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+transcriptome+response+of+the+midbrain%2Fdiencephalon+to+injury+in+the+adult+mummichog+%28Fundulus+heteroclitus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus).</a> Molecular Brain. 12 (1), 119(2019).</li>
<li>Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+adult+telencephalon%3A+a+method+to+investigate+vertebrate+brain+neurogenesis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (4), e51753(2014).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+5th+ed%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+neuroepithelial-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li>
<li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+a+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li>
<li>Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+glial+cell-specific+ablation+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain.</a> Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).</li>
<li>Godoy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neurons+regenerate+following+chemogenetic+ablation+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio).</a> Scientific Reports. 10 (1), 12825(2020).</li>
<li>Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+brain+ischemia-reperfusion+model+induced+by+hypoxia-reoxygenation+using+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae.</a> Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisano zestaw metod, które można zastosować do wywołania ran kłutych w tektum nerwu wzrokowego za pomocą igły w celu ułatwienia oceny proliferacji i różnicowania RGC po urazie mózgu. Rany kłute za pośrednictwem igieł są prostą, skutecznie wdrożoną metodą, którą można zastosować do wielu próbek eksperymentalnych przy użyciu standardowego zestawu narzędzi. Opracowano modele ran kłutych dla kilku obszarów mózgu danio pręgowanego 3,19,29<sup...

Danio pręgowany (Danio rerio) ma zwiększoną zdolność do regeneracji swojego ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w porównaniu do innych ssaków1,2,3. Ostatnio, aby lepiej zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw tej zwiększonej zdolności regeneracyjnej, przeprowadzono analizy porównawcze regeneracji tkanek przy użyciu technologii sekwencjonowania nowej generacji4,5,6. Struktury mózgu danio pręgowanego i czworonoga są zupełnie inne7,8,9. Oznacza to, że opracowano kilka modeli uszkodzeń mózgu z wykorzystaniem małych ryb o podobnej budowie mózgu i cechach biologicznych, aby ułatwić badanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tego zwiększonej zdolności regeneracyjnej.
Ponadto, medaka (Oryzias latipes) jest popularnym zwierzęciem laboratoryjnym o niskiej zdolności do regeneracji serca i neuronów10,11,12,13 w porównaniu z danio pręgowanym. Danio pręgowany i medaka mają podobne struktury mózgu i nisze dla dorosłych nerwowych komórek macierzystych (NSC)14,15,16,17. U danio pręgowanego i medaki tektum nerwu wzrokowego obejmuje dwa typy NSC, neuronabłonkowe komórki macierzyste i promieniste komórki glejowe (RGC)15,18. Wcześniej opracowano ranę kłutą łuku wzrokowego dorosłego danio pręgowanego, a model ten wykorzystano do zbadania mechanizmów molekularnych regulujących regenerację mózgu u tych zwierząt19,20,21,22,23. Ten model ran kłutych młodego dorosłego danio pręgowanego wywołał neurogenezę regeneracyjną z RGCs19,24,25. Ta rana kłuta w osłonie nerwu wzrokowego jest solidną i powtarzalną metodą13,19,20,21,22,23,24,25. Gdy ten sam model urazu został zastosowany do dorosłej medaki, niska zdolność neurogenna RGC w tektum wzrokowym medaka została ujawniona poprzez analizę porównawczą proliferacji i różnicowania RGC po urazie13.
Modele ran kłutych w osłonie wzrokowej zostały również opracowane w modelach mummichog26, ale szczegóły uszkodzenia tectum nie zostały dobrze udokumentowane w porównaniu z uszkodzeniem kresomózgowia27. Rana kłuta w tektum nerwu wzrokowego przy użyciu danio pręgowanego i medaki pozwala na zbadanie zróżnicowanych odpowiedzi komórkowych i ekspresji genów między gatunkami o zróżnicowanej zdolności regeneracyjnej. Protokół ten opisuje, jak wykonać ranę kłutą w tektum nerwu wzrokowego za pomocą igły iniekcyjnej. Tę metodę można zastosować do małych ryb, takich jak danio pręgowany i medaka. Opisano tutaj procesy przygotowania próbki do analizy histologicznej oraz analizy proliferacji i różnicowania komórkowego z wykorzystaniem immunohistochemii fluorescencyjnej i kriosekcji.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>TERUMO</td><td>SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris-HCl (pH 9,0)</td><td>NIPPON GENE</td><td>314-90381</td><td></td></tr><tr><td>Igła 30 G</td><td>Dentronics</td><td>HS-2739A</td> 4% roztwór buforowy fosforanu paraformaldehydu <td></td></tr><tr><td></td><td>Wako</td><td>163-20145</td><td></td></tr><tr><td>Blok</td><td></td><td></td> aluminiowy <td>115 x 80 x 37 mm (szer. x gł. x wys.) ma wystarczającą wielkość, aby zamrozić 6 krioform</td></tr><tr><td>Anti-BLBP</td><td>Millipore</td><td>ABN14</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anty-BrdU</td><td>Abcam</td><td>ab1893</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anti-HuC</td><td>Invitrogen</td><td>A21271</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anti-PCNA</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-56</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Brmodeoksyurydyna</td><td>Wako</td><td>023-15563</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny C1 plus</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>Sakura Finetek Japan</td><td>4565</td><td>10 x 10 x 5 mm (szer. x gł. x wys.)</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1960</td><td></td></tr><tr><td>Danio rerio Szczepy WT RW</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurka przedłużająca</td><td>TERUMO</td><td>SF-ET3520</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount (TM) Wodne podłoże montażowe, do stosowania z tkankami barwionymi barwnikiem fluorescencyjnym</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>DUMONT</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) Wysoce zaadsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor Plus 488</td><td>Invitrogen</td><td>A32723</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 roztwór</td><td>Dojindo</td><td>23491-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>Komora inkubacyjna na 10 szkiełek Ciemny Pomarańczowy</td><td>COSMO BIO CO., LTD.</td>Szkło przesuwne <td>10DO</td><td></td></tr><tr><td>MAS Szkło</td><td>Matsunami</td><td>MAS-01</td><td></td></tr><tr><td>Szkło z mikro pokrywą</td><td>Szkło Matsunami</td><td>C024451</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Normalny roztwór blokujący surowicę końską</td><td>VECTOR LABRATORIES</td><td>S-2000-20</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T Compound</td><td>Sakura Finetek Japan</td><td>83-1824</td><td></td></tr><tr><td>Szczepy Oryzias latipes WT Cab</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP Pen Super-Liquid Blocker</td><td>DAIDO SANGYO</td><td>PAP-S</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), pH 7,4</td><td>TaKaRa</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>Taca</td><td></td><td></td><td>styropianowa 100 x 100 x 10 mm (szer. x gł. x wys.) arkusz styropianu jest dostępny jako taca</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>30 % (w/v) Sacharoza w PBS</td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>nacarai tesque</td><td>14805-24</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trisodowy dwuwodny</td><td>Wako</td><td>191-01785</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako</td><td>04605-250</td><td></td></tr></tbody></table>

model rany kłutej dorosłego nerwu wzrokowego z wykorzystaniem danio pręgowanego i medaka do analizy porównawczej zdolności regeneracyjnych

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

Podczas gdy danio pręgowany ma większą zdolność do regeneracji swojego ośrodkowego układu nerwowego (OUN), medaka ma niższą zdolność do regeneracji OUN. Opracowano model uszkodzenia mózgu w tektum wzrokowym dorosłego osobnika danio pręgowanego i medaki, a także przeprowadzono porównawcze analizy histologiczne i molekularne w celu wyjaśnienia mechanizmów molekularnych regulujących wysoką zdolność regeneracyjną tej tkanki u tych gatunków ryb. W tym artykule przedstawiono model rany kłutej dla dorosłego kąta nerwu wzrokowego przy użyciu igły oraz analizy histologiczne pod kątem proliferacji i różnicowania nerwowych komórek macierzystych (NSC). Igła została ręcznie wprowadzona w centralną część tektum nerwu wzrokowego, a następnie ryby poddano perfuzji śródsercowej, a ich mózgi poddano sekcji. Tkanki te zostały następnie poddane kriosekcji i ocenione za pomocą barwienia immunologicznego pod kątem odpowiednich markerów proliferacji i różnicowania NSC. Ten model uszkodzeń tectum zapewnia solidne i powtarzalne wyniki zarówno u danio pręgowanego, jak i medaki, umożliwiając porównanie reakcji NSC po urazie. Metoda ta jest dostępna dla małych teleostów, w tym danio pręgowanego, medaki i afrykańskich karpiów, i umożliwia nam porównanie ich zdolności regeneracyjnych i zbadanie unikalnych mechanizmów molekularnych.

Uraz w postaci rany kłutej w obrębie tekta optycznego, wywołany wprowadzeniem igły do prawej półkuli (Rycina 1, Rycina 4A oraz Rycina 5A), indukuje różne odpowiedzi komórkowe, w tym proliferację radialnych komórek glejowych (RGC) i powstawanie nowych neuronów. Podobnie wykorzystano starsze populacje danio-pręgowanych (zebrafish) i medaka, aby zniwelować ewentualny wpływ starzenia się na odpowiedź regeneracyjną. Następnie na mrożonyc...

Opisano model mechanicznego uszkodzenia mózgu u dorosłego danio pręgowanego, aby zbadać mechanizmy molekularne regulujące ich wysoką zdolność regeneracyjną. Metoda wyjaśnia, jak stworzyć ranę kłutą w tektum nerwu wzrokowego wielu gatunków małych ryb w celu oceny odpowiedzi regeneracyjnych za pomocą fluorescencyjnego barwienia immunologicznego.

Model rany kłutej dorosłego nerwu wzrokowego z wykorzystaniem danio pręgowanego i medaka do analizy porównawczej zdolności regeneracyjnych

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

Rana kłuta to metoda urazu mechanicznego, która indukuje niespecyficzną ablację komórek. Metoda ta ułatwia ocenę proliferacji i różnicowania RGC po urazie mózgu. Rana kłuta za pośrednictwem igły jest prostą, skutecznie stosowaną metodą wywoływania uszkodzenia mózgu.Metodę tę można zastosować do wielu próbek eksperymentalnych przy użyciu standardowego zestawu narzędzi. Zdolność regeneracyjną danio pręgowanego zilustrowano za pomocą modelu rany kłutej. Nowe spojrzenie na mechanizm molekularny regulujący regenerację neuronów przyczynia się do rozwoju terapii regeneracyjnej w ośrodkowym układzie nerwowym.Zacznij od umieszczenia znieczulonego dorosłego danio pręgowanego lub medaki na styropianowej tacy. Zamocuj rybę pionowo między dwiema igłami o rozmiarze 30 włożonymi pionowo w styropian. Przytrzymaj ciało ryby, aby zapobiec ruchowi głowy ryby, a następnie włóż pionowo igłę o rozmiarze 30 przez czaszkę do przyśrodkowej części jednej ze sfer tektum optycznego.Następnie przenieś zranioną rybę do akwarium ze świeżą wodą z akwarium. Gdy ryby w pełni wyzdrowieją ze znieczulenia, przenieś zbiornik do systemu hodowlanego. Połóż ręczniki papierowe na styropianowej tacy, aby umieścić znieczuloną rybę.Następnie przytrzymaj ciało ryby na miejscu, wkładając pionowo dwie igły o rozmiarze 30 po obu stronach płetwy odbytowej. Po umieszczeniu ryby wykonaj brzuszne nacięcie od odbytu do serca. Utrzymuj serce w widocznym miejscu, wkładając dwie igły o rozmiarze 30 z każdej strony.Następnie za pomocą końcówki kleszczy usuń srebrną warstwę nabłonka. Włóż igłę o rozmiarze 30 do komory, utrzymując skos do góry, i wykonaj nacięcie w przedsionku za pomocą kleszczy. Następnie wepchnij PBS do przedsionka, naciskając strzykawkę, aby wypłukać krew z przedsionka.Kiedy krew zostanie spuszczona, a skrzela staną się białe, zatrzymaj perfuzję PBS. Później usuń igły mocujące ciało ryby na miejscu i przymocuj rybę brzuszną stroną do dołu. Po przecięciu rdzenia kręgowego i usunięciu czaszki z tektum nerwu wzrokowego i kresomózgowia należy przeciąć nerwy wzrokowe i przeprowadzić sekcję mózgu.Następnie przenieś mózgi do 1,5-mililitrowych probówek z jednym mililitrem 4% paraformaldehydu w PBS, aby utrwalić je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po trzykrotnym umyciu unieruchomionych mózgów w PBS przez pięć minut każde, przenieś mózgi do 1,5-mililitrowych probówek z jednym mililitrem 30% objętości sacharozy w PBS jako krioprotektantu i inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotuj związek do zatapiania, łącząc 30% sacharozy z 30 mililitrami optymalnej temperatury cięcia lub związku OCT i przechowuj związek w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Aby raz schłodzić kriomold, inkubuj aluminiowy blok przez noc w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i umieść wstępnie schłodzony blok w styropianowym pudełku z pokrywką, aby zapobiec nagrzewaniu. W przypadku przekrojów koronalnych należy osadzić wypreparowany mózg w kriomoldie, dostosowując orientację za pomocą kleszczy pod mikroskopem. Następnie umieść kriomold na wstępnie schłodzonym bloku aluminiowym w styropianowym pudełku i pozwól, aby związek OCT zamarzł i stał się biały.Gdy związek zamarza, nałóż mały okrąg związku OCT na krążek próbki przed zamontowaniem kriobloku na krążku próbki. Umieszczając krążek próbki w kriostacie, zamroź związek OCT. Następnie umieść krążek z próbką na głowicy próbki w kriostacie.Po ustawieniu orientacji kriobloku przytnij OCT, aby usunąć wszelkie dodatkowe obszary. Wytnij odcinki szeregowe o grubości 14 mikrometrów przez całą powłokę optyczną za pomocą kriostatu i przechowuj szkiełka w temperaturze minus 25 stopni Celsjusza. Oceniono proliferację promienistych komórek glejowych (RGC) w tkance mózgowej danio pręgowanego.Większość RGC proliferowała antygen komórkowy ujemny w przeciwległej, nieuszkodzonej półkuli. Dwa dni po urazie proliferacja RGC została indukowana po uszkodzonej stronie mettum medaka. Po uszkodzeniu mózgu linię komórkową i różnicowanie RGC oceniano za pomocą znakowania bromodeoksyurydyny lub BrdU.Reprezentatywna analiza pokazuje neurony nowonarodzonych w ciągu siedmiu dni po urazie u rannego danio pręgowanego i medaki. Jednym z krytycznych etapów w przypadku ran kłutych jest ręczne wprowadzenie igły. Konsekwentna kontuzja jest niezbędna do uzyskania powtarzalnych wyników.Barwniki fluorescencyjne są skuteczne jako markery ran. Stopień dyfuzji barwnika fluorescencyjnego wskazuje na lokalizację i głębokość rany kłutej. Technika ta jest potencjalnie dostosowana do innych małych gatunków ryb, a adaptacja do medaka pozwala na porównanie zdolności regeneracyjnych.

stab-wound-injury-model-adult-optic-tectum-using-zebrafish-medaka-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film demonstruje procedurę wywoływania zwyrodnienia siatkówki u dorosłych ryb pręgowanych za pomocą uszkodzenia laserowego. Laser celuje w komórki fotoreceptorowe w siatkówce, wywołując śmierć komórki i proces zwyrodnieniowy. To uszkodzenie aktywuje komórki glejowe Müllera (MG), prowadząc do ich odróżnicowania w komórki progenitorowe komórek macierzystych, które pomagają w regeneracji siatkówki.

Modelowanie zwyrodnienia i regeneracji siatkówki u danio pręgowanego za pomocą ogniskowego urazu laserowego

Po przecięciu kręgosłupa, dorosłe rybki pręgowane wracają do stanu funkcjonalnego w ciągu sześciu tygodni po urazie. Aby wykorzystać przezroczystość larw i szybszy powrót do zdrowia, przedstawiamy metodę transekcji rdzenia kręgowego larwy. Po przecięciu obserwujemy regenerację czuciową rozpoczynającą się po 2 dniach od urazu i ruch zgięcia C po 3 dniach od urazu.

Przekrój rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Aby rzucić światło na komórkowe i molekularne mechanizmy neurogenezy i regeneracji dorosłego danio pręgowanego, opracowaliśmy protokół inwazyjnej chirurgii powodującej mechaniczne urazy u dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego i późniejszego monitorowania zmian w ugodzonej półkuli za pomocą immunohistochemii lub hybrydyzacji in situ.

Rana kłuta dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego: metoda badania neurogenezy i regeneracji mózgu kręgowców

Tutaj prezentujemy wiarygodną metodę badania regeneracji nerek u dorosłych poprzez wywoływanie ostrego uszkodzenia nerek przez wstrzyknięcie gentamycyny. Pokazujemy, że uraz jest zależny od dawki gentamycyny i temperatury otoczenia, stosując hybrydyzację in situ do znakowania lhx1a+, tworząc nowe nefrony.

Regeneracja nerek u dorosłego danio pręgowanego przez uraz wywołany gentamycyną

Ten artykuł opisuje metodę mechanicznego uszkodzenia naczynia krwionośnego u zarodków danio pręgowanego. Ten model urazów stanowi platformę do badania hemostazy, stanów zapalnych związanych z urazami i gojenia się ran w organizmie idealnie nadającym się do mikroskopii w czasie rzeczywistym.

Mechaniczne uszkodzenie naczynia w zarodkach danio pręgowanego

Regeneracja siatkówki danio pręgowanego była głównie badana przy użyciu stałych siatek oka. Jednak dynamiczne procesy, takie jak interkinetyczna migracja jądrowa, zachodzą podczas odpowiedzi regeneracyjnej i wymagają obrazowania żywych komórek w celu zbadania mechanizmów leżących u ich podstaw. W tym miejscu opisujemy warunki hodowli i obrazowania w celu monitorowania międzykinetycznej migracji jądrowej (INM) w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej

Danio pręgowany jest popularnym modelem zwierzęcym do badania mechanizmów degeneracji/regeneracji siatkówki u kręgowców. Protokół ten opisuje metodę wywoływania miejscowego urazu zakłócającego zewnętrzną siatkówkę przy minimalnym uszkodzeniu wewnętrznej siatkówki. Następnie monitorujemy in vivo morfologię siatkówki i odpowiedź glejową Müllera przez cały okres regeneracji siatkówki.

Aktywacja komórek glejowych Müllera w indukowanym laserowo modelu zwyrodnienia i regeneracji siatkówki u danio pręgowanego

Tutaj opisujemy 3 modele uszkodzeń dorosłego danio pręgowanego i ich łączne stosowanie z leczeniem lekami immunosupresyjnymi. Udzielamy wskazówek w zakresie obrazowania regenerujących się tkanek oraz wykrywania w nich mineralizacji kości.

Modele urazów dorosłych danio pręgowanego w celu zbadania wpływu prednizolonu na regenerację tkanki kostnej

Zmodyfikowaliśmy model spadku masy Marmarou dla dorosłego danio pręgowanego, aby zbadać szeroki zakres patologii po uszkodzeniu mózgu (TBI) i mechanizmy leżące u podstaw późniejszej regeneracji neuronów. Ten model TBI jest skalowalny, indukuje łagodne, umiarkowane lub ciężkie TBI i podsumowuje niejednorodność obrażeń obserwowaną u ludzi.

Skalowalny model do badania skutków obrażeń spowodowanych siłą u dorosłych danio pręgowanych

Artykuł wyjaśnia, jak chirurgicznie usunąć oczy z żywych larw danio pręgowanego, co jest pierwszym krokiem w kierunku zbadania, jak wejście siatkówki wpływa na wzrost i rozwój tektum nerwu wzrokowego. Ponadto artykuł zawiera informacje na temat znieczulenia, fiksacji i preparacji larw, a następnie immunohistochemii i obrazowania konfokalnego.

Usunięcie oczu u żywych larw danio pręgowanego w celu zbadania zależnego od unerwienia wzrostu i rozwoju układu wzrokowego

Ten protokół skupia się na uszkadzaniu powierzchni oka danio pręgowanego poprzez ścieranie, aby ocenić późniejsze zamknięcie rany na poziomie komórkowym. Podejście to wykorzystuje zadzior oczny do częściowego usunięcia nabłonka rogówki i wykorzystuje skaningową mikroskopię elektronową do śledzenia zmian w morfologii komórek podczas zamykania rany.

Gojenie się ran rogówki danio pręgowanego: od ścierania do analizy obrazowej zamknięcia rany

Poznaj model rany kłutej dorosłego nerwu wzrokowego w danio pręgowanym i medaka do analizy porównawczej zdolności regeneracyjnych. Ta metoda pozwala badać mechanizmy molekularne regeneracji neuronów.

Model rany kłutej dorosłego nerwu wzrokowego z wykorzystaniem danio pręgowanego i medaka do analizy porównawczej zdolności regeneracyjnych (Wideo) | JoVE Journal

Model rany kłutej dorosłego nerwu wzrokowego z wykorzystaniem danio pręgowanego i medaka do analizy porównawczej zdolności regeneracyjnych

Przeglądaj więcej filmów