Wysokoprzepustowe sterowanie optyczne i rejestrowanie sygnału wapnia w kardiomiocytach pochodzących z iPSC do badań toksyczności i fenotypowych badań przesiewowych leków

Demonstrujemy niezliczoną ilość metod kontroli optycznej i obserwacji wyzwalanej aktywności komórkowej w kardiomiocytach pochodzących z iPSC do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i testów toksyczności. Umożliwiają wieloparametryczną kwantyfikację wzorców fenotypowych w czasie i przestrzeni, umożliwiają obserwację działania leków przez godziny lub dni. Metodę tę można zastosować do różnych typów komórek, takich jak nerwice lub komórki beta, do funkcjonalnych badań przesiewowych i testów toksyczności.

Procedurę zademonstruje Wan-Chi Su, inżynier bioobrazowania z mojego laboratorium. Przygotować płytkę wielodołkową przed wyjęciem kardiomiocytów iPSC z chłodni w celu rozmrożenia. Pokryj każdą studzienkę 96-dołkowej mikropłytki 100 mikrolitrami 0,02% roztworu żelatyny z 50 mikrogramami na mililitr fibronektyny, aby dokładnie pokryć wszystkie powierzchnie.

Przenieś kardiomiocyty iPSC ze zbiornika magazynującego ciekły azot do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zabierz fiolkę do szafki bezpieczeństwa biologicznego klasy drugiej i delikatnie przenieś zawartość do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów zawierającej dziewięć mililitrów pożywki o temperaturze pokojowej. Odwirować komórki w temperaturze 200 razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Odrzucić supernatant za pomocą pipety i delikatnie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki z 10-mikromolowym inhibitorem ROCK Y27632. Ogniwa płytkowe pokryły 96-dołkowe płytki o gęstości od 100 000 do 150 000 komórek na centymetr kwadratowy, zgodnie z instrukcjami producenta. Po 24 godzinach upewnij się, że komórki przymocowane do powierzchni płytki stykają się z innymi komórkami.

Po posiewaniu komórek przez 72 godziny rozmrozić zestawy wirusowe GECI na lodzie. Przygotować roztwór podstawowy zestawu wirusowego o podwójnej mocy z pożywką konserwacyjną. Przygotuj komórki do infekcji, dostosowując objętość pożywki do 100 mikrolitrów na studzienkę.

Dodaj 100 mikrolitrów wstępnie zmieszanego roztworu wirusowego do studzienek i inkubuj przez osiem do 16 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji zastąp 200 mikrolitrami wstępnie podgrzanego podłoża. Wizualizacja ekspresji GECI 24 godziny po transdukcji za pomocą systemu obrazowania.

Utrzymuj komórki w nawilżanym inkubatorze przed wykonaniem testów funkcjonalnych. Włącz wszystkie urządzenia systemu obrazowania o wysokiej zawartości. Sprawdź, czy temperatura komory osiąga 37 stopni Celsjusza przy 5% suplementacji dwutlenkiem węgla.

Otwórz oprogramowanie do obrazowania i wybierz ustawienie płytki dla płytki 96-dołkowej. Umieść nieosłoniętą płytkę 96-dołkową w komorze i załaduj pierścień uszczelniający żywej komórki na wierzch. Wybierz soczewki obiektywowe 20X, 60X i 20X do zanurzenia w wodzie, zgodnie z wymaganą rozdzielczością przestrzenną.

Dostosuj ostrość, aby robić wyraźne obrazy przed eksperymentalną akwizycją. Wybierz losowo od trzech do pięciu regionów na studzienkę w celu rejestracji aktywności wapnia. Wybierz odpowiednie filtry dla różnych wskaźników.

Ustaw odpowiednią moc diody elektroluminescencyjnej dla każdego używanego kanału obrazowania. Ustaw czas ekspozycji kamery na maksymalnie 40 milisekund lub 25 Hz oraz czas nagrywania 30 sekund dla akwizycji strumienia w celu obserwacji stanów przejściowych wapnia, zgłaszanych przez sondy MNG-GECO i K-GECO ulegających ekspresji w kardiomiocytach. Zwiększ moc diody LED, jeśli stosunek sygnału do szumu jest mniejszy niż dwa przy wyższych liczbach klatek.

W celu stymulacji optogenetycznej zoptymalizuj moc i częstotliwość niebieskiego światła w jednym hercu i rozpocznij akwizycję. Ponownie zawiesić E4031 Dofetilide i Werapamil w DMSO i rozcieńczyć je buforem Tyrode. Ułóż związki w odpowiednim miejscu docelowym.

Dodaj 100 mikrolitrów związku o podwójnej mocy za pomocą automatycznego systemu mikroprzepływowego do studzienek i rozpocznij akwizycję po pożądanym okresie inkubacji. Odizoluj obszar sygnału od tła, automatycznie wykrywając funkcję impulsów, rozdzielczość w czasie, za pomocą oprogramowania. Użyj oprogramowania do analizy pików wapnia, aby przeanalizować częstotliwość dudnienia, sygnał szczytowy, czas trwania przejściowy wapnia 50%, czas przejściowy wapnia 90% czas narastania i czas zaniku.

Na filmie przedstawiono obserwację spontanicznych oscylacji wapnia w NMG-GECO wyrażanych przez kardiomiocyty pochodzące z iPSC z leczeniem farmakologicznym lub bez niego. Ślady kinetyczne uzyskane przy użyciu MNG-GECO wykazały, że małocząsteczkowe inhibitory kanałów jonowych Werapamil, Dofetylid i E4031 wpływały na stany przejściowe wapnia zgodnie z oczekiwaniami. Aby ocenić odpowiedź na dawkę E4031 w standaryzowanych, stymulowanych warunkach, kanałrodepsyna-2 i CM iPSC eksprymujące K-GECO były optycznie kontrolowane za pomocą impulsów światła o częstotliwości jednego herca i 470 nanometrów i obserwowane za pomocą czerwonego sygnału K-GECO.

Postępujące zmniejszanie się amplitudy piku i wydłużanie czasu rozpadu stanów przejściowych wapnia następuje wraz ze wzrostem stężeń E4031. Zależny od dawki efekt E4031 był najbardziej widoczny w przypadku zmniejszenia amplitudy piku. Wyraźne stany przejściowe wapnia pozostają widoczne miesiąc po transdukcji wirusa lub bez dodatkowego światła używanego do stymulacji optycznej.

Wykres przedstawia lek, który wydaje się zwiększać częstość uderzeń, regulować interwał skurczu i zwiększać przejściową amplitudę wapnia w trybie LVNC iPSC CM. Zmienność częstotliwości dudnień i wynikający z niej wpływ na czas trwania przejściowych zaburzeń wapnia również zmieniają się, gdy iPSC CM są utrzymywane w hodowli. Kilka GECI, w tym ER LAR-GECO, MTG-Sepia i NIR-GECO, zostało opracowanych do ekspresji pojedynczo lub w połączeniu w modelach komórkowych do pomiaru aktywności wapnia w czasie rzeczywistym powstającej odpowiednio w retikulum endoplazmatycznym, siateczce sarkoplazmatycznej, mitochondriach i cytozolu.

GECI można łączyć w modelu iPSC CM w celu badania różnych wewnątrzkomórkowych magazynów wapnia. Kardiomiocyty wykazujące ekspresję K-GECO wykazywały spójne zachowanie bicia w czasie. Jednak obciążenie Fluo-4 wpłynęło zarówno na częstotliwość dudnień, jak i CTD w tym modelu, co sugeruje, że sam Fluo-4 może wpływać na wyniki takich eksperymentów.

Dostarczamy prosty sposób badania profili fenotypowych z komórek kontrolnych i pochodzących od pacjentów, podczas gdy produkt pośredni iPSC może rzucić światło na odkrywanie leków w różnych chorobach.