Stymulowanie i analiza neurogenezy dorosłych w centralnym mózgu Drosophila

Protokół ten jest istotny, ponieważ demonstruje centralną metodę uszkodzenia mózgu, która wyzwala neurogenezę u dorosłych u Drosophila, gdzie zwykle jej nie ma. Przewidujemy, że zastosowanie tej techniki do zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw neurogenezy u dorosłych będzie miało znaczenie dla regeneracji neuronów u ludzi. Nauka tej techniki wymaga cierpliwości i wytrwałości.

Zalecamy ćwiczenie na pięciu do 10 mózgach dziennie przez kilka tygodni przed pobraniem mózgów do analizy. Po znieczuleniu muchy na podkładce z dwutlenkiem węgla. Sortować nowo zamknięte młode samce much F1 w ciągu sześciu godzin od wylęgu i umieszczać je w czystych fiolkach zawierających pokarm z 40 lub mniej muchami na fiolkę.

Jeśli planujesz oznaczyć dzielące się komórki EdU, przygotuj 200 mikrolitrów 50 lub więcej młyna EdU w 10% sacharozie i umieść przygotowany roztwór na 23-milimetrowej okrągłej bibule filtracyjnej klasy trzeciej w pustej fiolce, a następnie umieść samce much w fiolce w celu wstępnego karmienia sześć godzin przed urazem. Następnie zdezynfekuj szpilki Minutien, umieszczając około 100 szpilek w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej wypełnionej 70% etanolem na pięć minut. Następnie zdezynfekuj podkładkę z dwutlenkiem węgla i pędzel, rozpylając 70% etanolu i wycierając do sucha czystą, niestrzępiącą się chusteczką.

Gdy narzędzia są czyste i suche, przenieś 40 lub mniej posortowanych samców F1 na czystą podkładkę i podziel je na dwie grupy. Jedna grupa będzie służyć jako kontrola nierannych much. Druga grupa eksperymentalna zostanie poddana penetrującemu urazowemu uszkodzeniu mózgu.

Następnie za pomocą kleszczy wyciągnij od czterech do pięciu nowych szpilek Minutien z probówki mikrowirówki i umieść je w pobliżu krawędzi podkładki z dwutlenkiem węgla. Następnie pod lunetą sekcyjną wybierz prostą szpilkę Minutien z ostrym końcem. Ponownie użyj ostrych szpilek i umieść uszkodzone lub kołki w osobnej tubce zawierającej 70% etanolu w celu bezpiecznej utylizacji.

Następnie, dla muszek ze standardowym genotypem krzyżowym, włącz lampę LED mikroskopu stereoskopowego wyposażoną w odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji dla białka zielonej fluorescencji, które umożliwia wzbudzenie w odległości od 440 do 460 nanometrów i umożliwia wizualizację w zakresie od 500 do 560 nanometrów. Następnie wybierz muchę do grupy eksperymentalnej i ustaw muchę tak, aby eksperymentator miał widok grzbietowy na kapsułę głowy z głową muchy w prawo. Za pomocą kleszczy podnieś i przytrzymaj wybraną szpilkę Minutien w jednej ręce, a pędzel w drugiej.

Następnie umieść szczoteczkę na przedniej stronie grzbietowej klatki piersiowej i delikatnie dociśnij, aby ustabilizować muchę. Wyceluj końcówką szpilki Minutien w ciała komórkowe grzybów po prawej stronie głowy i przeniknij przez torebkę głowy. Jeśli używasz punktów orientacyjnych, celuj w naskórek głowy grzbietowej między oczkami a grzbietową krawędzią oka.

Po zakończeniu urazu za pomocą pędzla delikatnie odepchnij główkę od kołka Minutien. Jeśli używasz mózgu do sekwencjonowania RNA lub QRT PCR, doznamy drugiego urazu po lewej stronie głowy. Gdy wszystkie eksperymentalne muchy zostaną zranione, umieść muchy kontrolne i ranne w oddzielnych oznakowanych fiolkach zawierających pokarm.

Fiolki należy ułożyć poziomo, aby zapobiec przedostawaniu się much do żywności. Umieść standardowe muchy krzyżowe w temperaturze 25 stopni Celsjusza, a muchy permatwin w 30 stopniach Celsjusza, aby się zestarzały. Jeśli starzenie się trwa dłużej niż 24 godziny, muchy przenoszą się na czysty pokarm co jeden do dwóch dni.

Znaczny wzrost proliferacji zaobserwowano 24 godziny po urazie przy użyciu anty pH3, markera dla komórek aktywnie przechodzących mitozę. W każdym z centralnych mózgów kontrolnych obserwuje się około trzech komórek pH3-dodatnich. I 11 komórek pH3 dodatnich w każdym z uszkodzonych ośrodkowych mózgów.

Po siedmiu dniach w każdym z mózgów komórek kontrolnych obecne są średnio dwie komórki EdU dodatnie. I 11 komórek EdU dodatnich w każdym z uszkodzonych centralnych mózgów, co jest podobne do wyników uzyskanych 24 godziny po urazie z przeciwciałem pH3. Po 14 dniach grupa kontrolna miała średnio jedną komórkę EdU dodatnią na centralny mózg, a uszkodzone mózgi średnio 29 komórek EdU dodatnich na centralny mózg.

Wykazanie, że proliferacja komórek trwa co najmniej do drugiego tygodnia po penetrującym urazowym uszkodzeniu mózgu. Najsilniejszą reakcję proliferacyjną w centralnej części mózgu obserwuje się, gdy mózg zostaje uszkodzony w ciągu pierwszych 24 godzin po ekleksji. Po siedmiu dniach od wykwitu uraz penetrujący nadal powoduje znaczny wzrost proliferacji.

Jednak po 14 dniach zdolność komórek do podziału znacznie spada do jednej dzielącej się komórki na mózg. Co jest podobne do tego, jak w przypadku mózgów kontrolnych. Korzystając z systemu etykietowania permatwin, w uszkodzonych próbkach wykryto więcej klonów permatwin w ciągu dwóch dni, w ciągu dwóch tygodni, w porównaniu z kontrolą.

Przy czym liczba klonów rośnie z czasem po urazie. Dwa tygodnie po urazie pojawiły się nowe neurony ciała grzyba w 50% uszkodzonych mózgów. Te nowe neurony rzutowały swoje dendryty w przybliżeniu na kielich ciała grzyba, a aksony na płaty ciała grzyba.

Inne obszary mózgu, które wydawały się regenerować, to ciało elipsoidalne, płaty antenowe i róg boczny. Pamiętaj, aby użyć ostrej szpilki Minutien podczas wykonywania urazów mózgu, ponieważ użycie lub wygiętej szpilki zwiększy śmiertelność. Pamiętaj też, aby nie naciskać zbyt mocno na muchy pędzlem, ponieważ zwiększy to również śmiertelność.

Po tej procedurze immunohistochemia może być wykorzystana do ilościowego określenia samoproliferacji, a także do identyfikacji nowych neuronów i gleju.