Name: Test rekombinowanych kończyn kurczaka w celu zrozumienia morfogenezy, wzorca i wczesnych etapów różnicowania komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Poznaj metodę tworzenia rekombinowanych kończyn kurczaka w celu badania różnicowania komórek i morfogenezy. Protokół ten pozwala analizować wpływ sygnałów embriogenicznych na formowanie wzorca in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Estefanii Garay-Pacheco za zdjęcia na rysunku 2 oraz Marii Valerii Chimal-Montes de Oca za grafikę. Prace te były wspierane przez Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [granty nr IN211117 i IN213314] oraz Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [grant nr 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] przyznany JC-M. JC M-L był stypendystą stażu podoktorskiego w Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).

To badanie zostało zrecenzowane i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Miasto Meksyk, Meksyk). Schematyczny schemat ogólnych kroków tego protokołu jest pokazany na Rysunek 1A.
1. Inkubacja zarodków i określenie żywotności
<ol>
	<li>Inkubuj zapłodnione jaja kurze w temperaturze 38 °C i wilgotności względnej 60% przez około trzy i pół dnia, aż osiągną etap 22 HH (według Hamilton i Hamburger, 1951)16. 
	UWAGA: Świeżo nawożone jaja kurze można przechowywać w temperaturze 15 °C przez okres do jednego tygodnia.
	<ol>
		<li>Aby wysiadywać zapłodnione jaja, umieść je pionowo spiczastą stroną do dołu w nawilżanym inkubatorze. Podczas inkubacji należy obracać jaja, ponieważ jest to konieczne, aby zapobiec przyleganiu rozwijającego się zarodka do błony skorupy. 
		UWAGA: Zapłodnione jaja kurze można uzyskać z lokalnych gospodarstw. Zapłodnione jaja kurze White Leghorn są zwykle używane w celu uniknięcia pigmentacji piór u późnych zarodków. Rozważ osobną inkubację wystarczającej liczby jaj, aby uzyskać trzy struktury: (1) komórki mezodermalne kończyn, (2) ektodermy kończyn i (3) zarodki dawcy do przeszczepienia RL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po trzech i pół dniach inkubacji wyjmij jaja z inkubatora, przetrzyj 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Zidentyfikuj rozwijające się zarodki świecujące komórkę jajową, aby obserwować naczynia krwionośne i zlokalizować zarodek. Wyrzuć jaja, które nie mają zarodka. 
	UWAGA: W tym momencie rozprowadź jaja, aby uzyskać komórki mezodermalne, ektodermy i gospodarzy dla RL.</li>
</ol>
2. Pozyskiwanie komórek mezodermalnych kończyn do wypełnienia ektoderm
UWAGA: Przed rozpoczęciem manipulacji, zaleca się zdezynfekowanie obszaru roboczego, mikroskopów i wszystkich urządzeń poprzez pobranie wymazu z 70% roztworem etanolu.
<ol>
	<li>Postukaj w koniec skorupki jajka końcem kleszczy, aby otworzyć okno i usuń około 1 cm x 1 cm skorupki za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Przenieś jaja do plastikowego lub kartonowego uchwytu i umieść je pojedynczo pod mikroskopem stereoskopowym. Zidentyfikuj membranę powietrzną, a następnie usuń ją, wybierając mały otwór, w którym nie znaleziono żadnych naczyń. Pociągnij ten obszar za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych. 
	UWAGA: Błonę powietrzną można zidentyfikować jako białą i nieprzezroczystą błonę obserwowaną natychmiast po zamknięciu jaja.
	<ol>
		<li>Usuń wszelkie małe kawałki skorupki jaja, które mogą mieć kontakt z zarodkiem. 
		UWAGA: Sprawdź, czy zarodki są w fazie 22 HH przed rozpoczęciem protokołu. Zarodki we wcześniejszych stadiach można zwrócić do inkubatora po uszczelnieniu okienka skorupki jaja taśmą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Całkowicie otworzyć worek owodniowy, rozrywając owodnię za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Owodnię można zidentyfikować jako przezroczystą błonę, która ściśle pokrywa zarodek i jest wypełniona płynem owodniowym.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij zarodek z komórki jajowej za pomocą kleszczy, a następnie przenieś na sterylną szalkę Petriego zawierającą lodowaty roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (1x PBS). Powtórz ten krok dla pozostałych jaj. Weź pod uwagę, że tylko ~8-10 zarodków wystarcza do uzyskania komórek mezodermalnych.</li>
	<li>Umyj zarodki raz w lodowatym 1x PBS i za pomocą mikroskopu stereoskopowego (patrz Tabela materiałów) usuń wszelkie pozostałe błony. Zlokalizuj pąki kończyn tylnych. 
	UWAGA: Zawiązki kończyn to zaokrąglone struktury położone wzdłuż osi przednio-tylnej zarodka jako wypukłości od boku. Kończyny tylne są położone bardziej z tyłu niż kończyny przednie.</li>
	<li>Utrzymuj zarodki w czystości 1x PBS i za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych odetnij każdy pączek kończyny tylnej wzdłużnie. Przetnij pączek bardzo blisko boku zarodka, aby wyciąć całe pąki kończyn tylnych. Powtórz ten krok z pozostałymi zarodkami.</li>
	<li>Użyj plastikowej pipety do przenoszenia, aby przenieść pąki kończyn do pustej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Użyj końcówki pipety, aby usunąć nadmiar 1x PBS i zastąp PBS 500 μl 0,5% roztworu trypsyny (patrz Tabela materiałów). Inkubować pąki kończyn w termobloku przez 7 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usunąć roztwór trypsyny i zastąpić go 500 μl kolagenazy typu IV w stężeniu 2 mg/ml w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (patrz tabela materiałów), a następnie inkubować go w termobloku w temperaturze 37 °C przez 8 min. 
	UWAGA: Inkubacja trypsyny nieznacznie odrywa ektodermy, podczas gdy kolagenaza dezagreguje komórki mezodermalne.</li>
	<li>Po inkubacji usuń jak najwięcej kolagenazy i zastąp ją 1 ml zimnej pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM-HG) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w celu dezaktywacji enzymów. Delikatnie odpipetować mieszaninę ~10 razy.</li>
	<li>Przefiltrować zawiesinę zawierającą komórki za pomocą sitka do komórek o wielkości 70 μm, aby pozostawić ektodermy. 
	UWAGA: Filtracja usunie również wszelkie niestrawione pąki kończyn, pozostawiając zawiesinę pojedynczych komórek.</li>
	<li>Po przefiltrowaniu ponownie odpipetować zawiesinę 5-10 razy i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Użyj 1 ml DMEM-HG uzupełnionego 10% FBS, aby zmyć nadmiar kolagenazy. Odwirować zawiesinę o sile 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie odrzucić pożywkę przez pipetowanie, a następnie zastąpić ją 1 ml świeżego DMEM-HG uzupełnionego 10% FBS, nie naruszając komórek na dnie probówki.</li>
	<li>Pozostawić komórki do uformowania zwartego osadu (reagregacji) po inkubacji przez 1-1,5 godziny w temperaturze 37 °C w termobloku. 
	UWAGA: Podczas gdy komórki mezodermalne tworzą osad, wygodnie jest uzyskać ektodermę kończyny.</li>
</ol>
3. Uzyskanie ektodermy kończyn
<ol>
	<li>Powtórzyć kroki 1-6 z sekcji 2 oddzielnie z pozostałymi 22 zarodkami kurcząt HH wybranymi do uzyskania ektoderm. 
	UWAGA: Liczba zarodków do tego celu jest proporcjonalna do ostatecznej liczby pożądanego RL. Odpowiedni jest stosunek ektoderm-RL 2:1.</li>
	<li>Po uzyskaniu pąków kończyn tylnych użyj plastikowej pipety, aby przenieść je do pustej probówki do mikrowirówki. Usuń nadmiar 1x PBS i zastąp go 500 μL 0,5% trypsyny w sterylnym 1x PBS. Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 37 °C w termobloku.</li>
	<li>Po trawieniu enzymatycznym przenieś roztwór trypsyny zawierający pąki kończyn na sterylną szalkę Petriego.</li>
	<li>Usuń nadmiar trypsyny tak bardzo, jak to możliwe, za pomocą mikropipety; zalej szalkę Petriego lodowatym 1x PBS uzupełnionym 10% FBS, aż wszystkie pąki kończyn zostaną pokryte. 
	UWAGA: FBS można zastąpić surowicą końską.</li>
	<li>Zidentyfikuj zawiązki kończyn pod mikroskopem stereoskopowym; zidentyfikuj ektodermę jako lekko oderwaną przezroczystą błonę od komórek mezodermalnych kończyn (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Przytrzymaj najbardziej proksymalny koniec zawiązka kończyny za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych, jednocześnie ostrożnie odłączając i oddzielając warstwę ektodermy za pomocą innych kleszczy. 
	UWAGA: Uzyskanie ektodermy może być trudne ze względu na zlepianie się komórek mezodermalnych i przyczepianie się do ektoderm, powodując w ten sposób ich lepkość. Zaleca się ciągłe odrzucanie komórek mezodermalnych, aby utrzymać tylko ektodermę na szalce Petriego.</li>
	<li>Utrzymuj ektodermę w lodowatym roztworze 1x PBS-10% FBS. 
	UWAGA: Ektodermy mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C w przypadku, gdy zreagregowana mezoderma nie jest gotowa. Zaleca się jednak skoordynowanie czasu inkubacji osadu z uzyskaniem ektodermalnym.</li>
</ol>
4. Składanie komórek mezodermalnych wewnątrz pokrywy ektodermalnej
UWAGA: W tym celu konieczne jest umieszczenie pustych ektoderm na szalce Petriego z sterylnym roztworem 1x PBS-10% FBS zawierającym uformowaną osadę komórek mezodermalnych.
<ol>
	<li>Po uformowaniu się osadu (patrz punkt 2) wyrzucić ~600 μl pożywki z probówki przez pipetowanie.</li>
	<li>Ostrożnie oderwij granulkę od dna za pomocą końcówki pipety i nie rozbijając jej ani nie niszcząc.</li>
	<li>Gdy osad zostanie całkowicie odłączony od dna probówki, odwróć probówkę do góry nogami, aby przenieść osad na szalkę Petriego zawierającą puste ektodermy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Wytnij mały kawałek granulki za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych i umieść go jak najbliżej ektodermy.</li>
	<li>Jakby to była torba, otwórz ektodermę kleszczami chirurgicznymi i umieść kawałek granulki tak ciasno, jak to możliwe, w osłonie ektodermalnej. Powtórz ten krok dla tylu RL, ile jest potrzebne (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D). 
	UWAGA: Pokrój kawałki granulatu jeden po drugim i napełnij ektodermy, aby utrzymać w czystości 1x PBS-10% roztwór FBS. Wielkość granulki musi odpowiadać każdej ektodermie.</li>
	<li>Pozwól ektodermie i mezodermie zagoić się razem przez ~ 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przeszczep je do zarodka gospodarza. Wyrzuć niewykorzystaną ektodermę i mezodermę.</li>
</ol>
5. Przeszczepienie wypełnionej ektodermy do zarodka gospodarza 
 
UWAGA: Przed przeszczepieniem ektoderm ustaw dwa mikroskopy stereoskopowe obok siebie na blacie, jeden do manipulacji zarodkami i szczepienia RL. Drugi służy do utrzymywania wypełnionych ektoderm w gotowości do przeniesienia do zarodka.
<ol>
	<li>Wybierz liczbę żądanych komórek jajowych, aby przeszczepić wypełnione ektodermy.</li>
	<li>Używając końca kleszczy, dotknij skorupki jaja 22 zarodków gospodarza HH, aby otworzyć okno. Zidentyfikuj błonę powietrzną i za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych usuń ją całkowicie.</li>
	<li>Otwórz worek owodniowy w pobliżu kończyny przedniej, aby odsłonić prawy bok zarodka. Otwórz tylko tyle ilości, ile jest potrzebne do wykonania procedury.</li>
	<li>Kierując się ułożeniem kończyn przednich, wykonaj drapanie rany igłą wolframową (patrz Tabela Materiałów) do długości 2-3 somitów, lekko uszkadzając mezodermę, aż do krwawienia.</li>
	<li>Indywidualnie przenieś wypełnioną ektodermę (RL) do zarodka pisklęcia i umieść podstawę rekombinowanej kończyny na ranie somitowej. 
	UWAGA: Przenoszenie RL można wykonać za pomocą plastikowej pipety lub kątowego noża do cięcia wzdłużnego.</li>
	<li>Prawidłowo zamocuj RL za pomocą dwóch kawałków drutu palladowego o średnicy 0.025 mm i długości 0.5-1 mm (patrz Tabela materiałów). Dopasuj podstawę RL do rany, aby upewnić się, że zostanie ona przymocowana do boku zarodka gospodarza i unaczyniona (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Uszczelnij okno taśmą i włóż jajo z powrotem do inkubatora. Zbierz zarodki w żądanych punktach czasowych do analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+pelvis+originates+from+lateral+plate+mesoderm+and+its+development+requires+signals+from+both+ectoderm+and+paraxial+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm.</a> Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).</li>
<li>Mahmood, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+FGF-8+in+the+initiation+and+maintenance+of+vertebrate+limb+bud+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A role for FGF-8 in the initiation and maintenance of vertebrate limb bud outgrowth.</a> Current Biology. 5 (7), 797-806 (1995).</li>
<li>Yu, K., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+regulates+mesenchymal+differentiation+and+skeletal+patterning+along+the+limb+bud+proximodistal+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF signaling regulates mesenchymal differentiation and skeletal patterning along the limb bud proximodistal axis.</a> Development. 135 (3), 483-491 (2008).</li>
<li>Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75 (5), 1401-1416 (1993).</li>
<li>McQueen, C., Towers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+the+pattern+of+the+vertebrate+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Establishing the pattern of the vertebrate limb.</a> Development. 147 (17), (2020).</li>
<li>Zwilling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+fragmented+and+of+dissociated+limb+bud+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Development of fragmented and of dissociated limb bud mesoderm.</a> Developmental biology. 9 (1), 20-37 (1964).</li>
<li>Frederick, J. M., Fallon, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proportion+and+distribution+of+polarizing+zone+cells+causing+morphogenetic+inhibition+when+coaggregated+with+anterior+half+wing+mesoderm+in+recombinant+limbs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The proportion and distribution of polarizing zone cells causing morphogenetic inhibition when coaggregated with anterior half wing mesoderm in recombinant limbs.</a> Development. 67 (1), 13-25 (1982).</li>
<li>Ros, M. A., Lyons, G. E., Mackem, S., Fallon, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+limbs+as+a+model+to+study+homeobox+gene+regulation+during+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Recombinant limbs as a model to study homeobox gene regulation during limb development.</a> Developmental Biology. 166 (1), 59-72 (1994).</li>
<li>Piedra, M. E., Rivero, F. B., Fernandez-Teran, M., Ros, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+and+regulation+of+gene+expressions+in+chick+recombinant+limbs%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Pattern formation and regulation of gene expressions in chick recombinant limbs.</a> Mechanisms of Development. 90 (2), 167-179 (2000).</li>
<li>Crosby, G. M., Fallon, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+on+limb+morphogenesis+by+cells+of+the+polarizing+zone+coaggregated+with+pre-or+postaxial+wing+bud+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect on limb morphogenesis by cells of the polarizing zone coaggregated with pre-or postaxial wing bud mesoderm.</a> Developmental Biology. 46 (1), 28-39 (1975).</li>
<li>Fallon, J. F., Simandl, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+chick+limb+bud+mesoderm+and+reptile+ectoderm+result+in+limb+outgrowth+in+the+limbless+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Interactions between chick limb bud mesoderm and reptile ectoderm result in limb outgrowth in the limbless mutant.</a> Anatomical Record. 208, Wiley-Liss Div John Wiley & Sons Inc. 605 Third Ave, New York, Ny. 53-54 (1984).</li>
<li>Kuhlman, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limb+deformity+proteins%3A+role+in+mesodermal+induction+of+the+apical+ectodermal+ridge%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Limb deformity proteins: role in mesodermal induction of the apical ectodermal ridge.</a> Development. 124 (1), 133-139 (1997).</li>
<li>Goetinck, P. F., Abbott, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+limb+morphogenesis.+I.+Experiments+with+the+polydactylous+mutant%2C+talpid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Studies on limb morphogenesis. I. Experiments with the polydactylous mutant, talpid.</a> Journal of Experimental Zoology. 155, 161-170 (1964).</li>
<li>Carrington, J. L., Fallon, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+limb+budding+is+independent+of+apical+ectodermal+ridge+activity%3B+evidence+from+a+limbless+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Initial limb budding is independent of apical ectodermal ridge activity; evidence from a limbless mutant.</a> Development. 104 (3), 361-367 (1988).</li>
<li>Fernandez-Teran, M., Piedra, M. E., Ros, M. A., Fallon, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recombinant+limb+as+a+model+for+the+study+of+limb+patterning%2C+and+its+application+to+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">The recombinant limb as a model for the study of limb patterning, and its application to muscle development.</a> Cell and Tissue Research. 296 (1), 121-129 (1999).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Ganan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TGF+beta+s+and+BMPs+as+signals+controlling+the+position+of+the+digits+and+the+areas+of+interdigital+cell+death+in+the+developing+chick+limb+autopod%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod.</a> Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).</li>
<li>Ros, M. A., Simandl, B. K., Clark, A. W., Fallon, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+manipulating+the+chick+limb+bud+to+study+gene+expression%2C+tissue+interactions%2C+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology+Protocols%22%5BJournal%5D)">Methods for manipulating the chick limb bud to study gene expression, tissue interactions, and patterning.</a> Developmental Biology Protocols. 137, 245-266 (2000).</li>
<li>MacCabe, J. A., Saunders, J. W., Pickett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+the+anteroposterior+and+dorsoventral+axes+in+embryonic+chick+limbs+constructed+of+dissociated+and+reaggregated+limb-bud+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The control of the anteroposterior and dorsoventral axes in embryonic chick limbs constructed of dissociated and reaggregated limb-bud mesoderm.</a> Developmental Biology. 31 (2), 323-335 (1973).</li>
<li>Zwilling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+contact+between+mutant+%28wingless%29+limb+buds+and+those+of+genetically+normal+chick+embryos%3A+confirmation+of+a+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of contact between mutant (wingless) limb buds and those of genetically normal chick embryos: confirmation of a hypothesis.</a> Developmental Biology. 39 (1), 37-48 (1974).</li>
<li>Prahlad, K. V., Skala, G., Jones, D. G., Briles, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbless%3A+A+new+genetic+mutant+in+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Limbless: A new genetic mutant in the chick.</a> Journal of Experimental Zoology. 209 (3), 427-434 (1979).</li>
<li>Marin Llera, J. C., Lorda-Diez, C. I., Hurle, J., Chimal-Monroy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCA-1%2FLy6A+mesodermal+skeletal+progenitor+subpopulations+reveal+differential+commitment+of+early+limb+bud+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">SCA-1/Ly6A mesodermal skeletal progenitor subpopulations reveal differential commitment of early limb bud cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 656999(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ogólnie rzecz biorąc, protokół RL można podzielić na pięć etapów: (1) inkubacja zarodków, (2) uzyskanie komórek mezodermalnych kończyn w celu wypełnienia ektoderm, (3) uzyskanie ektoderm, (4) montaż komórek mezodermalnych wewnątrz pokryw ektodermalnych oraz (5) przeszczepienie wypełnionych ektoderm do zarodków gospodarza. Głównym ograniczeniem techniki RL jest długi, szczegółowy protokół, który ma wiele krytycznych punktów, które wymagają cierpliwości, aby wykonać je prawidłowo. Aby pomyślnie ukończyć protokół, należy zi...

Kończyna kręgowca jest potężnym modelem do badania różnicowania komórek, proliferacji komórek, śmierci komórek, tworzenia wzorców i morfogenezy1,2. Podczas rozwoju kończyny wyłaniają się jako wybrzuszenia z komórek pochodzących z płytki bocznej mezoderm1. Zawiązki kończyn składają się z centralnego rdzenia komórek mezodermalnych pokrytych ektodermą. Z tej wczesnej struktury wyłania się cała i dobrze uformowana kończyna. Po powstaniu zawiązka kończyny rozpoznawane są trzy osie: (1) oś bliższej-dystalna ([PD] ramię do palców), (2) oś grzbietowo-brzuszna ([DV] od grzbietu dłoni do dłoni) i (3) przednio-tylna ([AP] kciuk do palca). Oś proksymalno-dystalna zależy od wierzchołkowego grzbietu ektodermalnego (AER), wyspecjalizowanej ektodermy znajdującej się na dystalnym końcu zawiązka kończyny. AER jest wymagany do wzrostu, utrzymania przetrwania, proliferacji i niezróżnicowanego stanu komórek odbierających sygnały2,3. Z drugiej strony, strefa aktywności polaryzacyjnej (ZPA) kontroluje wzorzec przednio-tylny4, podczas gdy grzbiet i ektoderma kontrolują wzorzec grzbietowo-brzuszny7,8. Integracja trójwymiarowych wzorców implikuje złożone przesłuchy między tymi trzema osiami5. Pomimo zrozumienia szlaku molekularnego podczas rozwoju kończyny, otwarte pytania dotyczące mechanizmów, które kontrolują wzorzec i prawidłowy wzrost w celu utworzenia całej kończyny, pozostają bez odpowiedzi.
Edgar Zwilling opracował system rekombinacji kończyn (RL) w 1964 roku, aby badać interakcje między komórkami mezenchymalnymi kończyn kończyn a ektodermą w rozwijających się kończynach6. System RL składa zdysocjowano-reagregowaną mezodermę zawiązka kończyny do ektodermy kończyny embrionalnej, aby wszczepić ją do grzbietowej części zarodka pisklęcia dawcy. Sygnały dostarczane przez ektodermę indukują ekspresję genów różnicujących i genów wzorcujących w sposób przestrzenno-czasowy, indukując w ten sposób tworzenie struktury przypominającej kończynę, która może podsumować programy komórkowe zachodzące podczas rozwoju kończyny7,8,9.
Model RL jest cenny dla zrozumienia właściwości komponentów kończyn i interakcji między komórkami mezodermalnymi i ektodermalnymi6. RL można zdefiniować jako strukturę podobną do kończyny utworzoną przez eksperymentalnie składane lub rekombinowane komórki mezodermalne pąków kończyn wewnątrz ektodermalnej pokrywy6. Morfogeneza RL zależy od charakterystyki komórek mezodermalnych (lub innych typów), które będą reagować na sygnały wzorca ektodermalnego. Jedną z zalet tego eksperymentalnego systemu jest jego wszechstronność. Ta cecha pozwala na tworzenie wielu kombinacji poprzez różnicowanie źródła komórek mezodermalnych, takich jak komórki z różnych etapów rozwoju, z różnych pozycji wzdłuż kończyny lub całe (niezdysocjowane) lub ponownie zagregowane komórki7,8,9,10. Innym przykładem jest możliwość uzyskania ektodermy embrionalnej od gatunków innych niż kurczak, na przykład turtle11, quail lub mouse12.
W tym sensie, technika RL pomaga badać rozwój kończyn i interakcje między komórkami mezenchymalnymi i ektodermalnymi kończyn z ewolucyjnego punktu widzenia. Technika ta ma również ogromny potencjał do analizy zdolności różnych źródeł komórek progenitorowych do różnicowania się w strukturę przypominającą kończynę, wykorzystując sygnały dostarczane przez embrionalną ektodermę12,13,14. W przeciwieństwie do hodowli in vitro, RL pozwala na ocenę różnicowania i potencjału morfogenetycznego populacji komórek poprzez interpretację sygnałów embrionalnych z rozwijającej się kończyny9,15.
W tym protokole znajduje się przewodnik krok po kroku, jak przeprowadzić udany RL z ponownie zagregowanymi komórkami mezodermalnych pąków kończyn, otwierając w ten sposób możliwość adaptacji tego protokołu z różnymi źródłami reagregowanych komórek lub nawet różnymi źródłami ektodermy.

<table><tbody><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A5268</td><td></td></tr><tr><td>Nóż kątowy</td><td>do cięcia Alcon</td><td>2,75 mm DB</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typ IV</td><td>Gibco</td><td>1704-019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator jaj</td><td>Incumatic de Mexico</td><td>Incumatic 1000</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>16000069</td><td></td></tr><tr><td>Drobne kleszcze chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>9115-10</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Zrównoważony roztwór soli</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta</td><td>NA</td><td>NA Drut</td><td></td></tr><tr><td>palladowy</td><td>GoodFellow</td><td>7440 05-3</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Gniazdo</td><td>705001</td><td></td></tr><tr><td>Pippette</td><td>crmglobe</td><td>PF1016</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Taśma</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna świnia</td><td>Merck</td><td>9002 07-7</td><td></td></tr><tr><td>Igła wolframowa</td><td>GoodFellow</td><td>E74-15096/01</td><td></td></tr></tbody></table>

test rekombinowanych kończyn kurczaka w celu zrozumienia morfogenezy, wzorca i wczesnych etapów różnicowania komórek

Chicken Recombinant Limbs Assay to Understand Morphogenesis, Patterning, and Early Steps in Cell Differentiation

Różnicowanie komórek to precyzyjnie dostrojony proces angażowania komórek, prowadzący do powstania różnych wyspecjalizowanych typów komórek podczas tworzenia rozwijających się tkanek i organów. Proces ten jest aktywnie podtrzymywany w wieku dorosłym. Różnicowanie komórek to proces ciągły podczas rozwoju i homeostazy narządów. Zrozumienie wczesnych etapów różnicowania komórek jest niezbędne do poznania innych złożonych procesów, takich jak morfogeneza. Tak więc rekombinowane kończyny kurczaka są modelem eksperymentalnym, który umożliwia badanie różnicowania komórek i generowania wzorców pod wpływem embrionalnych sygnałów wzorcowych. Ten eksperymentalny model imituje środowisko in vivo; Składa ponownie zagregowane komórki w ektodermalną osłonę uzyskaną z wczesnego pąka kończyny. Później ektodermy są przenoszone i wszczepiane do receptora zarodka pisklęcia, aby umożliwić jego rozwój. Test ten był używany głównie do oceny mezodermalnych komórek pączków kończyn; Można go jednak zastosować do innych komórek macierzystych lub progenitorowych innych organizmów.

Rozpoznawanie prawidłowo wykonanej rekombinowanej kończyny 
Po przeszczepieniu manipulowane embriony przeniesiono z powrotem do inkubatora, aby umożliwić rozwój RL. Czas inkubacji był dostosowany do wymogów eksperymentu. Niemniej jednak, RL można łatwo rozróżnić po 12 h od implantacji. Aby ustalić, czy implantacja była prawidłowa, obserwowano RL jako wypukłość ściśle przytwierdzoną do ściany mezodermalnej embrionu biorcy (Ryc. 2A). W przeciwnym razie, w przypadku utraty ż...

Rekombinowane kończyny to potężny model eksperymentalny, który pozwala badać proces różnicowania komórek i generowania wzorców pod wpływem sygnałów embrionalnych. Protokół ten przedstawia szczegółową metodę generowania rekombinowanych kończyn z komórkami mezodermalnymi kończyn kurczaka, które można dostosować do innych typów komórek uzyskanych z różnych organizmów.

Test rekombinowanych kończyn kurczaka w celu zrozumienia morfogenezy, wzorca i wczesnych etapów różnicowania komórek

Cell differentiation is the fine-tuned process of cell commitment leading to the formation of different specialized cell types during the establishment of ...

Rekombinowane kończyny są potężnym modelem do badań nad procesem różnicowania się komórek i tworzenia mocy pod wpływem sygnałów embrionalnych w środowisku in vivo. Test ten pozwala na wiele wariantów, co pozwala na potencjalne zastosowania bez ograniczania się do biologii rozwoju kończyn kurczaka. Może być stosowany do innych łodyg lub przodków z innych organizmów.Na początek wyjmij jaja z inkubatora po trzech i pół dniach, przetrzyj 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Następnie zidentyfikuj i zlokalizuj rozwijające się zarodki, prześwietlając komórkę jajową i obserwując naczynia krwionośne. Wyrzuć jaja, które nie mają zarodka.Postukaj w koniec skorupki jajka końcem pary kleszczy, aby otworzyć okno i usuń około jednego centymetra kwadratowego skorupki za pomocą kleszczy. Następnie przenieś jajka do plastikowego lub kartonowego uchwytu. Umieść jajka jedno po drugim pod mikroskopem stereoskopowym.Zidentyfikuj membranę powietrzną i usuń ją, wybierając mały otwór w obszarze, w którym nie ma żadnych naczyń. Wyciągnij ten obszar za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych i usuń kawałki skorupki jaja w kontakcie z zarodkiem. Rozerwij worek owodniowy cienkimi kleszczami chirurgicznymi.Ostrożnie wyjmij zarodek z komórki jajowej kleszczami i przenieś go na sterylną szalkę Petriego zawierającą lodowaty 1x PBS. Umyj zarodki raz w lodowatym 1x PBS i usuń pozostałe błony pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie zlokalizuj pąki kończyn tylnych.Odetnij każdy pączek kończyny tylnej wzdłużnie, przecinając bardzo blisko boku zarodka za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych. Utrzymanie zarodków w 1x PBS. Następnie przenieś pąki kończyn do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia.Następnie zastąp PBS 500 mikrolitrami 0,5% roztworu trypsyny. Inkubuj pąki kończyn w termobloku przez siedem minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie zastąp roztwór trypsyny 500 mikrolitrami po dwa miligramy na mililitr kolagenazy typu czwartego w HBSS i inkubuj go w termobloku przez kolejne osiem minut.Usuń jak najwięcej kolagenazy i zastąp ją jednym mililitrem zimnego DMEM o wysokiej zawartości glukozy z 10% FBS, aby dezaktywować enzymy. Delikatnie odpipetować mieszaninę około 10 razy. Przefiltrować zawiesinę zawierającą komórki za pomocą sitka o średnicy 70 mikrometrów, aby pozostawić ektodermy.Ponownie odpipetować zawiesinę około 5 do 10 razy i odwirować z prędkością 200 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odrzucić supernatant. Nadmiar kolagenazy przemyć jednym mililitrem pożywki, następnie odwirować zawiesinę i ostrożnie wyrzucić pożywkę.Następnie dodaj 1,5 mililitra pożywki bez naruszania komórek i inkubuj je przez jedną do 1,5 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termobloku, pozwalając komórkom uformować zwartą osadkę. Po uzyskaniu pąków kończyn tylnych przenieś je do pustej probówki do mikrowirówki za pomocą plastikowej pipety. Usuń nadmiar 1x PBS i zastąp go 500 mikrolitrami 0,5% trypsyny w sterylnym 1x PBS.Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termobloku. Przenieś roztwór trypsyny wraz z pąkami kończyn na sterylną szalkę Petriego. Następnie usuń jak najwięcej nadmiaru trypsyny i zalej szalkę Petriego lodowatym 1x PBS z 10% FBS, aż wszystkie pąki kończyn zostaną pokryte.Zidentyfikuj pąki kończyn pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie zidentyfikuj ektodermę jako lekko oderwaną przezroczystą błonę od komórek mezodermalnych kończyn. Odłącz i oddziel ektodermę za pomocą kleszczy, przytrzymując najbardziej proksymalny koniec zawiązka kończyny za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych.Weź osad mezodermalny z poprzednich kroków i wyrzuć około 600 mikrolitrów pożywki. Następnie ostrożnie odłącz granulkę końcówką pipety, nie rozbijając jej. Odwróć probówkę do góry nogami, aby przenieść osad na szalkę Petriego zawierającą puste ektodermy.Wytnij mały kawałek granulki za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych i umieść go jak najbliżej ektodermy. Otwórz ektodermę kleszczami chirurgicznymi i umieść osad tak ciasno, jak to możliwe, w hali ektodermalnej. Otwórz worek owodniowy w pobliżu kończyny przedniej, aby odsłonić prawy bok zarodka.Kierując się pozycją kończyn przednich, wykonaj drapanie rany igłą wolframową na długość dwóch do trzech somitów, lekko uszkadzając mezodermę, aż do krwawienia. Pojedynczo przenieś rekombinowane kończyny do zarodka pisklęcia, umieszczając jego podstawę na ranie somitowej. Prawidłowo zamocuj rekombinowaną kończynę za pomocą dwóch kawałków drutu palladowego.Wyrównaj podstawę rekombinowanej kończyny z raną. Uszczelnij okno taśmą i włóż jajo z powrotem do inkubatora. W przypadku udanej implantacji rekombinowaną kończynę obserwowano jako wypukłość, która była bezpiecznie przymocowana do ściany mezodermalnej zarodka dawcy.Wręcz przeciwnie, rekombinowana kończyna była odłączana od ściany mezodermalnej lub prezentowała przybliżoną morfologię, gdy żywotność komórki lub przeszczep zawiodły. Barwienie błękitem alcyjskim wykazało elementy szkieletowe w sześciodniowym kurczaku, rekombinowanej kończynie kurczaka. Przed usunięciem błękitu alcian uzyskano obrazy w etanolu do pomiarów morfologicznych i ilościowych.Kończyny barwione lub niebarwione metodą H&E były krojone w celu obserwacji tkanek i komórek. Technika ta może prowadzić do tworzenia organoidów kończyn in vivo i badania różnicowania komórek lub procesu morfogenetycznego przy użyciu komórek macierzystych z różnych źródeł lub gatunków.

chicken-recombinant-limbs-assay-to-understand-morphogenesis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano dwukolorową hybrydyzację in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization), metodę umożliwiającą wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji dwóch różnych genów w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Davida Wilkinsona, Domingosa Henrique, Phila Inghama i Davida Ish-Horowicza.

Podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

Indukcja neuralna jest pierwszym etapem formowania się mózgu. Jest to mechanizm, dzięki któremu węzeł Hensen’a (organizator) instruuje sąsiednie tkanki do przyjęcia losu neuralnego, tzn. do przekształcenia się w układ nerwowy. Niniejszy film prezentuje test indukcji neuralnej w embrionie kurczaka.

Analiza indukcji neuralnej w embrionie kurczaka

W niniejszym artykule opisano technikę transplantacji tkanek, która została opracowana w celu zbadania właściwości sygnalizacyjnych i wzorowania powierzchniowego ektodermy głownej podczas rozwoju kraniofacjalnego.

Ocena właściwości sygnalizacyjnych nabłonków ektodermalnych podczas rozwoju kraniofacjalnego

Niniejszy artykuł opisuje znakowanie powierzchniowe oraz hodowlę tkanek ex ovo we wczesnym embrionie kurczaka. Przedstawiono techniki umożliwiające obrazowanie w jasnym polu, fluorescencyjne oraz z wykorzystaniem tomografii optycznej koherencyjnej w trybie time-lapse. Śledzenie znaczników powierzchniowych z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną pozwala na obliczenie wielkości kinematycznych, takich jak odkształcenia morfogenetyczne, zarówno w dwóch, jak i w trzech wymiarach.

Śledzenie deformacji tkankowych w procesach morfogenetycznych we wczesnym zarodku kurczaka

Poprzez szczepienie koralików nasączonych czynnikami wzrostu lub specyficznymi inhibitorami szlaków sygnałowych do rozwijających się zarodków, możliwe jest bezpośrednie testowanie ich efektów in vivo. W tym protokole kulki są szczepione w zawiązku kończyny w celu określenia wpływu tych cząsteczek na ekspresję genów i transdukcję sygnału.

Szczepienie kulek w rozwijających się kończynach zarodka kurczaka w celu identyfikacji szlaków transdukcji sygnału wpływających na ekspresję genów

Opisane są protokoły wykorzystujące nieprzepuszczalne bariery do blokowania zdarzeń indukcyjnych między tkankami głównej osi ciała a bokiem zarodka pisklęcia, wymagane do tworzenia kończyn. Koraliki nasączone potencjalnymi sygnałami indukcyjnymi są wykorzystywane do przezwyciężenia efektu umieszczania bariery, a analiza ekspresji genów to potwierdza.

Zastosowanie nieprzepuszczalnych barier w połączeniu z kulkami nasączonymi czynnikiem kandydującym do badania sygnałów indukcyjnych w pisklątku

Test nasiąkniętych kulek polega na ukierunkowanym dostarczeniu odczynnika testowego w dowolnym momencie rozwoju w celu zbadania regulacji różnicowania i morfogenezy komórek. Przedstawiono szczegółowy protokół, mający zastosowanie do każdego doświadczalnego modelu zwierzęcego, dotyczący przygotowania trzech różnych rodzajów namoczonych koralików i wszczepienia ich w komórkę międzypalcową zarodka kurczaka.

Analiza różnicowania komórek, morfogenezy i wzorcowania podczas embriogenezy kurczaka przy użyciu testu z namoczonymi kulkami

Tutaj opisujemy protokoły dla trzech typów hodowli eksplantatów skóry embrionalnej ptaków, które mogą być użyte do badania interakcji tkankowych, obrazowania 4D filmu poklatkowego (3D plus czas), globalnych lub lokalnych zaburzeń funkcji molekularnych oraz charakterystyki biologii systemów.

Wykorzystanie eksplantatów ze skóry ptaków do badania wzorców tkanek i organogenezy

W tym badaniu opisujemy prostą metodę przeprowadzania analizy Evans Blue Dye (EBD) na larwach danio pręgowanego.  Technika ta jest potężnym narzędziem do charakteryzowania integralności mięśni szkieletowych i wyznaczania modeli dystrofii mięśniowej danio pręgowanego, a także jest cenną metodą opracowywania nowych metod terapeutycznych.

Analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Poznaj metodę tworzenia rekombinowanych kończyn kurczaka w celu badania różnicowania komórek i morfogenezy. Protokół ten pozwala analizować wpływ sygnałów embriogenicznych na formowanie wzorca in vivo.

Test rekombinowanych kończyn kurczaka w celu zrozumienia morfogenezy, wzorca i wczesnych etapów różnicowania komórek

Przeglądaj więcej filmów