Test rekombinowanych kończyn kurczaka w celu zrozumienia morfogenezy, wzorca i wczesnych etapów różnicowania komórek

Rekombinowane kończyny są potężnym modelem do badań nad procesem różnicowania się komórek i tworzenia mocy pod wpływem sygnałów embrionalnych w środowisku in vivo. Test ten pozwala na wiele wariantów, co pozwala na potencjalne zastosowania bez ograniczania się do biologii rozwoju kończyn kurczaka. Może być stosowany do innych łodyg lub przodków z innych organizmów.

Na początek wyjmij jaja z inkubatora po trzech i pół dniach, przetrzyj 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Następnie zidentyfikuj i zlokalizuj rozwijające się zarodki, prześwietlając komórkę jajową i obserwując naczynia krwionośne. Wyrzuć jaja, które nie mają zarodka.

Postukaj w koniec skorupki jajka końcem pary kleszczy, aby otworzyć okno i usuń około jednego centymetra kwadratowego skorupki za pomocą kleszczy. Następnie przenieś jajka do plastikowego lub kartonowego uchwytu. Umieść jajka jedno po drugim pod mikroskopem stereoskopowym.

Zidentyfikuj membranę powietrzną i usuń ją, wybierając mały otwór w obszarze, w którym nie ma żadnych naczyń. Wyciągnij ten obszar za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych i usuń kawałki skorupki jaja w kontakcie z zarodkiem. Rozerwij worek owodniowy cienkimi kleszczami chirurgicznymi.

Ostrożnie wyjmij zarodek z komórki jajowej kleszczami i przenieś go na sterylną szalkę Petriego zawierającą lodowaty 1x PBS. Umyj zarodki raz w lodowatym 1x PBS i usuń pozostałe błony pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie zlokalizuj pąki kończyn tylnych.

Odetnij każdy pączek kończyny tylnej wzdłużnie, przecinając bardzo blisko boku zarodka za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych. Utrzymanie zarodków w 1x PBS. Następnie przenieś pąki kończyn do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia.

Następnie zastąp PBS 500 mikrolitrami 0,5% roztworu trypsyny. Inkubuj pąki kończyn w termobloku przez siedem minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie zastąp roztwór trypsyny 500 mikrolitrami po dwa miligramy na mililitr kolagenazy typu czwartego w HBSS i inkubuj go w termobloku przez kolejne osiem minut.

Usuń jak najwięcej kolagenazy i zastąp ją jednym mililitrem zimnego DMEM o wysokiej zawartości glukozy z 10% FBS, aby dezaktywować enzymy. Delikatnie odpipetować mieszaninę około 10 razy. Przefiltrować zawiesinę zawierającą komórki za pomocą sitka o średnicy 70 mikrometrów, aby pozostawić ektodermy.

Ponownie odpipetować zawiesinę około 5 do 10 razy i odwirować z prędkością 200 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odrzucić supernatant. Nadmiar kolagenazy przemyć jednym mililitrem pożywki, następnie odwirować zawiesinę i ostrożnie wyrzucić pożywkę.

Następnie dodaj 1,5 mililitra pożywki bez naruszania komórek i inkubuj je przez jedną do 1,5 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termobloku, pozwalając komórkom uformować zwartą osadkę. Po uzyskaniu pąków kończyn tylnych przenieś je do pustej probówki do mikrowirówki za pomocą plastikowej pipety. Usuń nadmiar 1x PBS i zastąp go 500 mikrolitrami 0,5% trypsyny w sterylnym 1x PBS.

Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termobloku. Przenieś roztwór trypsyny wraz z pąkami kończyn na sterylną szalkę Petriego. Następnie usuń jak najwięcej nadmiaru trypsyny i zalej szalkę Petriego lodowatym 1x PBS z 10% FBS, aż wszystkie pąki kończyn zostaną pokryte.

Zidentyfikuj pąki kończyn pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie zidentyfikuj ektodermę jako lekko oderwaną przezroczystą błonę od komórek mezodermalnych kończyn. Odłącz i oddziel ektodermę za pomocą kleszczy, przytrzymując najbardziej proksymalny koniec zawiązka kończyny za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych.

Weź osad mezodermalny z poprzednich kroków i wyrzuć około 600 mikrolitrów pożywki. Następnie ostrożnie odłącz granulkę końcówką pipety, nie rozbijając jej. Odwróć probówkę do góry nogami, aby przenieść osad na szalkę Petriego zawierającą puste ektodermy.

Wytnij mały kawałek granulki za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych i umieść go jak najbliżej ektodermy. Otwórz ektodermę kleszczami chirurgicznymi i umieść osad tak ciasno, jak to możliwe, w hali ektodermalnej. Otwórz worek owodniowy w pobliżu kończyny przedniej, aby odsłonić prawy bok zarodka.

Kierując się pozycją kończyn przednich, wykonaj drapanie rany igłą wolframową na długość dwóch do trzech somitów, lekko uszkadzając mezodermę, aż do krwawienia. Pojedynczo przenieś rekombinowane kończyny do zarodka pisklęcia, umieszczając jego podstawę na ranie somitowej. Prawidłowo zamocuj rekombinowaną kończynę za pomocą dwóch kawałków drutu palladowego.

Wyrównaj podstawę rekombinowanej kończyny z raną. Uszczelnij okno taśmą i włóż jajo z powrotem do inkubatora. W przypadku udanej implantacji rekombinowaną kończynę obserwowano jako wypukłość, która była bezpiecznie przymocowana do ściany mezodermalnej zarodka dawcy.

Wręcz przeciwnie, rekombinowana kończyna była odłączana od ściany mezodermalnej lub prezentowała przybliżoną morfologię, gdy żywotność komórki lub przeszczep zawiodły. Barwienie błękitem alcyjskim wykazało elementy szkieletowe w sześciodniowym kurczaku, rekombinowanej kończynie kurczaka. Przed usunięciem błękitu alcian uzyskano obrazy w etanolu do pomiarów morfologicznych i ilościowych.

Kończyny barwione lub niebarwione metodą H&E były krojone w celu obserwacji tkanek i komórek. Technika ta może prowadzić do tworzenia organoidów kończyn in vivo i badania różnicowania komórek lub procesu morfogenetycznego przy użyciu komórek macierzystych z różnych źródeł lub gatunków.