Name: Wykorzystanie optogenetyki do odwrócenia neuroplastyczności i zahamowania poszukiwania kokainy u szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj metodę odwracania plastyczności neuronalnej indukowanej kokainą w obwodach talamo-amigdalowych szczurów za pomocą optogenetyki. Technika ta umożliwia precyzyjną manipulację aktywnością synaptyczną w przebudzonych zwierzętach, skutkując długotrwałym zahamowaniem poszukiwania narkotyku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony grantów USPHS K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) oraz Departamentu Zdrowia Pensylwanii.

<ol><li>Connors, N. J., Hoffman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+treatments+for+cocaine+toxicity%3A+A+difficult+transition+to+the+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).</li>
<li>Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+repetitive+transcranial+magnetic+stimulation+%28rTMS%29+in+treatment+of+addiction+and+related+disorders%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Abuse+Reviews%22%5BJournal%5D)">Role of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) in treatment of addiction and related disorders: A systematic review.</a> Current Drug Abuse Reviews. 10 (1), 31-43 (2017).</li>
<li>Shaham, Y., Shalev, U., Lu, L., De Wit, H., Stewart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reinstatement+model+of+drug+relapse%3A+History%2C+methodology+and+major+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">The reinstatement model of drug relapse: History, methodology and major findings.</a> Psychopharmacology. 168 (1-2), 3-20 (2003).</li>
<li>Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+at+Thalamo-amygdala+Synapses+Regulates+Cocaine-Cue+Memory+Formation+and+Extinction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Plasticity at Thalamo-amygdala Synapses Regulates Cocaine-Cue Memory Formation and Extinction.</a> Cell Reports. 26 (4), 1010-1020 (2019).</li>
<li>Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+promotes+neuroplastic+changes+in+the+amygdala+associated+with+weakened+cocaine-cue+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcineurin promotes neuroplastic changes in the amygdala associated with weakened cocaine-cue memories.</a> Journal of Neuroscience. 40 (6), 1344-1354 (2020).</li>
<li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+10+years+of+microbial+opsins+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optogenetics 10 years of microbial opsins in neuroscience.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).</li>
<li>Gradinaru, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141 (1), 154-165 (2010).</li>
<li>Nabavi, S., Fox, R., Proulx, C. D., Lin, J. Y., Tsien, R. Y., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+memory+with+LTD+and+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering a memory with LTD and LTP.</a> Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).</li>
<li>Sparta, D. R., Stamatakis, A. M., Phillips, J. L., Hovelsø, N., Van Zessen, R., Stuber, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2012).</li>
<li>Stripling, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+intravenous+catheter+for+use+with+a+cranial+pedestal+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%2C+Biochemistry+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">A simple intravenous catheter for use with a cranial pedestal in the rat.</a> Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 15 (5), 823-825 (1981).</li>
<li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates+Hard+Cover+Edition%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates Hard Cover Edition</a>. , 466(2013).</li>
<li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals%3A+Application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).</li>
<li>Bender, B. N., Torregrossa, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsolateral+striatum+dopamine-dependent+cocaine+seeking+is+resistant+to+pavlovian+cue+extinction+in+male+and+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Dorsolateral striatum dopamine-dependent cocaine seeking is resistant to pavlovian cue extinction in male and female rats.</a> Neuropharmacology. 182, (2021).</li>
<li>Milton, A. L., Everitt, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+persistence+of+maladaptive+memory%3A+Addiction%2C+drug+memories+and+anti-relapse+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">The persistence of maladaptive memory: Addiction, drug memories and anti-relapse treatments.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (4), 1119-1139 (2012).</li>
<li>Torregrossa, M. M., Taylor, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+to+forget%3A+Manipulating+extinction+and+reconsolidation+processes+to+treat+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Learning to forget: Manipulating extinction and reconsolidation processes to treat addiction.</a> Psychopharmacology. 226 (4), 659-672 (2013).</li>
<li>Kalivas, P. W., Volkow, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neural+Basis+of+Addiciton%3A+A+Pathology+of+Motivation+and+Choice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The Neural Basis of Addiciton: A Pathology of Motivation and Choice.</a> American Journal of Psychiatry. 162 (8), 1403-1413 (2005).</li>
<li>Stefanik, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+inhibition+of+cocaine+seeking+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Addiction+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic inhibition of cocaine seeking in rats.</a> Addiction Biology. 18 (1), 50-53 (2013).</li>
<li>Arguello, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+Lateral+Orbital+Frontal+Cortex-Basolateral+Amygdala+Circuit+in+Cue-Induced+Cocaine-Seeking+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of a Lateral Orbital Frontal Cortex-Basolateral Amygdala Circuit in Cue-Induced Cocaine-Seeking Behavior.</a> Neuropsychopharmacology. 42 (3), 727-735 (2017).</li>
<li>Cruz, A. M., Spencer, H. F., Kim, T. H., Jhou, T. C., Smith, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prelimbic+cortical+projections+to+rostromedial+tegmental+nucleus+play+a+suppressive+role+in+cue-induced+reinstatement+of+cocaine+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Prelimbic cortical projections to rostromedial tegmental nucleus play a suppressive role in cue-induced reinstatement of cocaine seeking.</a> Neuropsychopharmacology. 46 (8), 1399-1406 (2021).</li>
<li>Cruz, F. C., Javier Rubio, F., Hope, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+c-fos+to+study+neuronal+ensembles+in+corticostriatal+circuitry+of+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction.</a> Brain Research. 1628, 157-173 (2015).</li>
<li>Rubio, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-Induced+Reinstatement+of+Methamphetamine+Seeking+Is+Associated+with+Unique+Molecular+Alterations+in+Fos-Expressing+Dorsolateral+Striatum+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Context-Induced Reinstatement of Methamphetamine Seeking Is Associated with Unique Molecular Alterations in Fos-Expressing Dorsolateral Striatum Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 35 (14), 5625-5639 (2015).</li>
<li>Siuda, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Control+of+Opioid+Signaling+and+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior.</a> Neuron. 86 (4), 923-935 (2015).</li>
<li>McCracken, C. B., Grace, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+deep+brain+stimulation+of+the+nucleus+accumbens+region+suppresses+neuronal+activity+and+selectively+modulates+afferent+drive+in+rat+orbitofrontal+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-frequency deep brain stimulation of the nucleus accumbens region suppresses neuronal activity and selectively modulates afferent drive in rat orbitofrontal cortex in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 27 (46), 12601-12610 (2007).</li>
<li>Zhang, H., Bramham, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+Dysregulation+of+AMPA+Receptor-Mediated+Synaptic+Transmission+and+Plasticity+in+Brain+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bidirectional Dysregulation of AMPA Receptor-Mediated Synaptic Transmission and Plasticity in Brain Disorders.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12 (26), (2020).</li>
</ol>

Nic do ujawnienia.

Jak opisano powyżej, istnieje kilka krytycznych kroków, które są ważne dla osiągnięcia prawidłowych wyników eksperymentalnych. Protokół będzie prawdopodobnie skuteczny tylko u zwierząt, które prawidłowo nabywają samodzielne podawanie kokainy, a do tej pory był testowany tylko przy użyciu parametrów opisanych powyżej. Możliwe jest, że dawka kokainy, harmonogram wzmacniania i parametry cue mogą być modyfikowane z prawdopodobnie niewielkim wpływem na wyniki behawioralne, z wyjątkiem tego, że schemat wzmacniania drugiego rzę...

Nadużywanie substancji jest bardzo poważnym problemem zdrowia publicznego w USA i na całym świecie. Pomimo dziesięcioleci intensywnych badań, istnieje bardzo niewiele skutecznych opcji terapeutycznych1,2. Główną przeszkodą w leczeniu jest fakt, że przewlekłe zażywanie narkotyków generuje długotrwałe wspomnienia skojarzeniowe między sygnałami środowiskowymi a samym lekiem. Ponowna ekspozycja na sygnały związane z narkotykami napędza reakcje fizjologiczne i behawioralne, które motywują do dalszego używania narkotyków i nawrotu3. Nowatorską strategią terapeutyczną jest wprowadzenie terapii opartych na pamięci, które mają na celu manipulowanie obwodami zaangażowanymi w regulację skojarzeń między lekami a sygnałami. Ostatnio zaobserwowano, że synapsy w bocznym ciele migdałowatym (LA), w szczególności te powstające z przyśrodkowego jądra kolankowatego (MGN) wzgórza, są wzmacniane przez powtarzające się samodzielne podawanie kokainy związane ze wskazówkami i że to wzmocnienie może wspierać zachowania związane z poszukiwaniem kokainy4,5. W związku z tym zaproponowano, że przywrócenie wywołane cue może być osłabione przez odwrócenie plastyczności w synapsach MGN-LA.
Zdolność do precyzyjnego celowania w plastyczność synaptyczną określonego obwodu mózgu była głównym wyzwaniem dla tej dziedziny. Tradycyjne narzędzia farmakologiczne odniosły pewien sukces w zmniejszaniu zachowań nawrotowych, ale są ograniczone przez niemożność manipulowania poszczególnymi synapsami. Jednak niedawny rozwój optogenetyki in vivo dostarczył narzędzi potrzebnych do przezwyciężenia tych ograniczeń i kontrolowania ścieżek neuronowych z precyzją czasową i przestrzenną6,7,8. Poprzez ekspresję światłoczułych opsyn w określonym obwodzie mózgu, światło laserowe może być następnie wykorzystane do aktywacji lub zahamowania obwodu. Stymulacja optyczna zależna od częstotliwości może być wykorzystana do specyficznego manipulowania plastycznością synaptyczną obwodu u zachowującego się zwierzęcia.
Ten manuskrypt opisuje procedurę podjętą w celu manipulowania behawioralnie istotnym obwodem MGN-LA za pomocą optogenetyki in vivo. Po pierwsze, pobudzająca opsyna oChIEF uległa ekspresji w MGN, a światłowody zostały obustronnie wszczepione do LA. Zwierzęta zostały następnie przeszkolone do samodzielnego podawania kokainy w sposób zależny od sygnału, co wzmacnia szlak MGN-LA. Następnie, ciągła stymulacja o niskiej częstotliwości światłem laserowym o długości fali 473 nm została wykorzystana do wytworzenia LTD specyficznego dla obwodu. Odwrócenie plastyczności wywołanej używaniem kokainy spowodowało długotrwałe zmniejszenie zdolności sygnałów do wywoływania działań, które są związane z zachowaniami związanymi z poszukiwaniem narkotyków.

<table><tbody><tr><td>0,9% Saline</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0291799</td><td></td></tr><tr><td>A.M.P.I. Izolator bodźca</td><td>Iso-Flex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato</td><td>Duke Viral Vector Core (przez Rogera Tsiena)</td><td>#268</td><td>Patrz Lin i in., 2009; Nabavi i wsp., 2014</td></tr><tr><td>AAV5.hSyn.tdPomidor (kontrola)</td>Kontrola <td></td><td>rdzenia wektora wirusa Duke</td><td>Zobacz Lin i in., 2009; Nabavi i wsp., 2014</td></tr><tr><td>Sztuczne łzy (maść okulistyczna)</td><td>Covetrus</td><td>70349</td><td></td></tr><tr><td>ATP Sól magnezowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Butler Schein</td><td>38250</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fisher Scientific</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek cezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>289329</td><td></td></tr><tr><td>Cez wodorotlenek</td><td>Fisher Scientific</td><td>516988</td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfonian cezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr>Centrum Zaopatrzenia<td>w Kokainę HCl</td><td>NIDA</td><td>9041-001</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-1</td><td></td></tr><tr><td>Dwukanałowy regulator temperatury</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344C</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Uniwersytet w Pittsburghu Magazyn chemiczny</td><td>200C5000</td><td></td></tr><tr><td>Osłony przeciwpyłowe z okuciami</td><td>Thor Labs</td><td>CAPL</td><td>Białe plastikowe osłony przeciwpyłowe do okuć 1,25 mm</td></tr><tr><td>Tuleje współpracujące z okuciami</td><td>Doric Soczewki</td><td>F210-3011</td><td>Sleeve_BR_1.25, brąz, 1,25 mm ID</td></tr><tr><td>Ferrule</td><td>Precyzyjne produkty z włókien</td><td>MM-FER2007C-2300</td> <td>i Oslash; Skuwka ceramiczna 1,25 mm wielomodowa LC/PC, & Oslash; 230 &mu; m rozmiar otworu</td></tr><tr><td>Światłowód</td><td>Thor Labs</td><td>FP200URT</td><td>200 &mu; Światłowód wielomodowy z rdzeniem m (0,5 NA)</td></tr><tr><td>Światłowodowe złącze obrotowe</td><td>Prizmatix</td> <td>(zamówione w Amazon)</td> <td>Średnica 18 mm, złącze FC-FC do</td></tr><tr><td>włókna Narzędzie do ściągania izolacji z włókien</td><td>Thor Labs</td><td>T12S21</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield z DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Henry Schein</td><td>6913</td><td></td></tr><tr><td>GTP Sól sodowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>80085</td><td>10 &mu; L objętość, 26 gauge, 2 cale, styl punktowy 3</td></tr><tr><td>Opalarka</td><td>Allied Electronics</td><td>972-6966</td><td>250 V, 750-800 &deg; F</td></tr><tr><td>Utwardzane termicznie</td><td>precyzyjne produkty z włókien</td> epoksydowych <td>PFP-353ND-8OZ</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Henry Schein</td><td>55737</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>219405490</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina HCl</td><td>Henry Schein</td><td>55853</td><td>Ketamina jest substancją kontrolowaną i należy postępować z nią zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi</td></tr><tr><td>Ringer z mleczanami" s</td><td>Henry Schein</td><td>9846</td><td></td></tr><tr><td>Laser, sterownik i sprzęgacz laser-światłowód</td><td>OEM Systemy laserowe</td><td>BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0</td><td>100 mW, 473-nm, pompowany diodowo laser półprzewodnikowy (jedna opcja)</td></tr><tr><td>L-glutation</td><td>Fisher Scientific</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Lidokaina</td><td>Butler Schein</td><td>14583</td><td></td></tr><tr><td>Czujnik światła</td><td>Thor Labs</td><td>PM100D</td><td>Kompaktowa konsola licznika energii z cyfrowym wyświetlaczem</td></tr><tr><td>Klej błyskawiczny Loctite</td><td>Grainger</td><td>5E207</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203726</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz mikroelektrod / Akwizycja danych</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>MULTICLAMP700B / Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Pompa mikroiniekcyjna</td><td>Aparat Harvard</td><td>70-4501</td><td>Podwójna strzykawka</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200/ROE-200</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>Mikroskop pionowy do elektrofizjologii</td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop Olympus</td><td>BX61VS</td><td>Epifluorescencyjny mikroskop skaningowy szkiełkowy</td></tr><tr><td>N-metylo-D-glukamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td></td></tr><tr><td>Cement dentystyczny Orthojet, płynny</td><td>Lang Dental</td><td>1504BLK</td><td></td></tr><tr><td>cement dentystyczny Orthojet, proszek</td><td>Lang Dental</td><td>1530BLK</td><td>Współczesny proszek,</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td> krosowe <td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thor Labs</td><td>FP200ERT</td><td>wielomodowy, FT030 Rurki</td></tr><tr><td>Piprotoksyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC131210010</td><td></td></tr><tr><td>Tarcza polerska</td><td>Thor Labs</td><td>D50FC</td><td></td></tr><tr><td>Pad polerski</td><td>Thor Labs</td><td>NRS913</td><td>9" x 13"</td></tr> <tr><td>Bibuła polerska</td><td>Thor Labs</td><td>LFG5P</td><td>5 &mu; </td></tr><tr><td>papier polerski</td> o <td>ziarnistości m Thor Labs</td><td>LFG3P</td><td>3 &mu; </td></tr><tr><td>papier polerski</td> o <td>ziarnistości m Thor Labs</td><td>LFG1P</td><td>1 &mu; </td></tr><tr><td>papier polerski</td> o <td>ziarnistości m Thor Labs</td><td>LFG03P</td><td>0,3 &mu; m grit</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfonian potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>83000</td><td></td></tr><tr><td>QX-314-Cl Alomone</td><td>Labs</td><td>Q-150</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl (karprofen)</td><td>Henry Schein</td><td>24751</td><td></td></tr><tr><td>Samodzielne podawanie Chambers/Software</td><td>Med Associates</td><td>MED-NP5L-D1</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1064980500</td><td></td></tr><tr><td>L-askorbinian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Henry Schein</td><td>24352</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Fosfokreatyna sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Wkręty maszynowe ze stali nierdzewnej</td><td>WW Grainger</td><td>&nbsp; 6GB25</td><td>M2-0,40mm Śruba maszynowa, patelnia, krzyżak, A2 Stal nierdzewna, gładka, 3 mm długości</td></tr><tr><td>Adapter stereotaktyczny do okuć</td><td>Thor Labs</td><td>XCL</td><td></td></tr><tr><td>Rama stereotaktyczna</td><td>Stoelting</td><td>51603</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Nić do szwów</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td>Nić jedwabna; Rozmiar: 5/0, Średnica: 0,12 mm</td></tr><tr><td>Chlorek herbaty</td><td>Fisher Scientific</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>Tiomocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Klej do tkanek Vetbond</td><td>Covetrus</td><td>001505</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Butler Schein</td><td>33198</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie optogenetyki do odwrócenia neuroplastyczności i zahamowania poszukiwania kokainy u szczurów

Using Optogenetics to Reverse Neuroplasticity and Inhibit Cocaine Seeking in Rats

Ten protokół demonstruje kroki potrzebne do użycia narzędzi optogenetycznych do odwrócenia plastyczności wywołanej przez kokainę w obwodach wzgórzowo-migdałowatych, aby zmniejszyć późniejsze zachowania związane z poszukiwaniem kokainy u szczura. W naszych badaniach odkryliśmy, że gdy szczury samodzielnie podają kokainę dożylnie w połączeniu ze wskazówką audiowizualną, synapsy utworzone na wejściu z przyśrodkowego jądra kolankowatego wzgórza (MGN) na główne neurony bocznego ciała migdałowatego (LA) stają się silniejsze w miarę uczenia się związku sygnał-kokaina. Postawiliśmy hipotezę, że odwrócenie plastyczności wywołanej przez kokainę w tych synapsach zmniejszy zachowania związane z poszukiwaniem kokainy motywowane sygnałami. Aby osiągnąć ten rodzaj neuromodulacji in vivo, chcieliśmy wywołać synaptyczną depresję długotrwałą (LTD), która zmniejsza siłę synaps MGN-LA. W tym celu wykorzystaliśmy optogenetykę, która umożliwia neuromodulację obwodów mózgowych za pomocą światła. Pobudzająca opsyna oChiEF ulegała ekspresji na presynaptycznych końcach MGN w LA poprzez wprowadzenie AAV zawierającego oChiEF do MGN. Następnie wszczepiono światłowody do LA i światło laserowe o długości 473 nm pulsowano z częstotliwością 1 Hz przez 15 minut, aby wywołać LTD i odwrócić plastyczność indukowaną kokainą. Manipulacja ta powoduje długotrwałe zmniejszenie zdolności sygnałów związanych z kokainą do wywoływania działań związanych z poszukiwaniem narkotyków.

Oś czasu przedstawiająca kolejność przeprowadzonych doświadczeń pokazano na Rysunku 1. W trakcie eksperymentów behawioralnych liczba infuzji kokainy, a także liczba reakcji na dźwigni aktywnej służą jako miara intensywności zachowań poszukiwania kokainy. W początkowych dniach samopodawania kokainy liczba reakcji aktywnych powinna stopniowo wzrastać w każdym dniu nabywania, a następnie ustabilizować się w drugim tygodniu. Z kolei liczba reakcji na dźwigni nieaktywnej powinna pozostać niska pr...

Opisane tutaj metody opisują procedurę używaną do optogenetycznie odwracającej plastyczności wywołanej przez kokainę w behawioralnie istotnym obwodzie u szczurów. Utrzymująca się stymulacja optyczna synaps wzgórzowo-migdałowatych o niskiej częstotliwości wywołuje długotrwałą depresję (LTD). Indukowane optogenetycznie LTD in vivo u szczurów doświadczonych z kokainą skutkowało późniejszym osłabieniem poszukiwania narkotyków motywowanego sygnałem.

Wykorzystanie optogenetyki do odwrócenia neuroplastyczności i zahamowania poszukiwania kokainy u szczurów

This protocol demonstrates the steps needed to use optogenetic tools to reverse cocaine-induced plasticity at thalamo-amygdala circuits to reduce ...

Protokół ten jest znaczący, ponieważ wykorzystuje nowatorskie postępy w technikach optogenetycznych i przedkliniczny model nadużywania substancji w celu odwrócenia plastyczności w obwodach neuronalnych, które są odpowiedzialne za promowanie nawrotów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na specyficzną dla obwodu manipulację aktywnością synaptyczną u obudzonego zwierzęcia, co ma długotrwałe hamowanie zachowań związanych z poszukiwaniem kokainy w przyszłości. Metoda ta może być wykorzystana w wielu innych systemach i obwodach do specyficznego manipulowania behawioralnie istotną neuroplastycznością.Rozpocznij przygotowania do operacji, podłączając kaniulę iniekcyjną ze stali nierdzewnej o rozmiarze 26 do strzykawki Hamilton wypełnionej jednym mikrolitrem stężonego roztworu AAV. Po znieczuleniu zwierzęcia należy ogolić obszar operacyjny i nasmarować oczy, aby zapobiec wysuszeniu, jak opisano w rękopisie tekstu. Następnie wstrzyknąć szczurowi objętość przeciwbólowego karprofenu podskórnie przez skórę górnej części pleców i wstrzyknąć pięć mililitrów roztworu Ringera z mleczanami podskórnie przez skórę dolnej części pleców.Następnie należy wszczepić cewnik dożylny. Natychmiast po wszczepieniu cewnika należy zabezpieczyć szczura w ramie stereotaktycznej w celu wykonania zastrzyków wirusowych związanych z adeno. Wstrzyknąć bolus lidokainy podskórnie przez skórę nad czaszką w celu miejscowego znieczulenia tego obszaru, a następnie wykonać 0,5 milimetrowe nacięcie od przodu do tyłu czaszki.Usuń leżącą tkankę, aby odsłonić powierzchnię czaszki. Wypoziomuj głowę szczura wzdłuż przedniej tylnej osi i zeruj współrzędne stereotaktyczne do bregmy, a następnie użyj narzędzia dremel wyposażonego w małe wiertło, aby wywiercić trzy małe otwory w czaszce i zamontuj ze stali nierdzewnej za pomocą śrubokręta. W celu wstrzyknięcia AAV wywierć obustronne otwory na podstawie współrzędnych z Atlasu Mózgu Szczura "dla przyśrodkowego jądra kolankowatego lub MGN.Współrzędne używane w odniesieniu do bregmy to minus 5,4 milimetra na przedniej osi tylnej, plus trzy milimetry na przyśrodkowej osi bocznej i minus 6,6 milimetra na grzbietowej osi brzusznej. Powoli opuść kaniulę iniekcyjną z prędkością około czterech milimetrów na minutę, aż kaniula zostanie prawidłowo umieszczona w MGN, i wstrzyknij stężony roztwór AAV z szybkością 0,1 mikrolitra na minutę. Po zakończeniu infuzji pozostaw kaniulę iniekcyjną na miejscu na pięć minut, aby umożliwić dyfuzję wirusa z dala od kaniuli, a następnie powoli wyjmij kaniulę z mózgu.Następnie przystąp do implantacji światłowodów celujących w jądro kolankowate przyśrodkowe, boczne zakończenia ciała migdałowatego. Użyj narzędzia dremel, aby wywiercić obustronne otwory nad bocznym ciałem migdałowatym, we współrzędnych wyjaśnionych w rękopisie. Użyj kleszczyków, aby chwycić skuwkę implantu światłowodowego i przymocuj skuwkę do adapterów stereotaktycznych na miejscu.Powoli obniżaj włókna w tempie dwóch milimetrów na minutę, aż końcówka włókna znajdzie się w grzbietowej części LA. Przymocuj okucia do skóry, najpierw używając cienkiej warstwy kleju błyskawicznego Loctite, a następnie cementu dentystycznego. Gdy cement dentystyczny wystarczająco wyschnie, przykryj okucia tulejami i osłonami przeciwpyłowymi. Po zabiegach chirurgicznych należy trzymać szczura indywidualnie i codziennie przepłukiwać cewniki solą fizjologiczną zawierającą pięć miligramów na mililitr gentamycyny i 30 jednostek USP na mililitr heparyny.Na 24 godziny przed rozpoczęciem eksperymentów behawioralnych pokarm ogranicza szczury do 90% ich wagi podczas karmienia. Umieść szczura w komorze operacyjnej, aby przechodził codzienne godzinne sesje treningowe w zakresie samodzielnego podawania dwóch miligramów na mililitr kokainy, zgodnie z ustalonym stosunkiem jednego schematu wzmacniania. W komorze pozwól szczurowi nacisnąć dźwignię.Naciśnięcie wyznaczonej dźwigni aktywnej powoduje infuzję kokainy w dawce jednego miligrama na kilogram i dziesięciosekundową prezentację złożonej wskazówki świetlnej i tonalnej. Naciśnięcie wyznaczonej nieaktywnej dźwigni nie ma zaprogramowanych efektów. Kontynuuj eksperymenty z samodzielnym podawaniem przez co najmniej 10 dni, aż szczur z powodzeniem zdobędzie co najmniej osiem infuzji dziennie przez trzy kolejne dni.Niespełnienie kryteriów akwizycji do 20 dnia skutkuje wykluczeniem z badania. Po pomyślnym spełnieniu kryteriów nabycia, poddaj szczura godzinnym sesjom instrumentalnego wymierania przez sześć do 10 dni, pozwalając szczurom na swobodne naciskanie dźwigni w komorach operacyjnych. Kontynuuj wygaszanie instrumentalne codziennie, aż nastąpi średnio maksymalnie 25 naciśnięć dźwigni w ciągu dwóch kolejnych dni.W celu optogenetycznej indukcji długotrwałej depresji lub LTD, podłącz krosowe do niebieskiej diody laserowej o długości 473 nanometrów za pomocą obrotowego złącza zawieszonego nad czystą, standardową klatką w obudowie gryzoni. Włącz laser zgodnie z instrukcją obsługi i podłącz laser do generatora impulsów. Dostosuj ustawienia, aby dać szczurowi 900 impulsów światła w ciągu dwóch mikrosekund, w jednym hercu.Zmierz strumień świetlny przez krosowy za pomocą czujnika światła i dostosuj intensywność lasera tak, aby strumień świetlny przez krosowy wynosił około pięciu do siedmiu miliwatów. Umieść szczura w czystej klatce w obudowie i zdejmij osłony przeciwpyłowe oraz tuleje tulejowe odsłaniające okucia. Następnie podłącz krosowe dwustronnie do każdej tulejki.Przy odpowiednim ustawieniu gryzonie będą mogły swobodnie poruszać się po klatce podczas stymulacji optogenetycznej. Po umożliwieniu szczurowi eksploracji otoczenia przez trzy minuty, włącz generator impulsów, aby zainicjować stymulację optogenetyczną. Po długotrwałej indukcji depresji pozwól szczurowi pozostać w klatce przez trzy minuty, zanim umieścisz go z powrotem w klatce domowej.24 godziny po stymulacji optogenetycznej in vivo, umieść szczura z powrotem w komorach kondycjonowania instrumentalnego, aby przejść jednogodzinną standardową sesję przywracania w celu oceny zachowań związanych z poszukiwaniem kokainy. Naciśnięcie aktywnej dźwigni powoduje dziesięciosekundową prezentację sygnału świetlnego i tonalnego. Co najmniej tydzień po pierwszym teście należy wykonać drugi test przywracający, aby ustalić, czy indukcja optogenetyczna LTD powoduje długotrwałe zahamowanie poszukiwania kokainy.W analizie reprezentatywnej przedstawiono nabycie i zaprzestanie samodzielnego podawania kokainy. Wlewy kokainy i aktywne reakcje dźwigni nasilały się w trakcie nabywania, z niewielką liczbą nieaktywnych reakcji dźwigni. Podczas samodzielnego podawania kokainy, liczba aktywnych reakcji stopniowo zwiększała się w ciągu każdego dnia nabycia, zanim ustabilizowała się w drugim tygodniu.W pierwszym dniu wygaszania zaobserwowano początkowy wzrost nacisku na dźwignie, po którym nastąpił spadek reakcji na obie dźwignie. Po instrumentalnym wyginięciu, ponowne wprowadzenie sygnałów przywróciło poszukiwanie kokainy, co oznacza wzrost liczby aktywnych reakcji dźwigniowych. Optical LTD spowodował znaczne zmniejszenie liczby aktywnych naciśnięć dźwigni w stosunku do elementów sterujących.Siedem dni później szczury zostały ponownie przetestowane. Zwierzęta, które wcześniej przeszły MGN-LA LTD, miały znacznie zmniejszone aktywne naciskanie dźwigni w porównaniu z grupą kontrolną, co ujawniło, że optyczne LTD spowodowało długoterminowy spadek poszukiwania kokainy. Zapisy elektrofizjologiczne ex vivo wykazały spadek amplitudy optycznie wywołanego pobudzającego prądu postsynaptycznego w neuronach LA, po optycznym LTD.Dodatkowo, nachylenie wzrostu pobudzających potencjałów postsynaptycznych zostało zmniejszone przez stymulację optyczną ex vivo w neuronach, od zwierząt, które miały stymulację pozorowaną, ale nie w neuronach od zwierząt, które miały optyczną LTD in vivo. Rozmieszczenie implantów światłowodowych i ekspresję wirusa zweryfikowano histologicznie w bocznym ciele migdałowatym i MGN. Aby skutecznie ograniczyć zachowania związane z poszukiwaniem kokainy, konieczne jest osiągnięcie odpowiedniej mocy światła przez implanty światłowodowe oraz stosowanie długotrwałej stymulacji o niskiej częstotliwości w celu promowania długotrwałej depresji.Zgodnie z tą procedurą, techniki rejestracji neuronalnej mogą być wykorzystane do określenia zmian w aktywności neuronalnej, a także można przeprowadzić inne testy behawioralne poszukiwania kokainy lub innych wyuczonych zachowań.

using-optogenetics-to-reverse-neuroplasticity-inhibit-cocaine-seeking

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Rich, M. T., et al. Wykorzystanie optogenetyki do odwrócenia neuroplastyczności i zahamowania poszukiwania kokainy u szczurów. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje zastosowanie optogenetyki do wywoływania długotrwałej depresji (LTD) w synapsach przyśrodkowego jądra kolankowatego do bocznego ciała migdałowatego (MGN-LA), osłabiając wywołane sygnałem zachowanie związane z poszukiwaniem narkotyków w modelu szczurzym. Szczur, któremu chirurgicznie wszczepiono światłowody i wirusowo...

Optogenetyczna indukcja długotrwałej depresji w celu tłumienia zachowań związanych z poszukiwaniem narkotyków u szczurów

Niedawny rozwój narzędzi neuronauki, które łączą genetykę i optykę, określany jako "optogenetyka", umożliwia kontrolę nad aktywnością obwodów neuronowych z niespotykanym dotąd poziomem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół integracji zapisu in vivo z manipulacją optogenetyczną genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów przedczołowych korowych i podkostnych neuronów piramidowych.

Metoda wysokiej wierności optogenetycznej kontroli pojedynczych neuronów piramidowych in vivo

Ten artykuł opisuje, jak mikrowstrzykiwać wektory wirusowe do mózgu myszy, a następnie testować w warunkowym paradygmacie preferencji miejsca, który obejmuje fazę przejęcia, wyginięcia i przywrócenia.

Stereotaktyczne mikroiniekcja wektorów wirusowych eksprymujących rekombinazę Cre w celu zbadania roli genów docelowych w preferencjach miejsca uwarunkowanego kokainą

Optogenetyka stała się potężnym narzędziem do wykorzystania w eksperymentach neuronauki behawioralnej. Protokół ten oferuje przewodnik krok po kroku po projektowaniu i konfiguracji systemów laserowych oraz zapewnia pełny protokół przeprowadzania wielokrotnych i jednoczesnych stymulacji optogenetycznych in vivo zgodnych z większością paradygmatów testów behawioralnych gryzoni.

In vivo (in vivo) Stymulacja optogenetyczna ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Ten protokół opisuje, jak tymczasowo i zdalnie wyciszyć aktywność neuronalną w dyskretnych obszarach mózgu, podczas gdy szczury są zaangażowane w zadania związane z uczeniem się i pamięcią. Podejście to łączy farmakogenetykę (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) z paradygmatem behawioralnym (sensoryczne warunkowanie wstępne), które ma na celu rozróżnienie różnych elementów uczenia się.

Metoda zdalnego wyciszania aktywności neuronalnej u gryzoni podczas dyskretnych faz uczenia się

Ten protokół dostarcza przepływ pracy, jak połączyć sztuczną interferencję RNA za pośrednictwem mikroRNA z optogenetyką, aby stymulować specyficznie presynaptyczne butony ze zmniejszoną ekspresją selektywnych genów w nienaruszonych obwodach neuronalnych.

Połączenie optogenetyki ze sztucznymi mikroRNA w celu scharakteryzowania wpływu knockdownu genów na funkcję presynaptyczną w nienaruszonych obwodach neuronalnych

Celem tego protokołu jest opisanie podejścia do analizy zachowania dorosłych nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych w odpowiedzi na manipulację chemogenetyczną specyficznego lokalnego obwodu neuronowego.

Regulacja specyficzna dla obwodu testowego dorosłych nerwowych komórek prekursorowych hipokampa

Tutaj prezentujemy dwa łatwe do naśladowania protokoły krok po kroku dla paradygmatów preferencji miejsca z wykorzystaniem optogenetyki u myszy. Korzystając z tych dwóch różnych konfiguracji, zachowania związane z preferencjami i unikaniem mogą być solidnie oceniane w ramach tego samego aparatu z wysoką selektywnością przestrzenną i czasową oraz w prosty sposób.

Dwa różne paradygmaty preferencji miejsca w czasie rzeczywistym wykorzystujące optogenetykę w brzusznym obszarze nakrywki myszy

Dzięki optogenetycznej manipulacji określonych populacji neuronów lub obszarów mózgu, zachowanie może być modyfikowane z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u swobodnie poruszających się zwierząt. Stosując różne narzędzia optogenetyczne w połączeniu z przewlekle wszczepionymi światłowodami, można przeprowadzić różnorodne modulacje neuronalne i testy behawioralne.

Optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Obecny protokół opisuje, jak korzystać z bezprzewodowej optogenetyki w połączeniu z szybką wideografią w jednym zadaniu typu "sięgnij do uchwytu" w celu scharakteryzowania obwodów neuronowych zaangażowanych w realizację umiejętnego zachowania motorycznego u swobodnie poruszających się myszy.

In vivo (in vivo) Bezprzewodowa kontrola optogenetyczna wykwalifikowanych zachowań motorycznych

Poznaj metodę odwracania plastyczności neuronalnej indukowanej kokainą w obwodach talamo-amigdalowych szczurów za pomocą optogenetyki. Technika ta umożliwia precyzyjną manipulację aktywnością synaptyczną w przebudzonych zwierzętach, skutkując długotrwałym zahamowaniem poszukiwania narkotyku.

Wykorzystanie optogenetyki do odwrócenia neuroplastyczności i zahamowania poszukiwania kokainy u szczurów

Przeglądaj więcej filmów