Wykorzystanie optogenetyki do odwrócenia neuroplastyczności i zahamowania poszukiwania kokainy u szczurów

Protokół ten jest znaczący, ponieważ wykorzystuje nowatorskie postępy w technikach optogenetycznych i przedkliniczny model nadużywania substancji w celu odwrócenia plastyczności w obwodach neuronalnych, które są odpowiedzialne za promowanie nawrotów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na specyficzną dla obwodu manipulację aktywnością synaptyczną u obudzonego zwierzęcia, co ma długotrwałe hamowanie zachowań związanych z poszukiwaniem kokainy w przyszłości. Metoda ta może być wykorzystana w wielu innych systemach i obwodach do specyficznego manipulowania behawioralnie istotną neuroplastycznością.

Rozpocznij przygotowania do operacji, podłączając kaniulę iniekcyjną ze stali nierdzewnej o rozmiarze 26 do strzykawki Hamilton wypełnionej jednym mikrolitrem stężonego roztworu AAV. Po znieczuleniu zwierzęcia należy ogolić obszar operacyjny i nasmarować oczy, aby zapobiec wysuszeniu, jak opisano w rękopisie tekstu. Następnie wstrzyknąć szczurowi objętość przeciwbólowego karprofenu podskórnie przez skórę górnej części pleców i wstrzyknąć pięć mililitrów roztworu Ringera z mleczanami podskórnie przez skórę dolnej części pleców.

Następnie należy wszczepić cewnik dożylny. Natychmiast po wszczepieniu cewnika należy zabezpieczyć szczura w ramie stereotaktycznej w celu wykonania zastrzyków wirusowych związanych z adeno. Wstrzyknąć bolus lidokainy podskórnie przez skórę nad czaszką w celu miejscowego znieczulenia tego obszaru, a następnie wykonać 0,5 milimetrowe nacięcie od przodu do tyłu czaszki.

Usuń leżącą tkankę, aby odsłonić powierzchnię czaszki. Wypoziomuj głowę szczura wzdłuż przedniej tylnej osi i zeruj współrzędne stereotaktyczne do bregmy, a następnie użyj narzędzia dremel wyposażonego w małe wiertło, aby wywiercić trzy małe otwory w czaszce i zamontuj ze stali nierdzewnej za pomocą śrubokręta. W celu wstrzyknięcia AAV wywierć obustronne otwory na podstawie współrzędnych z Atlasu Mózgu Szczura "dla przyśrodkowego jądra kolankowatego lub MGN.

Współrzędne używane w odniesieniu do bregmy to minus 5,4 milimetra na przedniej osi tylnej, plus trzy milimetry na przyśrodkowej osi bocznej i minus 6,6 milimetra na grzbietowej osi brzusznej. Powoli opuść kaniulę iniekcyjną z prędkością około czterech milimetrów na minutę, aż kaniula zostanie prawidłowo umieszczona w MGN, i wstrzyknij stężony roztwór AAV z szybkością 0,1 mikrolitra na minutę. Po zakończeniu infuzji pozostaw kaniulę iniekcyjną na miejscu na pięć minut, aby umożliwić dyfuzję wirusa z dala od kaniuli, a następnie powoli wyjmij kaniulę z mózgu.

Następnie przystąp do implantacji światłowodów celujących w jądro kolankowate przyśrodkowe, boczne zakończenia ciała migdałowatego. Użyj narzędzia dremel, aby wywiercić obustronne otwory nad bocznym ciałem migdałowatym, we współrzędnych wyjaśnionych w rękopisie. Użyj kleszczyków, aby chwycić skuwkę implantu światłowodowego i przymocuj skuwkę do adapterów stereotaktycznych na miejscu.

Powoli obniżaj włókna w tempie dwóch milimetrów na minutę, aż końcówka włókna znajdzie się w grzbietowej części LA. Przymocuj okucia do skóry, najpierw używając cienkiej warstwy kleju błyskawicznego Loctite, a następnie cementu dentystycznego. Gdy cement dentystyczny wystarczająco wyschnie, przykryj okucia tulejami i osłonami przeciwpyłowymi. Po zabiegach chirurgicznych należy trzymać szczura indywidualnie i codziennie przepłukiwać cewniki solą fizjologiczną zawierającą pięć miligramów na mililitr gentamycyny i 30 jednostek USP na mililitr heparyny.

Na 24 godziny przed rozpoczęciem eksperymentów behawioralnych pokarm ogranicza szczury do 90% ich wagi podczas karmienia. Umieść szczura w komorze operacyjnej, aby przechodził codzienne godzinne sesje treningowe w zakresie samodzielnego podawania dwóch miligramów na mililitr kokainy, zgodnie z ustalonym stosunkiem jednego schematu wzmacniania. W komorze pozwól szczurowi nacisnąć dźwignię.

Naciśnięcie wyznaczonej dźwigni aktywnej powoduje infuzję kokainy w dawce jednego miligrama na kilogram i dziesięciosekundową prezentację złożonej wskazówki świetlnej i tonalnej. Naciśnięcie wyznaczonej nieaktywnej dźwigni nie ma zaprogramowanych efektów. Kontynuuj eksperymenty z samodzielnym podawaniem przez co najmniej 10 dni, aż szczur z powodzeniem zdobędzie co najmniej osiem infuzji dziennie przez trzy kolejne dni.

Niespełnienie kryteriów akwizycji do 20 dnia skutkuje wykluczeniem z badania. Po pomyślnym spełnieniu kryteriów nabycia, poddaj szczura godzinnym sesjom instrumentalnego wymierania przez sześć do 10 dni, pozwalając szczurom na swobodne naciskanie dźwigni w komorach operacyjnych. Kontynuuj wygaszanie instrumentalne codziennie, aż nastąpi średnio maksymalnie 25 naciśnięć dźwigni w ciągu dwóch kolejnych dni.

W celu optogenetycznej indukcji długotrwałej depresji lub LTD, podłącz krosowe do niebieskiej diody laserowej o długości 473 nanometrów za pomocą obrotowego złącza zawieszonego nad czystą, standardową klatką w obudowie gryzoni. Włącz laser zgodnie z instrukcją obsługi i podłącz laser do generatora impulsów. Dostosuj ustawienia, aby dać szczurowi 900 impulsów światła w ciągu dwóch mikrosekund, w jednym hercu.

Zmierz strumień świetlny przez krosowy za pomocą czujnika światła i dostosuj intensywność lasera tak, aby strumień świetlny przez krosowy wynosił około pięciu do siedmiu miliwatów. Umieść szczura w czystej klatce w obudowie i zdejmij osłony przeciwpyłowe oraz tuleje tulejowe odsłaniające okucia. Następnie podłącz krosowe dwustronnie do każdej tulejki.

Przy odpowiednim ustawieniu gryzonie będą mogły swobodnie poruszać się po klatce podczas stymulacji optogenetycznej. Po umożliwieniu szczurowi eksploracji otoczenia przez trzy minuty, włącz generator impulsów, aby zainicjować stymulację optogenetyczną. Po długotrwałej indukcji depresji pozwól szczurowi pozostać w klatce przez trzy minuty, zanim umieścisz go z powrotem w klatce domowej.

24 godziny po stymulacji optogenetycznej in vivo, umieść szczura z powrotem w komorach kondycjonowania instrumentalnego, aby przejść jednogodzinną standardową sesję przywracania w celu oceny zachowań związanych z poszukiwaniem kokainy. Naciśnięcie aktywnej dźwigni powoduje dziesięciosekundową prezentację sygnału świetlnego i tonalnego. Co najmniej tydzień po pierwszym teście należy wykonać drugi test przywracający, aby ustalić, czy indukcja optogenetyczna LTD powoduje długotrwałe zahamowanie poszukiwania kokainy.

W analizie reprezentatywnej przedstawiono nabycie i zaprzestanie samodzielnego podawania kokainy. Wlewy kokainy i aktywne reakcje dźwigni nasilały się w trakcie nabywania, z niewielką liczbą nieaktywnych reakcji dźwigni. Podczas samodzielnego podawania kokainy, liczba aktywnych reakcji stopniowo zwiększała się w ciągu każdego dnia nabycia, zanim ustabilizowała się w drugim tygodniu.

W pierwszym dniu wygaszania zaobserwowano początkowy wzrost nacisku na dźwignie, po którym nastąpił spadek reakcji na obie dźwignie. Po instrumentalnym wyginięciu, ponowne wprowadzenie sygnałów przywróciło poszukiwanie kokainy, co oznacza wzrost liczby aktywnych reakcji dźwigniowych. Optical LTD spowodował znaczne zmniejszenie liczby aktywnych naciśnięć dźwigni w stosunku do elementów sterujących.

Siedem dni później szczury zostały ponownie przetestowane. Zwierzęta, które wcześniej przeszły MGN-LA LTD, miały znacznie zmniejszone aktywne naciskanie dźwigni w porównaniu z grupą kontrolną, co ujawniło, że optyczne LTD spowodowało długoterminowy spadek poszukiwania kokainy. Zapisy elektrofizjologiczne ex vivo wykazały spadek amplitudy optycznie wywołanego pobudzającego prądu postsynaptycznego w neuronach LA, po optycznym LTD.

Dodatkowo, nachylenie wzrostu pobudzających potencjałów postsynaptycznych zostało zmniejszone przez stymulację optyczną ex vivo w neuronach, od zwierząt, które miały stymulację pozorowaną, ale nie w neuronach od zwierząt, które miały optyczną LTD in vivo. Rozmieszczenie implantów światłowodowych i ekspresję wirusa zweryfikowano histologicznie w bocznym ciele migdałowatym i MGN. Aby skutecznie ograniczyć zachowania związane z poszukiwaniem kokainy, konieczne jest osiągnięcie odpowiedniej mocy światła przez implanty światłowodowe oraz stosowanie długotrwałej stymulacji o niskiej częstotliwości w celu promowania długotrwałej depresji.

Zgodnie z tą procedurą, techniki rejestracji neuronalnej mogą być wykorzystane do określenia zmian w aktywności neuronalnej, a także można przeprowadzić inne testy behawioralne poszukiwania kokainy lub innych wyuczonych zachowań.