Solidna platforma odkrywcza do identyfikacji nowych mediatorów przerzutów czerniaka
8 marca 2022
Ten artykuł opisuje przebieg techniki wykorzystywane do testowania nowych kandydatów na mediatory przerzutów czerniaka i ich mechanizm(y) działania.
Protokół ten opisuje szereg technik w ramach ciągłego przepływu pracy, które można wykorzystać do oceny wpływu in vivo potencjalnych regulatorów przerzutów czerniaka, ale także przerzutów innych litych nowotworów złośliwych. Główną zaletą naszego systematycznego przepływu pracy jest zwiększona odtwarzalność danych dzięki solidnym i ustandaryzowanym modelom i technikom in vivo. Linia ta oferuje ścieżkę do odkrywania celów i opracowywania terapii poprzez testowanie kandydatów wywnioskowanych z danych omicznych lub testów in vitro w warunkach in vivo.
Krzywa uczenia się związana z technikami przedstawionymi w tym protokole jest skracana poprzez korzystanie z dostarczonych materiałów i przestrzeganie szczegółowego opisu podczas ćwiczenia kroków. W zademonstrowaniu procedury pomogą Orlando Aristizabal, naukowiec z The Preclinical Imaging Core oraz Ran Moubarak, instruktor w moim laboratorium. W przypadku wstrzyknięć śródskórnych znieczulij i ogol ośmio- do 10-tygodniową mysz w komorze bezpieczeństwa biologicznego, zachowując warunki aseptyki.
Następnie chwyć i cofnij skórę do tyłu w kierunku trajektorii ukłucia igłą i za pomocą igły do strzykawki insulinowej o długości sześciu milimetrów i rozmiarze 31 delikatnie nakłuj skórę pod ostrym kątem, ze skosem skierowanym do góry. Wstrzyknąć powoli 30 mikrolitrów zawiesiny komórek nowotworowych, aż do zaobserwowania koła w kształcie kopuły. Monitoruj postęp wzrostu guza, utratę masy ciała i ogólny stan zdrowia.
Podczas tych sesji monitorowania należy wykonać pomiary suwmiarką i użyć wymiarów długości i szerokości guza do obliczenia objętości. W przypadku wstrzyknięć dosercowych przenieś znieczuloną mysz na podgrzewaną platformę aparatu ultrasonograficznego. Następnie za pomocą hipoalergicznej taśmy przymocuj mysz do stożka nosowego.
Ogolić klatkę piersiową prostą żyletką lub ostrzem skalpela, nachylonym pod kątem 30 stopni i oczyść skórę wokół obszaru zabiegowego 10% jodowidonem. Następnie umieść sondę ultrasonograficzną na środku klatki piersiowej po lewej stronie myszy, aby uchwycić poziome okno zorientowane w celu uzyskania widoku przekroju poprzecznego lewej komory. Trzymając długą oś sondy skierowaną do góry, zamocuj sondę pod kątem 50 stopni, a podgrzewaną platformę pod kątem 20 stopni, a następnie zablokuj sondę i ramę nośną w tej pozycji.
Podczas pracy w szafie bezpieczeństwa należy pobrać zawiesinę komórek w tuberkulinowej strzykawce o pojemności jednego mililitra z igłą o rozmiarze 30 i średnicy 30 cali. Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza znajdujące się w strzykawce. Zablokować strzykawkę w wstrzykiwaczu stereotaktycznym.
A następnie pod kontrolą ultradźwięków wsuń igłę przez ścianę klatki piersiowej do lewej komory serca i powoli wstrzyknij od 100 do 250 mikrolitrów zawiesiny komórek nowotworowych. W przypadku etapowej operacji przetrwania należy umieścić znieczuloną mysz na podkładce rozgrzewającej i oczyścić skórę wokół obszaru zabiegowego 10% roztworem jodu powidonu. Po założeniu sterylnych środków ochrony osobistej i rękawiczek, połóż sterylną zasłonę na ciele zwierzęcia.
Następnie, za pomocą nożyczek do tęczówki lub skalpela, naciąć skórę, zachowując od pięciu do siedmiu milimetrów marginesu resekcji od krawędzi guza. W przypadku guzów śródskórnych należy wyciąć guz wraz z obwodem skóry. W przypadku guzów podskórnych należy wypreparować i usunąć guz pod skórą.
Po wycięciu guza zamknij ranę za pomocą dziewięciomilimetrowego urządzenia do zszywania. W przypadku obrazowania in vivo należy podać myszowi substrat d-lucyferyny przez wstrzyknięcie dootrzewnowe za pomocą jednomililitrowej strzykawki insulinowej i igły o rozmiarze 28, a następnie znieczulić mysz i umieścić ją w stożku nosowym wewnątrz skanera obrazowania bioluminescencyjnego. Uruchom instrument, naciskając przycisk inicjalizacji i ustaw czas ekspozycji na automatyczny.
Aby przechwycić pusty obraz w celu odjęcia tła, kliknij przycisk Pobierz i zapisz obraz po zakończeniu sekwencji akwizycji. Aby przeprowadzić analizę danych i skorzystać z tego samego oprogramowania do obrazowania in vivo, przejdź do folderu, w którym zapisywane są obrazy, i otwórz obrazy wszystkich myszy z jednego eksperymentu. Ustaw jednostki na radiancję i upewnij się, że pole wyboru wskazujące osobę nie jest zaznaczone, ponieważ uniemożliwi to normalizację sygnału między grupami.
Następnie, korzystając z obszaru zainteresowania lub narzędzia do rysowania ROI, narysuj okrągłe ROI dla obszaru mózgu i prostokątne ROI dla ciała, wyklucz uszy i nos w ROI mózgu, ponieważ mają one tendencję do emitowania nieokreślonej luminancji. Aby zminimalizować stronniczość, narysuj ROI na zdjęciach myszy bez nałożonego sygnału luminescencyjnego, a następnie wybierz opcję Zmierz zwrot z inwestycji, aby określić ilościowo sygnał i wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego. Analizuj różnice między grupami, wykreślając całkowity strumień luminescencyjny w obszarach ciała będących przedmiotem zainteresowania.
Po barwieniu NuMA za pomocą oprogramowania narysuj ROI, aby uwzględnić wszystkie komórki barwione NuMA w tkance narządu, z wyjątkiem innych miąższów narządów i pustych przestrzeni. Dostosuj ustawienia, aby kategoryzować komórki dodatnie i ujemne NuMA, używając odpowiednich kontroli dodatnich i ujemnych dla każdego narządu. Użyj ustalonego algorytmu oprogramowania, aby określić ilościowo całkowitą liczbę procentową komórek NuMA dodatnich dla każdej próbki.
Obrazy bioluminescencji, jasnego pola, fluorescencji ex vivo oraz barwienia hematoksyną i eozyną ilustrują wielotorowe podejście do analizy wpływu genów kandydujących na przerzuty czerniaka. Wyciszanie fukozylotransferazy upośledzało przerzutowe rozprzestrzenianie się komórek czerniaka. Pokazano tutaj barwione odcinki płuc komórek czerniaka zakażonych kontrolnym wirusem Linda i supresorem przerzutów wyrażającym wirusa Linda.
Komórki czerniaka z przerzutami są oznaczone kolorem zielonym, a obszar narządu jest ograniczony zieloną kreskowaną linią. Utrzymanie odpowiedniego napięcia skóry podczas wykonywania iniekcji śródskórnych, unikanie zatorowości powietrznej podczas przygotowywania strzykawek oraz uzyskanie odpowiednich marginesów resekcji, które nie powinny przeszkadzać zwierzęciu w poruszaniu się i predysponować do powikłań rany, pomagają poprawić wskaźnik powodzenia i odtwarzalności. Dalsze zastosowanie obrazowania multipleksowego do badania filtracji immunologicznej, sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki do analizy ekspresji genów i transkryptomiki przestrzennej może zapewnić uzupełniające możliwości badania heterogeniczności wewnątrznowotworowej.
Połączenie technik opisanych w tym protokole pomogło nam zidentyfikować nowe regulatory przerzutów czerniaka do mózgu, takie jak rola beta amyloidu wydzielanego przez czerniaka w tłumieniu zapalenia nerwów i promowaniu przerzutów do mózgu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Artykuł ten opisuje przepływ pracy technik stosowanych do testowania nowych kandydatów na mediatorów przerzutów czerniaka i ich mechanizm(y) działania. Systematyczny przepływ pracy zwiększa odtwarzalność dzięki solidnym modelom in vivo.
Kluczowe Elementy Badań
Dziedzina Nauki
- Neuroscience
- Onkologia
- Badania nad przerzutami
Tło
- Przerzuty czerniaka stanowią poważne wyzwanie w leczeniu raka.
- Zrozumienie mediatorów przerzutów może prowadzić do lepszych strategii terapeutycznych.
- Modele in vivo dostarczają informacji, których badania in vitro mogą nie ujawnić.
- Ustandaryzowane techniki poprawiają wiarygodność danych.
Cel Badań
- Ocena in vivo efektów kandydatów na regulatory przerzutów czerniaka.
- Ustanowienie odtwarzalnego przepływu pracy do testowania mediatorów.
- Ułatwienie odkrywania celów i opracowywania terapii.
Wykorzystane Metody
- In vivo oceny kandydatów na regulatory.
- Ustandaryzowane techniki śródskórnego wstrzykiwania.
- Wykorzystanie solidnych modeli zwierzęcych dla odtwarzalności.
- Współpraca z doświadczonymi naukowcami w celu uzyskania wskazówek proceduralnych.
Główne Wyniki
- Wykazano skuteczność przepływu pracy w ocenie mediatorów.
- Podkreślono znaczenie ustandaryzowanych technik dla odtwarzalności.
- Dostarczono informacji na temat mechanizmów przerzutów czerniaka.
- Ułatwiono testowanie kandydatów pochodzących z danych Omics.
Wnioski
- Przepływ pracy jest cennym narzędziem dla badań nad czerniakiem.
- Standaryzacja zwiększa wiarygodność badań in vivo.
- To podejście można dostosować do innych nowotworów złośliwych.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
This workflow addresses the critical need for reproducible in vivo validation of metastasis regulators, reducing false positives from in vitro assays. By enabling precise phenotypic characterization of candidate genes in physiologically relevant models, it supports target de-risking and improves predictive confidence in early discovery. The platform’s adaptability across solid tumor types enhances portfolio-wide applicability for metastasis-focused programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of therapeutic hypotheses in physiologically relevant metastasis models.
- Operational Value: Standardized engraftment and monitoring protocols improve reproducibility across experimental batches.
- Predictive Value: Quantifiable endpoints such as tumor volume and bioluminescent flux support data-driven go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Harvested tissues and sorted tumor cells are compatible with downstream omics platforms like single-cell RNA sequencing.
- Quantitative Outputs: Metastatic burden and anatomic mapping via imaging and immunohistochemistry provide measurable phenotypes for hit validation.
- Scalability: Standardized procedures for intracardiac, intradermal, and subcutaneous injections enable consistent application across cell lines and models.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models capture organ-specific metastasis, including brain and lung, enabling mechanistic insights into tropism and microenvironment interactions.
- Translational Continuity: Integration of imaging, histology, and molecular analysis supports biomarker-aligned progression from discovery to preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Longitudinal monitoring allows early detection of efficacy signals, informing prioritization of candidates for further development.
Pipeline & Workflow Integration
The platform fits within the discovery continuum, bridging initial target identification from omics or in vitro screens to functional in vivo validation before lead optimization.
- Discovery Biology: Tests candidates inferred from omics data in a physiological context to clarify role in metastatic dissemination.
- Screening: Standardized injection and imaging techniques ensure reproducible compound or genetic perturbation evaluation.
- Analytics: Bioluminescent flux, tumor volume, and immunohistochemical quantification enable objective comparison across conditions.
- Translational Research: Anatomic mapping of metastases supports correlation with clinical patterns and biomarker relevance.
- Enterprise Reuse: Standardized workflows can be applied across tumor types and therapeutic areas, maximizing infrastructure investment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking genetic or pharmacological perturbations to metastatic phenotypes in vivo.
- Operational Value: Standardized protocols minimize variability, enhancing cross-lab and cross-project consistency.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering non-functional targets early, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on validated in vivo efficacy and mechanistic insight.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgery, anesthesia, and aseptic technique for intracardiac and intradermal injections.
- Dependence on imaging infrastructure (ultrasound, bioluminescence) and trained personnel for longitudinal monitoring.
- Necessitates standardized tissue processing pipelines for histology, immunofluorescence, and omics compatibility.
- Adaptation considerations include model-specific engraftment efficiency and metastatic tropism across cancer types.
- Practical limitations include animal welfare monitoring and endpoint-defined survival constraints affecting study duration.
