Name: Wydajna i skalowalna produkcja pełnowymiarowych wariantów ludzkiej huntingtyny w komórkach ssaków przy użyciu systemu ekspresji przejściowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Poznaj protokół produkcji pełnowymiarowych wariantów białka huntingtyny w komórkach HEK293 z zastosowaniem chromatografii afinitetowej. Ta metoda zapewnia ponad 95% czystości białka niezbędnego do badań nad chorobą Huntingtona.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Wydziałowi Nauk Farmaceutycznych Uniwersytetu Stanowego Nowego Jorku w Buffalo za przeprowadzenie analizy HTT w kierunku stwardnienia rozsianego. Praca ta była wspólnym wysiłkiem Fundacji CHDI. W szczególności dziękujemy Elizabeth M. Doherty; Ignacio Muñoz-Sanjuan; Douglas Macdonald, Fundacja CHDI; oraz Rory'emu Curtisowi, Kurii, za ich nieoceniony wkład w przygotowanie tego manuskryptu. Jesteśmy również wdzięczni Michele Luche, Mithrze Mahmoudi i Stephanie Fox za ich wsparcie w tym wysiłku badawczym.

<ol><li>Walker, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease.</a> Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).</li>
<li>McColgan, P., Tabrizi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+a+clinical+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: a clinical review.</a> European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).</li>
<li>Duyao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trinucleotide+repeat+length+instability+and+age+of+onset+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Trinucleotide repeat length instability and age of onset in Huntington's disease.</a> Nature Genetics. 4 (4), 387-392 (1993).</li>
<li>MacDonald, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Nasir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+Huntington%27s+disease+gene+results+in+embryonic+lethality+and+behavioral+and+morphological+changes+in+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the Huntington's disease gene results in embryonic lethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes.</a> Cell. 81 (5), 811-823 (1995).</li>
<li>Dragatsis, I., Levine, M. S., Zeitlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Hdh+in+the+brain+and+testis+results+in+progressive+neurodegeneration+and+sterility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Hdh in the brain and testis results in progressive neurodegeneration and sterility in mice.</a> Nature Genetics. 26 (3), 300-306 (2000).</li>
<li>Anne, S. L., Saudou, F., Humbert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+huntingtin+by+cyclin-dependent+kinase+5+is+induced+by+DNA+damage+and+regulates+wild-type+and+mutant+huntingtin+toxicity+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of huntingtin by cyclin-dependent kinase 5 is induced by DNA damage and regulates wild-type and mutant huntingtin toxicity in neurons.</a> Journal of Neuroscience. 27 (27), 7318-7328 (2007).</li>
<li>Dietrich, P., Johnson, I. M., Alli, S., Dragatsis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+huntingtin+in+the+adult+mouse+leads+to+progressive+behavioral+deficits%2C+bilateral+thalamic+calcification%2C+and+altered+brain+iron+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Elimination of huntingtin in the adult mouse leads to progressive behavioral deficits, bilateral thalamic calcification, and altered brain iron homeostasis.</a> PLoS Genetics. 13 (7), 1006846(2017).</li>
<li>Dragatsis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+early+embryonic+deletion+of+huntingtin+from+pyramidal+neurons+on+the+development+and+long-term+survival+of+neurons+in+cerebral+cortex+and+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Effect of early embryonic deletion of huntingtin from pyramidal neurons on the development and long-term survival of neurons in cerebral cortex and striatum.</a> Neurobiology of Disease. 111, 102-117 (2018).</li>
<li>Benn, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+modulates+transcription%2C+occupies+gene+promoters+in+vivo%2C+and+binds+directly+to+DNA+in+a+polyglutamine-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Huntingtin modulates transcription, occupies gene promoters in vivo, and binds directly to DNA in a polyglutamine-dependent manner.</a> Journal of Neuroscience. 28 (42), 10720-10733 (2008).</li>
<li>Saudou, F., Humbert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The biology of huntingtin.</a> Neuron. 89 (5), 910-926 (2016).</li>
<li>Davies, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+neuronal+intranuclear+inclusions+underlies+the+neurological+dysfunction+in+mice+transgenic+for+the+HD+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of neuronal intranuclear inclusions underlies the neurological dysfunction in mice transgenic for the HD mutation.</a> Cell. 90 (3), 537-548 (1997).</li>
<li>DiFiglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+huntingtin+in+neuronal+intranuclear+inclusions+and+dystrophic+neurites+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain.</a> Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).</li>
<li>Gutekunst, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+neuropil+aggregates+in+Huntington%27s+disease%3A+Relationship+to+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nuclear and neuropil aggregates in Huntington's disease: Relationship to neuropathology.</a> Journal of Neuroscience. 19 (7), 2522-2534 (1999).</li>
<li>Hodgson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+YAC+mouse+model+for+Huntington%27s+disease+with+full-length+mutant+huntingtin%2C+cytoplasmic+toxicity%2C+and+selective+striatal+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A YAC mouse model for Huntington's disease with full-length mutant huntingtin, cytoplasmic toxicity, and selective striatal neurodegeneration.</a> Neuron. 23 (1), 181-192 (1999).</li>
<li>Hoffner, G., Djian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+aggregation+in+Huntington+disease%3A+does+structure+determine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine aggregation in Huntington disease: does structure determine toxicity.</a> Molecular Neurobiology. 52 (3), 1297-1314 (2015).</li>
<li>Waldvogel, H. J., Kim, E. H., Tippett, L. J., Vonsattel, J. P. G., Faull, R. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropathology+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Behavioral+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The neuropathology of Huntington's disease.</a> Current Topics in Behavioral Neurosciences. 22, 33-80 (2014).</li>
<li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+conformation+of+polyglutamine+track+revealed+by+a+crystal+structure+of+huntingtin+N-terminal+region+with+insertion+of+three+histidine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Beta conformation of polyglutamine track revealed by a crystal structure of huntingtin N-terminal region with insertion of three histidine residues.</a> Prion. 7 (3), 221-228 (2013).</li>
<li>Hoop, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+exon+1+fibrils+feature+an+interdigitated+%CE%B2-hairpin-based+polyglutamine+core%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Huntingtin exon 1 fibrils feature an interdigitated β-hairpin-based polyglutamine core.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1546-1551 (2016).</li>
<li>Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intein-based+strategy+for+the+production+of+tag-free+huntingtin+exon+1+proteins+enables+new+insights+into+the+polyglutamine+dependence+of+Httex1+aggregation+and+fibril+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An intein-based strategy for the production of tag-free huntingtin exon 1 proteins enables new insights into the polyglutamine dependence of Httex1 aggregation and fibril formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).</li>
<li>Seong, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+facilitates+polycomb+repressive+complex+2%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin facilitates polycomb repressive complex 2.</a> Human Molecular Genetics. 19 (4), 573-583 (2009).</li>
<li>Li, W., Serpell, L. C., Carter, W. J., Rubinsztein, D. C., Huntington, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+full-length+human+huntingtin%2C+an+elongated+HEAT+repeat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of full-length human huntingtin, an elongated HEAT repeat protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15916-15922 (2006).</li>
<li>Vijayvargia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin%27s+spherical+solenoid+structure+enables+polyglutamine+tract-dependent+modulation+of+its+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Huntingtin's spherical solenoid structure enables polyglutamine tract-dependent modulation of its structure and function.</a> eLife. 5, 11184(2016).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+production+in+human+cells+and+biochemical+characterization+of+full-length+normal+and+mutant+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Scalable production in human cells and biochemical characterization of full-length normal and mutant huntingtin.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0121055(2015).</li>
<li>Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cryo-electron+microscopy+structure+of+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The cryo-electron microscopy structure of huntingtin.</a> Nature. 555 (7694), 117-120 (2018).</li>
<li>Harding, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+characterization+of+mutant+and+wildtype+huntingtin+proteins+produced+from+a+toolkit+of+scalable+eukaryotic+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Design and characterization of mutant and wildtype huntingtin proteins produced from a toolkit of scalable eukaryotic expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (17), 6986-7001 (2019).</li>
<li>Harding, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAP40+orchestrates+huntingtin+structure+for+1+differential+interaction+with+polyglutamine+2+expanded+exon+1%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">HAP40 orchestrates huntingtin structure for 1 differential interaction with polyglutamine 2 expanded exon 1.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+polyQ+expansion+does+not+alter+the+conformation+of+the+Huntingtin-HAP40+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Pathological polyQ expansion does not alter the conformation of the Huntingtin-HAP40 complex.</a> Structure. 29 (8), 804-809 (2021).</li>
<li>Colin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+phosphorylation+acts+as+a+molecular+switch+for+anterograde%2Fretrograde+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Huntingtin phosphorylation acts as a molecular switch for anterograde/retrograde transport in neurons.</a> EMBO Journal. 27 (15), 2124-2134 (2008).</li>
<li>Thompson, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK+phosphorylates+Huntingtin+and+targets+it+for+degradation+by+the+proteasome+and+lysosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IKK phosphorylates Huntingtin and targets it for degradation by the proteasome and lysosome.</a> Journal of Cell Biology. 187 (7), 1083-1099 (2009).</li>
<li>Ratovitski, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+%28PTMs%29%2C+identified+on+endogenous+Huntingtin%2C+cluster+within+proteolytic+domains+between+HEAT+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications (PTMs), identified on endogenous Huntingtin, cluster within proteolytic domains between HEAT repeats.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2692-2708 (2017).</li>
<li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+western+blot+data%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A defined methodology for reliable quantification of western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li>
<li>Tarazona, M. P., Saiz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+SEC%2FMALS+experimental+procedures+and+theoretical+analysis+for+studying+the+solution+properties+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Combination of SEC/MALS experimental procedures and theoretical analysis for studying the solution properties of macromolecules.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 56 (1-3), 95-116 (2003).</li>
<li>Folta-Stogniew, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomeric+states+of+proteins+determined+by+size-exclusion+chromatography+coupled+with+light+scattering%2C+absorbance%2C+and+refractive+index+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors.</a> Methods in Molecular Biology. 328, Clifton, N.J. 97-112 (2006).</li>
<li>McMeekin, T. L., Wilensky, M., Groves, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractive+indices+of+proteins+in+relation+to+amino+acid+composition+and+specific+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Refractive indices of proteins in relation to amino acid composition and specific volume.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7 (2), 151-156 (1962).</li>
<li>Atwal, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+has+a+membrane+association+signal+that+can+modulate+huntingtin+aggregation%2C+nuclear+entry+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity.</a> Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).</li>
<li>Kegel-Gleason, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+interactions+with+membrane+phospholipids%3A+Strategic+targets+for+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Huntington%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Huntingtin interactions with membrane phospholipids: Strategic targets for therapeutic intervention.</a> Journal of Huntington's Disease. 2 (3), 239-250 (2013).</li>
<li>Michalek, M., Salnikov, E. S., Werten, S., Bechinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+interactions+of+the+amphipathic+amino+terminus+of+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane interactions of the amphipathic amino terminus of huntingtin.</a> Biochemistry. 52 (5), 847-858 (2013).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Nissley, D. A., O'Brien, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+co-translational+processing+plays+a+role+in+huntington%27s+pathogenesis-A+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered co-translational processing plays a role in huntington's pathogenesis-A hypothesis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 54(2016).</li>
<li>Kumar, N., Gammell, P., Clynes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+control+strategies+to+improve+productivity+and+survival+during+CHO+based+production+culture%3A+A+summary+of+recent+methods+employed+and+the+effects+of+proliferation+control+in+product+secreting+CHO+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Proliferation control strategies to improve productivity and survival during CHO based production culture: A summary of recent methods employed and the effects of proliferation control in product secreting CHO cell lines.</a> Cytotechnology. 53 (1-3), 33-46 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów z treścią niniejszego artykułu.

Opisujemy tutaj metodę transfekcji, ekspresji i oczyszczania w celu wygenerowania wielu konstruktów białkowych FL HTT o odpowiedniej czystości i jednorodności do wykorzystania jako wzorce do opracowywania testów immunologicznych i MS, kontroli do analizy western blot oraz do badań struktura-funkcja. Ta metoda ekspresji przejściowej jest skalowalna i wszechstronna oraz umożliwia użytkownikowi generowanie niskomiligramowych ilości wariantów FL HTT w bardziej efektywny sposób niż przy użyciu stabilnych linii komórkowych lub metod opartych na wirusach opisanych wcześniej 21,22,23,24. Rutynowo, 2-5 mg wysoce oczyszczonego FL HTT można wygenerować z produkcji białka w skali 2 litrów w czasie krótszym niż tydzień przy użyciu metody ekspresji przejściowej po skonstruowaniu plazmidu, z typową wydajnością 1-2,5 mg FL HTT na litr hodowli komórkowej.
Opisana tutaj metoda ekspresji przejściowej pokonuje wiele przeszkód w stabilnej ekspresji linii komórkowych, takich jak długi czas potrzebny do ustanowienia linii komórkowych oraz trudności w przechowywaniu i utrzymywaniu stabilnych linii komórkowych. PEI jest również stosunkowo niedrogi w porównaniu z innymi odczynnikami do transfekcji dostępnymi na rynku, dzięki czemu transfekcja na dużą skalę jest ekonomicznie opłacalna. Istnieją również ograniczenia w protokole: skuteczność transfekcji w dużej mierze zależy od jakości plazmidów, optymalnego wzrostu komórek oraz tego, jak dobrze PEI jest przechowywany i przygotowywany. Operatorzy muszą zachować szczególną ostrożność i przeprowadzać kontrole jakości na tych krytycznych etapach, aby uniknąć drastycznego spadku wydajności białka. Żywica Anti-FLAG zastosowana w protokole jest również stosunkowo droga i wykazuje zmniejszone wychwytywanie FL HTT po kilku oczyszczaniach i regeneracjach. Niektórzy badacze mogą uznać, że bardziej praktyczne jest przejście na inny znacznik, aby umożliwić bardziej solidną regenerację żywicy powinowactwa.
Przetestowano różne linie komórkowe i warunki ekspresji w celu optymalizacji poziomów ekspresji FL HTT. Komórki HEK293 zostały wybrane do ekspresji FL HTT ze względu na wysoką ekspresję białka i łatwość obsługi w formie hodowli zawiesinowej, dzięki czemu metoda ta jest odpowiednia do ekspresji na dużą skalę w wytrząsarkach lub bioreaktorach. Wyższy poziom ekspresji białka FL HTT można osiągnąć w niższych temperaturach hodowli, takich jak 32 °C, zamiast zwyczajowej temperatury 37 °C. Możliwe, że niższa temperatura może spowolnić syntezę białek i sprzyjać prawidłowemu fałdowaniu FL HTT40. Zjawisko to nie jest jednak specyficzne dla FL HTT ani badanych linii komórkowych. Obniżona temperatura po transfekcji jest szeroko stosowana w ekspresji białek farmaceutycznych w komórkach CHO. Chociaż mechanizm nie jest w pełni zrozumiały, uważa się, że niskie temperatury zatrzymują cykl komórkowy w fazie G1 i kierują energię komórkową do produkcji białek41.
Pełnowymiarowy HTT oczyszczony z komórek ssaków koeluuje się z chaperonem Hsp7024, a etapy płukania Mg-ATP mogą usunąć białko Hsp70. Co ciekawe, koeluowanego Hsp70 nie obserwuje się w FL HTT oczyszczonym z systemu ekspresji komórek owadów 21,22,23. Może to odzwierciedlać różnicę w PTM FL HTT lub odpowiedzi białek szoku cieplnego na nadekspresję FL HTT w komórkach ssaków i owadów. Po usunięciu rekombinowanego białka z Hsp70, do ustabilizowania monomerycznej formy FL HTT wymagane są niejonowe detergenty, takie jak CHAPS lub DDM.
Stany oligomeryzacji wariantów FL HTT analizowano przy użyciu Blue Native PAGE i SEC-MALS. Niewielka frakcja dimerycznego i oligomerycznego HTT wyższego rzędu była obecna, gdy była analizowana przez Blue Native PAGE lub SEC-MALS. Warto zauważyć, że oligomery wyższego rzędu utworzone przez FL HTT nie wydają się korelować z długością polyQ, a nawet mutant delecji Exon1 wykazuje podobny stosunek oligomer-dimer-monomer. Rzeczywiste różnice w zawartości oligomerów między tymi konstruktami są prawdopodobnie spowodowane niewielkimi różnicami w produkcji i obchodzeniu się z każdą partią. W przeciwieństwie do agregatów i włókien utworzonych przez HTT Exon140,41, oligomery FL HTT o wyższym rzędzie pozostały rozpuszczalne i mogły być analizowane przez SEC i Native PAGE.
Oczyszczony monomeryczny FL HTT jest tylko stosunkowo stabilny. Długotrwałe przechowywanie w temperaturze 4 °C, krótka inkubacja w temperaturze pokojowej lub stężenia > 1 mg/ml przekształcą monomeryczny FL HTT w dimeryczne i oligomeryczne formy o wyższym rzędzie, nawet jeśli w tych warunkach nie zaobserwuje się widocznych opadów. Oczyszczony monomeryczny FL HTT utrzymywany na poziomie ≤1 mg/ml pozostawał względnie stabilny w temperaturze -80 °C w buforze magazynowym (50 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 5% v/v glicerolu, 0,5% w/v CHAPS i 5 mM DTT), jak opisano wcześniej24. Do 6 cykli zamrażania i rozmrażania FL HTT przygotowanego i przechowywanego w ten sposób nie powodowało widocznego wytrącania się białka, chociaż SEC-MALS zaobserwował niewielkie przesunięcie do wyższego stanu oligomerycznego (rysunek uzupełniający S2). Próbki zostały również przeanalizowane przez SDS PAGE po powtarzających się cyklach zamrażania i rozmrażania. Nie zaobserwowano widocznych opadów; SDS-PAGE nie zaobserwował żadnych agregatów ani dodatkowych produktów degradacji (rysunek uzupełniający S3). Długoterminowa stabilność oczyszczonego FL HTT jest nadal badana. W przypadku braku jednoznacznych danych długoterminowych zalecamy przechowywanie oczyszczonego FL HTT w temperaturze -80 °C nie dłużej niż 6 miesięcy.
Wysokiej jakości, rekombinowane warianty białka FL HTT i metody ich produkcji są bardzo poszukiwane przez społeczność badawczą HD. Białka te są wykorzystywane jako testy immunologiczne i wzorce analityczne SM, w badaniach strukturalnych oraz do opracowywania nowych testów specyficznych dla FL HTT. Opisane tutaj metody ekspresji przejściowej na dużą skalę konsekwentnie wytwarzały miligramowe ilości wariantów FL HTT o czystości >95%, dostarczając niezbędnych narzędzi do badań HTT. Produkcja dziesiątek miligramów wysoko oczyszczonych wariantów FL HTT polyQ i innych mutantów w celu wsparcia badań nad HD stała się rutyną.

Choroba Huntingtona (HD) jest rzadką chorobą neurodegeneracyjną, charakteryzującą się głównie niestabilnymi i mimowolnymi ruchami motorycznymi, a także zmianami poznawczymi i psychiatrycznymi, takimi jak zmiany osobowości i apatia1,2. Choroba Huntingtona jest związana z rozszerzeniem drogi powtórzeń CAG zlokalizowanej w eksonie 1 genu huntingtyny (HTT) do ponad 35 powtórzeń, przy czym większa liczba powtórzeń CAG koreluje z wcześniejszym początkiem choroby3,4. Produkt translacyjny HTT, białko huntingtyny (HTT), jest zaangażowany w żywotność neuronów i rozwój mózgu5,6,7,8,9.
HTT to białko rusztowania, które według doniesień uczestniczy w szerokim zakresie procesów komórkowych, transportu pęcherzyków, podziału komórek, ciliogenezy i autofagii10,11. Jednak molekularna patogeneza HD nie jest do końca jasna, a identyfikacja kluczowych interaktorów białkowych pośredniczących w patologicznym wpływie mHTT ekspandowanego poliQ jest niepełna. Niektóre badania sugerują wzrost toksycznej funkcji mHTT spowodowany skłonnością do oligomeryzacji ekspandowanego białka HTT, ponieważ agregaty HTT zostały zidentyfikowane w neuronach i gleju u pacjentów z HD i zwierzęcych modelach choroby12,13,14,15,16,17. Aby wesprzeć badania nad funkcją i strukturą wariantów FL HTT i mHTT oraz zapewnić naukowcom wysokiej jakości standardy białka do opracowywania testów, potrzebne jest solidne i skalowalne zaopatrzenie w jednorodne białko rekombinowane.
Ze względu na swój rozmiar (aa 1-3,144, numeracja na podstawie długości polyQ Q23), niestabilność proteolityczną i skłonność do agregacji, FL HTT okazał się trudny do wyrażenia i wyizolowania jako rozpuszczalne białko. Wcześniej region eksonu 1 (aa 2-90) HTT był wyrażany i oczyszczany na dużą skalę przy użyciu różnych znaczników, które mogą zwiększyć rozpuszczalność białka w Escherichia coli18,19,20. FL HTT został po raz pierwszy wyrażony i oczyszczony w systemie ekspresji komórek owadów przy użyciu baculovirus21,22, a struktury mikroskopii elektronowej (EM) o niskiej rozdzielczości 30 A chemicznie usieciowanych FL Q23-HTT i Q78-HTT zostały zgłoszone23. Badania nad strukturą HTT posunęły się jeszcze bardziej, gdy w komórkach ludzkich przy użyciu stabilnych linii komórkowych lub ><systemów ekspresji adenowirusa osiągnięto produkcję FL Q17, Q46 i Q128-HTT z natywnymi modyfikacjami potranslacyjnymi (PTM). Badania te sugerują, że chociaż oczyszczony HTT występuje głównie w stanie monomerycznym, ma również tendencję do tworzenia oligomerów i agregatów wysokiego rzędu.
Analityczne ultrawirowanie FL Q128-HTT, z wysoce rozwiniętym regionem polyQ, dostarczyło więcej frakcji oligomerycznych i zagregowanych niż białko z nieekspandowanym regionem polyQ24. Wykorzystując stabilną linię komórkową, z powodzeniem zaadaptowano strategię stabilizacji FL HTT poprzez koekspresję z partnerem interakcji HAP40. Struktura krio-EM kompleksu FL HTT i HAP40 została rozwiązana w średniej rozdzielczości 4 A przy użyciu oczyszczonego kompleksu białkowego (PDB:6EZ8)25. Ta strategia koekspresji została z powodzeniem zaadaptowana do systemu bakulowirusa, a seria wysokiej jakości wariantów HTT o różnych długościach polyQ została wyrażona i oczyszczona z komórek owadów26. Od tego czasu więcej struktur krio-EM kompleksu HTT o zmiennych długościach polyQ i strukturach HAP40 i wyższej rozdzielczości zostało rozwiązanych i zdeponowanych w Bazie Danych Białek27,28 (PDB: 7DXK, 7DXH, 6X9O).
Zoptymalizowaliśmy metodę transfekcji i ekspresji w komórkach HEK293, używając polietylenininy (PEI), do szybkiej przejściowej ekspresji FL HTT. Jako dowód słuszności zasady, warianty FL HTT zawierające 23 glutaminy (FL Q23-HTT) zostały najpierw oczyszczone i scharakteryzowane przy użyciu modyfikacji metody oczyszczania opisanej wcześniej24. Ta metoda transfekcji przejściowej jest wygodna, wysoce wydajna i skalowalna; może wytwarzać oczyszczony HTT z wydajnością 1-2 mg / L, porównywalną z metodą stabilnej linii komórkowej reported24. Ponieważ białko jest wytwarzane w ludzkiej linii komórkowej, wytworzone HTT jest bardziej prawdopodobne, że będzie miało natywne ludzkie PTM po poddaniu analizie proteomicznej spektrometrii mas11,29,30,31. Wyprodukowano miligramowe ilości wariantów FL Q48-HTT, FL Q73-HTT i wariantów FL HTT z delecją ekson1 (ΔExon1-HTT), co pokazuje, że metoda ekspresji przejściowej jest szczególnie przydatna w szybkim wytwarzaniu alternatywnych wariantów HTT bez konieczności podejmowania czasochłonnego wysiłku wymaganego do ustanowienia stabilnych linii komórkowych do produkcji.
Poniższy protokół ilustruje standardową metodę stosowaną w laboratorium tych autorów do hodowli komórek, transfekcji, oczyszczania białek i charakterystyki białek po oczyszczeniu do produkcji FL Q23-HTT z hodowli komórkowej o pojemności 2 litrów. Protokół może być skalowany do większych kultur lub dostosowany do oczyszczania innych wariantów HTT. Do 10 kultur komórek L FL HTT oraz różne mutacje miejscowe lub skrócone homologów HTT i HTT zostały pomyślnie przeprowadzone w laboratorium przy użyciu tego samego protokołu. Oczyszczony FL HTT zawiera wysoki procent monomerów wraz z dimerami i oligomerami wyższego rzędu. Ten sam zagregowany profil obserwuje się wśród wytworzonych wariantów (Q23, Q48, Q73 i usunięty Exon1). Ponieważ agregacja może zachodzić, gdy nie zostanie zachowana odpowiednia ostrożność, przeprowadzono badanie odporności preparatu i stabilności zamrażania i rozmrażania w celu określenia najlepszych warunków obchodzenia się z białkiem. Opisano również metody, takie jak Blue Native PAGE i SEC/MALS-RI, służące do analizy zawartości oligomerów HTT w ramach procesu kontroli jakości. Aby przynieść korzyści społeczności badawczej HD, plazmidy i białka HTT opisane w tym badaniu są również zdeponowane w Repozytorium Społeczności HD w Instytucie Coriell (www.coriell.org/1/CHDI).

<table><tbody><tr><td>Koncentrator 100 kDa - Amicon</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td>Protokół Numer sekcji-6.2.4</td></tr><tr><td>20x niebieski natywny bufor uruchomiony PAGE</td><td>Protokół Invitrogen</td><td>BN2001</td><td>Numer sekcji-8.1</td></tr><tr><td>20x TBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI28358</td><td>Protokół Numer sekcji-5.1 4x</td></tr><tr><td>niebieski natywny bufor próbki PAGE</td><td>Invitrogen</td><td>BN2003 Protokół Invitrogen BN2003</td><td>Numer sekcji-8.3</td></tr><tr><td>4x bufor ładujący LDS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td>Protokół Numer sekcji-5.3</td></tr><tr><td>Kolby Erlenmeyera</td><td>5 L Protokół Corning</td><td>431685</td><td>Numer sekcji-4.2</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu agarozowego</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Protokół Numer sekcji-2.2</td></tr><tr><td>Środek przeciwzbrylający</td><td>Thermo Fisher</td><td>0010057AE</td><td>Protokół Numer sekcji-4.8</td></tr><tr><td>powinowactwo anty-FLAG M2 żel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>Numer sekcji protokołu-6.1.1</td></tr><tr><td>anty-FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td>Protokół numer sekcji-5.7</td></tr><tr><td>Przeciwpieniąco-Excell przeciwpieniący</td><td>Sigma</td><td>59920C-1B</td><td>Numer sekcji protokołu-4.8</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A6419</td> Numer <td>sekcji protokołu 6.1.4.4</td></tr><tr><td>BEH 450 SEC</td><td>Waters</td><td>186006851</td><td>2,5 &mikro; m x 4,6 mm x 150 mm Protokół Numer sekcji-7.3</td></tr><tr><td>niebieski natywny STRONA 5% Dodatek do próbek G-250</td><td>Protokół Invitrogen</td><td>BN2004</td><td>Numer sekcji-8.3</td></tr><tr><td>karbenicylina</td><td>Thermo Fisher</td><td>10177012</td><td>Protokół Nr sekcji-2.5</td></tr><tr><td>Wirówka - Sorvall Lynx 6000</td><td>Thermo Fisher</td><td>75006590</td><td>Protokół Nr sekcji-6.1.3</td></tr><tr><td>Licznik komórek - ViCELL</td><td>BECKMAN COULTER</td><td></td><td>Numer sekcji protokołu-4.3</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Anatrace</td><td>C316S</td><td>Numer sekcji protokołu-6.1.4.6</td></tr><tr><td>Właściwe komórki E. coli-TOP10</td><td>Protokół Invitrogen</td><td>C404010</td><td>Numer sekcji-2.4</td></tr><tr><td>digitonina</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Sekcja protokołu numer 5.1</td></tr> detektor <tr><td>różnicowego indeksu refrakcji</td><td>Wyatt Protokół Wyatt</td><td></td><td>Numer sekcji-7.1</td></tr><tr>Usługa syntezy <td>peptydów peptydu DYKDDDDK</td><td>Genscript</td><td></td><td> Numer sekcji protokołu 5.1.4.6</td></tr><tr>Protokół<td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS</td><td>Numer sekcji-5.1</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Giga Kit</td><td>Qiagen</td><td>12391</td><td>Numer sekcji protokołu-3.3</td></tr><tr><td>Woda wolna od endotoksyn</td><td>Cytiva</td><td>SH30529.03</td><td>Numer sekcji protokołu-4.1</td></tr><tr><td>zestaw do oznaczania ilościowego endotoksyn-CRL System wykrywania Endosafe Nexgen-PTS</td> Charles <td>River</td><td>PTS150K</td><td>Protokół Numer sekcji-3.4</td></tr><tr><td>Wirnik o stałym kącie Wirnik A23-6x100</td><td>Protokół Thermo Fisher</td><td>75003006</td><td>Numer sekcji-6.1.3</td></tr><tr><td>Oprogramowanie FPLC - Jednorożec 6.2</td><td>Protokół Cytiva</td><td></td><td>Numer sekcji-6.1.4</td></tr><tr><td>Synteza genów</td><td>Genscript</td><td></td><td>Usługa syntezy genów Protokół Numer sekcji-1.2</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific Glycerol (certyfikowany ACS)</td><td>G33-4</td><td>Protokół numer 5.6</td></tr><tr><td>Pożywka wzrostowa-Expi293 Podłoże do wyrażania</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1435102</td><td>Protocol Numer sekcji-4.2</td></tr><tr><td>Ogniwa HEK293</td><td>Thermo Fisher</td><td>R79007</td><td>Sekcja protokołu Numer-4</td></tr><tr><td>wysokie ścinanie homogenizator-Mikrofluidyzator</td><td>MicroFluidics</td><td>LM10</td><td>Protokół Numer sekcji-6.1.3</td></tr><tr><td>HPLC - 1260 nieskończoność II Bio-Insert HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td>Protokół Nr sekcji-7.1</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LiCor</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu Protokół nr 5.1</td></tr><tr><td>MAB2166</td><td></td><td>Sigma MAB2166 Numer sekcji protokołu Sigma-5.7</td><td></td></tr><tr><td>MAB2168</td><td></td><td>Numer sekcji protokołu EMD MAB2168-5.7</td><td></td></tr><tr><td>MAB3E10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47757</td><td>Numer sekcji protokołu-5.7</td></tr><tr><td>MAB4E10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-7757</td><td>Numer sekcji protokołu-5.7</td></tr><tr><td>MAB5490</td> Protokół <td>Sigma</td><td>MAB5490</td><td>numer sekcji-5.7</td></tr><tr><td>MAB5492</td> Numer sekcji protokołu <td>Sigma</td><td></td> MAB5492-5.7 <td></td></tr><tr><td>MAB8A4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47759</td><td>Numer sekcji protokołu-5.7</td></tr><tr><td>Wielokątowy detektor rozpraszania światła</td> Protokół <td>Wyatt</td><td></td><td>Numer sekcji-7.1</td></tr><tr><td>NativeMark Unbared Protein Standard</td><td>Invitrogen</td><td>LC0725</td><td>Protokół Numer sekcji-8.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>Numer sekcji protokołu-5.6</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolab</td><td>R0131S</td><td>Dostępna wersja Hi-Fi Sekcja protokołu nr 2.2</td></tr><tr><td>NuPAGE 3&ndash; 8% żele octanowe Tris</td><td>Protokół Invitrogen</td><td>EA0375PK2</td><td>Numer sekcji-5.4</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Bufor do biegania</td><td>Invitrogen</td><td>LA0041</td><td>Protokół nr sekcji-5.4</td></tr><tr><td>PEI 25K</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td>Numer sekcji protokołu-4.1</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher</td><td>15070063</td><td>Protokół Numer sekcji-4.2</td></tr><tr><td>Fosforan Buforowana sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.02</td><td>Protokół Numer sekcji-4.5</td></tr><tr><td>Zestaw do miniprzygotowania plazmidu</td><td>Qiagen</td><td>27104 Protokół Qiagen 27104</td> Numer <td>sekcji-2.6</td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolab</td><td>R0560S</td><td>Protokół nr sekcji-2.2</td></tr><tr><td>prefabrykowany żel Bis-tris - 3-12% NativePAGE Novex Bis-tris Gel</td><td>Invitrogen</td><td>BN1003BOX</td><td>Protokół Nr sekcji Numer-8.4</td></tr><tr><td>proteaza koktajl inhibitorów</td><td>GoldBio</td><td>GB-331-1</td><td>Protokół Numer sekcji-5.1</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy SEC-MALS - Astra 7</td><td>Wyatt Technology</td><td></td><td>Protocol Sekcja numer sekcji-7.6</td></tr><tr><td>przeciwciało wtórne -IRdye 800 CW koza anty-mysia IgG</td><td>LiCor</td><td>926-32210</td><td>Numer sekcji protokołu-5.9</td></tr><tr><td>Superose 6 pg XK 16/70</td><td>Cytiva</td><td>90100042</td><td>Protokół Numer sekcji-6.2</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td>Protokół nr sekcji-5.6</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher</td><td>AAJ20605AP</td><td>Protokół numer sekcji-6.1.1</td></tr><tr><td>Spektrometr UV - Nanodrop 8000</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-8000-GL</td><td>Numer sekcji protokołu-2.2</td></tr><tr><td>XK26/100</td><td>Cytiva</td><td>28988951</td> Numer <td>sekcji protokołu-6.1.1</td></tr></tbody></table>

wydajna i skalowalna produkcja pełnowymiarowych wariantów ludzkiej huntingtyny w komórkach ssaków przy użyciu systemu ekspresji przejściowej

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Huntingtyna o pełnej długości (FL HTT) to duże (aa 1-3,144), powszechnie wyrażane, białko zawierające poliglutaminę (polyQ) o masie około 350 kDa. Chociaż funkcja komórkowa FL HTT nie jest do końca poznana, zmutowana ekspansja przewodu polyQ powyżej ~36 powtórzeń jest związana z chorobą Huntingtona (HD), przy czym długość polyQ odpowiada mniej więcej wiekowi zachorowania. Aby lepiej zrozumieć wpływ struktury na funkcję zmutowanego HTT (mHTT), potrzebne są duże ilości białka. Submiligramową produkcję FL HTT w komórkach ssaków osiągnięto przy użyciu indukowanej doksycykliną stabilnej ekspresji linii komórkowej. Jednak produkcja białek ze stabilnych linii komórkowych ma ograniczenia, które można przezwyciężyć za pomocą metod transfekcji przejściowej. 
Ten artykuł przedstawia solidną metodę produkcji FL HTT i jego wariantów z plazmidów zoptymalizowanych pod kątem kodonów za pomocą transfekcji przejściowej przy użyciu polietylenininy (PEI). Metoda jest skalowalna (>10 mg) i konsekwentnie daje 1-2 mg/L hodowli komórkowej wysoko oczyszczonego FL HTT. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, stwierdzono, że stan oczyszczonego roztworu FL HTT jest wysoce dynamiczny; Białko ma skłonność do tworzenia dimerów i oligomerów wysokiego rzędu. Kluczem do spowolnienia powstawania oligomerów jest szybka praca nad wyizolowaniem frakcji monomerycznych od dimerycznych i oligomerycznych frakcji wysokiego rzędu podczas chromatografii wykluczania wielkości. 
Chromatografia wykluczania wielkości z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS) została użyta do analizy zawartości dimerów i oligomerów wyższego rzędu w oczyszczonym HTT. Nie zaobserwowano korelacji między długością poliQ FL HTT (Q23, Q48 i Q73) a zawartością oligomerów. Konstrukt delecyjny ekson1 (aa 91-3,144) wykazywał porównywalną skłonność do oligomeryzacji do FL HTT (aa 1-3,144). W niniejszym dokumencie opisano metody wytwarzania, oczyszczania i charakteryzowania za pomocą indeksu refrakcyjnego (RI) SEC/MALS, elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), western blot, Native PAGE i Blue Native PAGE.

Zapewniamy skalowalne protokoły obejmujące projektowanie konstrukcji, transfekcję przejściową oraz ekspresję i oczyszczanie pełnowymiarowych wariantów ludzkiego białka huntingtyny w komórkach HEK293.

Wydajna i skalowalna produkcja pełnowymiarowych wariantów ludzkiej huntingtyny w komórkach ssaków przy użyciu systemu ekspresji przejściowej

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

Protokół został opracowany do produkcji pełnowymiarowych wariantów huntinginy w niskiej skali miligramowej. Pozwala to na uzyskanie stałego, wysokiej jakości białka, które jest niezbędne dla badaczy HD. Procedurę zademonstruje Michael Harris, naukowiec z Curia Laboratory.Zacznij od dodania jednego grama polietylenoiminy 25 K do jednego litra wody wolnej od endotoksyn i dobrze wymieszaj. Dostosuj pH do 2,0 za pomocą 100-milimolowego kwasu solnego i mieszaj, aż cała polietylenomina się rozpuści. Następnie dostosuj pH do 7,0 za pomocą 100-milimolowego roztworu wodorotlenku sodu i przepuść roztwór przez filtr 0,2 mikrometra.Zrób porcje przefiltrowanego roztworu i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Rozmnażaj komórki HEK293 w pożywce wzrostowej uzupełnionej streptomycyną penicyliny w wilgotnym inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 90 obr./min, 5% dwutlenku węgla przez 18 do 24 godzin. Na dzień przed transfekcją rozcieńczyć komórki o gęstości około 1,2 x 10 do szóstych ogniw zasilających na mililitr w dwóch litrach pożywki wzrostowej w pięciolitrowej kolbie Erlenmeyera i inkubować przez 18 do 24 godzin.Pod koniec inkubacji zmierz gęstość i żywotność komórek za pomocą automatycznego licznika komórek, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Po obliczeniu ilości polietylenoiminy i plazmidu potrzebnej do transfekcji, rozcieńczyć polietylenominę i plazmid pojedynczo w 100 mililitrach PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie wymieszaj rozcieńczony plazmid i polietyleninoiminę, delikatnie obracając i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Dodaj mieszaninę do kultury komórkowej i delikatnie mieszaj, delikatnie mieszając. Teraz pozwól komórkom rosnąć przez 24 godziny. Następnego dnia dodać do hodowli roztwór maślanu sodu do końcowego stężenia dwumilimolowego środka przeciwzbrylającego i przeciwpieniącego w stosunku objętościowym 1:1 000 i inkubować komórki w wilgotnym inkubatorze z wytrząsarką przez 48 godzin.Po zmierzeniu żywotności i gęstości komórek, zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 2 000 G przez 30 minut i przechowywać osad komórkowy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przed oczyszczeniem. W celu oczyszczania anty-FLAG za pomocą FPLC, zapakuj od 12 do 25 mililitrów żywicy anty-FLAG na pustą kolumnę z natężeniem przepływu czterech mililitrów na minutę za pomocą buforu A i wyreguluj wysokość tłoka, aby usunąć szczelinę między końcem tłoka a złożem żywicy. Następnie zawiesić rozmrożone osady komórkowe w buforze do lizy na zimno i przepuścić zawiesinę komórek raz przez homogenizator o wysokim ścinaniu pod ciśnieniem 1,000 funtów na cal kwadratowy.Za pomocą wirówki wyposażonej w kompatybilny wirnik o stałym kącie nachylenia sklarować lizat w stężeniu 20 000 G przez jedną godzinę. Zaprogramuj FPLC w oknie Metoda, załaduj oczyszczony lizat przez pompę do próbki i umyj kolumnę żądanymi objętościami kolumny buforu A, B, C, D i buforu elucyjnego zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Po zakończeniu cyklu przeanalizuj 10 mikrolitrów frakcji szczytowych za pomocą SDS-PAGE.Połącz frakcje pikowe o pożądanej czystości i zachowaj około 50 mikrolitrów połączonych eluatów do dalszej analizy SDS-PAGE. Rozpocznij równoważenie kolumny SEC za pomocą FPLC i załaduj eluat anty-FLAG przez 50-mililitrową superpętlę. Po uruchomieniu bufora SEC pozwól, aby separacja SEC nastąpiła przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Porównaj profil elucji ze standardowym profilem elucji HTT, aby odróżnić piki monomerowe, dimerowe i oligomeryczne wyższego rzędu. Połączyć monomeryczne frakcje HTT w oparciu o profil elucji kolumny SEC i, w razie potrzeby, oddzielnie połączyć oligomeryczne i dimeryczne frakcje HTT wyższego rzędu. Zagęścić połączone białko HTT za pomocą 100-kilodaltonowego koncentratora odśrodkowego w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po obliczeniu stężenia białka, podwielokrotność mniej niż 100 mikrolitrów oczyszczonego białka HTT w kriobezpiecznej probówce do mikrowirówki. Błyskawiczne zamrożenie porcji za pomocą ciekłego azotu i przechowywanie ich w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Wykonaj wszystkie analityczne SEC-MALS w czterech stopniach Celsjusza w systemie HPLC, w połączeniu z detektorem UV, wielokątowym detektorem rozpraszania światła, detektorem różnicowego indeksu załamania światła i użyj 0,185 jako przyrostu współczynnika załamania światła dla HTT.Przedmuchnąć pompę i detektory przefiltrowaną wodą klasy HPLC i podłączyć kolumnę UHPLC do systemu. Zrównoważyć kolumnę przefiltrowaną wodą, a następnie buforem SEC-MALS, aż wszystkie sygnały detektora osiągną linię podstawową. Wstrzyknąć dwa mikrolitry roztworu BSA z natężeniem przepływu 0,3 mililitra na minutę przez 15 minut na wstrzyknięcie.Sprawdź jakość danych, wykonaj normalizację, wyrównanie pików i korekcję poszerzenia pasma w oparciu o profil BSA i utwórz szablon dla kolejnych serii próbek HTT. Szybko rozmrozić fiolkę z próbką FL Q23-HTT w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej za pomocą pływaka. Przefiltruj HTT przez filtr wirowy o średnicy 0,1 mikrometra.Wstrzyknąć od dwóch do czterech mikrolitrów próbki HTT i pracować przez 15 minut w czterech stopniach Celsjusza przy natężeniu przepływu 0,3 mililitra na minutę. Przeanalizuj dane chromatograficzne i rozpraszanie światła za pomocą dołączonego oprogramowania i wygeneruj wykres Zimma, aby określić uśrednioną wagowo masę cząsteczkową dla każdego piku. W niniejszym badaniu, przy użyciu dwuetapowego procesu kolumnowego, uzyskano ponad 95% czystości dla HTT, a głównym zanieczyszczeniem był chaperon Hsp70, który został wyeliminowany przez intensywne płukanie chlorkiem magnezu i ATP podczas etapu oczyszczania powinowactwa anty-FLAG Nadekspresja FL HTT może powodować fragmentację białka, ale FL Q23-HTT wytwarzany metodą rozdzieloną jako pojedyncze prążko o prawidłowej masie cząsteczkowej 350 kilodaltonów wskazuje na brak fragmentacja.Analiza Western blot po reakcji przeciwciał z FL Q23-HTT wykazała, że białko zostało wyizolowane bez istotnych wykrywalnych obcięć, ponieważ nie zaobserwowano żadnych dodatkowych prążków związanych z fragmentami. Wariancja długości FL HTT poly-Q, Q23, Q48 i Q73 zareagowały zgodnie z oczekiwaniami w Western blot, wykazując coraz silniejszy sygnał dla przeciwciała monoklonalnego MW1 skierowanego do poli-Q, korelując ze wzrostem długości Q. Spośród badanych kolumn HPLC kolumna SEC wykazała wystarczającą rozdzielczość między monomerem HTT a dimerem, tak że można było rozróżnić masy molowe.Oczyszczony FL HTT z SEC wykazał wiele prążków odpowiadających stanom oligomeryzacji, co może być spowodowane obecnością kilku hydrofobowych plam, które przyczyniają się do tworzenia oligomerów wyższego rzędu podczas migracji w żelu. Oczyszczony HTT wykazał trzy główne pasma na niebieskim natywnym PAGE o szacowanej masie cząsteczkowej 643, 927 i 1070 kilodaltonów, które prawdopodobnie reprezentują odpowiednio monomeryczne, dimeryczne i trimeryczne gatunki HTT. Właściwe obchodzenie się z oczyszczoną huntingtyną jest niezbędne, aby uniknąć generowania wysoko uporządkowanych oligomerów w rozpuszczalnych agregatach.Konieczne jest, aby użytkownik końcowy działał szybko, aby dozować próbkę do wstępnie schłodzonych probówek przed błyskawicznym zamrożeniem. Długoterminowe badanie stabilności można przeprowadzić na próbkach przechowywanych przez dłuższy czas w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Powtórzone analizy HPLC SEC-MALS potwierdzą, czy nastąpiły jakiekolwiek zmiany w zawartości monomerycznej w próbce.

efficient-scalable-production-full-length-human-huntingtin-variants

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Szybki i prosty sposób na wygenerowanie ludzkich linii komórkowych z indukowalną i odwracalną nadekspresją cDNA lub nokautem za pośrednictwem shRNA interesującego genu. Metoda ta umożliwia naukowcom wiarygodne i wysoce powtarzalne manipulowanie liniami komórkowymi, które są trudne do zmiany za pomocą przejściowych metod transfekcji lub konwencjonalnych strategii knockdown/knockout.

Generowanie stabilnych linii komórek ludzkich z ekspresją shRNA lub cDNA indukowaną tetracykliną (Tet-on)

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

Opisujemy tutaj opłacalny system ekspresji granzymu wykorzystujący komórki HEK293T, który daje wysokie plony czystej, w pełni glikozylowanej i enzymatycznie aktywnej proteazy.

Wysokowydajny i ekonomiczny system ekspresji ludzkich granzymów w komórkach ssaków

To jest szybki, efektywny kosztowo protokół produkcji wydzielanych, glikozylowanych białek ssaków i późniejszego jednoetapowego oczyszczania z wystarczającą wydajnością jednorodnego białka do krystalografii rentgenowskiej i innych badań biofizycznych.

Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Badanie kanałów jonowych za pomocą heterologicznie wyrażającego systemu stało się podstawową techniką w badaniach biomedycznych. W tym manuskrypcie przedstawiamy efektywną czasowo metodę osiągania ściśle kontrolowanej ekspresji kanału jonowego poprzez przeprowadzanie transfekcji przejściowej pod kontrolą indukowalnego promotora.

Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Tutaj prezentujemy solidny i zoptymalizowany protokół produkcji miligramowych ilości natywnych, bezznacznikowych monomerów i włókienek eksonu1 białka huntingtyny (Httex1) w oparciu o przejściową fuzję małego modyfikatora związanego z ubikwityną (SUMO).

Generowanie natywnego, nieznakowanego monomeru i włókien eksonu huntingtyny1 przy użyciu strategii fuzji SUMO

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Rekombinowany BDNF zawierający sekwencję Avi (BDNFAvi) jest wytwarzany w komórkach HEK293 w opłacalny sposób i oczyszczany przez chromatografię powinowactwa. BDNFavi jest następnie bezpośrednio monobiotynylowany enzymem BirA w probówce. BDNFavi i monobiotynylowany BDNFavi zachowują swoją aktywność biologiczną w porównaniu z dostępnym na rynku BDNF.

Ulepszony protokół oczyszczania i bezpośredniego monobiotynylowania rekombinowanego BDNF w probówce do badań nad transportem komórkowym w neuronach

Tutaj prezentowany jest protokół produkcji zawiesiny HEK293 oparty na komórkach AAV, co skutkuje zmniejszeniem czasu i pracy potrzebnej do produkcji wektorów przy użyciu komponentów, które są dostępne do celów badawczych od komercyjnych dostawców.

Produkcja wysokowydajnych partii wektorów związanych z adeno przy użyciu komórek zawiesinowych HEK293

Poznaj protokół produkcji pełnowymiarowych wariantów białka huntingtyny w komórkach HEK293 z zastosowaniem chromatografii afinitetowej. Ta metoda zapewnia ponad 95% czystości białka niezbędnego do badań nad chorobą Huntingtona.

Wydajna i skalowalna produkcja pełnowymiarowych wariantów ludzkiej huntingtyny w komórkach ssaków przy użyciu systemu ekspresji przejściowej (Wideo) | JoVE Journal

Wydajna i skalowalna produkcja pełnowymiarowych wariantów ludzkiej huntingtyny w komórkach ssaków przy użyciu systemu ekspresji przejściowej

Przeglądaj więcej filmów