Wydajna i skalowalna produkcja pełnowymiarowych wariantów ludzkiej huntingtyny w komórkach ssaków przy użyciu systemu ekspresji przejściowej

Protokół został opracowany do produkcji pełnowymiarowych wariantów huntinginy w niskiej skali miligramowej. Pozwala to na uzyskanie stałego, wysokiej jakości białka, które jest niezbędne dla badaczy HD. Procedurę zademonstruje Michael Harris, naukowiec z Curia Laboratory.

Zacznij od dodania jednego grama polietylenoiminy 25 K do jednego litra wody wolnej od endotoksyn i dobrze wymieszaj. Dostosuj pH do 2,0 za pomocą 100-milimolowego kwasu solnego i mieszaj, aż cała polietylenomina się rozpuści. Następnie dostosuj pH do 7,0 za pomocą 100-milimolowego roztworu wodorotlenku sodu i przepuść roztwór przez filtr 0,2 mikrometra.

Zrób porcje przefiltrowanego roztworu i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Rozmnażaj komórki HEK293 w pożywce wzrostowej uzupełnionej streptomycyną penicyliny w wilgotnym inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 90 obr./min, 5% dwutlenku węgla przez 18 do 24 godzin. Na dzień przed transfekcją rozcieńczyć komórki o gęstości około 1,2 x 10 do szóstych ogniw zasilających na mililitr w dwóch litrach pożywki wzrostowej w pięciolitrowej kolbie Erlenmeyera i inkubować przez 18 do 24 godzin.

Pod koniec inkubacji zmierz gęstość i żywotność komórek za pomocą automatycznego licznika komórek, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Po obliczeniu ilości polietylenoiminy i plazmidu potrzebnej do transfekcji, rozcieńczyć polietylenominę i plazmid pojedynczo w 100 mililitrach PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie wymieszaj rozcieńczony plazmid i polietyleninoiminę, delikatnie obracając i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Dodaj mieszaninę do kultury komórkowej i delikatnie mieszaj, delikatnie mieszając. Teraz pozwól komórkom rosnąć przez 24 godziny. Następnego dnia dodać do hodowli roztwór maślanu sodu do końcowego stężenia dwumilimolowego środka przeciwzbrylającego i przeciwpieniącego w stosunku objętościowym 1:1 000 i inkubować komórki w wilgotnym inkubatorze z wytrząsarką przez 48 godzin.

Po zmierzeniu żywotności i gęstości komórek, zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 2 000 G przez 30 minut i przechowywać osad komórkowy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przed oczyszczeniem. W celu oczyszczania anty-FLAG za pomocą FPLC, zapakuj od 12 do 25 mililitrów żywicy anty-FLAG na pustą kolumnę z natężeniem przepływu czterech mililitrów na minutę za pomocą buforu A i wyreguluj wysokość tłoka, aby usunąć szczelinę między końcem tłoka a złożem żywicy. Następnie zawiesić rozmrożone osady komórkowe w buforze do lizy na zimno i przepuścić zawiesinę komórek raz przez homogenizator o wysokim ścinaniu pod ciśnieniem 1,000 funtów na cal kwadratowy.

Za pomocą wirówki wyposażonej w kompatybilny wirnik o stałym kącie nachylenia sklarować lizat w stężeniu 20 000 G przez jedną godzinę. Zaprogramuj FPLC w oknie Metoda, załaduj oczyszczony lizat przez pompę do próbki i umyj kolumnę żądanymi objętościami kolumny buforu A, B, C, D i buforu elucyjnego zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Po zakończeniu cyklu przeanalizuj 10 mikrolitrów frakcji szczytowych za pomocą SDS-PAGE.

Połącz frakcje pikowe o pożądanej czystości i zachowaj około 50 mikrolitrów połączonych eluatów do dalszej analizy SDS-PAGE. Rozpocznij równoważenie kolumny SEC za pomocą FPLC i załaduj eluat anty-FLAG przez 50-mililitrową superpętlę. Po uruchomieniu bufora SEC pozwól, aby separacja SEC nastąpiła przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Porównaj profil elucji ze standardowym profilem elucji HTT, aby odróżnić piki monomerowe, dimerowe i oligomeryczne wyższego rzędu. Połączyć monomeryczne frakcje HTT w oparciu o profil elucji kolumny SEC i, w razie potrzeby, oddzielnie połączyć oligomeryczne i dimeryczne frakcje HTT wyższego rzędu. Zagęścić połączone białko HTT za pomocą 100-kilodaltonowego koncentratora odśrodkowego w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po obliczeniu stężenia białka, podwielokrotność mniej niż 100 mikrolitrów oczyszczonego białka HTT w kriobezpiecznej probówce do mikrowirówki. Błyskawiczne zamrożenie porcji za pomocą ciekłego azotu i przechowywanie ich w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Wykonaj wszystkie analityczne SEC-MALS w czterech stopniach Celsjusza w systemie HPLC, w połączeniu z detektorem UV, wielokątowym detektorem rozpraszania światła, detektorem różnicowego indeksu załamania światła i użyj 0,185 jako przyrostu współczynnika załamania światła dla HTT.

Przedmuchnąć pompę i detektory przefiltrowaną wodą klasy HPLC i podłączyć kolumnę UHPLC do systemu. Zrównoważyć kolumnę przefiltrowaną wodą, a następnie buforem SEC-MALS, aż wszystkie sygnały detektora osiągną linię podstawową. Wstrzyknąć dwa mikrolitry roztworu BSA z natężeniem przepływu 0,3 mililitra na minutę przez 15 minut na wstrzyknięcie.

Sprawdź jakość danych, wykonaj normalizację, wyrównanie pików i korekcję poszerzenia pasma w oparciu o profil BSA i utwórz szablon dla kolejnych serii próbek HTT. Szybko rozmrozić fiolkę z próbką FL Q23-HTT w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej za pomocą pływaka. Przefiltruj HTT przez filtr wirowy o średnicy 0,1 mikrometra.

Wstrzyknąć od dwóch do czterech mikrolitrów próbki HTT i pracować przez 15 minut w czterech stopniach Celsjusza przy natężeniu przepływu 0,3 mililitra na minutę. Przeanalizuj dane chromatograficzne i rozpraszanie światła za pomocą dołączonego oprogramowania i wygeneruj wykres Zimma, aby określić uśrednioną wagowo masę cząsteczkową dla każdego piku. W niniejszym badaniu, przy użyciu dwuetapowego procesu kolumnowego, uzyskano ponad 95% czystości dla HTT, a głównym zanieczyszczeniem był chaperon Hsp70, który został wyeliminowany przez intensywne płukanie chlorkiem magnezu i ATP podczas etapu oczyszczania powinowactwa anty-FLAG Nadekspresja FL HTT może powodować fragmentację białka, ale FL Q23-HTT wytwarzany metodą rozdzieloną jako pojedyncze prążko o prawidłowej masie cząsteczkowej 350 kilodaltonów wskazuje na brak fragmentacja.

Analiza Western blot po reakcji przeciwciał z FL Q23-HTT wykazała, że białko zostało wyizolowane bez istotnych wykrywalnych obcięć, ponieważ nie zaobserwowano żadnych dodatkowych prążków związanych z fragmentami. Wariancja długości FL HTT poly-Q, Q23, Q48 i Q73 zareagowały zgodnie z oczekiwaniami w Western blot, wykazując coraz silniejszy sygnał dla przeciwciała monoklonalnego MW1 skierowanego do poli-Q, korelując ze wzrostem długości Q. Spośród badanych kolumn HPLC kolumna SEC wykazała wystarczającą rozdzielczość między monomerem HTT a dimerem, tak że można było rozróżnić masy molowe.

Oczyszczony FL HTT z SEC wykazał wiele prążków odpowiadających stanom oligomeryzacji, co może być spowodowane obecnością kilku hydrofobowych plam, które przyczyniają się do tworzenia oligomerów wyższego rzędu podczas migracji w żelu. Oczyszczony HTT wykazał trzy główne pasma na niebieskim natywnym PAGE o szacowanej masie cząsteczkowej 643, 927 i 1070 kilodaltonów, które prawdopodobnie reprezentują odpowiednio monomeryczne, dimeryczne i trimeryczne gatunki HTT. Właściwe obchodzenie się z oczyszczoną huntingtyną jest niezbędne, aby uniknąć generowania wysoko uporządkowanych oligomerów w rozpuszczalnych agregatach.

Konieczne jest, aby użytkownik końcowy działał szybko, aby dozować próbkę do wstępnie schłodzonych probówek przed błyskawicznym zamrożeniem. Długoterminowe badanie stabilności można przeprowadzić na próbkach przechowywanych przez dłuższy czas w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Powtórzone analizy HPLC SEC-MALS potwierdzą, czy nastąpiły jakiekolwiek zmiany w zawartości monomerycznej w próbce.