Synteza masarymycyny, małocząsteczkowego inhibitora wzrostu bakterii Gram-dodatnich

Masarymycyna jest jednym z niewielu inhibitorów autolizyn bakteryjnych, który hamuje wzrost komórek bakteryjnych. Może być stosowany do badania różnic między chemiczną i genetyczną inaktywacją autolizyn i zapewnia ortogonalne podejście do genetyki w celu badania fizjologii bakterii. Synteza masarimycyny może wydawać się zniechęcająca.

Postępuj zgodnie z pokazanymi krokami. W razie wątpliwości, czy etap reakcji zadziałał, potwierdź chromatografię cienkowarstwową i zmiany wartości RF. Na początek przygotuj 0,1-molowy roztwór cykloheksyloaminy, cykloheksylokarboksyaldehydu, kwasu ortojodobenzoesowego i izocyjanku cykloheksylu w metanolu.

Dodać mieszadło magnetyczne, a następnie wymieszać pięć mililitrów cykloheksyloaminy i pięć mililitrów karboksyaldehydu cykloheksylu w kolbie okrągłodennej z nakrętką i umieścić kolbę w kąpieli piaskowej na mieszadle z płytą grzejną na 30 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Monitoruj temperaturę za pomocą termometru umieszczonego około jednego centymetra pod powierzchnią piasku. Po 30 minutach dodaj pięć mililitrów izocyjanku cykloheksylu do roztworu i mieszaj przez dodatkowe 20 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza.

Następnie dodaj pięć mililitrów kwasu orto-jodobenzoesowego do mieszaniny reakcyjnej i kontynuuj mieszanie w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu godzin. Po trzech godzinach mieszania należy okresowo monitorować postęp reakcji za pomocą chromatografii cienkowarstwowej lub TLC, w odstępach około jednogodzinnych. Uznaje się reakcję za zakończoną, gdy na płytce TLC widoczna jest tylko jedna plamka o współczynniku retencji równym 0,3.

Usunąć rozpuszczalnik z parownika obrotowego pod zmniejszonym ciśnieniem. Po odparowaniu całego metanolu należy rozpuścić wysuszony produkt surowy w 30 mililitrach octanu etylu i przenieść go do rozdzielacza. Octan etylu ekstrahować sekwencyjnie jednomolowym kwasem solnym, wodą, nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu, ponownie wodą i nasyconym roztworem chlorku sodu, odrzucając warstwy wodne przy każdej ekstrakcji.

Następnie usunąć warstwę octanu etylu z rozdzielacza i zebrać ją do kolby Erlenmeyera. Dodaj szpatułkę pełną bezwodnego siarczanu sodu, aby usunąć resztki wody z octanu etylu. Przefiltruj wysuszony roztwór octanu etylu przez bibułę filtracyjną numer jeden, aby usunąć siarczan sodu.

Następnie umyj bibułę filtracyjną niewielką ilością octanu etylu. Przefiltrowany roztwór octanu etylu odparowano do sucha na parowniku obrotowym pod zmniejszonym ciśnieniem w celu uzyskania masarymycyny w postaci oleju po usunięciu całego octanu etylu. Rozpuść olej masarimycyny w jednym do dwóch mililitrów roztworu heksanu do izopropanolu w proporcji 9:1 i mieszaj na magnetycznej płytce mieszającej, aż cały związek się rozpuści.

Aby oczyścić rozpuszczoną masarymycynę, należy przeprowadzić chromatografię błyskową z 12-gramową kolumną błyskową krzemionki o normalnej fazie. Zrównoważyć kolumnę błyskową z 10 objętościami fazy ruchomej za pomocą przyrządów ustawionych na natężenie przepływu 15 mililitrów na minutę. Po zakończeniu równoważenia pobrać rozpuszczoną masarymycynę za pomocą pięciomililitrowej strzykawki.

Podłączyć strzykawkę bezpośrednio do górnej części kolumny z wyrównanym zapłonem i wstrzyknąć roztwór do kolumny. Ponownie podłączyć załadowaną kolumnę do systemu chromatografii flash i rozpocząć elucję gradientu. Eluować masarymycynę z kolumny za pomocą elucji gradientowej do końcowego stężenia fazy ruchomej 10:90 heksanu do izopropanolu w ciągu 12 objętości kolumny.

Monitorować elucję masarymycyny poprzez absorpcję w prędkościach 230 i 254 nanometrów. Do badania morfologii hoduj Bacillus subtilis 11774 na płytkach agarowych LB w temperaturze 37 stopni Celsjusza. We wszystkich kolejnych eksperymentach używaj komórek drugiego pasażu hodowanych w pięciu mililitrach bulionu LB, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 1.

Następnie, za pomocą pipety, dodaj masarymycynę do probówek hodowlanych oznaczonych potraktowanych do końcowego stężenia 3,8 mikromola. W przypadku probówek hodowlanych oznaczonych jako kontrolne, dodaj równoważną objętość DMSO. Umieścić próbki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 90 minut z wytrząsaniem przy 150 obr./min.

Po 90 minutach utrwalić chemicznie kultury w mieszaninie pożywek hodowlanych w proporcji 1:10 i utrwalać bufor w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia za pomocą pipety nałóż od 10 do 20 mikrolitrów chemicznie utrwalonych próbek na szklane szkiełka mikroskopowe i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu. Następnie utrwalaj termicznie wysuszone powietrzem próbki, podgrzewając szkiełka podstawowe za pomocą palnika Bunsena.

Po utrwaleniu termicznym wybarwić próbki 100 mikrolitrami 0,1% błękitu metylenowego. Po 10 minutach inkubacji z plamą zmyj nadmiar barwnika wodą destylowaną. Następnie delikatnie podgrzej poplamione szkiełka do 60 stopni Celsjusza w piekarniku przez 15 do 20 minut, aby doprowadzić komórki do wspólnej płaszczyzny ogniskowej.

Zapieczętuj barwione próbki, umieszczając szkiełko osłonowe mikroskopu na wybarwionych komórkach. Następnie uszczelnij krawędzie za pomocą cementu do szkiełek mikroskopowych. Umieść szczelnie zamknięte szkiełko mikroskopowe na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość obrazu przy 100-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopii jasnego pola.

Umieść kroplę olejku immersyjnego na szkiełku mikroskopowym i ustaw ostrość pola widzenia za pomocą 1000-krotnego powiększenia. Mikrofotografie należy uzyskiwać za pomocą kamery dołączonej do mikroskopu i powiązanego z nim oprogramowania. Rób zdjęcia przy użyciu automatycznych ustawień balansu bieli i przysłony w oprogramowaniu.

Chromatografia flash pozwala na szybkie oczyszczenie masarymycyny o wysokiej czystości. Przedstawiono ocenę synergii lub antagonizmu z inhibitorem ATPazy optochiną w S.pneumoniae. Najniższe stężenie związku hamującego rozwój bakterii, oznaczone kolorem niebieskim, jest uważane za minimalną wartość stężenia hamującego w obecności leku towarzyszącego.

Natomiast studzienki o różowym kolorze wskazują na rozwój bakterii. Testy fenotypowe z użyciem masarymycyny w stężeniu 0,75 razy większym niż minimalne stężenia hamujące wykazały fenotyp podobny do kiełbasy dla B.subtilis i fenotyp zlepiający się dla S. pneumoniae. Zwróć uwagę na temperaturę reakcji.

Upewnij się, że reakcja jest kompletna, monitorując ją za pomocą TLC. Metoda ta może być stosowana w połączeniu z antybiotykami znakowanymi fluorescencyjnie w celu zbadania zmian w ścianie komórkowej za pomocą mikroskopii.