Name: Synteza masarymycyny, małocząsteczkowego inhibitora wzrostu bakterii Gram-dodatnich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Poznaj protokół syntezy masarymycyny, inhibitora autolizyn bakteryjnych, i zastosowanie w badaniach morfologicznych z Bacillus subtilis oraz Streptococcus pneumoniae. Metoda umożliwia analizę fizjologii bakterii Gram-dodatnich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania były wspierane przez National Science Foundation w ramach grantu numer 2009522. Analiza NMR masarymycyny została wsparta nagrodą National Science Foundation w ramach grantu numer 1919644. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation.

1. Metody ogólne
UWAGA: Wszystkie związki zostały zakupione od standardowych dostawców i użyte bez dalszego oczyszczania.
<ol>
	<li>Przeprowadzić cienkowarstwową chromatografię (TLC) na płytce aluminiowej powlekonej żelem krzemionkowym XG F254. Plamy wykrywać pod lampą UV, poprzez zanurzenie w odczynniku p-anisaldehydowym lub poprzez ekspozycję na opary I2 .</li>
	<li>Wszystkie widma magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) zarejestrować na spektrometrze 400 MHz. 
	UWAGA: Widma 1H-NMR oraz 13C-NMR odniesiono do sygnałów pozostałego rozpuszczalnika. Stałe sprzężenia podano w [Hz], a przesunięcia chemiczne w [ppm].</li>
	<li>Widma spektrometrii mas z jonizacją chemiczną przy ciśnieniu atmosferycznym (APCI) dla masarymycyny zarejestrować na kompaktowym spektrometrze mas wyposażonym w sondę do analizy ciał stałych przy ciśnieniu atmosferycznym.</li>
</ol>
2. Ogólna procedura przygotowania masarymicyny
UWAGA: Poniższe kroki należy wykonać w dygestorium.
<ol>
	<li>Przygotować 0,1 M roztwór każdego z substratów w metanolu: cykloheksyloaminy oraz cykloheksylokarbaldehydu. o-kwas jodobenzoowy i izocyjanek cykloheksylu35. 
	OSTRZEŻENIE: Cykloheksyloamina, cykloheksyloizocyjanek i cykloheksylokarboksaldehyd są łatwopalne. Mogą powodować oparzenia skóry oraz wywoływać toksyczność przy podaniu doustnym, przezskórnym, wziewnym lub toksyczność dla rozrodczości. Przechowywać związki z dala od otwartego ognia, gorących powierzchni i źródeł zapłonu. Należy stosować odpowiednie środki ochrony skóry i oczu, pracować w dobrze wentylowanym pomieszczeniu oraz unikać wdychania oparów lub mgły. W celu przechowywania butelki należy szczelnie zamykać i trzymać w chłodnym, suchym miejscu. Cykloheksylokarboksaldehyd przechowywać w eksykatorze pod atmosferą N2.2 atmosfera</li>
	<li>W zakorkowanej kolbie okrągłodennej wymieszać 5 ml cykloheksyloaminy (roztwór 0,1 M w metanolu) i 5 ml cykloheksylokarbaldehydu (0,1 M w metanolu), a następnie mieszać roztwór za pomocą mieszadła magnetycznego na płycie grzewczo-mieszalnej przez 30 min w temperaturze 40 °C w łaźni piaskowej. Temperaturę należy monitorować za pomocą termometru umieszczonego około 1 cm poniżej powierzchni piasku.</li>
	<li>Po 30 minutach do roztworu z kroku 2.2 należy dodać 5 ml cykloheksyloizocyjanianku (roztwór 0,1 M w metanolu) i mieszać przez kolejne 20 minut w 50 °CNa koniec dodać 5 ml o-kwas jodobenzoowy (roztwór 0,1 M w metanolu) do mieszaniny reakcyjnej i kontynuuj mieszanie w 55 °C przez 3–5 h.</li>
	<li>Monitoruj postępy reakcji okresowo za pomocą TLC, mniej więcej co godzinę, po tym jak powyższa mieszanina reakcyjna była mieszana przez 3 h.</li>
	<li>Wytnij pasek płytki TLC z podkładem aluminiowym o wymiarach 3 cm x 6 cm. Za pomocą ołówka nr 2 narysuj linię w odległości około 1 cm od dolnej krawędzi. Używając szklanej mikrokapilary, nanieś około 5 µL mieszaniny reakcyjnej na płytkę TLC i pozostawić do wyschnięcia.</li>
	<li>Do zlewki o pojemności 150 ml wlać taką ilość fazy ruchomej (heksan:izopropanol w stosunku 90:10), aby przykryła ona dno naczynia. Za pomocą pęsety ostrożnie umieścić opisaną płytkę TLC w zlewce, upewniając się, że płytka równomiernie zanurza się w fazie ruchomej. Górę zlewki przykryć kawałkiem folii aluminiowej. 
	UWAGA: Należy upewnić się, że faza ruchoma nie zalewa linii startowej ani naniesionej próbki.</li>
	<li>Pozostaw fazę ruchomą do czasu, aż przemieści się w górę płytki TLC na odległość około 1 cm poniżej górnej krawędzi płytki. Wyjmij płytkę TLC i za pomocą ołówka narysuj linię wskazującą dystans, jaki przebyła faza ruchoma. Pozostaw płytkę TLC do wyschnięcia w dygestorium.</li>
	<li>Po wysuszeniu umieść płytkę TLC w zlewce zawierającej niewielką ilość substancji stałej I2 i przykryć zlewkę kawałkiem folii aluminiowej. Monitorować płytkę TLC pod kątem pojawienia się żółtych/brązowych plam. Po ich pojawieniu się wyjąć płytkę TLC i zaznaczyć ołówkiem położenie plam (Rycina uzupełniająca 1). 
	UWAGA: Jeśli ja2 jeśli plamy nie zostaną zaznaczone, barwnik z czasem wyblaknie. Plamy na płytce TLC można również wizualizować za pomocą światła UV, pbarwienie anisaldehydem lub barwienie nadmanganianem potasu (patrz Informacje uzupełniające).</li>
	<li>Oblicz Rf wartości dla wszystkich zwizualizowanych plamek według następującego wzoru: 
	Rf = <img alt="Wzór chromatograficzny, obliczanie Rf, stosunek odległości, metoda chemiczna, analiza rozdziału." src="/files/ftp_upload/63191/63191eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"></li>
	<li>Reakcję uznaje się za zakończoną, gdy widoczna jest tylko jedna plama o wartości Rff = 0,3 jest widoczna na płytce TLC. Rozpuszczalnik usunąć za pomocą rotacyjnego odparowacza pod zmniejszonym ciśnieniem, a surowy produkt (otrzymany w postaci żółto-brązowego oleju) wysuszyć w wysokiej próżni do czasu całkowitego odparowania metanolu.</li>
	<li>Rozpuścić wysuszony produkt surowy w 30 ml octanu etylu i przelać do rozdzielacza. Wyekstrahować octan etylu sekwencyjnie za pomocą 1 M HCl (2 x 30 ml), H2O (30 ml), nasycony NaHCO33 roztwór (2 x 30 ml), H2O (30 ml) i nasycony roztwór NaCl (2 x 30 ml). Odrzucić warstwy wodne. 
	UWAGA: Warstwa octanu etylu jest warstwą górną w każdym z etapów ekstrakcji. Podczas każdej ekstrakcji należy energicznie wstrząsnąć rozdzielaczem zawierającym octan etylu i roztwór wodny (HCl, H2O, NaHCO₃3, lub NaCl) i poczekać do całkowitego rozdzielenia się warstw.</li>
	<li>Odlaj warstwę octanu etylu z rozdzielacza i zbierz ją do kolby Erlenmeyera. Dodaj szpatułkę Na2SO4 (bezwodny) w celu usunięcia resztkowej wody z octanu etylu. 
	UWAGA: Roztwór octanu etylu uznaje się za suchy, gdy Na2SO4 w kolbie sypie się swobodnie i nie tworzy grudek. Jeśli Na2SO4 w przypadku powstawania grudek, dodać kolejną szpatułkę Na2SO4 można dodać.</li>
	<li>Przefiltrować wysuszony roztwór octanu etylu przez papier filtracyjny nr 1, aby usunąć Na.2SO4Przemyj papier filtracyjny niewielką ilością octanu etylu. Przefiltrowany roztwór octanu etylu przelej do kolby okrągłej i odparuj rozpuszczalnik na ewaporatorze rotacyjnym pod zmniejszonym ciśnieniem; po całkowitym usunięciu octanu etylu masarimycyna zostanie otrzymana w postaci olejku.</li>
	<li>Rozpuścić otrzymany wcześniej olejek masarymycynowy w minimalnej ilości (1–2 ml) mieszaniny heksanu z izopropanolem w stosunku 9:1 i mieszać na mieszalce magnetycznej do całkowitego rozpuszczenia związku.</li>
	<li>Oczyść rozpuszczoną masarymycynę za pomocą chromatografii błyskawicznej, wykorzystując kolumnę z silikagelem w fazie normalnej o masie 12 g.
	<ol>
		<li>Równoważyć kolumnę do chromatografii flash za pomocą 10 objętości kolumny fazy ruchomej (heksan:izopropanol 99:1), ustawiając przepływ urządzenia na 15 ml/min. 
		UWAGA: Po zakończeniu równoważenia należy zatrzymać przepływ i odłączyć górną część kolumny od systemu.</li>
		<li>Pobrać rozpuszczoną masarymycynę za pomocą strzykawki 5 ml. Podłączyć strzykawkę bezpośrednio do górnej części wyrównanej kolumny do chromatografii błyskawicznej i wstrzyknąć roztwór do kolumny. Ponownie podłączyć załadowaną kolumnę do systemu chromatografii błyskawicznej i rozpocząć elucję gradientową.</li>
		<li>Wymyć masarymycynę z kolumny, stosując elucję gradientową do końcowego stężenia fazy ruchomej 10:90 heksan:izopropanol w ciągu 12 objętości kolumny. Monitorować elucję masarymycyny. poprzez absorpcja przy 230 i 254 nm.</li>
		<li>Związkami wymywanymi z kolumny należy zbierać za pomocą automatycznego zbieracza frakcji, ustawionego na pobieranie 20 ml rozpuszczalnika na jedną frakcję. 
		UWAGA: W przypadku braku systemu do błyskawicznej chromatografii, oczyszczanie masarymicyny można przeprowadzić poprzez kolumna z krzemionką w układzie grawitacyjnym z fazą ruchomą 3:1 (heksan: octan etylu). Frakcje zawierające masarymycynę można zidentyfikować za pomocą TLC, stosując tę samą fazę ruchomą. Wizualizację plam w TLC przeprowadzono przy użyciu światła UV, I2 opary lub barwienie nadmanganianem potasu.</li>
		<li>Zidentyfikuj frakcje zawierające masarymycynę za pomocą TLC (kroki 2.5–2.9) lub spektrometrii mas przy użyciu kompaktowego spektrometru mas wyposażonego w sondę do analizy ciał stałych w warunkach atmosferycznych. Wysusz produkt końcowy w próżni (~0,3 mbar). 
		UWAGA: Masarymycynę rutynowo otrzymuje się w postaci bezbarwnego oleju lub ciała stałego, przy wydajności wynoszącej 55%–70% w stosunku do mmol cykloheksylokarboksaldehydu dodanego do reakcji. Oblicz końcową wydajność masarymycyny, wyznaczając masę oczyszczonej masarymycyny i obliczając wydajność teoretyczną reakcji według następującego wzoru: 
		wydajność % = <img alt="Równanie obliczania czystości: masa oczyszczonego produktu podzielona przez teoretyczną masę produktu." src="/files/ftp_upload/63191/63191eq02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2"> x 100%</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdź strukturę masarymycyny za pomocą NMR.
	<ol>
		<li>Rozpuścić ok. 10 mg próbki masarymicyny w 0,5 ml CDCl33Za pomocą pipety Pasteura przenieś roztwór do probówki do NMR o średnicy 5 mm i zakryj ją korkiem. Umieść probówkę NMR w spektrometrze.</li>
		<li>Pozyskać 1H i 13widma 13C NMR uzyskane przy użyciu predefiniowanych eksperymentów producenta. Przypisania przesunięć chemicznych oraz reprezentatywne widma przedstawiono w Rysunki uzupełniające 3-4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechowywać masarymycynę w formie suchej lub rozpuszczoną w DMSO (stężenie końcowe 25 mM) w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
3. Procedura mikrofalowa przygotowania masarymicyny
<ol>
	<li>Przygotować 0,6 M roztwory cykloheksyloaminy, cykloheksyloceboaldehydu, cykloheksyloizocyjanidu oraz kwasu o-jodobenzoenowego w acetonitrylu.</li>
	<li>Do szklanej fiolki do reakcji w mikrofalach dodać mieszadło magnetyczne oraz 10 mL acetonitrylu.</li>
	<li>Do fiolki dodać 2 mL cykloheksyloaminy (0,6 M w acetonitrylu), 2 mL cykloheksyloceboaldehydu (0,6 M w acetonitrylu) oraz 7 mL acetonitrylu.</li>
	<li>Umieścić fiolkę do reakcji w karuzeli mikrofalowej. Mieszać mieszaninę, ogrzewać przez 30 min w temperaturze 50°C przy mocy 400 W, a następnie pozwolić jej ostygnąć do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Do fiolki dodać 2 mL kwasu o-jodobenzoenowego (0,6 M w metanolu) oraz 2 mL cykloheksyloizocyjanidu (0,6 M w acetonitrylu). Mieszać mieszaninę, ogrzewać w mikrofalach do 100 °C przez 40 min przy mocy 400 W, a następnie pozwolić jej ostygnąć do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Po zakończeniu kroku 3.5 monitorować przebieg reakcji za pomocą TLC (90:10 heksan: izopropanol), wykorzystując opary I2. 
	UWAGA: Jeśli TLC wykaże, że reakcja nie została zakończona (tj. widoczne są wiele plam na płytce TLC), ponownie umieścić fiolkę w mikrofalach i zastosować warunki opisane w kroku 3.5.</li>
	<li>Po zakończeniu reakcji przelać roztwór do kolby okrągłodennej o pojemności 100 mL i odparować do suchości za pomocą rotacyjnego odparowacza.</li>
	<li>Postępować zgodnie z krokami 2.6-2.16 opisanymi powyżej, aby przeprowadzić obróbkę wodną, oczyszczanie oraz charakterystykę masarimycyny.</li>
</ol>
4. Analiza synergizmu i antagonizmu
<ol>
	<li>Hodowla Streptococcus pneumoniae R6 na płytkach z agarem Müllera-Hintona (MH) zawierających 5% (v/v) krwi owczej w 37 °C w warunkach beztlenowych. we wszystkich eksperymentach należy użyć komórek z drugiego pasażu hodowanych w 5 ml bulionu MH w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych do momentu uzyskania OD600 wynosi około 0,4.</li>
	<li>Inhibitory masarimycinę i optochinę poddać seryjnym rozcieńczeniom 1:2 w odpowiednich rozpuszczalnikach, tak aby uzyskane stężenia obejmowały wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC) dla każdego z inhibitorów.
	<ol>
		<li>Przygotować początkowe rozcieńczenie masarymicyny w dimetylosulfotlenku (DMSO) do stężenia 100 µM zostanie osiągnięta. Od tego momentu należy przygotować rozcieńczenia masarymycyny w bulionie MH. Przygotować roztwór zapasowy optochiny (3,5 mM), rozpuszczając dostępną komercyjnie optochinę (patrz Tabela materiałów) w sterylnej pożywce MH. 
		UWAGA: Roztwory zapasowe masarymycyny przygotowano w stężeniu 25 mM w DMSO.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do sterylnej mikropłytki do miareczkowania o 96 dołkach należy dodać 2 µL alikwoty każdego rozcieńczenia optochiny do każdego rzędu płytki. Do tej samej płytki należy dodać 2 µL alikwoty każdego rozcieńczenia masarymycyny do każdej kolumny, aby stworzyć na płytce macierz stężeń optochiny i masarymycyny (Rycina 2).</li>
	<li>Dodaj sterylny bulion MH (93 µL) do każdej studzienki zawierającej powyższe inhibitory. Zaszczep płytki mikrotitracyjne za pomocą 5 µL kultury (OD600 ~0,4) z kroku 4.1. 
	UWAGA: Inokulacja płytki 96-dołkowej jest zazwyczaj przeprowadzana w warunkach beztlenowych w komorze beztlenowej. Objętość końcowa w dołku wynosi 100 µL.</li>
	<li>Inkubować hodowle przez 18 h w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych, a następnie po dodaniu 30 µL 0,01% (m/v) roztworu soli sodowej rezazureny. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 min, aby umożliwić utworzenie i stabilizację barwy. 
	UWAGA: Roztwór rezazuryny przygotowuje się poprzez rozpuszczenie związku w wodzie destylowanej; można go przechowywać w 4 °C przez maksymalnie dwa tygodnie.</li>
	<li>Odczytaj bezpośrednio wartości stężeń z płytki i przypisz najniższe stężenie inhibitora, dla którego nie zaobserwowano wzrostu bakterii (kolor niebieski), jako [X] (patrz krok 4.7.1), czyli najniższe stężenie hamujące leku w obecności leku wspomagającego. 
	UWAGA: Pozytywny wzrost bakterii w dołkach rozpoznaje się po zmianie koloru barwnika rezazuryny na różowy. Wartości MIC dla każdego leku podawanego pojedynczo (t.j. bez drugiego leku) określa się w podobny sposób, stosując test MIC z użyciem rezazuryny.35 z każdym lekiem osobno (Rycina uzupełniająca 5). MIC w S. pneumoniae są 7.8 µM i 15.85 µM odpowiednio dla masarymycyny i optochiny.</li>
	<li>Wyznaczanie frakcyjnego stężenia hamującego (FIC) oraz indeksu FIC (FICI) przy użyciu następujących równań.
	<ol>
		<li>FIC = [X]/MICProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia., gdzie [X] (z kroku 4.6) to najniższe stężenie hamujące leku w obecności leku wspomagającego, a MICPrzykładowy tekst źródłowy nie został dostarczony. Proszę o przesłanie tekstu do tłumaczenia. jest najniższym stężeniem hamującym lek w obecności leku pomocniczego.</li>
		<li>FICI= FICmasarymycyna + FICantybiotyk 
		UWAGA: FICI &lt; 0,5 = synergistyczny, 0,5 &lt; FIC (frakcjonująca inhibitory koncentracja)I &lt; 1 = dodatek, 1 &lt; FICI &lt; 4 = obojętny, FICI &gt; 4 = antagonistyczny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Badanie morfologiczne
<ol>
	<li>Hodować Bacillus subtilis 11774 na płytkach z agarem Luria-Bertani (LB) (10 g/L tryptony, 5 g/L ekstraktu drożdżowego i 5 g/L NaCl) zawierających 1,5% Bacto agar w temperaturze 37 °C. we wszystkich eksperymentach należy użyć komórek z drugiego pasażu wyhodowanych w 5 mL bulionu LB w temperaturze 37 °C aż do osiągnięcia OD600 = 1. Hodować S. pneumoniae w taki sam sposób, jak opisano w kroku 4.1.</li>
	<li>Po uzyskaniu gęstości hodowli komórkowej OD600nm = 1 dla B. subtilis lub OD600nm = 0,4 dla S. pneumoniae, dodać za pomocą pipety masarymycynę do probówki z hodowlą oznaczonej jako „treated” do końcowego stężenia 3,8 µM (0,75x MIC dla B. subtilis) lub 5,85 µM (0,75x MIC dla S. pneumoniae). Do drugiej probówki z hodowlą oznaczonej jako „control” dodać równoważną objętość DMSO.</li>
	<li>W przypadku B. subtilis próbki umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 90 min przy wytrząsaniu z prędkością 150 rpm. W przypadku S. pneumoniae inkubować komórki bez wytrząsania w warunkach beztlenowych.</li>
	<li>Po 90 min utrwalić chemicznie hodowle w mieszaninie 1:10 (v/v) pożywki i buforu utrwalającego (20 mM HEPES, 1% formaldehydu (pH 6,8)) w temperaturze 4 °C przez noc. Po zakończeniu utrwalania nanieść za pomocą pipety 10-20 µL próbek na szklane preparaty mikroskopowe i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Próbki wysuszone na powietrzu utrwalić termicznie, podgrzewając szkiełka nad palnikiem Bunsena.</li>
	<li>Po utrwalaniu termicznym zabarwić próbki, dodając 100 µL 0,1% (m/v) błękitu metylenowego (roztwór w 20% (v/v) etanolu). Inkubować zabarwione szkiełka przez 10 min, a następnie wypłukać nadmiar barwnika wodą dH2O. Następnie delikatnie podgrzać zabarwione szkiełka do 60 °C w piecu przez 15-20 min, aby sprowadzić komórki do wspólnej płaszczyzny ogniskowej.</li>
	<li>Zabezpieczyć zabarwione próbki, nakładając na zabarwione komórki szkiełko nakrywki. Następnie uszczelnić krawędzie za pomocą cementu do preparatów mikroskopowych. Umieścić zabezpieczone szkiełko na stole mikroskopu i ustawić ostrość obrazu przy powiększeniu 100x w mikroskopii w polu jasnym.</li>
	<li>Nanieść kroplę olejku imersyjnego na szkiełko i ustawić ostrość pola widzenia przy powiększeniu 1000x. Wykonać mikrofotografie przy użyciu kamery podłączonej do mikroskopu oraz odpowiedniego oprogramowania. Obrazy należy rejestrować przy użyciu automatycznego balansu bieli i ustawień przysłony w oprogramowaniu. 
	UWAGA: Alternatywnie obrazy można przetwarzać przy użyciu otwartoźródłowego oprogramowania ImageJ.</li>
</ol>

Reid, C. W. posiada własność intelektualną obejmującą konkretne zastosowania masarymycyny.

Masarymycyna jest pojedynczym mikromolowym inhibitorem bakteriostatycznym wzrostu B. subtilis35 i S. pneumoniae37 . Wykazano, że u B. subtilis masarymycyna hamuje GlcNAcase LytG35, podczas gdy dokładny cel molekularny w ścianie komórkowej S. pneumoniae nie został zidentyfikowany37. Synteza masarimycyny przy użyciu klasycznej syntezy organicznej lub procedury mikrofalowej zapewnia inhibitor o dobrej w...

Peptydoglikan (PG) to polimer przypominający siatkę, który wyznacza kształt i strukturę komórek zarówno u bakterii Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych1,2. Ten heteropolimer jest matrycą aminocukrów usieciowanych krótkimi peptydami3,4,5,6 ze szkieletem złożonym z β-(1,4)-połączonych naprzemiennie reszt N-acetyloglukozaminy (GlcNAc) i kwasu N-acetylomuraminowego (MurNAc) (Rysunek 1)1. Do ugrupowania laktylowego C-3 MurNAc przyłączony jest peptyd macierzysty. Metabolizm PG obejmuje ściśle skoordynowany system enzymów biosyntetycznych i degradacyjnych w celu włączenia nowego materiału do ściany komórkowej7,8. Degradacja PG jest przeprowadzana przez enzymy zbiorczo określane jako autolizyny9 i dalej klasyfikowane na podstawie specyficzności rozszczepionego wiązania. Autolizyny uczestniczą w wielu procesach komórkowych, w tym we wzroście komórek, podziale komórek, ruchliwości, dojrzewaniu PG, chemotaksji, wydzielaniu białek, kompetencjach genetycznych, różnicowaniu i patogenności10,11. Rozwikłanie specyficznych funkcji biologicznych poszczególnych autolizyn może być zniechęcające, częściowo ze względu na redundancję funkcjonalną. Jednak niedawne badania biofizyczne8,12,13 i badania obliczeniowe12 dostarczyły nowych informacji na temat ich roli w metabolizmie PG. Ponadto ostatnie raporty dostarczyły dalszych informacji na temat synthesis14 i membranowych15,16,17 etapów metabolizmu PG. Dogłębne zrozumienie związku między degradacyjnymi i syntetycznymi szlakami metabolizmu PG może doprowadzić do powstania wcześniej niewykorzystanych celów antybiotykowych.
Chociaż nastąpił znaczny postęp w metodologii badania glikobiologii u eukariontów, glikobiologia bakteryjna, a w szczególności metabolizm PG, nie rozwijała się w podobnym tempie. Obecne chemiczne podejścia do badania metabolizmu PG obejmują fluorescencyjnie znakowane antybiotyki18, sondy fluorescencyjne19,20, oraz etykietowanie metaboliczne21,22,23,24. Te nowe podejścia dostarczają nowych sposobów badania metabolizmu ścian komórkowych bakterii. Podczas gdy niektóre z tych strategii są w stanie oznaczyć PG in vivo, mogą być specyficzne dla gatunku19, lub działać tylko w szczepach bez określonej klasy autolysin<sup="xref">25. Wiele strategii znakowania PG jest przeznaczonych do stosowania z izolowanymi ścianami komórkowymi26 lub z odtworzonymi in vitro szlakami biosyntezy PG20,27,28. Stosowanie antybiotyków znakowanych fluorescencyjnie jest obecnie ograniczone do etapów biosyntezy i transpeptydacji18.
Obecna wiedza na temat bakteryjnych autolizyn i ich roli w metabolizmie ściany komórkowej pochodzi z analizy genetycznej i biochemicznej in vitro11,29,30,31,32. Chociaż podejścia te dostarczyły wielu informacji na temat tej ważnej klasy enzymów, rozszyfrowanie ich biologicznej roli może być trudne. Na przykład, ze względu na redundancję funkcjonalną33, usunięcie autolizyny w większości przypadków nie powoduje zatrzymania wzrostu bakterii. Dzieje się tak pomimo ich domniemanej roli we wzroście i podziale komórek7,12. Kolejną komplikacją jest to, że genetyczna delecja autolizyn bakteryjnych może prowadzić do powstania meta-fenotypów34. Metafenotypy powstają w wyniku złożonej interakcji między szlakiem, na który wpływa delecja genetyczna, a innymi wzajemnie powiązanymi szlakami. Na przykład metafenotyp może powstać w wyniku efektu bezpośredniego, takiego jak brak enzymu, lub efektu pośredniego, takiego jak zakłócenie regulatorów.
Obecnie istnieje tylko kilka inhibitorów autolizyn glikozydazy, takich jak N-acetyloglukozaminidazy (GlcNAcase) i N-acetylmuramidazy, które mogą być używane jako sondy chemiczne do badania degradacji PG. Aby temu zaradzić, diamidowa masarymycyna (wcześniej określana jako fgkc) została zidentyfikowana i scharakteryzowana35 jako bakteriostatyczny inhibitor wzrostu Bacillus subtilis, który jest ukierunkowany na GlcNAcase LytG32 (Rysunek 1). LytG jest egzodziałającą GlcNAcase36, członkiem klastra 2 w rodzinie hydrolaz glikozylowych 73 (GH73). Jest to główny aktywny przypadek GlcNAcase podczas wzrostu wegetatywnego32. Według naszej wiedzy, masarymycyna jest pierwszym inhibitorem GlcNAcase działającego na PG, który hamuje wzrost komórek. Dodatkowe badania masarymycyny z Streptococcus pneumoniae wykazały, że masarymycyna prawdopodobnie hamuje metabolizm ściany komórkowej w tym organizmie37. W tym przypadku preparat masarimycyny jest zgłaszany do stosowania jako sonda biologii chemicznej do badania fizjologii organizmów Gram-dodatnich B. subtilis i S. pneumoniae. Przedstawiono przykłady analizy morfologicznej leczenia masarymycyną subminimalnym stężeniem hamującym, a także test synergii/antagonizmu. Testy synergii i antagonizmu przy użyciu antybiotyków o dobrze zdefiniowanych sposobach działania mogą być użytecznym sposobem badania powiązań między procesami komórkowymi38,39,40.

<table><tbody><tr><td>Kwas 2-jodobenzoesowy</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I7675-25G</td><td>, drażniący, jasnożółty do pomarańczowo-brązowego proszek</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>109827-4L</td><td>łatwopalna, drażniąca, bezbarwna ciecz</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>34851-4L</td><td>łatwopalna, drażniąca, bezbarwna ciecz</td></tr><tr><td>Płyty krzemionkowe na podłożu aluminiowym</td><td>Sorbtech</td><td>4434126</td><td>żel krzemionkowy XG F254 na aluminiowych płytkach z podkładem</td></tr><tr><td>chloroform-d</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>151823-50G</td><td>rozpuszczalnik do</td></tr><tr><td>kompaktowego spektrometru masowego</td><td>NMR Kompaktowy spektrometr masowy Advion-Interchim</td><td>Advion CMS</td><td>wyposażony w źródło APCI i sondę do analizy ciał stałych w atmosferze</td></tr><tr><td>Corning Costar 96-well flat bottom plates - sterylny</td><td>fisher chemical</td><td>07-200-90</td><td>do testów synergii / antagonizmu</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>fisher chemical</td><td>12-547</td><td>do mikroskopii</td></tr><tr><td>Cykloheksanokarboksyaldehyd</td><td>CHEM-IMPEX INT'L INC.</td><td>24451</td><td>łatwopalna, drażniąca, bezbarwna do różowej ciecz</td></tr><tr><td>Izocyjanek cykloheksylu</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>133302-5G</td><td>drażniąca, bezbarwna ciecz, wyjątkowo nieprzyjemny zapach</td></tr><tr><td>Cykloheksyloamina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>240648-100ML</td><td>, łatwopalna, drażniąca, bezbarwna ciecz, chyba że zanieczyszczona</td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>537446-4L</td><td>łatwopalny, drażniący, bezbarwny wkład z ciekłą</td></tr><tr><td>krzemionką flash (12g)</td><td>Advion-Interchim</td><td>PF-50SIHP-F0012</td><td>zestaw kolumn krzemionki błyskowej (12g) do oczyszczania masarimycyny</td></tr><tr><td>i formaldehydu</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F8775-25ML</td><td>środek utrwalający do mikroskopii</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H8651-25G</td><td>bufor do mikroskopii roztwór utrwalający</td></tr><tr><td>Heksan, mieszanina izomerów</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>178918-4L</td><td>szkodliwy dla środowiska, łatwopalny, drażniący, zagrażający zdrowiu, bezbarwna ciecz</td></tr><tr><td>Wysokowydajny kompaktowy spektrometr masowy</td><td>Ekspresja advion</td><td></td><td>Sonda do analizy ciał stałych w atmosferze (ASAP), niska rozdzielczość</td></tr><tr><td>High Vac</td><td>eppendorf</td><td>Vacufuge plus</td><td>próżnia wspomagana siłą odśrodkową i temperaturą</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>258148-2.5L</td><td>, drażniący, bezbarwny płynny</td></tr><tr><td>kwas solny</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>320331-2.5L</td><td>olejek immersyjny z mocnym kwasem</td></tr><tr><td></td><td>rybak chemiczny</td><td>12-365-19</td><td>do mikroskopii</td></tr><tr><td>Jod, resublimowane kryształy</td><td>Alfa Aesar</td><td>41955</td><td>szkodliwy dla środowiska, drażniący, zagrażający zdrowiu, ciemnoszare/fioletowe kryształy</td></tr><tr><td>Mestre Mnova</td><td>MestreLab Research</td><td></td><td>oprogramowanie do przetwarzania widm NMR</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>439193-4L</td><td>łatwopalny, toksyczny, zagrażający zdrowiu, bezbarwny</td></tr><tr><td>płynny błękit metylenowy</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M9140-25G</td><td>barwnik mikroskopowy do barwienia ścian komórkowych</td></tr><tr><td>Płytki agarowe Meuller-Hinton + 5% pożywka</td><td>chemiczna</td><td>B21176X</td><td>wzrostu dla Streptococcus pneumoniae</td></tr><tr><td>bulion Meuller-Hinton</td><td>fisher chemical</td><td>DF0757-17-6</td><td>pożywka wzrostowa dla Streptococcus pneumoniae</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Chemical</td><td>22-310397</td><td>do mikroskopii</td></tr><tr><td>Stacja laboratoryjna do syntezy mikrofalowej</td><td>MILESTONE</td><td>START SYNTH</td><td>urządzenie wymagające wentylacji dygestoriów, wyposażone w karuzelę syntezy</td></tr><tr><td>Rurki NMR</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z562769-5EA</td><td>Lampy NMR 5mm 600 MHz</td></tr><tr><td>Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR)</td>Duży magnes nadprzewodzący <td>Bruker</td><td>Ascend 400</td><td>(400 MHz)</td></tr><tr><td>optochin</td><td>fisher chemical</td><td>AAB21627MC</td><td>chlorowodorek etylohydrocupreiny</td></tr> płytki <tr><td>Petriego</td><td>Celltreat</td><td>229695</td><td>do przygotowania płytek agarowych do rozwoju bakterii</td></tr><tr><td>Primo Star Mikroskop z jasnym polem/kontrastem fazowym z kamerą ERc5s</td><td>Zeiss</td><td></td><td>do badania morfologii</td></tr><tr><td>puriFlash</td><td>interchim</td><td>XS520plus</td><td>chromatografia flash system oczyszczania</td></tr><tr><td>resazurin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>R7017-1G</td><td>do oznaczania synergii/antagonizmu</td></tr><tr><td>Parownik obrotowy</td><td>Heidolph</td><td>Hei-VAP Wartość "The Collegiate"</td> <td>parownik rozpuszczalnikowy</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S6014-500G</td><td>drażniący, biały proszek</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>fisher chemiczny</td><td>S271-1</td><td>krystaliczny, bezbarwny</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S5886-500G</td><td>do wzrostu B.subtilis i przygotowania pożywki LB</td></tr><tr><td>Siarczan sodu</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>7985592-500G</td><td>bezwodny, granulowany, biały</td></tr><tr><td>trypton</td><td>fisher chemiczny</td><td>BP1421-500</td><td>do wzrostu B.subtilis i przygotowanie pożywki LB</td></tr><tr><td>Stacja robocza Whitney DG250 Stacja robocza</td><td>Microbiology International</td><td>DG250</td><td>beztlenowa. Zastosowano beztlenową mieszaninę gazów: 5% wodoru, 10% dwutlenku węgla, bilansowy</td></tr><tr><td>ekstrakt drożdży</td><td>azotowych fisher chemical</td><td>BP1422-500</td><td>do wzrostu B.subtilis i przygotowania podłoża LB</td></tr><tr><td>Zen Lite (niebieski) oprogramowanie</td><td>Zeiss</td><td></td><td>do pozyskiwania mikrofotografii</td></tr></tbody></table>

synteza masarymycyny, małocząsteczkowego inhibitora wzrostu bakterii gram-dodatnich

Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

Peptydoglikan (PG) w ścianie komórkowej bakterii to unikalna struktura makromolekularna, która nadaje kształt i chroni przed otaczającym środowiskiem. Kluczowe znaczenie dla zrozumienia wzrostu i podziału komórek ma wiedza o tym, jak degradacja PG wpływa na biosyntezę i tworzenie ścian komórkowych. Ostatnio doniesiono o metabolicznym znakowaniu PG poprzez wprowadzenie zmodyfikowanych cukrów lub aminokwasów. Podczas gdy chemiczne badanie etapów biosyntezy za pomocą inhibitorów małocząsteczkowych jest możliwe, narzędzia biologii chemicznej do badania degradacji PG przez autolizyny są słabo rozwinięte. Autolizyny bakteryjne to szeroka klasa enzymów, które biorą udział w ściśle skoordynowanej degradacji PG. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół przygotowania sondy małocząsteczkowej, masarymycyny, która jest inhibitorem N-acetyloglukozaminidazy LytG w Bacillus subtilis i metabolizmu ściany komórkowej w Streptococcus pneumoniae. Zapewnione jest przygotowanie inhibitora za pomocą wspomaganej mikrofalami i klasycznej syntezy organicznej. Przedstawiono jego przydatność jako narzędzia do badania fizjologii Gram-dodatniej w testach biologicznych.

Masarimycyna jest małocząsteczkowym bakteriostatycznym inhibitorem B. subtilis oraz S. pneumoniae; wykazano, że hamuje ona działającą zewnątrzkomórkowo glcNAkazę LytG u B. subtilis35,37 oraz oddziałuje na ścianę komórkową S. pneumoniae37. Masarimycynę można efektywnie otrzymywać zarówno za pomocą klasycznej syntezy organicznej, jak i syntezy wspomaganej mikrofalowo, z wydajnością w zakresie 55%-70%. Synt...

Przedstawiono szczegółowy protokół przygotowania bakteriostatycznego diamidu masarimycyny, małocząsteczkowej sondy, która hamuje wzrost Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae poprzez ukierunkowanie na degradację ściany komórkowej. Jego zastosowanie jako sondy chemicznej wykazano w testach synergii/antagonizmu i badaniach morfologicznych z B. subtilis i S. pneumoniae.

Synteza masarymycyny, małocząsteczkowego inhibitora wzrostu bakterii Gram-dodatnich

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

Masarymycyna jest jednym z niewielu inhibitorów autolizyn bakteryjnych, który hamuje wzrost komórek bakteryjnych. Może być stosowany do badania różnic między chemiczną i genetyczną inaktywacją autolizyn i zapewnia ortogonalne podejście do genetyki w celu badania fizjologii bakterii. Synteza masarimycyny może wydawać się zniechęcająca.Postępuj zgodnie z pokazanymi krokami. W razie wątpliwości, czy etap reakcji zadziałał, potwierdź chromatografię cienkowarstwową i zmiany wartości RF. Na początek przygotuj 0,1-molowy roztwór cykloheksyloaminy, cykloheksylokarboksyaldehydu, kwasu ortojodobenzoesowego i izocyjanku cykloheksylu w metanolu.Dodać mieszadło magnetyczne, a następnie wymieszać pięć mililitrów cykloheksyloaminy i pięć mililitrów karboksyaldehydu cykloheksylu w kolbie okrągłodennej z nakrętką i umieścić kolbę w kąpieli piaskowej na mieszadle z płytą grzejną na 30 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Monitoruj temperaturę za pomocą termometru umieszczonego około jednego centymetra pod powierzchnią piasku. Po 30 minutach dodaj pięć mililitrów izocyjanku cykloheksylu do roztworu i mieszaj przez dodatkowe 20 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza.Następnie dodaj pięć mililitrów kwasu orto-jodobenzoesowego do mieszaniny reakcyjnej i kontynuuj mieszanie w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu godzin. Po trzech godzinach mieszania należy okresowo monitorować postęp reakcji za pomocą chromatografii cienkowarstwowej lub TLC, w odstępach około jednogodzinnych. Uznaje się reakcję za zakończoną, gdy na płytce TLC widoczna jest tylko jedna plamka o współczynniku retencji równym 0,3.Usunąć rozpuszczalnik z parownika obrotowego pod zmniejszonym ciśnieniem. Po odparowaniu całego metanolu należy rozpuścić wysuszony produkt surowy w 30 mililitrach octanu etylu i przenieść go do rozdzielacza. Octan etylu ekstrahować sekwencyjnie jednomolowym kwasem solnym, wodą, nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu, ponownie wodą i nasyconym roztworem chlorku sodu, odrzucając warstwy wodne przy każdej ekstrakcji.Następnie usunąć warstwę octanu etylu z rozdzielacza i zebrać ją do kolby Erlenmeyera. Dodaj szpatułkę pełną bezwodnego siarczanu sodu, aby usunąć resztki wody z octanu etylu. Przefiltruj wysuszony roztwór octanu etylu przez bibułę filtracyjną numer jeden, aby usunąć siarczan sodu.Następnie umyj bibułę filtracyjną niewielką ilością octanu etylu. Przefiltrowany roztwór octanu etylu odparowano do sucha na parowniku obrotowym pod zmniejszonym ciśnieniem w celu uzyskania masarymycyny w postaci oleju po usunięciu całego octanu etylu. Rozpuść olej masarimycyny w jednym do dwóch mililitrów roztworu heksanu do izopropanolu w proporcji 9:1 i mieszaj na magnetycznej płytce mieszającej, aż cały związek się rozpuści.Aby oczyścić rozpuszczoną masarymycynę, należy przeprowadzić chromatografię błyskową z 12-gramową kolumną błyskową krzemionki o normalnej fazie. Zrównoważyć kolumnę błyskową z 10 objętościami fazy ruchomej za pomocą przyrządów ustawionych na natężenie przepływu 15 mililitrów na minutę. Po zakończeniu równoważenia pobrać rozpuszczoną masarymycynę za pomocą pięciomililitrowej strzykawki.Podłączyć strzykawkę bezpośrednio do górnej części kolumny z wyrównanym zapłonem i wstrzyknąć roztwór do kolumny. Ponownie podłączyć załadowaną kolumnę do systemu chromatografii flash i rozpocząć elucję gradientu. Eluować masarymycynę z kolumny za pomocą elucji gradientowej do końcowego stężenia fazy ruchomej 10:90 heksanu do izopropanolu w ciągu 12 objętości kolumny.Monitorować elucję masarymycyny poprzez absorpcję w prędkościach 230 i 254 nanometrów. Do badania morfologii hoduj Bacillus subtilis 11774 na płytkach agarowych LB w temperaturze 37 stopni Celsjusza. We wszystkich kolejnych eksperymentach używaj komórek drugiego pasażu hodowanych w pięciu mililitrach bulionu LB, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 1.Następnie, za pomocą pipety, dodaj masarymycynę do probówek hodowlanych oznaczonych potraktowanych do końcowego stężenia 3,8 mikromola. W przypadku probówek hodowlanych oznaczonych jako kontrolne, dodaj równoważną objętość DMSO. Umieścić próbki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 90 minut z wytrząsaniem przy 150 obr./min.Po 90 minutach utrwalić chemicznie kultury w mieszaninie pożywek hodowlanych w proporcji 1:10 i utrwalać bufor w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia za pomocą pipety nałóż od 10 do 20 mikrolitrów chemicznie utrwalonych próbek na szklane szkiełka mikroskopowe i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu. Następnie utrwalaj termicznie wysuszone powietrzem próbki, podgrzewając szkiełka podstawowe za pomocą palnika Bunsena.Po utrwaleniu termicznym wybarwić próbki 100 mikrolitrami 0,1% błękitu metylenowego. Po 10 minutach inkubacji z plamą zmyj nadmiar barwnika wodą destylowaną. Następnie delikatnie podgrzej poplamione szkiełka do 60 stopni Celsjusza w piekarniku przez 15 do 20 minut, aby doprowadzić komórki do wspólnej płaszczyzny ogniskowej.Zapieczętuj barwione próbki, umieszczając szkiełko osłonowe mikroskopu na wybarwionych komórkach. Następnie uszczelnij krawędzie za pomocą cementu do szkiełek mikroskopowych. Umieść szczelnie zamknięte szkiełko mikroskopowe na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość obrazu przy 100-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopii jasnego pola.Umieść kroplę olejku immersyjnego na szkiełku mikroskopowym i ustaw ostrość pola widzenia za pomocą 1000-krotnego powiększenia. Mikrofotografie należy uzyskiwać za pomocą kamery dołączonej do mikroskopu i powiązanego z nim oprogramowania. Rób zdjęcia przy użyciu automatycznych ustawień balansu bieli i przysłony w oprogramowaniu.Chromatografia flash pozwala na szybkie oczyszczenie masarymycyny o wysokiej czystości. Przedstawiono ocenę synergii lub antagonizmu z inhibitorem ATPazy optochiną w S.pneumoniae. Najniższe stężenie związku hamującego rozwój bakterii, oznaczone kolorem niebieskim, jest uważane za minimalną wartość stężenia hamującego w obecności leku towarzyszącego.Natomiast studzienki o różowym kolorze wskazują na rozwój bakterii. Testy fenotypowe z użyciem masarymycyny w stężeniu 0,75 razy większym niż minimalne stężenia hamujące wykazały fenotyp podobny do kiełbasy dla B.subtilis i fenotyp zlepiający się dla S. pneumoniae. Zwróć uwagę na temperaturę reakcji.Upewnij się, że reakcja jest kompletna, monitorując ją za pomocą TLC. Metoda ta może być stosowana w połączeniu z antybiotykami znakowanymi fluorescencyjnie w celu zbadania zmian w ścianie komórkowej za pomocą mikroskopii.

synthesis-masarimycin-small-molecule-inhibitor-gram-positive

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Heterologiczna biosynteza erytromycyny A w E. coli obejmuje następujące etapy eksperymentalne: 1) transfer genetyczny; 2) rekonstrukcję heterologiczną; oraz 3) analizę produktu. Każdy z tych etapów zostanie omówiony w kontekście motywacji, potencjału oraz wyzwań związanych z produkcją terapeutycznych produktów naturalnych z wykorzystaniem E. coli jako gospodarza zastępczego.

Logika, kroki eksperymentalne i potencjał heterologicznej biosyntezy produktów naturalnych na przykładzie złożonego antybiotyku erytromycyny A produkowanego przez E. coli

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół (A) identyfikacji naturalnego produktu o aktywności antybiotykowej, (B) oczyszczania związku, (C) pierwszego modelu jego biosyntezy, (D) sekwencjonowania/-eksploracji genomu oraz (E) weryfikacji klastra genów biosyntetycznych.

Od produktu naturalnego do klastra genów biosyntezy: demonstracja z użyciem poliketomycyny ze Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

Protokół eksploracji genomu sterowany spektrometrią mas jest ustanowiony i opisany tutaj. Opiera się na informacjach o sekwencjach genomu i analizie LC-MS/MS i ma na celu ułatwienie identyfikacji cząsteczek ze złożonych ekstraktów mikrobiologicznych i roślinnych.

Eksploracja genomu pod kontrolą spektrometrii mas jako narzędzie do odkrywania nowych produktów naturalnych

Tutaj opisujemy test biologiczny z użyciem bromku 3-(4′,5′-dimetylotiazol-2′-ylo)-2,5-difenylotetrazolowego (MTT) do testowania wcześniej zsyntetyzowanych oksymów spirocyklicznych.

Funkcjonalizowana spirocykliczna synteza heterocykliczna i test cytotoksyczności

Związki tiofenesulfonamidu są silnymi i specyficznymi inhibitorami regulatorów Vibrio quorum sensing LuxR/HapR, które blokują ich aktywność in vivo, zapobiegając w ten sposób transkrypcji genów zjadliwości, ruchliwości i biofilmów. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób związki te są syntetyzowane, modelowane in silico i oznaczane in vivo pod kątem aktywności przeciwko LuxR / HapR.

Synteza i test inhibitorów Vibrio Quorum Sensing

Drożdże rozszczepienia są tutaj używane jako heterologiczne gospodarze do ekspresji bakteryjnych białek cytoszkieletu, takich jak FtsZ i MreB, jako translacyjnych białek fuzyjnych z GFP, aby uwidocznić ich polimeryzację. Również związki, które wpływają na polimeryzację, są identyfikowane przez obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

To badanie opracowało test do wysokoprzepustowych badań przesiewowych przeciwko Mycobacterium abscessus z niedawno stworzonym podwójnym szczepem reporterowym, wykorzystując fluorescencję i luminescencję do szybkiej oceny żywotności bakterii. Protokół ten będzie istotny dla naukowców dążących do badań przesiewowych nowych leków przeciwko tej lekoopornej bakterii.

Opracowanie testów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom

Protokół ten wprowadza fluorometryczną metodologię przesiewania zoptymalizowaną do identyfikacji produktów naturalnych/inhibitorów małych cząsteczek syntezy białek. Jego praktyczność sprawia, że nadaje się zarówno do nauczania technik odkrywania leków na poziomie licencjackim, jak i do wdrażania w kampaniach chemii medycznej.

Protokół oparty na fluorescencji do wstępnego badania inhibitorów syntezy białek pochodzących z naturalnych źródeł

Protokół ten opisuje metodę produkcji i oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej oraz cytotoksyczności peptydu kationowego Mel4 oraz naśladowcy peptydu RK758. Integrując syntezę chemiczną, ekspresję rekombinowaną oraz standaryzowane testy funkcjonalne, zapewnia usprawniony proces produkcji i testowania peptydów oraz naśladowców małych cząsteczek.

Produkcja i testowanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych oraz ich naśladowców

Przedstawiamy tutaj protokół do identyfikacji potencjalnych kandydatów do leków przeciwgruźliczych poprzez badanie fenotypową, obejmujące syntezę chemiczną związku 4-aminochinolinowego, określenie jego minimalnego stężenia hamującego wobec Mycobacterium tuberculosis i ocenę jego cytotoksyczności w liniach komórek ssaczych.

Identyfikacja potencjalnych kandydatów przeciwgruźliczych: Krok po kroku przewodnik po syntezie, oznaczaniu MIC i ocenie cytotoksyczności w komórkach ssaczy

Poznaj protokół syntezy masarymycyny, inhibitora autolizyn bakteryjnych, i zastosowanie w badaniach morfologicznych z Bacillus subtilis oraz Streptococcus pneumoniae. Metoda umożliwia analizę fizjologii bakterii Gram-dodatnich.

Synteza masarymycyny, małocząsteczkowego inhibitora wzrostu bakterii Gram-dodatnich

Przeglądaj więcej filmów