Wysokoprzepustowe obrazowanie konfokalne trymerów kolców SARS-CoV-2 sprzężonych z kropkami kwantowymi w celu śledzenia wiązania i endocytozy w komórkach HEK293T

Opracowaliśmy technologię platformy dla SARS COVID 2, która może być stosowana do innych wirusów, z rozpoznawaniem i wnikaniem komórek za pośrednictwem Spike jako pierwszym krokiem w komórkowej infekcji wirusowej. Kropki kwantowe są jasne, stabilne, a ich powierzchnia może być funkcjonalizowana do różnych zastosowań komórkowych. Za pomocą tej metody możemy wizualizować i mierzyć internalizację Spike w komórkach.

Aby przygotować 0,1%BSA. Dodaj 130 mikrolitrów 7,5% BSA do 10 mililitrów nośników obrazowania w mieszance. Aby uzyskać 6,1 do trzech seryjnych rozcieńczeń i trzykrotności, dodaj 14,26 mikrolitrów QD Spike do 285,74 mikrolitrów 0,1% BSA, aby uzyskać najwyższe stężenie 20 nanomoli.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów 20 nanomoli lub QD Spike do 200 mikrolitrów 0,1% BSA, aby uzyskać drugie złudzenie 6,67 nanomola QD Spike. Usuń wszystkie zużyte media z każdej studzienki za pomocą aspiratora wielokanałowego, umyj raz pipetą wielokanałową ze 100 mikrolitrami pożywki do obrazowania na studzienkę, a następnie odessaj 100 mikrolitrów pożywki do obrazowania. Dodaj z powrotem 50 mikrolitrów roztworu QD Spike na studzienkę i inkubuj płytkę przez trzy godziny w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Nosząc sprzęt ochronny, przygotuj 4% PFA i 0,1% PSA pożywki obrazowe w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego, odessaj 50 mikrolitrów QD Spike z każdej studzienki i dodaj 100 mikrolitrów 4% PFA na studzienkę za pomocą automatycznej pipety wielokanałowej, aby uniknąć wysuszenia studzienek. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, następnie przemyć trzykrotnie PBS, przygotować ciemnoczerwony barwnik jądrowy, rozcieńczając pięciomilimetrowy roztwór podstawowy w stężeniu od jednego do 1000 w PBS, zassać PBS i dodać z powrotem 50 mikrolitrów rozcieńczonego barwnika jądrowego na studzienkę. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć trzykrotnie PBS, zobrazować płytkę lub uszczelnić ją za pomocą zgrzewarki do płytek w celu późniejszego obrazowania.

Przechowuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Uruchom oprogramowanie platformy do obrazowania. Po zalogowaniu się na platformę obrazowania utwórz nowy protokół akwizycji, wybierając typ płytki jako przezroczystą dolną płytkę obrazową o 96 ściankach, wybierz tryb optyczny, który przeszedł na ogniskową i powiększenie jako 40-krotne zanurzenie w wodzie, wybierz binowanie jako jeden.

Wybierz tryb cyfrowych kontrastów twarzy, takich jak wysoki kontrast, aby uzyskać dobrze zdefiniowane ciała komórek. Zrób migawkę, aby potwierdzić, że ten kierunek jest odpowiedni, jak widać w oknie obrazu, wybierz kanał dopasowania C do użycia z linią komórkową ACE2-GFP, aby zobrazować transport ACE2 w komórce. Aby utworzyć niestandardowy kanał QD, wybierz menu rozwijane trójkąta i wybierz wzbudzenie w zakresie 405 nanometrów w emisji w zakresie 608 nanometrów, wybierz studzienkę z silnym cytoplazmatycznym sygnałem QD, aby ustawić czas ekspozycji, moc lasera i pozycję wysokości Z.

Sprawdź, czy domyślna wysokość tworzy obraz komórek w żądanej płaszczyźnie ogniskowej. Pozycja Z będzie niższa dla punktu endocytozy niż pozycja Z dla błony plazmatycznej. Wybierz czas naświetlania, zwykle od 100 do 300 milisekund, który daje jasny obraz z poziomami szarości, co najmniej trzykrotnie większymi niż sygnał tła.

Przy 20 nanomolach poziomy szarości powinny wynosić około 6 000 jednostek atomowych z czasem naświetlania 200 milisekund i 80% mocą lasera. Sprawdź poziomy szarości, klikając prawym przyciskiem myszy obraz utworzony za pomocą funkcji migawki w każdym kanale i wybierając pokaż intensywność, a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy interesujący obiekt lub tło, aby wyświetlić poziom szarości dla tego piksela, dostosuj moc lasera, aby precyzyjnie dostroić intensywność interesujących obiektów. Zapisz protokół akwizycji, przełącz się na uruchomienie eksperymentu i wprowadź nazwę tabliczki, uruchom eksperyment.

Translokację zarówno QD, jak i ACE2 uwidoczniono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i linii komórkowej eksprymującej ACE2-GFP. Przeprowadzono segmentację obrazu, a następnie analizę w celu wyodrębnienia odpowiednich parametrów, takich jak liczba punktów. Po pierwsze, jądra zostały wydzielone z kanału znacznika jądrowego, aby stworzyć populację ROI.

Następnie region ROI przedstawiający komórkę z segmentacją za pomocą kanału ACE2-GFP. Wreszcie, plamki kolców QD 608 zostały podzielone na segmenty z regionu ROI komórki, zinternalizowane sygnały QD i ACE2 wykazały silną kolokalizację. Eksperyment stężenie-odpowiedź z sześcioma różnymi stężeniami QD Spike przeprowadzono w komórkach HEK 293T.

Określając stężenia optyczne QD, QDS może być stosowany już od 2,22 nanomola, jednak zaleca się stosowanie stężeń 10 nanomoli lub wyższych, aby zapewnić solidną odpowiedź. Podczas koniugacji z białkiem QD może dojść do agregacji. Agregaty zostały zauważone w roztworze QD jako jasne zlepione osady i komórki HEK 293T, QD inkubowano ze zneutralizowanymi przeciwciałami, zaczynając od 30 mikrogramów na mikrolitr przed dodaniem do komórek, przeciwciała te blokowały internalizację wiązania i powodowały zmniejszenie liczby plamek w porównaniu z komórkami traktowanymi tylko QD.

Ten esej może być również wykorzystany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, wiodącej oceny przeciwciał neutralizujących w celu identyfikacji leków przeciwwirusowych typu pun do zablokowania wejścia wirusa i dostosowania do badania nowo pojawiających się wariantów.