Elastyczna platforma do monitorowania sensorycznego uczenia się asocjacyjnego zależnego od móżdżku
19 stycznia 2022
Opracowaliśmy pojedynczą platformę do śledzenia zachowań zwierząt podczas dwóch zadań związanych z nauką asocjacyjną zależnych od włókien wspinaczkowych. Niedroga konstrukcja umożliwia integrację z eksperymentami optogenetycznymi lub obrazowymi ukierunkowanymi na aktywność móżdżku związaną ze wspinaniem się włókien.
Paradygmaty sensorycznego uczenia się asocjacyjnego ujawniły wiele na temat funkcji móżdżku i jego związku z resztą mózgu oraz zachowaniem. Używając myszy jako organizmu modelowego, przedstawiamy metodę o wystarczającej szczegółowości, aby laboratoria na całym świecie mogły skutecznie i niedrogo wdrożyć te potężne metody. Nasz protokół pozwoli naukowcom na ustalenie wielu zachowań zależnych od móżdżku.
Podstawowe funkcje naszej platformy badawczej można łatwo modyfikować w celu dopasowania do konkretnego pytania badawczego. Aby rozpocząć, podłącz interfejsu szeregowego kamery do aparatu i port kamery w kontrolerze SBC. Następnie pobierz system operacyjny kontrolera SBC na komputer hosta i utwórz plik o nazwie ssh na karcie microSD.
Wysuń kartę microSD z komputera hosta. Włóż go do gniazda kart microSD SBC i włącz SBC. Następnie, aby przygotować kontroler SBC do zaakceptowania przewodowego połączenia z hostem, otwórz terminal, wpisz polecenie ifconfig" i zapisz adres IP Ethernet kontrolera SBC.
Następnie przejdź do zakładki Interface w ustawieniach Konfiguracja Raspberry Pi i włącz opcje dla kamery, SSH i VNC. Aby ustanowić połączenie przewodowe, podłącz Ethernet do portu Ethernet kontrolera SBC i komputera hosta, a drugi koniec tych podłącz do przełącznika Ethernet. Następnie, korzystając z klienta przetwarzania w sieci wirtualnej, takiego jak VNC, uzyskaj dostęp do pulpitu przy użyciu adresu IP kontrolera SBC i domyślnego uwierzytelniania.
Następnie pobierz wymagane oprogramowanie i niezbędne biblioteki Pythona do kontrolera SBC. Aby umożliwić bezpośrednią kontrolę nad mikrokontrolerem, pobierz zintegrowane środowisko programistyczne mikrokontrolera lub oprogramowanie IDE. Następnie otwórz okno terminala SBC, przejdź do katalogu Pobrane i zainstaluj IDE.
Po otwarciu IDE mikrokontrolera wybierz Narzędzia, a następnie Zarządzaj bibliotekami i zainstaluj bibliotekę kodera od Paula Stoffregena. Na koniec włóż pendrive do portu USB w kontrolerze SBC i wprowadź polecenia dotyczące montażu zewnętrznego urządzenia pamięci masowej USB. Po podłączeniu kontrolera SBC do portu programowania mikrokontrolera otwórz szkic do pobrania za pomocą IDE mikrokontrolera i prześlij go do mikrokontrolera.
Następnie należy pobrać i zainstalować odpowiednią wersję Arduino IDE na komputerze hosta. Następnie pobierz plik DTSC_US. ino sketch do komputera hosta.
Podłącz przewód USB A do USB B do komputera hosta i mikrokontrolera. Otwórz szkic i prześlij go do mikrokontrolera. Podłącz przewody do płytki stykowej mikrokontrolera, diod LED, enkodera obrotowego, silnika krokowego ze sterownikiem i elektrozaworu ze sterownikiem.
Następnie podłącz jeden kanał zasilacza do pinów dodatniego V i GND sterownika silnika krokowego. Po włączeniu zasilania należy ustawić napięcie dołączonego kanału na 25 woltów. Następnie podłącz dodatni przewód zasilacza do pinu napięcia podtrzymującego sterownika zaworu elektromagnetycznego, a drugi przewód dodatni do pinu napięcia skokowego.
Po włączeniu zasilania należy ustawić kanał podłączony do napięcia skokowego na 12 woltów, a kanał podłączony do napięcia podtrzymania na 2,5 wolta. Następnie podłącz źródło powietrza o ciśnieniu 20 funtów na cal kwadratowy do zaworu elektromagnetycznego. Następnie, aby wykonać koło jezdne, wytnij trzycalowe koło z wałka piankowego i wywierć ćwierćcalowy otwór w dokładnym środku koła.
Następnie włóż ćwierćcalowy wałek do koła i zamocuj go na miejscu za pomocą zacisków piast. Przymocuj enkoder obrotowy do 4.5-calowego aluminiowego kanału. Następnie ustabilizuj aluminiowy kanał na aluminiowej płytce stykowej.
Po zamocowaniu koła na enkoderze obrotowym należy ustabilizować wolną stronę wału koła za pomocą łożyska umieszczonego w zacisku końcowym pod kątem prostym, zamontowanego na słupku optycznym montowanym na płytce stykowej. Następnie ustaw zagłówki za pomocą słupków optycznych i zacisków słupków pod kątem prostym. Następnie umieść diodę LED bodźca warunkowego i wylot zaworu elektromagnetycznego dla bodźca bezwarunkowego DEC wokół zmontowanego koła.
Następnie zamontuj silnik krokowy używany do bezwarunkowego bodźca DTSC i kamery Pi na słupku optycznym. Umieść matrycę światła podczerwonego po tej samej stronie co kamera Pi, nieco powyżej i bezpośrednio skierowana w stronę, w której zostanie umieszczony pysk zwierzęcia. Stwórz bodziec dotykowy do opóźnionego kondycjonowania dotykowego przerażenia, przyklejając piankę do krawędzi kawałka akrylu.
Zamontuj na ćwierćcalowym wale za pomocą clamppiasty, a następnie przymocuj bodziec dotykowy do wału silnika krokowego. Aby wszczepić płytkę głowy, znieczul mysz, a następnie wykonaj nacięcie skalpelem wzdłuż linii środkowej skóry głowy, od tylnej krawędzi oczu do czaszki. Rozłóż nacięcie otwarte i zaciśnij obie strony hemostatykami, aby utrzymać je otwarte.
Za pomocą kleju cyjanoakrylowego przymocuj płytkę głowy do czaszki. Następnie nałóż mieszankę proszku cementu dentystycznego, rozpuszczalnika i katalizatora na wszystkie obszary odsłoniętej kości. Zszyj skórę zamkniętą, z tyłu i z przodu płyty głowy.
Następnie wstrzyknij pooperacyjne środki przeciwbólowe, pozwalając myszy dojść do siebie przez co najmniej pięć dni. Aby przygotować myszy do sesji behawioralnych, pozwól im przyzwyczaić się do platformy, montując je w zagłówku. Przed sesją upewnij się, że wylot zaworu elektromagnetycznego jest wyśrodkowany na oku docelowym, w odległości mniejszej niż jeden centymetr, a bodziec dotykowy jest wyśrodkowany na nosie myszy, w odległości około 1.5 centymetra.
Aby przygotować sesję DTSC, uruchom graficzny interfejs użytkownika z terminala SBC. Przeprowadź sesję testową składającą się z trzech prób i upewnij się, że zarejestrowane dane, które są drukowane do terminala, wykazują odchylenie większe niż 20, ale mniejsze niż 100 kroków. Aby uruchomić sesję, zamontuj mysz na zagłówku i uruchom graficzny interfejs użytkownika z terminala SBC.
Aby zapisać nagrania z kamery, naciśnij przycisk Strumień przed rozpoczęciem sesji. Wprowadź informacje identyfikujące zwierzę w polu Identyfikator zwierzęcia i naciśnij przycisk Ustaw. Następnie wprowadź żądane parametry eksperymentu i naciśnij przycisk Prześlij do Arduino".
Na koniec naciśnij Rozpocznij sesję, aby rozpocząć sesję. Wyniki treningu DEC z sesji nagraniowej przy dopuszczalnym oświetleniu są pokazane tutaj. Dopuszczalne warunki oświetlenia skutkowały dobrym kontrastem między sierścią oka a sierścią okołooczną.
Wydajność pojedynczej myszy trenowanej przez osiem sesji wykazała ślady behawioralne, bez warunkowej odpowiedzi u niewytrenowanej myszy i solidnych reakcji warunkowych po wytrenowaniu myszy. Przykładowy film próbny pokazuje wyszkoloną mysz, która z powodzeniem zamyka oko w odpowiedzi na bodziec warunkowy LED, podczas gdy niewyszkolona mysz nie mruga, dopóki nie pojawi się bodziec bezwarunkowy. Reakcja warunkowa zwiększa się pod względem wielkości i częstotliwości poprzez sesje behawioralne wykonywane w ciągu kilku dni.
Nieoptymalne warunki oświetleniowe poważnie ograniczają jakość pozyskiwanych danych. Gdy kontrast między okiem a otaczającym go futrem jest niski, niewielkie zmiany w obrazie mogą znacząco zmienić zarejestrowany kształt bezwarunkowej odpowiedzi w ciągu jednej sesji i zmniejszyć stosunek sygnału do szumu w celu wykrycia położenia powieki. Wyniki treningu DTSC dla myszy trenowanej przez pięć sesji przedstawiono tutaj.
Przykładowy film próbny pokazuje wyszkoloną mysz, która z powodzeniem cofa koło w odpowiedzi na bodziec warunkowy LED, podczas gdy niewyszkolona mysz nie porusza kołem, dopóki nie zostanie zastosowany dotykowy bodziec bezwarunkowy. Częstotliwość i amplituda uwarunkowanej odpowiedzi wzrasta wraz z postępem treningu. W kohorcie zwierząt trenowanych bezwarunkowym bodźcem, który wytwarzał bezwarunkowe reakcje o niskiej amplitudzie, żadne zwierzę nie nauczyło się konsekwentnie wytwarzać uwarunkowanych reakcji po czterech dniach treningu.
Dla udanego zachowania kluczowy jest komfort zwierzęcia podczas biegania na platformie. Ważne jest, aby upewnić się, że koło obraca się swobodnie i równomiernie przed przyzwyczajeniem zwierząt do zestawu. Korzystając z tej elastycznej platformy, udało nam się zobrazować i zaburzyć aktywność neuronów Purkinjego, komórek wyjściowych móżdżku, podczas uczenia się u zwierząt z unieruchomioną głową.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia wszechstronną platformę do śledzenia zachowań zwierząt podczas zadań związanych z uczeniem asocjacyjnym zależnym od włókien pnących, wykorzystującą niskokosztową konstrukcję odpowiednią do integracji z eksperymentami optogenetycznymi lub obrazowaniem. Badania koncentrują się na aktywności móżdżku u myszy, mając na celu pogłębienie zrozumienia procesów uczenia się oraz zachowań związanych z móżdżkiem.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Zachowanie zwierząt
- Funkcje móżdżku
Wprowadzenie
- Niniejsze badanie wykorzystuje paradygmaty sensorycznego uczenia asocjacyjnego do eksploracji funkcji móżdżku.
- Mysz służy jako organizm modelowy do badania interakcji móżdżku z zachowaniem.
- Opracowana platforma może wspomagać badanie zachowań zależnych od móżdżku w ramach różnorodnych pytań badawczych.
- Konstrukcja ta jest w znacznym stopniu dostosowywalna do specyficznych potrzeb badawczych.
Cel badania
- Zapewnienie szczegółowej i kosztowo efektywnej metody wdrażania śledzenia zachowań móżdżkowych.
- Wsparcie badaczy w opracowywaniu zadań zależnych od włókien pnących w modelach zwierzęcych.
- Umożliwienie modyfikacji podstawowych funkcji platformy w zależności od pytań badawczych.
Zastosowane metody
- Platforma zawiera komputer jednopłytkowy (SBC) oraz kamerę do śledzenia wizualnego.
- Wykorzystuje myszy jako główny model biologiczny do badania aktywności i zachowania móżdżku.
- W transkrypcji nie wspomniano o przepływach pracy multiomicznych.
- Kluczowe etapy obejmują konfigurację SBC, instalację niezbędnego oprogramowania oraz okablowanie poszczególnych komponentów do eksperymentów behawioralnych.
- Opisano konkretne przygotowania do sesji behawioralnych oraz metodologię monitorowania sesji.
Główne wyniki
- Platforma umożliwia skuteczne śledzenie i integrację zachowań zależnych od włókien pnących.
- Specyficzne kroki metodologiczne ułatwiają niezawodne gromadzenie danych podczas sesji behawioralnych.
- Sprzyja zrozumieniu mechanizmów i reakcji móżdżku w kontekście uczenia się asocjacyjnego.
- Adaptacyjność platformy została podkreślona jako istotna zaleta dla różnorodnych zastosowań badawczych.
Wnioski
- Niniejsze badanie prezentuje praktyczne podejście do kosztownej analizy funkcji móżdżku oraz związanych z nimi zachowań uczących się w sposób ekonomiczny.
- Adaptacyjność zapewnia badaczom elastyczność niezbędną do dostosowania eksperymentów do ich specyficznych pytań badawczych.
- Wyniki przyczyniają się do głębszego zrozumienia mechanizmów neuronalnych związanych z uczeniem się i zachowaniem.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niskokosztowa, adaptacyjna platforma behawioralna umożliwia skalowalną, wysokoprzepustową ocenę zależnego od móżdżku sensorycznego uczenia asocjacyjnego u myszy z unieruchomioną głową. Dzięki wsparciu równoległego treningu wielu zwierząt oraz integracji z optogenetycznymi odczytami lub obrazowaniem, system zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz redukcji ryzyka mechanistycznego w programach poszukiwania leków na schorzenia OUN.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrycia i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie funkcji obwodów móżdżku w paradygmatach sensorycznego uczenia się asocjacyjnego w celu walidacji celów zaangażowanych w uczenie się motoryczne i koordynację.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzowane, powtarzalne odczyty behawioralne u wielu zwierząt, co zmniejsza zmienność w początkowym etapie testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych pomiarów zmiennych zależnych (np. amplitudy i częstotliwości reakcji warunkowanej), które są odpowiednie do opracowywania testów oraz przesiewowania związków w obrębie szlaków móżdżkowych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia standaryzację testów dzięki automatycznemu śledzeniu ruchu koła i rejestracji zachowań za pomocą kamery, co umożliwia wiarygodną ocenę związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia system istotny w kontekście chorób do badania deficytów uczenia się zależnych od móżdżku, co wspiera dopasowanie translacyjnych biomarkerów w zaburzeniach koordynacji ruchowej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia przejście od etapu odkryć do przedklinicznej walidacji poprzez dopuszczenie podłużnego śledzenia postępów w uczeniu się pomiędzy poszczególnymi sesjami.
Integracja potoku i przepływu pracy
Platforma ta integruje się z kontinuum odkryć, od wczesnej walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, wspierając testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w obwodach móżdżku.
- Biologia odkryć: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolację wkładu włókien wspinających do komórek Purkinjego podczas uczenia się asocjacyjnego.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowe wyniki behawioralne (odchylenie koła, zamknięcie powiek), które umożliwiają porównanie między warunkami eksperymentalnymi a manipulacjami genetycznymi lub farmakologicznymi.
- Analityka: Zapewnia dane z szeregów czasowych dotyczące rozwoju reakcji warunkowej, co ułatwia analizę statystyczną krzywych uczenia się i wielkości efektów.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie zachowań zależnych od móżdżku, które mają znaczenie dla ludzkiego uczenia się motorycznego oraz zaburzeń poczucia czasu.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zaprojektowane do trenowania wielu zwierząt na jednym komputerze hostującym, co sprzyja ponownemu wykorzystaniu platformy w różnych projektach i zespołach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w funkcji obwodów móżdżku.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację, powtarzalność i skalowalność dzięki niskokosztowej, modułowej konstrukcji oraz zautomatyzowanemu rejestrowaniu danych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), umożliwiając wczesne wykrycie zaangażowania celu w szlakach związanych z uczeniem się, co redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów w obrębie OUN z uwzględnieniem ryzyka poprzez wiarygodne, wysokoprzepustowe fenotypowanie behawioralne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu neuronauki behawioralnej, podstaw elektroniki oraz konfiguracji oprogramowania (SBC, mikrokontroler, Python/Arduino IDE).
- Metoda zależy od instrumentacji, w tym od komputera jednopłytowego, kamery, enkodera obrotowego, silnika krokowego, elektrozaworu oraz wsporników optycznych do stabilizacji głowy.
- Konieczna jest standaryzacja procedur montażowych, protokołów kalibracyjnych (np. progi ugięcia koła, warunki oświetleniowe) oraz potoków analizy danych pomiędzy zespołami.
- Wymaga rozważenia adaptacji do różnych szczepów myszy, wieku oraz technik implantacji płytek głowowych w celu zapewnienia spójnych wyników behawioralnych.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak wrażliwość na nieoptymalne oświetlenie, co może pogorszyć stosunek sygnału do szumu w śledzeniu powiek, oraz konieczność habituacji w celu zmniejszenia zmienności wywołanej stresem.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:47
Setting Up the Single-Board Computer (SBC)
3:13
Wiring Stimulus Hardware and Assembling Stage
6:40
Preparing and Running the Behavior Experiments
8:48
Results: Delay Eyeblink Conditioning (DEC) and Delayed Tactile Startle Conditioning (DTSC) Trials
10:56
Conclusion
