Mikroskopia fluorescencyjna trójfotonowa tkanek głębokich w nienaruszonym mózgu myszy i danio pręgowanego

Protokół ilustruje, jak przeprowadzić mikroskopię trójfotonową in vivo w głębokich tkankach w mózgu myszy i dorosłym danio pręgowanym. Dwa ważne systemy modelowe w naukach przyrodniczych. Mikroskopia trójfotonowa o dużej długości fali umożliwia obrazowanie in vivo w wysokiej rozdzielczości przestrzennej nienaruszonych tkanek lub narządów na głębokościach, które są niedostępne dla mikroskopii dwufotonowej.

Ta technika może pomóc nam zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw chorób neurologicznych, takich jak choroba Alzheimera i autyzm, w przypadku których brakuje pełnego zrozumienia, w jaki sposób choroba wpływa na mózg. Procedurę obrazowania mózgu myszy zademonstruje Kibaek Choe, doktor habilitowany z naszego laboratorium, a procedurę obrazowania mózgu danio pręgowanego zademonstruje Kristine Kolkman, pracownik naukowy z Fetcho Research Laboratory. Aby rozpocząć, włącz laser i ustaw środkową długość fali wyjścia idlera niewspółliniowego optycznego wzmacniacza parametrycznego na 1, 300 lub 1, 700 nanometrów, a następnie umieść kompresory impulsów na ścieżce światła, aby wstępnie ćwierkać laser femtosekundowy i zoptymalizować czas trwania impulsu dla obrazowania trójfotonowego.

Ustaw kąt między płytką krzemową a ścieżką lasera pod kątem Brewstera, aby zmaksymalizować przepuszczalność lasera, a następnie obróć płytkę silikonową, aby uzyskać kąt Brewstera, minimalizując odbicie. Następnie umieść lustra flipper, aby wygodnie przełączać się między liniami wiązki 1, 300 i 1, 700 nanometrów. Umieść półpłytkę falową zamontowaną na stoliku obrotowym i rozdzielaczu wiązki polaryzacyjnej, aby kontrolować intensywność lasera, a następnie umieść bloker wiązki na ścieżce odbicia rozdzielacza wiązki.

Przygotuj szalkę Petriego z 0,5 centymetra 2% agaru o wysokiej temperaturze topnienia. Gdy agar ostygnie i zastygnie, wytnij prostokątny otwór w agarze dłuższy i nieco szerszy niż ryba. Za pomocą wosku przymocuj cienką rurkę do szalki Petriego z jednym końcem w prostokącie i rurką o większej średnicy do krawędzi szalki Petriego.

Następnie znieczulij rybę, umieszczając ją w roztworze tricainy o stężeniu 0,2 miligrama na mililitr, następnie umieść znieczuloną rybę na boku na mokrej gąbce, a następnie za pomocą mikrostrzykawki wstrzyknij po orbicie 3 mikrolitry bromku pankuronium, aby sparaliżować rybę i na krótko umieść ją w roztworze Hanka, aby upewnić się, że jest całkowicie sparaliżowana. Następnie umieść rybę grzbietem do góry na szalce Petriego z głową skierowaną w stronę rurki, a następnie za pomocą kleszczy delikatnie otwórz pysk ryby i wsuń rurkę do ust. Delikatnie przesuń rybę w kierunku rurki, tak aby rurka znalazła się z tyłu pyska ryby.

Szybko, ale delikatnie, osusz agar wokół ryby i usuń wodę z wierzchu ryby. Zanurz mały kawałek tkanki laboratoryjnej w kleju laboratoryjnym i połóż tkankę na agarze po obu stronach ryby i na grzbiecie ryby, ogonowo do skrzeli. Następnie znieczul skórę ryby, umieszczając niewielką kroplę bupiwakainy bezpośrednio na powierzchni głowy, a następnie przynieś szalkę Petriego z rybą do mikroskopu.

Napełnij naczynie wodą z urządzenia do ryb i podłącz do rurki pompę wodną, aby pompować wodę z systemu do pyska ryby. Upewnij się, że woda jest natleniona bełkotką i podgrzana do 30 stopni Celsjusza za pomocą grzałki akwariowej. W celu obrazowania należy umieścić obiektyw o małym powiększeniu na mikroskopie trójfotonowym, a następnie umieścić szalkę Petriego zawierającą rybę i rurki pod mikroskopem i użyć źródła światła LED do oświetlenia szalki Petriego.

W oprogramowaniu do akwizycji obrazów otwórz tryb aparatu, kliknij na żywo, wybierz kanał A po prawej stronie ekranu i dostosuj ustawienia histogramu, aby obraz był wyraźnie widoczny. Po ustawieniu ustawienia silnika w sterowniku silnika na podstawę, opuść obiektyw, aż ryba będzie widoczna. Umieść środek głowy ryby w środku pola widzenia, a następnie przesuń obiektyw w górę i odsuń go od głowy ryby.

Zamień soczewkę obiektywu o małym powiększeniu na soczewkę obiektywową o dużej aperturze numerycznej do obrazowania trójfotonowego, a następnie przesuń ją bliżej głowy ryby. Ustaw wartości osi wszystkich silników na zero. Powoli opuść soczewkę obiektywu, upewniając się, że obiektyw nie styka się fizycznie z głową.

W oprogramowaniu kamery CCD zatrzymaj przesuwanie obiektywu, gdy widoczny jest czubek głowy, i ustaw położenie X, Y i Z na zero. Wyłącz źródło światła LED i zamknij ciemną kurtynę wokół systemu, a następnie ustaw oprogramowanie do akwizycji obrazu w trybie wielofotonowego GG dla obrazowania trójfotonowego i ustaw moc pod soczewką obiektywu na mniej niż jeden miliwat. Kliknij przycisk Na żywo w oprogramowaniu do akwizycji obrazu.

Otwórz kanały PMT i dostosuj wzmocnienie PMT i poziom tła zgodnie z potrzebami. Powoli przesuwaj soczewkę obiektywu w górę, aby zlokalizować powierzchnię głowy, monitorując kanał THG z dużych naczyń krwionośnych i powierzchni szyby okiennej. Po zbliżeniu soczewki obiektywu do okienka należy nalać wodę między obiektyw a okienko czaszki, a następnie ustawić wartości osi wszystkich silników na zero.

Kliknij przycisk Na żywo w oprogramowaniu do akwizycji obrazu. Otwórz kanały PMT i w razie potrzeby dostosuj wzmocnienie PMT i poziom tła, a następnie powoli przesuwaj soczewkę obiektywu w górę, aby zlokalizować powierzchnię szkiełka nakrywkowego, monitorując kanał THG z dużych naczyń krwionośnych i powierzchni szkła okiennego. W razie potrzeby dostosuj orientację okna, a następnie wyzeruj silniki, aby zdefiniować powierzchnię mózgu.

Wykonaj obrazowanie i dostosuj poziom mocy do głębokości obrazowania. Nieinwazyjne i głębokie obrazowanie genetycznie znakowanych neuronów w mózgu dorosłego danio pręgowanego uzyskuje się za pomocą mikroskopii trójfotonowej. Można również zaobserwować rozmieszczenie warstw komórkowych w tektum nerwu wzrokowego i móżdżku.

Do zlokalizowania ryby wykorzystano funkcję kamery mikroskopu. Czaszka jest widoczna w kanale THG, który pomaga poruszać się po mózgu i znaleźć górną powierzchnię. Neurony można wyróżnić wysokim stosunkiem sygnału do tła głęboko w mózgu dorosłego człowieka.

Pokazano tutaj wielokolorowe, trójfotonowe obrazy neuronów znakowanych GCaMP6s i naczyń krwionośnych znakowanych Texas Red wraz z sygnałami THG w mózgu dorosłej myszy. Dzięki optymalizacji konfiguracji udało się uzyskać obrazy o wysokim kontraście z dokładnością do 1,2 milimetra od powierzchni mózgu w regionie hipokampa CA1. Ślady aktywności wapnia neuronów znakowanych GCaMP6s na głębokości 750 mikrometrów podczas 10-minutowej sesji nagraniowej wykazały wysoką wierność zapisu.

Ta konfiguracja może pomóc w wizualizacji aktywności neuronalnej w celu zrozumienia funkcji mózgu. Może być również używany do śledzenia ruchu komórek w tkance biologicznej w celu zrozumienia różnych systemów biologicznych. Dodatkowo można również zmierzyć prędkość przepływu krwi w celu monitorowania stanu zdrowia zwierzęcia.