Name: Mikroskopia fluorescencyjna trójfotonowa tkanek głębokich w nienaruszonym mózgu myszy i danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Poznaj mikroskopię trójfotonową do obrazowania głębokich tkanek mózgu myszy i danio pręgowanego. Ta technika umożliwia wysokorozdzielcze, nieinwazyjne badanie neuronów w celu zrozumienia chorób neurologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub i NIH 1U01NS103516.

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Horton, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+three-photon+microscopy+of+subcortical+structures+within+an+intact+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain.</a> Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).</li>
<li>Wang, T., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-photon+neuronal+imaging+in+deep+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Three-photon neuronal imaging in deep mouse brain.</a> Optica. 7 (8), 947-960 (2020).</li>
<li>Ouzounov, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+three-photon+imaging+of+activity+of+GCaMP6-labeled+neurons+deep+in+intact+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled neurons deep in intact mouse brain.</a> Nature Methods. 14 (4), 388-390 (2017).</li>
<li>Weisenburger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+Ca2%2B+imaging+in+the+mouse+brain+using+hybrid+multiplexed+sculpted+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Volumetric Ca2+ imaging in the mouse brain using hybrid multiplexed sculpted light microscopy.</a> Cell. 177 (4), 1050-1066 (2019).</li>
<li>Yildirim, M., Sugihara, H., So, P. T. C., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+visual+cortical+layers+and+subplate+in+awake+mice+with+optimized+three-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of visual cortical layers and subplate in awake mice with optimized three-photon microscopy.</a> Nature Communications. 10, 177(2019).</li>
<li>Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficial+bound+of+the+depth+limit+of+two-photon+imaging+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain.</a> eNeuro. 7 (1), (2020).</li>
<li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Light%2C+Science+%26+Applications%22%5BJournal%5D)">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light, Science & Applications. 7, 12(2018).</li>
<li>Hontani, Y., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+three-photon+fluorescence+imaging+with+single-wavelength+excitation+deep+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain.</a> Science Advances. 7 (12), 3531(2021).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+deep-brain+structural+and+hemodynamic+multiphoton+microscopy+enabled+by+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">In vivo deep-brain structural and hemodynamic multiphoton microscopy enabled by quantum dots.</a> Nano Letters. 19 (8), 5260-5265 (2019).</li>
<li>Chow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+three-photon+imaging+of+the+brain+in+intact+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li>
<li>Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aXu%2C+C+%22Topics+in+Fluorescence+Spectroscopy.+5%22">Topics in Fluorescence Spectroscopy. 5</a>. , Springer. Boston, MA. 471-540 (2002).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (12), e680(2008).</li>
<li>Łukasiewicz, K., Robacha, M., Bożycki, Ł, Radwanska, K., Czajkowski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+two-photon+in+vivo+imaging+of+synaptic+inputs+and+postsynaptic+targets+in+the+mouse+retrosplenial+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53528(2016).</li>
<li>Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+lateral+craniotomy+procedure+for+mesoscale+wide-field+optical+imaging+of+brain+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e52642(2017).</li>
<li>Gordon, J. P., Martinez, O. E., Fork, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+dispersion+using+pairs+of+prisms%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Negative dispersion using pairs of prisms.</a> Optics Letters. 9 (5), 150-152 (1984).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setup+and+use+of+a+two-laser+multiphoton+microscope+for+multichannel+intravital+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).</li>
<li>Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersion+compensation+in+three-photon+fluorescence+microscopy+at+1%2C700+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Dispersion compensation in three-photon fluorescence microscopy at 1,700 nm.</a> Biomedical Optics Express. 6 (4), 1392-1397 (2015).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+1300-nm+three-photon+calcium+imaging+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of 1300-nm three-photon calcium imaging in the mouse brain.</a> eLife. 9, 53205(2020).</li>
<li>Cheng, L. -C., Horton, N. G., Wang, K., Chen, S. -J., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+multiphoton+action+cross+sections+for+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Measurements of multiphoton action cross sections for multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3427-3433 (2014).</li>
<li>Huang, K. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virtual+reality+system+to+analyze+neural+activity+and+behavior+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).</li>
<li>Jacobson, G. A., Rupprecht, P., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+odor+representations+in+the+telencephalon+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of odor representations in the telencephalon of zebrafish.</a> Current Biology. 28 (1), 1-14 (2018).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+of+functional+spatial+maps+in+the+zebrafish+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Early development of functional spatial maps in the zebrafish olfactory bulb.</a> Journal of Neuroscience. 25 (24), 5784-5795 (2005).</li>
<li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 348 (6236), 789-793 (2015).</li>
<li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+live+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+their+endogenous+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche.</a> Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).</li>
<li>Kobat, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+multiphoton+microscopy+using+longer+wavelength+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation.</a> Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).</li>
<li>Wang, M., Wu, C., Sinefeld, D., Li, B., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+effective+attenuation+lengths+for+long+wavelength+in+vivo+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Comparing the effective attenuation lengths for long wavelength in vivo imaging of the mouse brain.</a> Biomedical Optics Express. 9 (8), 3534-3543 (2018).</li>
<li>Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+femtosecond+laser+nanosurgery+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+B%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues.</a> Applied Physics B. 81 (8), 1015-1047 (2005).</li>
<li>Li, B., Wu, C., Wang, M., Charan, K., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adaptive+excitation+source+for+high-speed+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy.</a> Nature Methods. 17 (2), 163-166 (2019).</li>
<li>Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+microscopy+to+1.6-mm+depth+in+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106014(2011).</li>
<li>Akbari, N., Rebec, M. R., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+deeper+than+the+transport+mean+free+path+with+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Imaging deeper than the transport mean free path with multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 13, 452-463 (2022).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje procedury konfiguracji obrazowania 3P z wykorzystaniem komercyjnego mikroskopu i źródła laserowego. W porównaniu do 2PM, 3PM wykazuje przewagę w zastosowaniach wymagających dostępu optycznego do głębszych obszarów, takich jak hipokamp mózgu myszy. Choć 3PM jest stosowane głównie w neuronauce, może ono potencjalnie znaleźć zastosowanie w innych tkankach, takich jak węzły chłonne, kości i guzy, w celu obserwacji głębokich warstw tkanki.
Ważne jest, aby zweryfikować, czy system obrazowania pracuje blisko limitu szumu śrutowego, co gwarantuje, że elektronika detekcji i akwizycji danych wnosi pomijalny szum do obrazu za PMT. Niepewność liczby wykrytych fotonów jest fundamentalnie ograniczona przez szum śrutowy fotonów. Wydajność ograniczoną szumem śrutowym można osiągnąć w typowym mikroskopie wielofotonowym, stosując fotodetektor o dużym wzmocnieniu (np. PMT). Szum śrutowy fotonów podlega rozkładowi statystycznemu Poissona, w którym odchylenie standardowe rozkładu jest równe pierwiastkowi kwadratowemu z jego średniej. Aby zweryfikować wydajność ograniczoną szumem śrutowym, należy wykonać krok 1.14 w sekcji protokołu.
Aby uniknąć tłumienia światła przez H2O, pomocne jest zastosowanie D2O do imersji, szczególnie przy pobudzeniu ok. 1,700 nm. W przypadku użycia D2O niezbędne jest odświeżanie D2O co ok. 10 min lub zastosowanie dużej objętości D2O, aby zapobiec wymianie D2O/H2O podczas obrazowania. Można również odizolować D2O od otoczenia3. Jeśli do obrazowania używany jest obiektyw z dużą odległością roboczą (WD) (np. WD wynosząca 4 mm lub więcej), grubość cieczy imersyjnej może przekraczać 2-3 mm. Zwiększona grubość sprawia, że absorpcja H2O staje się niepomijalna nawet przy ok. 1,300 nm21. W związku z tym D2O może być niezbędne nawet w przypadku 3PM przy 1,300 nm podczas korzystania z obiektywu z dużą WD.
Ponieważ intensywność fluorescencji 3P zależy od sześcianu energii impulsu wzbudzenia w ognisku (Równanie (1)), ustawienie odpowiedniej mocy lasera jest szczególnie istotne dla uzyskania odpowiednich sygnałów fluorescencji 3P przy jednoczesnym uniknięciu uszkodzeń termicznych i nieliniowych w żywych tkankach. Średnia moc lasera powinna być utrzymywana poniżej progu uszkodzeń termicznych. Przykładowo, w mózgu myszy, aby uniknąć termicznego uszkodzenia tkanki, średnia moc na powierzchni mózgu myszy powinna wynosić około 100 mW lub mniej dla wzbudzenia przy ~1,300 nm na głębokości 1 mm i polu widzenia (FOV) 230 µm x 230 µm21. Podobnie, średnia moc przy ~1,700 nm powinna wynosić około 50 mW lub mniej na głębokości ~1 mm i przy FOV ~230 µm x 230 µm (dane nieopublikowane). Ponadto, aby uniknąć nasycenia wzbudzenia i potencjalnych uszkodzeń nieliniowych, energia impulsu wzbudzenia powinna być utrzymywana poniżej <img alt="Równowaga statyczna; ΣFx≤0; schemat; fizyka; analiza równowagi; wektory sił; warunki stabilności." src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3">2 nJ oraz <img alt="Równowaga statyczna; ΣFx≤0; schemat; fizyka; analiza równowagi; wektory sił; warunki stabilności." src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3">3 nJ odpowiednio dla wzbudzenia ~1,300 nm i ~1,700 nm30.
Ze względu na absorpcję i rozpraszanie światła w tkankach, energia impulsu w ognisku ulega osłabieniu do 1/e (~37%) po penetracji tkanek przez 1 EAL. EAL różni się w zależności od rodzaju tkanki i długości fali wzbudzenia, np. w neocortex mózgu myszy EAL wynosi ~300 µm oraz ~400 µm odpowiednio przy ~1300 nm i ~1700 nm3,29 (Rycina 5). W związku z tym, aby zachować tę samą energię impulsu w ognisku (np. 1 nJ/impuls) na głębokości n W przypadku EAL, energię impulsu powierzchniowego należy pomnożyć przez 1 nJ × enW celu szybkiego obrazowania dynamiki strukturalnej i funkcjonalnej pożądane jest zastosowanie lasera wzbudzającego o wysokiej częstotliwości repetycji (1 MHz lub więcej), aby uzyskać wysoką liczbę klatek na sekundę.5,6,7,10Jednakże wymagana energia impulsu oraz limit średniej mocy lasera ograniczają możliwą do zastosowania częstotliwość repetycji.
Na przykład, podczas obrazowania regionu o umiarkowanej głębokości na poziomie 4 EAL (tj. ~1,2 mm w korze mózgu myszy przy pobudzeniu 1 300 nm), wymagane jest ~55 nJ/impuls na powierzchni, aby utrzymać 1 nJ/impuls w ognisku. Przy ograniczeniu mocy średniej do 100 mW możemy zastosować częstotliwość repetycji lasera ~2 MHz. Jednakże, aby obrazować głębiej, na poziomie 7 EAL, na powierzchni wymagane jest ~1 100 nJ/impuls, aby utrzymać 1 nJ/impuls w ognisku. Przy założeniu, że maksymalna moc średnia wynosi 100 mW w celu uniknięcia uszkodzeń termicznych, częstotliwość repetycji lasera powinna zostać zredukowana do 0,1 MHz, aby uzyskać 1 100 nJ/impuls na powierzchni. Tabela 1 podsumowuje typowe warunki obrazowania w korze mózgu myszy. Należy zauważyć, że głębokości obrazowania w Tabeli 1 zakładają, że EAL jest jednorodna w całej korze mózgu myszy.
Ponadto, ze względu na ograniczenia mocy lasera w 3PM w głębokich tkankach, istnieje kompromis między częstotliwością odświeżania klatek a rozmiarem piksela obrazu, co jest szczególnie istotne w obrazowaniu funkcjonalnym, takim jak obrazowanie wapnia. Maksymalna dostępna częstotliwość repetycji lasera jest określana dla każdej głębokości na podstawie wymaganej energii impulsu w ognisku oraz dopuszczalnej średniej mocy lasera, o czym mowa powyżej, np. 2 MHz na głębokości odpowiadającej ~4 EALs przy wzbudzeniu 1 300 nm. Generalnie obrazowanie wymaga co najmniej jednego impulsu na piksel. W związku z tym minimalny dostępny czas przebywania wiązki w pikselu jest determinowany przez częstotliwość repetycji lasera, np. 0,5 µs/pixel przy wzbudzeniu 2 MHz.
Aby zachować wysoką rozdzielczość przestrzenną (~1 µm w płaszczyźnie bocznej) w obrazach 3P, idealnie jest przypisać 1 piksel do obszaru ~1 µm2, np. 256 x 256 pikseli dla pola widzenia (FOV) o wymiarach 250 x 250 µm2. W związku z tym, aby przeprowadzić szybkie obrazowanie przy znacznie dużym FOV (np. 250 x 250 µm2 przy 256 x 256 pikselach), częstotliwości powtarzania impulsów 0,5 MHz, 1 MHz i 2 MHz zapewniają teoretyczne maksymalne prędkości obrazowania wynoszące odpowiednio ~7,6, ~15 i ~30 klatek/s. Podobnie, w zależności od docelowej głębokości, prędkości skanowania i FOV, niezbędna jest optymalizacja częstotliwości powtarzania laserowego, aby zastosować odpowiednią energię impulsu poniżej progu uszkodzeń termicznych. W celu zwiększenia prędkości obrazowania można zastosować adaptacyjne źródło wzbudzenia, aby skoncentrować wszystkie impulsy wzbudzenia na neuronach (tj. w obszarach zainteresowania), dostarczając impulsy laserowe do neuronów na żądanie31.
Mikroskopia 3-fotonowa (3PM) wykazuje przewagę nad mikroskopią 2-fotonową (2PM) w obrazowaniu głębokim w żywych tkankach oraz przez media silnie rozpraszające, takie jak czaszka, kości i warstwa białej istoty (np. torebka zewnętrzna) mózgu myszy. Dłuższa efektywna długość tłumienia (EAL) oraz nieliniowe wzbudzenie wyższego rzędu w procesie 3-fotonowej absorpcji (3PE) sprzyjają obrazowaniu w głębokich tkankach. Na przykład, podczas obrazowania GCaMP6 w korze mózgu myszy, sygnał fluorescencji 2P przy wzbudzeniu 920 nm jest silniejszy niż sygnał fluorescencji 3P przy wzbudzeniu 1,300 nm w regionach płytkich na głębokości <img alt="Równowaga statyczna; ΣFx≤0; schemat; fizyka; analiza równowagi; wektory sił; warunki stabilności." src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3">690 µm (tj. ~2,3 EAL przy 1,300 nm)21. Jednak ze względu na dłuższą EAL przy 1,300 nm w porównaniu do 920 nm, 3PE generuje silniejszą fluorescencję niż wzbudzenie 2-fotonowe (2PE) na głębokości ~690 µm i większej21. Głębokość ta jest definiowana jako „głębokość przecięcia sygnałów” (signal crossover depth), przy której natężenia sygnałów fluorescencji 2PE i 3PE są identyczne przy tej samej częstotliwości repetycji i tej samej maksymalnej dopuszczalnej mocy średniej21. Głębokość przecięcia sygnałów zależy od długości fal wzbudzenia dla 2PE i 3PE oraz od rodzaju fluoroforu.
W praktyce wzbudzanie przy 920 nm pozwala na zastosowanie wyższej średniej mocy lasera niż wzbudzanie przy 1300 nm ze względu na mniejszą absorpcję wody. Jednak wyższa średnia moc 2PE przesunęłaby głębokość przecięcia sygnałów jedynie o 0,9 EALs4. Ponadto, gdy próbka jest gęsto znakowana, 3PE oferuje dodatkową zaletę w postaci znacznie wyższego SBR. Zatem, nawet przed osiągnięciem długości przecięcia sygnałów, 3PM może być lepsze do obrazowania niż 2PM. Na przykład podczas obrazowania naczyń krwionośnych mózgu myszy, które mają ułamek objętości (tj. gęstość znakowania) wynoszący ~2%, 3PM przy 1300 nm i mocy wzbudzenia 100 mW przewyższa 2PM przy 920 nm i mocy wzbudzenia 200 mW na głębokości ~700 µm dla fluoresceiny.
3PM ma również przewagę podczas obrazowania przez cienką, lecz silnie rozpraszającą warstwę, która może zniekształcić funkcję rozproszenia punktowego (PSF) wiązki wzbudzenia i generować tło wynikające z defokusowania4. Na przykład w przypadku obrazowania przez nienaruszoną czaszkę mózgu myszy, obrazy 2PM są obarczone tłem z defokusowania nawet przy niewielkiej głębokości &lt;100 µm od powierzchni mózgu13. Podobne tło z defokusowania zaobserwowano w 2PM przy wzbudzeniu 1,280 nm przez białą istotę mózgu myszy32. Zatem w przypadku obrazowania tkanek przez warstwy mętne, 3PM jest preferowaną metodą względem 2PM dla uzyskania obrazowania o wysokim kontraście, niezależnie od gęstości znakowania.
Niedawno przedstawiliśmy fantom z kuleczkami oraz analizę teoretyczną wykazującą, że limit głębokości obrazowania w 3PM przekracza 8 EALs33; 8 EALs odpowiada ok. 3 mm przy wzbudzeniu ok. 1,700 nm w korze mózgu myszy. Jednak obecnie dostępne lasery nie posiadają wystarczającej energii impulsu, aby osiągnąć 8 EALs w mózgu myszy. Dalszy rozwój mocniejszych laserów pozwoli przesunąć obecny limit głębokości obrazowania w 3PM.

W naukach o życiu techniki mikroskopii wielofotonowej (MPM), takie jak 2PM i 3PM, stały się potężnymi narzędziami do głębokiego obrazowania in vivo z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną i wysokim kontrastem w tkankach rozpraszających. Dodatkowo metody te powodują mniejszy fotobleaching w porównaniu z konfokalną mikroskopią jednofotonową1,2,3,4. 3PM jest korzystniejsza w obrazowaniu głębszych warstw tkanki w porównaniu z 2PM ze względu na dwie główne cechy: (i) zastosowanie dłuższej długości fali wzbudzenia (~1,300 nm lub ~1,700 nm) redukuje rozpraszanie w tkance oraz (ii) proces wzbudzenia wyższego rzędu (tzn. sygnał fluorescencji w 3PM zależy od sześcianu mocy wzbudzenia, zamiast od kwadratu mocy wzbudzenia w 2PM), co tłumi niepożądaną fluorescencję tła3. W konsekwencji 3PM umożliwia obrazowanie o wysokim kontraście w głębszych obszarach żywych tkanek, takich jak hipokamp w nienaruszonym mózgu dorosłej myszy3,5,6,7,8,9,10,11 oraz cały przedmózg dorosłego danio pręgowanego12, w tym rejestrację aktywności Ca2+ i obserwacje wielokolorowe. Ponadto za pomocą 3PM uzyskano obrazy o wysokim kontraście poprzez nienaruszone czaszki myszy i dorosłego danio pręgowanego12,13.
Obecnie w sprzedaży dostępne są źródła laserów wzbudzających odpowiednie do wzbudzania trójfotonowego (3PE) przy długościach fali ~1,300 i ~1,700 nm. Ponieważ system skanowania laserowego jest w zasadzie taki sam dla 2PM i 3PM, w laboratoriach biologicznych możliwe jest przekształcenie istniejącego układu 2P w układ 3P poprzez instalację dostępnego komercyjnie lasera do 3PE. Sygnał fluorescencji 3P zależy od mocy lasera, czasu trwania impulsu, częstotliwości repetycji lasera oraz apertury numerycznej (NA) obiektywu. Przy założeniu ogniska ograniczonego dyfrakcyjnie (tj. gdy tylna apertura obiektywu jest przepełniona przez wiązkę wzbudzającą), równanie (1) opisuje średni w czasie strumień fotonów fluorescencji z objętości ogniskowej wynikający z 3PE.
<img alt="Równanie optyki nieliniowej do badań w dziedzinie fotoniki i spektroskopii; reprezentacja wzoru matematycznego." src="/files/ftp_upload/63213/63213eq01v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> (1)
Gdzie f częstotliwość powtarzania impulsu lasera, τ czas trwania impulsu lasera (pełna szerokość w połowie maksimum), ϕ wydajność zbierania układu, η jest wydajność kwantowa fluorescencji, σ3 jest to przekrój czynny na absorpcję 3-fotonową, C stężenie fluoroforu, n0 jest współczynnikiem załamania światła medium próbki (np. wody), λ czy długość fali wzbudzenia w próżni wynosi, ND jest aperturą numeryczną obiektywu, a3 jest stałą integracji przestrzennej objętości ogniskowej, <img alt="Wzór na równowagę statyczną ⟨P(t)⟩ w kontekście analizy równań fizycznych." src="/files/ftp_upload/63213/62313eq02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> jest to uśredniony w czasie strumień fotonów wzbudzenia (fotony/s) pod obiektywem, z jest głębokością obrazowania, a EAL jest efektywną długością tłumienia14W tym przypadku przyjęto, że EAL (zazwyczaj &gt; 100 µm) jest znacznie większa niż rozdzielczość osiowa mikroskopu (zazwyczaj &lt; 10 µm). W przybliżeniu paraksjalnym, a3 wynosi 28,114. gp(3) Czy 3 jestrd-rzędową spójność czasową źródła wzbudzenia oraz gp(3) wynosi odpowiednio 0,41 dla impulsów o kształcie kwadratu sekansa hiperbolicznego oraz 0,51 dla impulsów gaussowskich. Wydajność zbierania ϕ można oszacować, biorąc pod uwagę zbieranie fluorescencji przez obiektyw, transmitancję obiektywu, odblaskowość lustra dichroicznego, transmitancję filtrów oraz wydajność detekcji detektora (np. fotopowielacza, PMT). Ponieważ intensywność fluorescencji 3P jest silnie zależna od wielu parametrów, optymalizacja układu 3P jest niezbędna w celu maksymalizacji sygnałów fluorescencji 3P.
Niniejszy protokół ilustruje proces optymalizacji typowego układu 3P, co będzie szczególnie przydatne dla laboratoriów biologicznych, które dysponują układem 2P i planują rozszerzyć jego możliwości o obrazowanie 3P lub chcą utrzymać komercyjny układ 3P na optymalnym poziomie wydajności. Ten artykuł wideo demonstruje również głębokie obrazowanie 3P w mózgach żywych zwierząt. Pierwsza sekcja dotyczy optymalizacji typowego układu 3P z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego źródła laserowego i mikroskopu wielofotonowego. Druga i trzecia sekcje opisują odpowiednio przygotowanie danio pręgowanego i myszy do 3PM struktur i aktywności neuronalnej. Operacja kraniotomii u myszy została wcześniej opisana w artykułach protokołowych15,16,17. Czwarta sekcja prezentuje obrazowanie 3P intravitalne w mózgach danio pręgowanego i myszy.

<table><tbody><tr><td>5% powidon-jod</td><td>Amazon</td><td>NDC 67818-155-32</td><td>Aceptyczne czyszczenie obszarów chirurgicznych</td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CAS 64-17-5</td><td>Aceptyczne czyszczenie obszarów chirurgicznych</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma</td><td>A4718-256</td><td>Przygotowanie komory danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Atropine</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bergamo II</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>Mikroskop do obrazowania wielofotonowego</td></tr><tr><td>Bupiwakaina</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkło w kształcie pączka (ID4.5, OD6.5)</td><td>Potomac Photonics</td><td></td><td>Szkło nakrywkowe używane do maści do oczu kraniotomii</td></tr><tr><td>(lub miejscowej maści okulistycznej)</td><td>Puralube Maść weterynaryjna</td><td>NDC 17033-211-38</td><td>Stosowany jako lubrykant zapobiegający podrażnieniom lub łagodzący suchość oka podczas operacji i znieczulenia</td></tr><tr><td>GaAsP Amplified PMT</td><td>Thorlabs</td><td>PMT2100</td><td>detektor PMT</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycopyrrolate</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heater (800 W)</td><td>Finnex</td><td></td><td>Grzejnik akwariowy do wody danio pręgowanego)</td></tr><tr><td>Isoflurane USP 250 mL</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-0013-25</td><td>Do znieczulenia myszy</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td></td><td>Tkanka laboratoryjna do przygotowania danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Strzykawka Nanofil (10 mikrometrów) z igłą 36 G</td><td>WPI</td><td>NANOFIL + NF36BV</td><td>Strzykawka i igła do wstrzykiwań bromku pankuronium</td></tr><tr><td>Klej optyczny</td><td>Norland</td><td>NOA 68</td><td>Do sklejania ze sobą okrągłego szkiełka nakrywkowego i szkła w kształcie pączka.</td></tr><tr><td>Bromek pankuronium</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Elemental Science</td><td>ESI MP2</td><td>Pompa wodna do konfiguracji danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Rurki polietylenowe (ID 0,58 mm., OD 0,965 mm.)</td><td>Elemental Science</td><td>Rurka pompy MP2</td><td>Rurka, która wchodzi do pyska danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Okrągłe szkiełko nakrywkowe Niemieckie szkło #1,5, 5 mm</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>7229605</td><td>Szkło nakrywkowe używane do kraniotomii</td></tr><tr><td>Spirit-NOPA</td><td>Spectra Physics</td><td></td><td>Przestrajalny optyczny wzmacniacz parametryczny</td></tr><tr><td>SR400</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR400</td><td>Licznik fotonów</td></tr><tr><td>Standardowy czujnik mocy fotodiody</td><td>Thorlabs</td><td>S122C</td><td>Detektor mocy</td></tr><tr><td>Sterylizowany bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>SKU 806552-500ml</td><td>Używany podczas operacji mózgu myszy</td></tr><tr><td>Serweta chirurgiczna</td><td>Jednorazowa serweta na ręcznik Dynarex</td><td>4410</td><td>Do chirurgii myszy</td></tr><tr><td>Cienki pasek wosku bokserskiego</td><td>Corning Rubber Co., Inc.</td><td></td><td>Rurki przytrzymujące na miejscu w komorze danio pręgowanego</td></tr><tr><td>ThorImage</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>Oprogramowanie do akwizycji obrazu</td></tr><tr><td>Trikaina (sól metanosulfonianu etylu)</td> <td>MP</td><td>103106</td><td>Danio pręgowany anestezjologiczne i eutanazyjne</td></tr><tr><td>Rurki Tygon (ID 1/16 cala, OD 1/8 cala)</td><td>Tygon</td><td></td><td>Rurka do przepływu wody do przygotowania danio pręgowanego</td></tr><tr><td>VaporGuard</td><td>VetEquip</td><td>931401</td><td>Do recyklingu kleju tkankowego izofluranu</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>Do przyklejenia szklanego okienka na czaszce myszy oraz do przyklejenia tkanki laboratoryjnej podczas przygotowywania ryby.</td></tr><tr><td>XLPLN25XWMP2</td><td>Olympus</td><td></td><td>Dedykowany cel wzbudzenia wielofotonowego</td></tr></tbody></table>

mikroskopia fluorescencyjna trójfotonowa tkanek głębokich w nienaruszonym mózgu myszy i danio pręgowanego

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Techniki mikroskopii wielofotonowej, takie jak mikroskopia dwufotonowa (2PM) i mikroskopia trójfotonowa (3PM), są potężnymi narzędziami do obrazowania tkanek głębokich in vivo z rozdzielczością subkomórkową. 3PM ma dwie główne zalety dla obrazowania tkanek głębokich w porównaniu z 2PM, które jest szeroko stosowane w laboratoriach biologicznych: (i) dłuższa długość tłumienia w tkankach rozpraszających dzięki zastosowaniu lasera wzbudzającego ~1,300 nm lub ~1,700 nm; (ii) mniejsze generowanie fluorescencji tła z powodu wzbudzenia nieliniowego wyższego rzędu. W rezultacie, 3PM umożliwia obrazowanie strukturalne i funkcjonalne o wysokim kontraście głęboko w tkankach rozproszonych, takich jak nienaruszony mózg myszy, od warstw korowych do hipokampa i całego przodomózgowia dorosłego danio pręgowanego.
Dzisiaj, źródła laserowe odpowiednie dla 3PM są dostępne na rynku, umożliwiając konwersję istniejącego systemu obrazowania dwufotonowego (2P) na system trójfotonowy (3P). Ponadto dostępnych jest wiele komercyjnych mikroskopów 3P, co sprawia, że technika ta jest łatwo dostępna dla laboratoriów badawczych zajmujących się biologią. Ten artykuł pokazuje optymalizację typowej konfiguracji 3PM, szczególnie ukierunkowanej na grupy biologiczne, które mają już konfigurację 2P, i demonstruje obrazowanie 3D w trybie przyżyciowym w nienaruszonych mózgach myszy i dorosłych danio pręgowanego. Protokół ten obejmuje pełną procedurę eksperymentalną obrazowania 3P, w tym wyrównanie mikroskopu, wstępne chirping impulsów laserowych ~1,300 i ~1,700 nm, przygotowanie zwierząt i przyżyciowe obrazowanie fluorescencyjne 3P głęboko w mózgach dorosłych danio pręgowanych i myszy.

Prawidłowe wykonanie niniejszego protokołu pozwoli na właściwe skalibrowanie mikroskopu z optymalnymi parametrami światła (np. czas trwania impulsu, NA) oraz przygotowanie zwierząt odpowiednie do in vivo 3PM. Dostępny komercyjnie zestaw 3P zawiera odpowiednie lustra i soczewki zarówno dla długości fali ~1,300 nm, jak i ~1,700 nm; w związku z tym zmiana długości fali wzbudzenia między 1,300 nm a 1,700 nm nie wymaga modyfikacji optyki. Jeśli soczewki w zestawie 3P nie posiadają odpowiedniej powłoki dla 1,300 i 1,700 nm, należy je zastąpić właściwymi elementami w celu zminimalizowania strat mocy lasera. Dzięki zoptymalizowanemu 3PM i właściwemu przygotowaniu zwierząt możliwe jest uzyskanie wysokokontrastowych obrazów fluorescencji in vivo oraz obrazów THG z głębokich struktur mózgu.
Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne obrazy 3P nienaruszonych dorosłych rybek danio pręgowanych. Dzięki 3PM uzyskano wysokorozdzielcze, nieinwazyjne i głębokie obrazowanie genetycznie znakowanych neuronów w mózgu dorosłej rybki danio pręgowanej. Chociaż w literaturze opisano obrazowanie obszaru telencefalonu w mózgu dorosłych rybek danio pręgowanych z użyciem 2PM24,25,26,27, 3PM umożliwia dostęp do całego telencefalonu oraz obszarów, których obserwacja za pomocą innych technik jest trudniejsza lub niemożliwa. Rozkład warstw komórkowych w tekcie optycznym i móżdżku można zaobserwować na Rysunku 3C. W przypadku udanej sesji obrazowania kość jest widoczna w kanale THG, a neurony w kanale fluorescencji. Do obrazowania dorosłych rybek danio pręgowanych wykorzystano funkcję kamery mikroskopu w celu zlokalizowania ryby (Rysunek 3A). Krok ten nie jest konieczny przy obrazowaniu mózgu myszy, ponieważ szklane okno jest wystarczająco duże, aby mózg był łatwo dostępny. Wysokorozdzielcze obrazy strukturalne mózgu dorosłych rybek danio pręgowanych uzyskano przy użyciu systemu opisanego w poprzednich sekcjach. Czaszka jest widoczna w kanale THG (Rysunek 3B), co ułatwia nawigację po mózgu i odnalezienie jego powierzchni górnej. Jak pokazano na Rysunku 3C, neurony są możliwe do rozróżnienia z wysokim stosunkiem sygnału do tła (SBR) głęboko w mózgu dorosłej ryby. Tkanka nad mózgiem jest widoczna w kanale fluorescencji ze względu na autofluorescencję.
Rysunek 4 przedstawia wielokolorowe obrazy 3P neuronów znakowanych GCaMP6s (zielony) i naczyń krwionośnych znakowanych Texas Red (czerwony) wraz z sygnałami THG (niebieski) w mózgu dorosłej myszy przy wzbudzeniu 1 340 nm10. Obrazy zostały powtórzone z poprzedniej pracy10. Na Rysunku 4 energia impulsu w ognisku była utrzymywana na poziomie ~1,5 nJ w całej głębokości w celu uzyskania wystarczających sygnałów fluorescencji i THG, a maksymalna średnia moc lasera wynosiła ~70 mW. Czas trwania impulsu został dostrojony do ~60 fs, a efektywna NA wynosiła ~0,8. Dzięki optymalizacji układu 3PM pomyślnie uzyskano obrazy o wysokim kontraście do głębokości 1,2 mm od powierzchni mózgu, w regionie CA1 hipokampa (Rysunek 4A,B). Rysunek 4C,D przedstawia przebiegi aktywności Ca2+ neuronów znakowanych GCaMP6s na głębokości 750 µm podczas 10-minutowej sesji rejestracji, co wykazuje wysoką wierność zapisu.
Jeśli laser wzbudzający jest źle ustawiony, może zostać zaobserwowana nierównomierność jasności sygnału w polu widzenia. Ponadto, jeśli parametry lasera, takie jak czas trwania impulsu, energia impulsu wzbudzenia w ognisku oraz efektywna NA, nie są zoptymalizowane, obraz THG czaszki ryby lub okna kraniotomii mózgu myszy nie będzie widoczny i/lub będzie wymagał wysokiej energii impulsu wzbudzenia (np. &gt;2 nJ/pulse w ognisku). Zatem sygnały THG na powierzchni mózgu mogą służyć jako wskaźnik zoptymalizowanego układu 3PM przed rozpoczęciem obrazowania głębokich tkanek.
<img alt="Układ mikroskopii tróbfotonowej; NOPA z laserem pompującym, kompresorem pryzmatycznym, schemat systemu obrazowania 3PM." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny rysunek układu 3PM. Długość fali lasera wzbudzającego jest ustawiona na ~1,300 nm lub ~1,700 nm, z wyjściem z portu idler NOPA. Kompresor z pary pryzmatów oraz kompresor z płytki Si są używane odpowiednio dla lasera ~1,300 nm i ~1,700 nm w celu wstępnej kompresji (prechirp) impulsu lasera wzbudzającego. Wiązki laserowe ~1,300 nm i ~1,700 nm można przełączać za pomocą luster odchylających (flipper mirrors). Port sygnałowy NOPA jest wykorzystywany do uzyskania sygnału wyzwalającego. Do kontroli mocy wzbudzenia użyto płytki ćwierćfalowej i PBS. Fluorescencję oraz THG wykrywają PMT z GaAsP. Odpowiednie kombinacje luster dichroicznych i filtrów pasmowych są stosowane do oddzielenia sygnałów fluorescencji i THG. Skróty: 3PM = mikroskopia tróbfotonowa; NOPA = niekolinearny optyczny wzmacniacz parametryczny; PBS = polaryzacyjny dzielnik wiązki; THG = generowanie trzeciej harmonicznej; DAQ = akwizycja danych; PMT = fotopowielacz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat interfejsu oprogramowania do mikroskopii fluorescencyjnej; wyświetlone ustawienia przechwytywania i analizy obrazu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne zrzuty ekranu dla obrazowania intravitalnego u ryb (sekcja protokołu 4.1). (A) Widok trybu kamery w oprogramowaniu do akwizycji obrazu z zainstalowanym obiektywem 4x. Kluczowe funkcje oprogramowania są obrysowane i ponumerowane w następujący sposób: 1. Tryb obrazowania w oprogramowaniu do akwizycji obrazu. Opcje trybów to Camera, Multiphoton oraz Multiphoton GG. Do obrazowania w świetle białym z kamerą CCD wybierany jest tryb Camera. 2. Kliknięcie przycisku Live włącza kamerę (lub PMT w opcjach wielofotonowych), co umożliwia obserwację podglądu mikroskopu w czasie rzeczywistym. 3. W zakładce Capture Setup ustawiane są pożądane parametry obrazowania (moc, lokalizacja, głębokość). 4. W zakładce Capture przypisuje się lokalizację folderu, w którym mają zostać zapisane obrazy. W tej zakładce można rozpocząć obrazowanie. 5. Ustawienie Z Control kontroluje głębokość obrazowania poprzez przesuwanie silnika stolika w osi z. 6. Reprezentatywny obraz głowy danio pręgowanego. Strona rostralna głowy znajduje się po lewej stronie. (B) Reprezentatywny widok trybu Camera z obiektywem 25x. (C) Reprezentatywny widok trybu Multiphoton GG zawierający obraz THG obszaru widocznego na zdjęciu (B). Skróty: CCD = charge-coupled device; PMT = photomultiplier tube; THG = third-harmonic generation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat obrazowania nerwowego z regionami OT i CB, przedstawiony w mikroskopii fluorescencyjnej na różnych głębokościach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywne obrazy mózgu dorosłego danio pręgowanego uzyskane za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazów. (A) Obraz głowy dorosłego danio pręgowanego w trybie kamery, wykonany przy użyciu obiektywu 4x. Górna część obrazu wskazuje kierunek rostralny. Obrysowano płaty OT oraz CB. (B) Reprezentatywny obraz uzyskany w trybie Multiphoton GG przy użyciu obiektywu 25x, zawierający obraz THG obszaru z (A). (C) Obrazy fluorescencyjne mózgu dorosłego danio pręgowanego na styku móżdżku i wzgórza optycznego, gdzie GFP jest ekspresowane w cytoplazmie neuronów na różnych głębokościach. Paski skali = 100 µm. Skróty: OT = wzgórze optyczne; CB = móżdżek; THG = generacja trzeciej harmonicznej; GFP = zielone białko fluorescencyjne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazowanie tkanki mózgowej przedstawiające profile głębokości, mikroskopię fluorescencyjną i wykresy natężenia sygnału." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wielokolorowa 3PM neuronów znakowanych GCaMP6s (zielone), naczyń krwionośnych znakowanych Texas Red (czerwone) oraz generacji trzeciej harmonicznej (niebieskie) przy podbudzeniu 1,340 nm w mózgu myszy. (A) Obrazy Z-stack do głębokości 1,200 µm od powierzchni mózgu z polem widzenia 270 x 270 µm (512 x 512 pikseli na klatkę). Moc lasera była zmieniana w zależności od głębokości obrazowania, aby utrzymać energię impulsu ~1.5 nJ w ognisku. Maksymalna moc średnia pod obiektywem wynosiła 70 mW. (B) Wybrane obrazy 2D na różnych głębokościach obrazowania. (C) Miejsce rejestracji aktywności na głębokości 750 µm pod oponą twardą z polem widzenia 270 x 270 µm (256 x 256 pikseli). (D) Ślady spontanicznej aktywności mózgu zarejestrowane u budzącej się myszy z neuronów znakowanych wskazanych na (C). Częstotliwość klatek wynosiła 8.3 Hz, a czas przebywania piksela 0.51 µs. Częstotliwość repetycji lasera wynosiła 2 MHz, a moc średnia pod soczewką obiektywu 56 mW. Każdy ślad został znormalizowany do poziomu bazowego i przefiltrowany dolnoprzepustowo przy użyciu okna Hamminga o stałej czasowej 0.72 s. Paski skali = 50 µm. Rycina i legenda zostały powtórzone z 10. Skrót: 3PM = mikroskopia trójfotonowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres spektroskopowy; długość tłumienia w funkcji długości fali; analiza absorpcji wody i rozpraszania w tkankach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Efektywna długość tłumienia w neocortex mózgu myszy. EAL (linia purpurowa) została obliczona na podstawie rozpraszania w tkance (linia czerwona) i absorpcji wody w tkance (linia niebieska), przy założeniu 75% zawartości wody. Czarne gwiazdki wskazują zgłoszone dane eksperymentalne dotyczące EAL w neocortex mózgu myszy3,21,28,29. Należy zauważyć, że EAL różni się w zależności od tkanki. Skrót: EAL = efektywna długość tłumienia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Długość fali wzbudzenia 
			(nm)</td>
			<td>Woda immersyjna</td>
			<td>Maksymalna moc lasera 
			(mW)</td>
			<td>Maksymalna energia impulsu w ognisku* 
			(nJ)</td>
			<td>Typowy EAL w korze mózgu myszy 
			(µm)</td>
			<td>Głębokość obrazowania w korze mysiej 
			(mm)</td>
			<td>Energia impulsu pod obiektywem 
			(nJ)</td>
			<td>Maksymalna częstotliwość powtarzania impulsu lasera 
			(MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">1300</td>
			<td rowspan="4">H2O lub D2O</td>
			<td rowspan="4"><img alt="Równowaga statyczna; ΣFx≤0; diagram; fizyka; analiza równowagi; wektory sił; warunki stabilności." src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3">100</td>
			<td rowspan="4"><img alt="Równowaga statyczna; ΣFx≤0; diagram; fizyka; analiza równowagi; wektory sił; warunki stabilności." src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3">2</td>
			<td rowspan="4">~300</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~14</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2</td>
			<td>~55</td>
			<td>~2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6</td>
			<td>~210</td>
			<td>~0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.1</td>
			<td>~1100</td>
			<td>~0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">1700</td>
			<td rowspan="4">D2O</td>
			<td rowspan="4"><img alt="Równowaga statyczna; ΣFx≤0; schemat; fizyka; analiza równowagi; wektory sił; warunki stabilności." src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3">50</td>
			<td rowspan="4"><img alt="Równowaga statyczna; ΣFx≤0; diagram; fizyka; analiza równowagi; wektory sił; warunki stabilności." src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3">3</td>
			<td rowspan="4">~400</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~7</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2</td>
			<td>~20</td>
			<td>~2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6</td>
			<td>~55</td>
			<td>~1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.1</td>
			<td>~190</td>
			<td>~0.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Typowe warunki wzbudzenia 3P dla obrazowania kory mózgu myszy. 
*Przy użyciu obiektywu o wysokiej NA (~1.0), szerokości impulsu ~50 fs i typowych fluoroforów, takich jak białka fluorescencyjne (np. GFP i RFP). 
** Przy założeniu, że EAL jest jednorodna w całej korze. 
*** Aby uzyskać ~1 nJ/impuls w ognisku, obliczone na podstawie EAL i głębokości obrazowania. 
**** Obliczone na podstawie energii impulsu pod obiektywem i maksymalnej dopuszczalnej mocy lasera. 
Skróty: 3P = tróbfotonowe; NA = apertura numeryczna; GFP = zielone białko fluorescencyjne; RFP = czerwone białko fluorescencyjne; EAL = efektywna długość tłumienia.

Mikroskopia trójfotonowa umożliwia obrazowanie fluorescencyjne o wysokim kontraście głęboko w żywych tkankach biologicznych, takich jak mózgi myszy i danio pręgowanego, z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną.

Mikroskopia fluorescencyjna trójfotonowa tkanek głębokich w nienaruszonym mózgu myszy i danio pręgowanego

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

Protokół ilustruje, jak przeprowadzić mikroskopię trójfotonową in vivo w głębokich tkankach w mózgu myszy i dorosłym danio pręgowanym. Dwa ważne systemy modelowe w naukach przyrodniczych. Mikroskopia trójfotonowa o dużej długości fali umożliwia obrazowanie in vivo w wysokiej rozdzielczości przestrzennej nienaruszonych tkanek lub narządów na głębokościach, które są niedostępne dla mikroskopii dwufotonowej.Ta technika może pomóc nam zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw chorób neurologicznych, takich jak choroba Alzheimera i autyzm, w przypadku których brakuje pełnego zrozumienia, w jaki sposób choroba wpływa na mózg. Procedurę obrazowania mózgu myszy zademonstruje Kibaek Choe, doktor habilitowany z naszego laboratorium, a procedurę obrazowania mózgu danio pręgowanego zademonstruje Kristine Kolkman, pracownik naukowy z Fetcho Research Laboratory. Aby rozpocząć, włącz laser i ustaw środkową długość fali wyjścia idlera niewspółliniowego optycznego wzmacniacza parametrycznego na 1, 300 lub 1, 700 nanometrów, a następnie umieść kompresory impulsów na ścieżce światła, aby wstępnie ćwierkać laser femtosekundowy i zoptymalizować czas trwania impulsu dla obrazowania trójfotonowego.Ustaw kąt między płytką krzemową a ścieżką lasera pod kątem Brewstera, aby zmaksymalizować przepuszczalność lasera, a następnie obróć płytkę silikonową, aby uzyskać kąt Brewstera, minimalizując odbicie. Następnie umieść lustra flipper, aby wygodnie przełączać się między liniami wiązki 1, 300 i 1, 700 nanometrów. Umieść półpłytkę falową zamontowaną na stoliku obrotowym i rozdzielaczu wiązki polaryzacyjnej, aby kontrolować intensywność lasera, a następnie umieść bloker wiązki na ścieżce odbicia rozdzielacza wiązki.Przygotuj szalkę Petriego z 0,5 centymetra 2% agaru o wysokiej temperaturze topnienia. Gdy agar ostygnie i zastygnie, wytnij prostokątny otwór w agarze dłuższy i nieco szerszy niż ryba. Za pomocą wosku przymocuj cienką rurkę do szalki Petriego z jednym końcem w prostokącie i rurką o większej średnicy do krawędzi szalki Petriego.Następnie znieczulij rybę, umieszczając ją w roztworze tricainy o stężeniu 0,2 miligrama na mililitr, następnie umieść znieczuloną rybę na boku na mokrej gąbce, a następnie za pomocą mikrostrzykawki wstrzyknij po orbicie 3 mikrolitry bromku pankuronium, aby sparaliżować rybę i na krótko umieść ją w roztworze Hanka, aby upewnić się, że jest całkowicie sparaliżowana. Następnie umieść rybę grzbietem do góry na szalce Petriego z głową skierowaną w stronę rurki, a następnie za pomocą kleszczy delikatnie otwórz pysk ryby i wsuń rurkę do ust. Delikatnie przesuń rybę w kierunku rurki, tak aby rurka znalazła się z tyłu pyska ryby.Szybko, ale delikatnie, osusz agar wokół ryby i usuń wodę z wierzchu ryby. Zanurz mały kawałek tkanki laboratoryjnej w kleju laboratoryjnym i połóż tkankę na agarze po obu stronach ryby i na grzbiecie ryby, ogonowo do skrzeli. Następnie znieczul skórę ryby, umieszczając niewielką kroplę bupiwakainy bezpośrednio na powierzchni głowy, a następnie przynieś szalkę Petriego z rybą do mikroskopu.Napełnij naczynie wodą z urządzenia do ryb i podłącz do rurki pompę wodną, aby pompować wodę z systemu do pyska ryby. Upewnij się, że woda jest natleniona bełkotką i podgrzana do 30 stopni Celsjusza za pomocą grzałki akwariowej. W celu obrazowania należy umieścić obiektyw o małym powiększeniu na mikroskopie trójfotonowym, a następnie umieścić szalkę Petriego zawierającą rybę i rurki pod mikroskopem i użyć źródła światła LED do oświetlenia szalki Petriego.W oprogramowaniu do akwizycji obrazów otwórz tryb aparatu, kliknij na żywo, wybierz kanał A po prawej stronie ekranu i dostosuj ustawienia histogramu, aby obraz był wyraźnie widoczny. Po ustawieniu ustawienia silnika w sterowniku silnika na podstawę, opuść obiektyw, aż ryba będzie widoczna. Umieść środek głowy ryby w środku pola widzenia, a następnie przesuń obiektyw w górę i odsuń go od głowy ryby.Zamień soczewkę obiektywu o małym powiększeniu na soczewkę obiektywową o dużej aperturze numerycznej do obrazowania trójfotonowego, a następnie przesuń ją bliżej głowy ryby. Ustaw wartości osi wszystkich silników na zero. Powoli opuść soczewkę obiektywu, upewniając się, że obiektyw nie styka się fizycznie z głową.W oprogramowaniu kamery CCD zatrzymaj przesuwanie obiektywu, gdy widoczny jest czubek głowy, i ustaw położenie X, Y i Z na zero. Wyłącz źródło światła LED i zamknij ciemną kurtynę wokół systemu, a następnie ustaw oprogramowanie do akwizycji obrazu w trybie wielofotonowego GG dla obrazowania trójfotonowego i ustaw moc pod soczewką obiektywu na mniej niż jeden miliwat. Kliknij przycisk Na żywo w oprogramowaniu do akwizycji obrazu.Otwórz kanały PMT i dostosuj wzmocnienie PMT i poziom tła zgodnie z potrzebami. Powoli przesuwaj soczewkę obiektywu w górę, aby zlokalizować powierzchnię głowy, monitorując kanał THG z dużych naczyń krwionośnych i powierzchni szyby okiennej. Po zbliżeniu soczewki obiektywu do okienka należy nalać wodę między obiektyw a okienko czaszki, a następnie ustawić wartości osi wszystkich silników na zero.Kliknij przycisk Na żywo w oprogramowaniu do akwizycji obrazu. Otwórz kanały PMT i w razie potrzeby dostosuj wzmocnienie PMT i poziom tła, a następnie powoli przesuwaj soczewkę obiektywu w górę, aby zlokalizować powierzchnię szkiełka nakrywkowego, monitorując kanał THG z dużych naczyń krwionośnych i powierzchni szkła okiennego. W razie potrzeby dostosuj orientację okna, a następnie wyzeruj silniki, aby zdefiniować powierzchnię mózgu.Wykonaj obrazowanie i dostosuj poziom mocy do głębokości obrazowania. Nieinwazyjne i głębokie obrazowanie genetycznie znakowanych neuronów w mózgu dorosłego danio pręgowanego uzyskuje się za pomocą mikroskopii trójfotonowej. Można również zaobserwować rozmieszczenie warstw komórkowych w tektum nerwu wzrokowego i móżdżku.Do zlokalizowania ryby wykorzystano funkcję kamery mikroskopu. Czaszka jest widoczna w kanale THG, który pomaga poruszać się po mózgu i znaleźć górną powierzchnię. Neurony można wyróżnić wysokim stosunkiem sygnału do tła głęboko w mózgu dorosłego człowieka.Pokazano tutaj wielokolorowe, trójfotonowe obrazy neuronów znakowanych GCaMP6s i naczyń krwionośnych znakowanych Texas Red wraz z sygnałami THG w mózgu dorosłej myszy. Dzięki optymalizacji konfiguracji udało się uzyskać obrazy o wysokim kontraście z dokładnością do 1,2 milimetra od powierzchni mózgu w regionie hipokampa CA1. Ślady aktywności wapnia neuronów znakowanych GCaMP6s na głębokości 750 mikrometrów podczas 10-minutowej sesji nagraniowej wykazały wysoką wierność zapisu.Ta konfiguracja może pomóc w wizualizacji aktywności neuronalnej w celu zrozumienia funkcji mózgu. Może być również używany do śledzenia ruchu komórek w tkance biologicznej w celu zrozumienia różnych systemów biologicznych. Dodatkowo można również zmierzyć prędkość przepływu krwi w celu monitorowania stanu zdrowia zwierzęcia.

deep-tissue-three-photon-fluorescence-microscopy-intact-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej pracy opisujemy metodę montowania embrionów zebrafish do długotrwałego obrazowania, obrazowania dwufotonowego, technik uszkadzania tkanek oraz konfokalnego obrazowania time-lapse.

Dwufotonowa aksotomia i konfokalne obrazowanie time-lapse w żywych embrionach danio pręgowanego

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę obrazowania fluorescencyjnie znakowanych komórek w półgrubych skrawkach mózgu. Poprzez utrwalenie, pocięcie i optyczne klarowanie tkanki mózgowej opisujemy, w jaki sposób standardowe obrazowanie epifluorescencyjne lub konfokalne może być wykorzystane do wizualizacji poszczególnych komórek i sieci neuronalnych w obrębie nienaruszonej tkanki nerwowej.

Szybka metoda obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości w półgrubych przekrojach mózgu

Mikroskopia wielofotonowa całych organów myszy jest możliwa dzięki optycznemu klarowaniu organu przed obrazowaniem, jednak nie wszystkie protokoły zachowują sygnał fluorescencyjny białek fluorescencyjnych. Stosując metodę klarowania optycznego z dehydratacją opartą na etanolu oraz klarowaniem za pomocą mieszaniny alkoholu benzylowego i benzojanu benzylowego, prezentujemy wysokorozdzielcze obrazy wielofotonowe całego mózgu myszy wykazującego ekspresję YFP.

Mikroskopia wielofotonowa oczyszczonego mózgu mysiego z ekspresją YFP

Źródło: Hontani, Y., et al. Mikroskopia fluorescencyjna trójfotonowa tkanek głębokich w nienaruszonym mózgu myszy i danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje konfigurację i wykonanie obrazowania trójfotonowego w znieczulonym mózgu danio pręgowanego. Protokół umożliwia wizualizację głębokich tkanek neuronów znakowanych fluorescencyjnie, ujawniając aktywność neuronalną i struktury w czasie rzeczywistym do zastosowań badawczych w dziedzinie neurobiologii.

Obrazowanie tkanek głębokich mózgu danio pręgowanego przy użyciu trójfotonowego mikroskopu fluorescencyjnego

Opisano obrazowanie rozwoju naczyń mózgowych u larw danio pręgowanego. Dostępne są również techniki ułatwiające obrazowanie 3D i modyfikujące rozwój naczyń mózgowych za pomocą zabiegów chemicznych.

Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

W tym artykule opisujemy pełną procedurę eksperymentalną mającą na celu zrekonstrukcję, z wysoką rozdzielczością, anatomii mózgu fluorescencyjnie znakowanych myszy. Opisany protokół obejmuje przygotowanie i oczyszczanie próbki, montaż próbki do obrazowania, przetwarzanie końcowe danych oraz wizualizację wieloskalową.

Tomografia optyczna całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową z konfokalną mikroskopią arkuszową światła

Wielkoskalowa mikroskopia elektronowa 2D (EM), czyli nanotomia, to ogólnotkankowe zastosowanie nanoskalowej rozdzielczości EM. W tym miejscu opisujemy uniwersalną metodę nanotomii stosowaną do badania mózgu larw danio pręgowanego w zdrowiu i po nieinwazyjnym uszkodzeniu mózgu.

Wielkoskalowa skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (nanotomia) mózgu zdrowego i uszkodzonego danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

To badanie demonstruje dostarczanie powtarzających się urazowych uszkodzeń mózgu myszom i jednoczesne wszczepienie okna czaszkowego do późniejszego przyżyciowego obrazowania EGFP wyrażonego przez neuron za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Przyżyciowe obrazowanie ekspresji białek fluorescencyjnych u myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu i okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopu dwufotonowego

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania in vivo całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej. Procedura eksperymentalna obejmuje przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i wizualizację.

In vivo (in vivo) Obrazowanie całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej

Protokół ten zawiera szczegółowy opis krok po kroku podejścia dla przewlekłego modelu myszy z przewlekłym oknem czaszki oraz mikronaczyniowym zatorem naczyniowym, zoptymalizowanego do mikroskopii in vivo dwufotonowej z użyciem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych.

Model mikronaczyniowej embolii myszy do mikroskopii in vivo dwufotonowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych

Poznaj mikroskopię trójfotonową do obrazowania głębokich tkanek mózgu myszy i danio pręgowanego. Ta technika umożliwia wysokorozdzielcze, nieinwazyjne badanie neuronów w celu zrozumienia chorób neurologicznych.

Mikroskopia fluorescencyjna trójfotonowa tkanek głębokich w nienaruszonym mózgu myszy i danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów