In vitro Charakterystyka białek opiekuńczych histonów za pomocą testów analitycznych, pull-down i chaperoningowych

Nasz protokół opisuje, w jaki sposób techniki, takie jak testy pull-down, analityczna chromatografia wykluczająca rozmiar, analityczne ultrawirowanie i test opiekuńczy histonów, mogą być wykorzystane do potwierdzenia, czy białko jest opiekuńczym histonem. Omówione tutaj techniki, podczas korzystania z tandemu, mogą być stosowane bezpośrednio do scharakteryzowania domniemanego opiekuna. Jego praca mogłaby iść w parze z techniką biologii strukturalnej.

Techniki te mają zastosowanie w dziedzinie badań nad chromatyną. Jednak poszczególne metody mogą być stosowane do każdego innego białka będącego przedmiotem zainteresowania, w zależności od potrzeb. Procedurę zademonstruje Pan Surajit Gandhi, doktorant z mojego laboratorium, za skomplikowany test ściągany, Pani

Archana Samal, doktorantka, wraz z Panem Ruchirem C. Bobde za analityczny eksperyment ultra-wirowania, Pan Somanath Baral, doktorant; wraz z Mr.Ketul Saharan do testu super-zwijania plazmidu Najpierw wymieszaj pięciomikromolowe białka opiekuńcze histonów z 20-mikromolowymi dimerami H2A / H2B w 300 mikrolitrach buforu równoważącego. Odwirować kompleks opiekuńczy histonów H2A/H2B, aby usunąć wszelkie osady.

Załadować próbkę na kolumnę wirową wstępnie zrównoważoną buforem równowagowym. Przemyć kolumnę 100 objętościami kolumny lub czterema mililitrami buforu do płukania, aby usunąć nadmiar dimera H2A/H2B. Następnie wymieszaj kompleks opiekuńczy histonów H2A/H2B z tetramerem H3/H4 o grubości od 20 do 60 mikromolów.

Ponownie przemyć kolumnę 100 objętościami kolumny lub czterema mililitrami buforu płuczącego w celu usunięcia niezwiązanego tetrameru H3/H4, a następnie eluować próbki buforem elucyjnym. Poddaj elucjowane próbki 18%SDS-PAGE. Następnie zabarwij go błękitem brylantowym Coomassie R250 i zwizualizuj żel.

Oczyść dimer H2A/H2B, tetramer H3/H4 w opiekuńczym histonie indywidualnie za pomocą buforu dializacyjnego przy użyciu analitycznej chromatografii wykluczającej rozmiar. Należy zachować bufor z przebiegu, aby później przygotować dalsze rozcieńczenia i użyć go jako odniesienia w komórce AUC. W przypadku próbek AUC należy zmieszać oczyszczone białka opiekuńcze z dimerem lub tetramerem w oddzielnych probówkach do końcowej objętości 450 mikrolitrów, używając zaoszczędzonego buforu do dializy, aby osiągnąć OD280 od 0,3 do 0,6.

Zmontuj komórkę z dwusektorowym elementem centralnym i oknami kwarcowymi wyposażonymi w ultrawirówkę analityczną z detektorem absorbancji. Wlać 400 mikrolitrów roztworu próbki i 420 mikrolitrów buforu dializacyjnego odpowiednio do sektorów odniesienia i próbki komórki. Zważ i dokładnie wyważ ogniwa i załaduj je do czterootworowego tytanowego wirnika.

Wyrównaj komórki za pomocą znaczników na dole komórek i pokrętła. Załaduj wirnik do wirówki, zamknij pokrywę i rozpocznij pracę, co pozwoli na wytworzenie podciśnienia i ustabilizowanie temperatury. W celu analizy danych należy obliczyć gęstość i lepkość składników buforowych białek oraz częściową objętość właściwą na podstawie składu aminokwasowego białka za pomocą programu SEDNTERP.

Załaduj dane z maszyny AUC do programu SEDFIT. Zdefiniuj menisku, czerwoną linię, dolną komórkę, niebieską linię i zielone linie granic analizy danych. Wybierz opcję Ciągła dystrybucja CS jako model.

W sekcji parametrów ustaw maksymalną rozdzielczość do 100. Następnie ustaw minimum współczynnika sedymentacji na zero i maksimum na 10 do 15. Początkowo ustaw współczynnik tarcia na 1,2 i wybierz opcję zmiennoprzecinkową, aby uzyskać współczynnik na podstawie danych.

Ustaw współczynnik F na 0,68 dla regularyzacji jednej sigma. Ustawić częściową objętość właściwą, gęstość buforu i lepkość uzyskaną z SEDNTURP. Naciśnij Uruchom, aby umożliwić oprogramowaniu rozwiązanie równania lam.

Naciśnij przycisk Dopasuj, aby uściślić. Wybierz opcję Pokaż szczyt Mw w CS w funkcji wyświetlania głównego paska narzędzi, aby oszacować masy cząsteczkowe. Wymieszać dwumikromolowy tetramer H3/H4 i czteromikromolowy dimer H2A/H2B ze zwiększającymi się stężeniami opiekuńczego histonu, w zakresie od jednego do sześciu mikromolów, w buforze montażowym do końcowej objętości 50 mikrolitrów.

Inkubować mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Jednocześnie należy wstępnie potraktować 500 nanogramów ujemnie super-zwiniętego plazmidu PUC-19 jednym mikrogramem enzymu topoizomerazy I w buforze montażowym w końcowej objętości przy 50 mikrolitrach. Następnie połącz wstępnie zmieszany roztwór zawierający tetramer, dimer i opiekuńczy histon ze zrelaksowanym DNA osocza.

Dodaj 100 mikrolitrów buforu zatrzymanego 2X i inkubuj, aby zakończyć reakcję składania poprzez deproteinizację plazmidowego DNA. Dodać równą objętość fenolu nasyconego trisem do probówki zawierającej mieszaninę reakcyjną i dobrze wymieszać zawartość mieszaniny reakcyjnej. Następnie odwirować próbkę.

Delikatnie zebrać górną fazę wodną zawierającą plazmidowe DNA za pomocą mikropipety i wymieszać równą objętość chloroformu. Zwiruj mieszaninę. Następnie zbierz górną fazę wodną, dodaj 1/10 objętości trójmolowego octanu sodu o pH 5,5 i 2,5 objętości lodowatego etanolu.

Dobrze wymieszaj roztwór, odwracając probówkę trzy do czterech razy. Odwirować próbkę o stężeniu 16,200 g przez 10 minut i delikatnie odrzucić supernatant. Utrzymuj probówki otwarte w temperaturze pokojowej, aż nawet śladowe ilości etanolu odparują, pozostawiając wytrącone plazmidowe DNA w probówce.

Wyniki analityczne SEC wykazały, że rekombinowana domena N-końcowej nukleoplazminy białka FKBP53 Arabidopsis thaliana jest pentamerem o mocy 65 kilodaltonów w roztworze. Próbka nukleoplazminy poddana obróbce cieplnej wykazała, że domena jest wysoce stabilna termicznie. Domena nukleoplazminy wykazywała stabilność soli do dwóch molowców chlorku sodu i stabilność mocznika do czterech zębów trzonowych.

Test pull-down wykazał, że oddziaływanie domeny nukleoplazminy z dimerem H2A/H2B było stabilne do 0,4-molowego chlorku sodu, podczas gdy asocjacja z H3/H4 była stabilna do 0,7 molowców. Białko opiekuńcze wiąże jednocześnie dimer H2A/H2B i tetramer H3/H4, niezależnie od kolejności, w jakiej są one dodawane do białka opiekuńczego, co wskazuje na oddzielne miejsca interakcji dla oligomerów. Szacowane masy cząsteczkowe za pomocą AUC-SV ujawniają stechiometrię 1:1 domeny nukleoplazminy z oligomerami histonowymi.

W teście superzwijania plazmidu rekombinowane białka opiekuńcze histonów roślinnych AtNRP1 i AtNRP2 zwiększały ilość superskręconego plazmidu, co sugeruje, że może on osadzać histony na DNA, tworząc nukleosomy, powodując super zwijanie DNA. Test superzwijania plazmidu wymaga szczególnej ostrożności i możliwej optymalizacji pod kątem charakterystyki DNA histonów i białek opiekuńczych. Telemetria charakterystyki izomerycznej może być używana jako kontynuacja eksperymentów analitycznych z wykluczeniem wielkości w celu potwierdzenia stabilności wiązania.