In vitro Charakterystyka białek opiekuńczych histonów za pomocą testów analitycznych, pull-down i chaperoningowych
December 29th, 2021
Ten protokół opisuje zestaw metod, które obejmują analityczną chromatografię wykluczającą wielkość do badania oligomeryzacji i stabilności histonów opiekuńczych, test pull-down do rozwikłania interakcji chaperon-histon histon, AUC do analizy stechiometrii kompleksów białkowych oraz test opiekuńczy histonów do funkcjonalnego scharakteryzowania domniemanego chaperonu histonów in vitro.
Nasz protokół opisuje, w jaki sposób techniki, takie jak testy pull-down, analityczna chromatografia wykluczająca rozmiar, analityczne ultrawirowanie i test opiekuńczy histonów, mogą być wykorzystane do potwierdzenia, czy białko jest opiekuńczym histonem. Omówione tutaj techniki, podczas korzystania z tandemu, mogą być stosowane bezpośrednio do scharakteryzowania domniemanego opiekuna. Jego praca mogłaby iść w parze z techniką biologii strukturalnej.
Techniki te mają zastosowanie w dziedzinie badań nad chromatyną. Jednak poszczególne metody mogą być stosowane do każdego innego białka będącego przedmiotem zainteresowania, w zależności od potrzeb. Procedurę zademonstruje Pan Surajit Gandhi, doktorant z mojego laboratorium, za skomplikowany test ściągany, Pani
Archana Samal, doktorantka, wraz z Panem Ruchirem C. Bobde za analityczny eksperyment ultra-wirowania, Pan Somanath Baral, doktorant; wraz z Mr.Ketul Saharan do testu super-zwijania plazmidu Najpierw wymieszaj pięciomikromolowe białka opiekuńcze histonów z 20-mikromolowymi dimerami H2A / H2B w 300 mikrolitrach buforu równoważącego. Odwirować kompleks opiekuńczy histonów H2A/H2B, aby usunąć wszelkie osady.
Załadować próbkę na kolumnę wirową wstępnie zrównoważoną buforem równowagowym. Przemyć kolumnę 100 objętościami kolumny lub czterema mililitrami buforu do płukania, aby usunąć nadmiar dimera H2A/H2B. Następnie wymieszaj kompleks opiekuńczy histonów H2A/H2B z tetramerem H3/H4 o grubości od 20 do 60 mikromolów.
Ponownie przemyć kolumnę 100 objętościami kolumny lub czterema mililitrami buforu płuczącego w celu usunięcia niezwiązanego tetrameru H3/H4, a następnie eluować próbki buforem elucyjnym. Poddaj elucjowane próbki 18%SDS-PAGE. Następnie zabarwij go błękitem brylantowym Coomassie R250 i zwizualizuj żel.
Oczyść dimer H2A/H2B, tetramer H3/H4 w opiekuńczym histonie indywidualnie za pomocą buforu dializacyjnego przy użyciu analitycznej chromatografii wykluczającej rozmiar. Należy zachować bufor z przebiegu, aby później przygotować dalsze rozcieńczenia i użyć go jako odniesienia w komórce AUC. W przypadku próbek AUC należy zmieszać oczyszczone białka opiekuńcze z dimerem lub tetramerem w oddzielnych probówkach do końcowej objętości 450 mikrolitrów, używając zaoszczędzonego buforu do dializy, aby osiągnąć OD280 od 0,3 do 0,6.
Zmontuj komórkę z dwusektorowym elementem centralnym i oknami kwarcowymi wyposażonymi w ultrawirówkę analityczną z detektorem absorbancji. Wlać 400 mikrolitrów roztworu próbki i 420 mikrolitrów buforu dializacyjnego odpowiednio do sektorów odniesienia i próbki komórki. Zważ i dokładnie wyważ ogniwa i załaduj je do czterootworowego tytanowego wirnika.
Wyrównaj komórki za pomocą znaczników na dole komórek i pokrętła. Załaduj wirnik do wirówki, zamknij pokrywę i rozpocznij pracę, co pozwoli na wytworzenie podciśnienia i ustabilizowanie temperatury. W celu analizy danych należy obliczyć gęstość i lepkość składników buforowych białek oraz częściową objętość właściwą na podstawie składu aminokwasowego białka za pomocą programu SEDNTERP.
Załaduj dane z maszyny AUC do programu SEDFIT. Zdefiniuj menisku, czerwoną linię, dolną komórkę, niebieską linię i zielone linie granic analizy danych. Wybierz opcję Ciągła dystrybucja CS jako model.
W sekcji parametrów ustaw maksymalną rozdzielczość do 100. Następnie ustaw minimum współczynnika sedymentacji na zero i maksimum na 10 do 15. Początkowo ustaw współczynnik tarcia na 1,2 i wybierz opcję zmiennoprzecinkową, aby uzyskać współczynnik na podstawie danych.
Ustaw współczynnik F na 0,68 dla regularyzacji jednej sigma. Ustawić częściową objętość właściwą, gęstość buforu i lepkość uzyskaną z SEDNTURP. Naciśnij Uruchom, aby umożliwić oprogramowaniu rozwiązanie równania lam.
Naciśnij przycisk Dopasuj, aby uściślić. Wybierz opcję Pokaż szczyt Mw w CS w funkcji wyświetlania głównego paska narzędzi, aby oszacować masy cząsteczkowe. Wymieszać dwumikromolowy tetramer H3/H4 i czteromikromolowy dimer H2A/H2B ze zwiększającymi się stężeniami opiekuńczego histonu, w zakresie od jednego do sześciu mikromolów, w buforze montażowym do końcowej objętości 50 mikrolitrów.
Inkubować mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Jednocześnie należy wstępnie potraktować 500 nanogramów ujemnie super-zwiniętego plazmidu PUC-19 jednym mikrogramem enzymu topoizomerazy I w buforze montażowym w końcowej objętości przy 50 mikrolitrach. Następnie połącz wstępnie zmieszany roztwór zawierający tetramer, dimer i opiekuńczy histon ze zrelaksowanym DNA osocza.
Dodaj 100 mikrolitrów buforu zatrzymanego 2X i inkubuj, aby zakończyć reakcję składania poprzez deproteinizację plazmidowego DNA. Dodać równą objętość fenolu nasyconego trisem do probówki zawierającej mieszaninę reakcyjną i dobrze wymieszać zawartość mieszaniny reakcyjnej. Następnie odwirować próbkę.
Delikatnie zebrać górną fazę wodną zawierającą plazmidowe DNA za pomocą mikropipety i wymieszać równą objętość chloroformu. Zwiruj mieszaninę. Następnie zbierz górną fazę wodną, dodaj 1/10 objętości trójmolowego octanu sodu o pH 5,5 i 2,5 objętości lodowatego etanolu.
Dobrze wymieszaj roztwór, odwracając probówkę trzy do czterech razy. Odwirować próbkę o stężeniu 16,200 g przez 10 minut i delikatnie odrzucić supernatant. Utrzymuj probówki otwarte w temperaturze pokojowej, aż nawet śladowe ilości etanolu odparują, pozostawiając wytrącone plazmidowe DNA w probówce.
Wyniki analityczne SEC wykazały, że rekombinowana domena N-końcowej nukleoplazminy białka FKBP53 Arabidopsis thaliana jest pentamerem o mocy 65 kilodaltonów w roztworze. Próbka nukleoplazminy poddana obróbce cieplnej wykazała, że domena jest wysoce stabilna termicznie. Domena nukleoplazminy wykazywała stabilność soli do dwóch molowców chlorku sodu i stabilność mocznika do czterech zębów trzonowych.
Test pull-down wykazał, że oddziaływanie domeny nukleoplazminy z dimerem H2A/H2B było stabilne do 0,4-molowego chlorku sodu, podczas gdy asocjacja z H3/H4 była stabilna do 0,7 molowców. Białko opiekuńcze wiąże jednocześnie dimer H2A/H2B i tetramer H3/H4, niezależnie od kolejności, w jakiej są one dodawane do białka opiekuńczego, co wskazuje na oddzielne miejsca interakcji dla oligomerów. Szacowane masy cząsteczkowe za pomocą AUC-SV ujawniają stechiometrię 1:1 domeny nukleoplazminy z oligomerami histonowymi.
W teście superzwijania plazmidu rekombinowane białka opiekuńcze histonów roślinnych AtNRP1 i AtNRP2 zwiększały ilość superskręconego plazmidu, co sugeruje, że może on osadzać histony na DNA, tworząc nukleosomy, powodując super zwijanie DNA. Test superzwijania plazmidu wymaga szczególnej ostrożności i możliwej optymalizacji pod kątem charakterystyki DNA histonów i białek opiekuńczych. Telemetria charakterystyki izomerycznej może być używana jako kontynuacja eksperymentów analitycznych z wykluczeniem wielkości w celu potwierdzenia stabilności wiązania.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje różne metody badania właściwości chaperonów histonowych, w tym ich oligomeryzację i interakcje z histonami. Techniki takie jak pull-down assays i analityczna chromatografia wykluczająca są stosowane do charakteryzacji tych białek in vitro.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Badania chromatinu
- Interakcje białek
- Funkcjonalność chaperonów histonowych
Tło
- Chaperony histonowe odgrywają kluczowa rolę w dynamice chromatinu.
- Rozumienie ich interakcji jest niezbędne do wyjaśnienia regulacji chromatinu.
- Można zastosować różne metody biochemiczne do badania tych białek.
- Celem tego badania jest zapewnienie kompleksowego protokołu dla takich analiz.
Cel badania
- Potwierdzenie tożsamości domniemanych chaperonów histonowych.
- Charakteryzacja interakcji i stabilności chaperonów histonowych.
- Dostarczenie szczegółowej metodologii dla badaczy w tej dziedzinie.
Stosowane metody
- Analityczna chromatografia wykluczająca
- Pull-down assays
- Analityczna ultra-wirówka (AUC)
- Asezy chaperonowania histonów
Główne wyniki
- Sukces w identyfikacji interakcji chaperonów histonowych.
- Charakteryzacja stechiometrii kompleksów białkowych.
- Wgląd w stabilność chaperonów histonowych.
- Demonstracja przydatności protokołu dla innych białek.
Konkluzje
- Opisane metody są skuteczne w badaniu chaperonów histonowych.
- Te techniki można dostosować do badań nad innymi białkami.
- Dalsze badania mogą opierać się na tych znaleziskach do badania dynamiki chromatinu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Characterizing histone chaperone function supports target validation in epigenetic drug discovery by confirming protein-histone interaction specificity and complex stability. This mechanistic de-risking enables predictive confidence in modulating chromatin dynamics for therapeutic intervention. The integrated assay approach provides quantitative, reproducible data essential for early-stage target triage and lead identification efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Confirms specific binding between putative chaperones and histone oligomers (H2A/H2B, H3/H4) to validate functional relevance in nucleosome assembly.
- Operational Value: Enables discrimination of chaperone selectivity and stoichiometry through orthogonal methods like pull-down and AUC.
- Predictive Value: Supports target confidence by demonstrating stable interaction under physiological salt and denaturant conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Histone chaperoning assay using super-coiled plasmid deposition provides functional readout of nucleosome assembly activity.
- Operational Value: Enables standardized, quantitative assessment of chaperone-mediated DNA super-coiling as a proxy for chromatin assembly.
- Reproducibility: Defined buffer conditions and incubation parameters support assay standardization across laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Characterizes chaperone stability (thermal, salt, urea) to predict behavior in complex cellular environments.
- Operational Value: AUC-derived sedimentation coefficients and molecular masses enable stoichiometric modeling of chaperone-histone complexes.
- Translational Continuity: Validated chaperone function bridges biochemical activity to nucleosome formation, supporting preclinical target validation.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow positions biochemical characterization early in the discovery continuum, informing target selection before phenotypic screening or lead optimization.
- Discovery Biology: Pull-down and AUC assays clarify interaction specificity and complex formation to de-risk mechanistic hypotheses.
- Screening: Histone chaperoning assay delivers functional, quantitative output for evaluating compound effects on chaperone activity.
- Analytics: SEC, AUC, and SDS-PAGE provide orthogonal validation of oligomerization, binding affinity, and complex stability.
- Translational Research: Demonstrated nucleosome deposition activity links target engagement to chromatin-level phenotypic outcomes.
- Enterprise Reuse: Modular assay design allows adaptation to other chromatin-associated proteins or epigenetic regulators.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of histone chaperone targets through validated interaction and functional data.
- Operational Value: Standardized, multi-parametric assay cascade improves reproducibility and reduces false positives in target validation.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions based on binding stability, stoichiometry, and nucleosome assembly capacity.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of epigenetic targets with validated chromatin-modulating potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, biochemical assay design, and biophysical analysis (AUC, SEC).
- Dependent on access to analytical ultracentrifuge, HPLC system for SEC, and electrophoresis equipment.
- Necessitates standardized histone oligomer preparation (H2A/H2B dimers, H3/H4 tetramers) for reproducible binding assays.
- Adaptation to non-histone chaperones may require optimization of buffer conditions and assay readouts.
- Plasmid super-coiling assay demands careful titration of chaperone, histone, and DNA concentrations to avoid aggregation or incomplete assembly.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:04
Competitive Pull-Down Assay
2:06
Analytical Ultracentrifugation-Sedimentation Velocity (AUC-SV) Experiments
4:29
Plasmid Supercoiling Assay to Confirm Histone Chaperoning Function
6:11
Results: Characterization of Histone Chaperones Using Analytical, Pull-Down, and Chaperoning Assays
7:41
Conclusion
