Name: Analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Poznaj analizę dynamiki aktyny i sił uciągu w stożkach wzrostu neuronów przy użyciu mikroskopii sił uciągu i obrazowania pojedynczych plamek. Ta metoda pozwala badać mechanizmy migracji komórek nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez AMED w ramach grantu numer 21gm0810011h0005 (N.I. i Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) i JSPS Grants-in-Aid dla początkujących naukowców (JP19K16258, T.M.), Osaka Medical Research Foundation for Incurable Diseases (T.M.) oraz NAIST Next Generation Interdisciplinary Research Project (Y.S.).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokoły opisane w tym badaniu wykorzystują komercyjnie dostępne materiały i sprzęt mikroskopowy, który rutynowo znajduje się we wszystkich laboratoriach, instytutach i uniwersytetach. W związku z tym badacze mogą z łatwością zastosować w swoich badaniach obrazowanie pojedynczej plamki i mikroskopię sił trakcyjnych.
Obrazowanie plamkowe może analizować polimeryzację aktyny i sprzęgło sprzęgła. Ponadto obrazowanie plamkowe może monitorować wsteczny przepływ cząsteczek sprzęgła, takich jak shootin1 i kortaktyna, które oddziałują z przepływem wstecznym F-aktyny. Za pomocą mikroskopu TIRF można również monitorować wsteczny przepływ cząsteczki adhezyjnej L1-CAM23,41; L1-CAM ulega przyczepności i poślizgowi, które odzwierciedlają sprawność sprzęgła23,41. Chociaż w niniejszym badaniu wykorzystano system TMR-HaloTag do obrazowania plamkowego, w analizie dostępne są również inne białka fluorescencyjne, takie jak EGFP i monomeryczne czerwone białko fluorescencyjne 16,18,20,23,24,27,39. Podstawą do wizualizacji plamek aktyny jest niski poziom ekspresji fluorescencyjnej aktyny i oświetlenie minimalnego obszaru (ryc. 2). W tym protokole sygnały Lifeact i HaloTag-actin są pozyskiwane sekwencyjnie. Ponieważ przepływ wsteczny aktyny jest stosunkowo powolny (4,5 ± 0,1 μm/min)24, analiza przepływu wstecznego F-aktyny i polimeryzacji aktyny nie ma wpływu sekwencyjna akwizycja obrazów różnych kanałów fluorescencyjnych (interwał ~1 s). Lifeact jest szeroko stosowanym markerem F-aktyny, ale może konkurować z białkami wiążącymi aktynę47. Co ważne, Lifeact może zmieniać dynamikę aktyny, wpływając w ten sposób na struktury F-aktyny i morfologię komórek 47,48,49.
Mikroskopia sił trakcyjnych może wykryć siły napędzające postęp stożka wzrostu. Montując neurony w macierzy zewnątrzkomórkowej, badacze mogą również analizować siły generowanew środowisku pół-3D11. Obrazowanie w dużym powiększeniu jest ważne dla dokładnej oceny siły uciągu, ponieważ stożki wzrostu generują słabe siły pociągowe7. Chociaż do pomiaru siły pociągowej stosuje się również inne metody z nanofilarami lub bioczujnikami wrażliwymi na stres50,51, metoda na bazie żelu PAA jest wysoce elastyczna i pozwala na regulację sztywności podłoża poprzez zmianę stężeń akrylamidu i bis-akrylamidu 41,44,52. W tym protokole żel PAA przygotowuje się w końcowym stężeniu 3,75% akrylamidu i 0,03% bis-akrylamidu; Moduł Younga wynosi ~270 Pa22, a sztywność ta mieści się w zakresie tkanki mózgowej (100-10 000 Pa)53,54,55. Ze względu na grubość żelu PAA (~100 μm) metoda ta ogranicza stosowanie soczewek o dużym powiększeniu podczas mikroskopii. Aby uzyskać obrazy o dużym powiększeniu, badacze powinni korzystać z funkcji zoomu w laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym.
Podsumowując, obecne obrazowanie plamkowe i mikroskopia sił trakcyjnych umożliwiają analizę ilościową kluczowych zdarzeń w generacjach sił. Informacje te będą nieocenione dla lepszego zrozumienia mechanizmów, które leżą u podstaw rozwoju stożka wzrostu i nawigacji.

W rozwijającym się mózgu kręgowców neurony przechodzą misternie zorganizowane migracje i kierują aksony w kierunku odpowiednich partnerów synaptycznych w celu utworzenia funkcjonalnych sieci neuronowych1,2,3. Stożki wzrostu, które są czuciowymi i ruchliwymi strukturami znajdującymi się na czubku neurytów, określają prędkość i kierunek migracji neuronów oraz wzrostu aksonów3,4,5. Ponieważ neurony są otoczone ciasno upakowanymi środowiskami, stożki wzrostu muszą wywierać siły na swoje otoczenie, aby poruszać się naprzód6,7. Aby zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw migracji neuronów i przewodnictwa aksonów, niezbędne są analizy mechaniki molekularnej postępu stożka wzrostu.
Dziesięciolecia analiz wykazały, że siła pociągowa napędzająca postęp stożka wzrostu jest generowana przez mechanizm 'sprzęgła'; uważa się, że mechanizm ten działa nie tylko w stożku wzrostu aksonu, ale także w stożku wzrostu głównego procesu migrujących neuronów8,9,10,11,12. Mianowicie, filamenty aktynowe (F-aktyny) w stożkach wzrostu polimeryzują na krawędzi natarcia i depolimeryzują proksymalnie, wypychając membranę krawędzi natarcia13,14,15. Wynikowa siła, w połączeniu ze skurczem aktomiozyny, indukuje ruch F-aktyn do tyłu zwany przepływem wstecznym7,11,16,17,18,19,20,21. Cząsteczki adhezyjne sprzęgła i komórek pośredniczą w mechanicznym sprzężeniu między przepływem wstecznym F-aktyny a podłożem adhezyjnym i przenoszą siłę przepływu F-aktyny na podłoże, generując w ten sposób siłę pociągową dla wzrostu stożek natarcia 7,8,9,11,12,22. Jednocześnie sprzężenie aktyna-substrat zmniejsza prędkość przepływu F-aktyny i przekształca polimeryzację aktyny w siłę wystającą z membrany krawędzi natarcia9,10.
Stożki wzrostu aksonów wyczuwają lokalne sygnały chemiczne i przekształcają je w kierunkową siłę napędową dla nawigacji po stożku wzrostu3,23,24,25. Na przykład cząsteczka prowadząca aksony netrin-1 stymuluje swój receptor deleczowany w raku jelita grubego (DCC) i aktywuje białko kontrolujące podział komórek 42 (Cdc42) wiążące trifosforan guanozyny (GTP) i substrat 1 toksyny botulinowej C3 związany z Ras (Rac1) oraz ich kinazę aktywowaną przez p21 (Pak1)26. Cdc42 i Rac1 promują 1) polimeryzację aktyny, a Pak1 fosforyluje cząsteczkę sprzęgła shootin122,26. Shootin1 oddziałuje z przepływem wstecznym F-aktyny poprzez białko wiążące aktynę cortactin27. Shootin1 oddziałuje również z cząsteczką adhezyjną komórek L1 (L1-CAM)20,24. Fosforylacja Shootin1 zwiększa powinowactwo wiązania kortaktyny i L1-CAM oraz wzmacnia sprzężenie sprzęgła za pośrednictwem shootin1 2) sprzęgło sprzęgła24,27. W obrębie stożka wzrostu asymetryczne aktywacje polimeryzacji aktyny i sprzężenia sprzęgła zwiększają 3) siłę uciągu po stronie źródła netryny-1, generując w ten sposób kierunkową siłę napędową do obracania stożka wzrostu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)<klasa sup="xref">24. Intensywne badania prowadzone w ciągu ostatnich kilku dekad w odniesieniu do migracji neuronów i kierowania aksonami poszerzyły wiedzę na temat cząsteczek naprowadzających, ich receptorów i związanych z nimi kaskad sygnałowych2,10,28,29,30. Jednak mechanizmy molekularne generujące siły powodujące postęp stożka wzrostu dopiero zaczynają być wyjaśniane; Można to przypisać ograniczonemu wykorzystaniu protokołów do analiz mechanobiologicznych.
Niniejsze badanie opisuje szczegółowy protokół monitorowania wstecznego przepływu F-aktyny za pomocą obrazowania pojedynczej plamki16,18. Monitorowanie przepływu wstecznego F-aktyny zostało szeroko przeprowadzone przy użyciu mikroskopii superrozdzielczej, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i mikroskopii fluorescencji refleksyjnej (TIRF) 25,31,32,33,34,35,36,37,38. Protokół w niniejszym badaniu wykorzystuje jednak standardowy mikroskop epifluorescencyjny, dzięki czemu można go łatwo zaadoptować11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. W połączeniu z znakowaniem F-aktyny przez Lifeact43, obrazowanie pojedynczej plamki pozwala na ilościowe określenie szybkości polimeryzacji aktyny i wydajności sprzężenia sprzęgła między przepływem wstecznym F-aktyny a podłożem adhezyjnym39,42. W niniejszym badaniu opisano szczegółowy protokół mikroskopii siły trakcyjnej przy użyciu żelu poliakrylamidowego (PAA) zatopionego we fluorescencyjnym kulkach11,22,23,24,27,39,41,42,44. Ta metoda wykrywa i określa ilościowo siłę uciągu pod stożkiem wzrostu, monitorując ruchy ściegu wywołane siłą44,45. Dostępny jest kod analizy siły pociągowej o otwartym kodzie źródłowym, a metoda ilościowego określania siły uciągu podczas migracji stożka wzrostu jest szczegółowo wyjaśniona. Dzięki obrazowaniu pojedynczych plamek i mikroskopii sił trakcyjnych łatwiej będzie zrozumieć mechanikę molekularną leżącą u podstaw migracji stożków wzrostu i nawigacji. Techniki te mają również zastosowanie do analizy mechaniki molekularnej leżącej u podstaw dendrytycznego powiększania kręgosłupa, o którym wiadomo, że jest ważne w uczeniu się i pamięci42.

<table><tbody><tr><td>0,5% roztwór niebieskiego trypanu</td><td>Nacalai</td><td>29853-34</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropylotrimetyoksysilan</td><td>Sigma</td><td>281778-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Monomer akryloamidu</td><td>Nacalai</td><td>00809-85</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Cytiva</td><td>17-1311-1</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td>431007-9902-000</td><td>Mikroskop epifluorescencyjny ( obrazowanie z pojedynczą plamką)</td></tr><tr><td>Suplement B-27 (50x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca albmine</td><td>Sigma</td><td>A7906-10G</td><td></td></tr><tr><td>C-Apochromat 63x/1,2 W Corr</td><td>Zeiss</td><td>421787-9970-799</td><td>Soczewka obiektywowa (mikroskopia siły trakcji)</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe (średnica 18 mm)</td><td>Matsunami</td><td>C018001</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Nacalai</td><td>16806-25</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Pakiet oprogramowania Open source</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr> <tr><td>FluoSpheres modyfikowany karboksylanem 0,2 mm, czerwony (580/605), 2% stałe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F8810</td><td>modyfikowany karboksylanem mikrokulki</td></tr><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem (średnica 14 mm)</td><td>Matsunami</td><td>D1130H</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem (średnica 27 mm)</td><td>Matsunami</td><td>D1140H</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aldehydu glutarowego</td><td>Sigma</td><td>G5882-10X10ML</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag TMR</td><td>ligand Promega</td><td>G8251</td><td></td></tr><tr><td>HBO103 W/2</td><td>Osram</td><td>4050300382128</td><td>Lampa rtęciowa (pojedyncza plamka obrazowanie)</td></tr> <tr><td>Zestaw narzędzi do przetwarzania obrazu</td><td>MathWork</td><td>https://www.mathworks.com/products/image.html</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Lamininy z mysiego guza EHS</td><td>Wako</td><td>120-05751</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Nacalai</td><td>16919-42</td><td></td></tr><tr><td>LSM710</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Konforcyjny mikroskop laserowy (mikroskopia sił pociągowych)</td></tr><tr><td>MATLAB2018a</td><td>Mysz</td><td>https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html</td><td></td>MathWork</tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Japonia SLC</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw nukleofektora neuronów myszy</td><td>Lonza</td><td>VPG-1001</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Nacalai</td><td>33401-72</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-metylenobisakryloamid</td><td>Nacalai</td><td>22402-02</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka neuropodstawowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector I</td><td>Amaxa</td><td>AAD-1001</td><td>Aparat do elektroporacji</td></tr><tr><td>ORCA Flash 4.0 V2</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td>Kamera CMOS (obrazowanie z pojedynczą plamką)</td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Nacalai</td><td>26036-34</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw narzędzi do obliczeń równoległych</td><td>MathWork</td><td>https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>1528177</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna (100x)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>pFN21A-HaloTag-aktyna</td><td>(Minegishi i wsp., 2018)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) pH 7,4 (10x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 100x/1.4 Olej</td><td>Zeiss</td><td>420790-9901-000</td><td>Soczewka obiektywowa (obrazowanie z pojedynczą plamką)</td></tr><tr><td>pmNeonGreen-N1-Lifeact</td><td>(Kastian i in., 2021)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-D-lizyny</td><td>Sigma</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Slulfo-SAMPHA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Nacalai</td><td>08933-05</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat sodu (NaOH)</td><td>Nacalai</td><td>31511-05</td><td></td></tr><tr><td>Stalowa kula</td><td>Sako tekkou</td><td>N/A</td><td>Microshpere do określania sztywności żelu PAA. Średnica 0,6 mm, 7,87 g/cm3.</td></tr><tr><td>ZEN2009</td> Oprogramowanie do akwizycji obrazu <td>Zeiss</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td><td>(mikroskopia sił trakcyjnych)</td></tr><tr><td>ZEN2012</td><td>Zeiss</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td><td>Oprogramowanie do akwizycji obrazu (obrazowanie z pojedynczą plamką)</td></tr></tbody></table>

analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

Aby stworzyć funkcjonalne sieci, neurony muszą migrować do odpowiednich miejsc docelowych, a następnie rozszerzać aksony w kierunku swoich komórek docelowych. Procesy te zależą od postępów stożków wzrostu, które znajdują się na końcach neurytów. Stożki wzrostu aksonów generują siły napędowe, wyczuwając swoje lokalne mikrośrodowisko i modulując dynamikę cytoszkieletu oraz sprzężenie adhezyjne aktyna (sprzężenie sprzęgła). Dziesięciolecia badań doprowadziły do zidentyfikowania cząsteczek naprowadzających, ich receptorów i kaskad sygnalizacyjnych w celu regulacji migracji neuronów i prowadzenia aksonów; Jednak mechanizmy molekularne niezbędne do generowania sił napędzających postęp stożka wzrostu i nawigację dopiero zaczynają być wyjaśniane. Na przedniej krawędzi neuronalnych stożków wzrostu włókna aktyny podlegają przepływowi wstecznemu, który jest napędzany przez polimeryzację aktyny i skurcz aktomiozyny. Sprzężenie sprzęgła między przepływem wstecznym F-aktyny a podłożem adhezyjnym generuje siły trakcyjne dla wyprzedzenia stożka wzrostu. W niniejszym badaniu opisano szczegółowy protokół monitorowania wstecznego przepływu F-aktyny za pomocą obrazowania pojedynczej plamki. Co ważne, w połączeniu z markerem F-aktyny Lifeact, technika ta może określić ilościowo 1) szybkość polimeryzacji F-aktyny i 2) skuteczność sprzężenia sprzęgła między przepływem wstecznym F-aktyny a podłożem adhezyjnym. Obie są zmiennymi krytycznymi do generowania sił dla wzrostu stożka wyprzedzenia i nawigacji. Ponadto w niniejszym badaniu opisano szczegółowy protokół mikroskopii sił trakcyjnych, który może określić ilościowo 3) siłę trakcyjną generowaną przez stożki wzrostu. W ten sposób, łącząc analizy obrazowania pojedynczej plamki i mikroskopii siły pociągowej, badacze mogą monitorować mechanikę molekularną leżącą u podstaw wyprzedzenia stożka wzrostu i nawigacji.

Obrazowanie pojedynczych plamek w celu ilościowego oznaczenia szybkości polimeryzacji aktyny i wydajności sprzężenia sprzęgła 
Wysoka ekspresja Lifeact umożliwia wizualizację F-aktyny w obrębie stożka wzrostu; niska ekspresja HaloTag-aktyny pozwala na monitorowanie wstecznego przepływu F-aktyny (Rycina 3, Plik uzupełniający 2). Śledzenie plamek aktynowych pozwala na pomiar prędkości przepływu F-aktyny (Rycina 3C,D). Ponieważ mechaniczne sprzężenie wstecznego przepływu F-aktyny z podłożem adhezyjnym zmniejsza prędkość przepływu F-aktyny, wydajność sprzężenia sprzęgła można oszacować na podstawie tej prędkości. Ponadto znakowanie F-aktyny za pomocą Lifeact wspomaga wizualizację wydłużania się F-aktyny i jest przydatne do ilościowego oznaczenia szybkości polimeryzacji aktyny (Rycina 3E,F).
Ilościowa analiza siły trakcyjnej 
Ścisłe przestrzeganie opisanej tutaj metodologii pozwoli na ujawnienie ruchów fluorescencyjnych kulek pod stożkiem wzrostu (Rycina 6C, Plik uzupełniający 4). Retrogradny przepływ F-aktyny w kierunku podłoża generuje siłę trakcyjną, która powoduje przemieszczanie się fluorescencyjnych kulek do tyłu pod stożkiem wzrostu. Kod do analizy siły trakcyjnej szacuje tę siłę na podstawie przemieszczenia fluorescencyjnych kulek i wyraża obliczoną siłę trakcyjną jako wektor siły. Kierunek i wartość siły trakcyjnej są wyznaczane z komponentów x i y wektora siły (Rycina 8C, D). Czerwona ramka na Rycynie 8D przedstawia komponenty x i y wektora siły; Rycina 8C przedstawia odpowiadający mu stożek wzrostu. W układzie współrzędnych x-y wektor wskazuje kąt -93,8° względem osi x; orientacja ta jest skierowana w stronę tylnej części stożka wzrostu (Rycina 8C). Wartość siły trakcyjnej F została obliczona w następujący sposób:
<img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/63227/63227eq02.jpg" />
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig01.jpg" /> 
Rysunek 1Mechanizm stożka wzrostu odpowiedzialny za generowanie siły oraz nawigację stożka wzrostu. Gradient chemoatraktanta netryny-1 indukuje asymetryczną stymulację jej receptora DCC w stożku wzrostu aksonu. Aktywuje to białka Rac1 i Cdc42 oraz ich kinazę efektorową Pak1. Rac1 i Cdc42 promują (1) polimeryzację aktyny, podczas gdy Pak1 fosforyluje białko shootin1, wzmacniając zapośredniczone przez shootin1 (2) sprzężenie sprzęgła (clutch coupling). Asymetryczna aktywacja dynamiki aktyny oraz sprzężenia sprzęgła w obrębie stożka wzrostu zwiększa (3) siłę trakcyjną po stronie źródła netryny-1, generując tym samym kierunkową siłę napędową dla atrakcji stożka wzrostu. Przedstawione tutaj protokoły umożliwiają kwantyfikację kluczowych zmiennych (1)–(3) dla nawigacji stożka wzrostu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig02.jpg" /> 
Rycina 2Obrazy fluorescencyjne stożka wzrostu neuronu przy w pełni otwartej i zwężonej przysłonie. Stożek wzrostu wykazuje ekspresję Lifeact oraz HaloTag-aktyny. (AWysoka ekspresja białka Lifeact umożliwia wizualizację morfologii stożka wzrostu. Z drugiej strony poziomy ekspresji HaloTag-aktyny są bardzo niskie, co skutkuje słabymi sygnałami przy całkowicie otwartej przysłonie.BPrzy odpowiednim przymknięciu przysłony sygnały tła słabną, a w stożku wzrostu pojawiają się pojedyncze plamki aktyny. Paski skali: 5 &#181;m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2.jpg" /> 
Rysunek 3Kroki kwantyfikacji prędkości przepływu F-aktyny i szybkości polimeryzacji aktyny przy użyciu oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów Fiji. (A) Dostosuj kąt obrazu do analizy. (1) Znajdź i zaznacz plamkę aktynową (grot strzałki) przemieszczającą się w pęczku aktyny F. (2) Zaznacz Obraz &#62; Przekształć &#62; Obracać(3) Ustaw kąt tak, aby wiązka F-aktyny była skierowana w górę. (4) Kąt obrazu zostanie zmieniony. (B) Wyznaczyć obszar, obejmujący plamkę aktynową (actin speckle) oraz pęczek F-aktyny. (1) Kliknąć w Prostokąt na pasku narzędzi. (2) Wyznacz obszar na obrazie. Jasność i kontrast obrazu zostają zwiększone, aby umożliwić wyraźną wizualizację plamki aktynowej oraz końcówki pęczka F-aktyny. (3) Wybierz Obraz &#62; Duplikat(4) Wprowadź pięć przedziałów czasowych, które pokazują przepływ plamek aktynowych w pęczku F-aktyny. (5) Wybrany stos obrazów pojawi się na ekranie. (C) Nałóż okręgi na plamkę aktynową. (1) Kliknij w Owalu na pasku narzędzi. (2) Narysuj okrąg na plamce aktynowej. (3) Wybierz Obraz &#62; Nałożenie &#62; Dodaj do zaznaczenia(4) Naniesiono okrąg. 5) Powtórz nakładanie okręgów na pozostałe plamki aktyny.D) Zmierz dystans translokacji plamek aktyny w pięciu przedziałach czasowych. (1) Kliknij w Prosty na pasku narzędzi. (2) Narysować linię łączącą środki okręgów. (3) Wybrać Analiza &#62; PomiarWynik, określony parametrem Wzrost (czerwone pole), przekazujące dystans translokacji plamek aktynowych. (E) Zmierz zmianę długości wypustki F-aktyny w pięciu ramach czasowych. (1) Narysuj linię łączącą końce wypustki F-aktyny. (2) Wybierz Analiza &#62; PomiarWynik (czerwona ramka), Wzrost, wskazuje długość wydłużenia wiązki F-aktyny. (FSzybkość polimeryzacji aktyny oblicza się jako sumę prędkości przepływu aktyny filamentarnej (F-aktyny) i szybkości wydłużania.&#160;Zobacz także Plik uzupełniający 2. Plik uzupełniający 3 pomaga badaczom w ćwiczeniu opisanej powyżej metodologii. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig04.jpg" /> 
Rysunek 4Kroki przygotowania żelu PAA. Szczegółowy opis znajduje się w kroku 7.1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig04large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig05.jpg" /> 
Rysunek 5Wyznaczanie sztywności żelu PAA. (A) Metoda wgłębienia mikrosferą. Gdy mikrosferę umieści się na żelu PAA z zatopionymi fluorescencyjnymi kuleczkami, ciężar mikrosfery powoduje powstanie wgłębienia w żelu. Głębokość wgłębienia oblicza się poprzez odjęcie pozycji z powierzchni żelu PAA od pozycji dna mikrosfery (B,C) Obrazy fluorescencyjne żelu PAA z wgłębieniem wykonanym przez mikrosferę, zawierającego fluorescencyjne kuleczki. Do rejestracji obrazów powierzchni żelu wykorzystano konfokalny mikroskop skaningowy z laserowym wzbudzeniem (B) i dno mikrosfery (C). Sygnały z fluorescencyjnego&#160;perełki nie są widoczne na powierzchni żelu w obszarze z wgłębieniem (B, koło). Można je jednak zaobserwować u podstawy mikrosfery. Paski skali: 50 &#181;m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig06.jpg" /> 
Rycina 6Mapowanie sił stożka wzrostu neuronu. (A-Węgiel) Obrazy fluorescencyjne kulek zatopionych w żelu PAA oraz stożka wzrostu neuronu wizualizowanego za pomocą EGFP. Po wykonaniu obrazowania time-lapse (A), neuron został uwolniony z podłoża żelowego poprzez zastosowanie roztworu SDS, a następnie wykonano obraz kulek w nienapiętym podłożu (B). (CObraz kulek w podłożu nierozciągniętym przedstawia kulki w ich pierwotnych (zielonych) i przemieszczonych (czerwonych) pozycjach. Sygnał EGFP stożka wzrostu przedstawiono na niebiesko. Kimografy (po prawej) obrazują ruchy kulek w odstępach 3 s przez czas trwania 147 s, wskazane strzałkami w obramowanych obszarach 1 i 2. Kulka w obszarze 2 jest kulką referencyjną. Paski skali: 2 &#181;m dla (A), (B) i (C, po lewej), i 1 &#181;m dla (C, środek). Patrz również Plik uzupełniający 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig06large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Rysunek 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig07.jpg" /> 
Rycina 7Kroki korygowania pozycji x-y obrazu kulek w podłożu nieodkształconym przy użyciu programu Fiji. (A) Połącz obraz kulek w nieprzefiltrowanym podłożu ze stosem obrazów time-lapse fluorescencyjnych kulek. (1) Wybierz Obraz &#62; Stosy &#62; Narzędzia &#62; Łączyć (konkatenować)(2) Wybrać obraz kulek w nieprzefiltrowanym podłożu oraz obraz z serii czasowej (time-lapse stack) fluorescencyjnych kulek w Obraz 1 i Obraz 2odpowiednio. Kliknij w&#160;Proszę o przesłanie tekstu źródłowego do tłumaczenia.(3) Obraz kulek w podłożu nierozciągniętym zostaje dodany do stosu obrazów time-lapse.B) Skoryguj pozycję x-y obrazu fluorescencyjnego koralika. (1) Użyj paska przewijania (czerwona ramka), aby wybrać drugą klatkę (czerwona strzałka) w stosie obrazów. (2) Wybierz Wtyczki &#62; StackReg(3) Wybierz Bryła sztywna z listy rozwijanej (czerwona ramka) i kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Rozpocznie się korekcja pozycji x-y.C) Zapisz obraz kulek po korekcie pozycji x-y. Po wybraniu pierwszej klatki stosu obrazów po korekcie pozycji x-y (1) wybierz Obraz &#62; Duplikat(2) wejście 1 do Zakres i odznacz Duplikuj stosNastępnie kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.(3) na ekranie pojawi się obraz kulek w podłożu nierozciągniętym z korekcją pozycji x-y. Zapisz ten obraz jako plik tiff. Plik uzupełniający 6 pomaga badaczom w przećwiczeniu opisanej powyżej metodologii. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig07large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić tę figurę w większym rozmiarze, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Rysunek 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig08.jpg" /> 
Rycina 8Analiza siły trakcyjnej pod stożkiem wzrostu neuronu z wykorzystaniem otwartoźródłowego kodu do analizy sił trakcyjnych. (A) Interfejs graficzny użytkownika (GUI) do analizy siły trakcyjnej. Obrazy z serii czasowej wybrane w interfejsie można potwierdzić na liście rozwijanej oraz za pomocą wskazanego suwaka (czerwona ramka). (B) Wybierz obszar obejmujący stożek wzrostu. (1) Kliknij w ROI (region zainteresowania) na interfejsie graficznym (GUI). Za pomocą kursora myszy należy wyznaczyć dwa punkty (groty strzałek) na obrazie komórki. (2) Na obrazie komórki pojawi się czerwone pole. Dwa kliknięcia określają położenie dwóch narożników. (C) Wybierz wykryte kuleczki (białe kropki) pod stożkiem wzrostu. (1) W interfejsie użytkownika (GUI) kliknij Wybierz kuleczkii wyznaczyć kliknięciem obszar wielokąta obejmujący stożek wzrostu. Nacisnąć Wprowadź klucz. (2) Białe kropki wewnątrz obszaru wielokąta zmienią kolor na czerwony. (D) Obliczone wyniki kierunku i wartości siły trakcyjnej. Czerwona ramka w arkuszu kalkulacyjnym przedstawia składowe x i y wektora siły, oszacowane za pomocą analizy sił trakcyjnych. W układzie współrzędnych x-y na prawym panelu wektor siły generowany przez stożek wzrostu skierowany jest w stronę -93.8&#176; przeciwlegle do osi x; orientacja ta jest skierowana w stronę tylnej części stożka wzrostu w (C). Plik uzupełniający 6 pomaga badaczom w ćwiczeniu opisanej powyżej metodologii. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig08large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
Plik uzupełniający 1: Składy roztworów i pożywek użytych w niniejszym badaniu. Zapoznaj się z tekstem w celu uzyskania szczegółowych informacji o zastosowaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE Review - Supplemental File 1-63227R1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Obrazowanie fluorescencyjne Lifeact oraz obrazowanie fluorescencyjne plamek HaloTag-aktyny w stożku wzrostu nerwu. Lifeact (zielony) i HaloTag-aktyna (magenta). Obrazy pozyskano co 3 s przez całkowity czas 147 s. Pasek skali: 2 &#181;mZobacz także Rycina 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE Review - Supplemental File 2.mp4" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: Dane ćwiczeniowe do ilościowego oznaczenia prędkości przepływu F-aktyny i szybkości polimeryzacji aktyny. Wielokanałowy stos obrazów time-lapse przedstawiający Lifeact (zielony) i HaloTag-aktynę (magenta). Zobacz także Rycina 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/Supplemental file 3.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 4: Film z mapowania sił wykrywający siłę trakcyjną w stożku wzrostu neuronu. Pozycje pierwotne (zielone) i przesunięte (czerwone) kulek. Sygnał EGFP w stożku wzrostu przedstawiono kolorem niebieskim. Obrazyzowano co 3 s przez 147 s. Pasek skali: 2 &#181;mPatrz również Rycina 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE Review - Supplemental File 4.mp4" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 5: Kod do analizy siły trakcyjnej. Szczegółowe informacje dotyczące zastosowania znajdują się w kroku 8.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE Review - Supplemental file 5.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 6: Dane treningowe do kwantyfikacji siły trakcyjnej. Jednokanałowy obraz RGB kulek w nierozciągniętym podłożu oraz jednokanałowe serie obrazów RGB time-lapse fluorescencyjnych kulek pod stożkiem wzrostu, EGFP i w polu jasnym. Patrz również Ryciny 7 i 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE Review - Supplemental file 6.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Aby się rozwijać, stożki wzrostu muszą wywierać siłę napędową na środowisko zewnętrzne. Wytwarzanie sił uciągu zależy od dynamiki aktyny i sprzężenia sprzęgła. W niniejszej pracy opisano metody analizy dynamiki aktyny, sprzęgu sprzęgła i sił trakcyjnych dla wyprzedzenia stożka wzrostu.

Analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

Analiza sprzężenia obrazowania pojedynczej plamki i mikroskopijnej siły trakcyjnej może analizować maszynerię molekularną do wzrostu stożka wzrostu i nawigacji. Jako techniki wykorzystuje się dostępne na rynku materiały i standardowe mikroskopy. Naukowcy mogą dosłownie dostosować się do technik stosowanych w ich badaniach.Rozpocząć od potraktowania neuronów tetrametylo-rodaminą lub ligandem TMR w rozcieńczeniu od 1 do 2000 w pożywce hodowlanej w dniu in vitro 3. Następnie utrzymuj neurony w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Po inkubacji przemyć ligand TMR trzykrotnie wstępnie podgrzanym PBS.Usuń PBS przed dodaniem 0,5 mililitra podgrzanej pożywki L-15 Leibovitza do neuronów. Utrzymuj neurony w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie włącz mikroskop epifluorescencyjny i ustaw górny inkubator stanowy na 37 stopni Celsjusza.Następnie umieść neurony traktowane ligandem TMR w szklanym naczyniu na podgrzewanym inkubatorze ze stopniem. Ustaw parametry akwizycji obrazu, takie jak czas naświetlania na 500 milisekund dla kanałów fluorescencyjnych Lifeact i HaloTag-aktyna oraz kategoryzacja jako 0,065 mikrona na 0,065 mikrona na piksel w interwale czasowym trzech sekund dla 50 klatek. Po wybraniu stożka wzrostu, który silnie wyraża Lifeact i co tydzień wyraża HaloTag-aktynę.Zamknij pole na przysłonie, aby oświetlić minimalny obszar, który obejmuje stożek wzrostu i uzyskać obrazy poklatkowe. W dniu in vitro 3 zastąp pożywkę hodowlaną 0,5 mililitra podgrzanej pożywki L-15 Leibovitza i utrzymuj neurony przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby uzyskać mikroskopię sił trakcyjnych, włącz laserowy skaningowy mikroskop konfokalny i ustaw górny inkubator stopnia na 37 stopni Celsjusza.Umieść neurony na szklanym naczyniu na uprzednim inkubatorze ze stopniem wstępnym. Ustaw parametry akwizycji obrazu zgodnie z opisem w skrypcie menu i wybierz stożek wzrostu, który silnie wyraża wzmocnione białko zielonej fluorescencji lub EGFP. Skoncentruj się na powierzchni żelu i uzyskaj zdjęcia poklatkowe.Po zakończeniu użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby utworzyć jednokanałowe stosy obrazów poklatkowych RGB. Następnie zapisz obrazy jako pliki tiff. Następnie nałóż 100 mikrolitrów 10% wagowo dodecylosiarczanu sodu lub SDS rozpuszczonego w wodzie destylowanej do naczynia ze szklanym dnem, aby rozluźnić podłoże żelowe poprzez uwolnienie neuronów z podłoża.Następnie inkubuj naczynie w inkubatorze stage top przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby ustabilizować temperaturę. W laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym skup się na powierzchni żelu, aby uzyskać obraz kulek w nienapiętym podłożu. Utwórz jednokanałowy obraz RGB ściegów na nienaprężonym podłożu i zapisz ten obraz jako plik tiff.Pobierz kod analizy siły pociągowej TFM2021 i otwórz TFM2021 w MATLAB. Otwórz stronę główną. m w TFM2021 i uruchom go.Gdy na ekranie pojawi się graficzny interfejs użytkownika. Kliknij na załaduj niewytrenowany obraz podłoża i wybierz obraz ściegu z korekcją pozycji X-Y na nienaprężonym podłożu. Przejdź do ładowania obrazów z koralików fluorescencyjnych i wybierz stos koralików obrazu poklatkowego.Następnie kliknij załaduj obrazy w jasnym polu, aby wybrać obraz poklatkowy stosu jasnego pola i użyj załaduj obrazy GFP, aby wybrać obraz stosu poklatkowego EGFP. Z listy rozwijanej w graficznym interfejsie użytkownika wybierz GFP przed kliknięciem ROI, aby określić prostokątny obszar zainteresowania, w tym stożek wzrostu, klikając dwa punkty na wyświetlanym obrazie komórki. Po zakończeniu kliknij przycisk Zapisz w graficznym interfejsie użytkownika, aby zapisać wybrane obrazy stosu wraz z ROI w pliku maty.Następnie kliknij wykrywanie punktowe i wprowadź żądaną wartość w oknie dialogowym, aby określić próg wykrywania ściegów. Naciśnij OK, aby rozpocząć obliczenia. Po zakończeniu obliczeń kliknij na ścieżkę kreślenia, aby powiększyć wybrany wcześniej obszar i wyświetlić wykryte koraliki jako białe kropki.Użyj wybranych ściegów, aby wyznaczyć wielokątny obszar, który zawiera odpowiednie kropki pod stożkiem wzrostu. Następnie, naciskając Enter na klawiaturze, białe kropki w regionie wielokąta zmienią kolor na czerwony. Kliknij Oszacuj siłę w graficznym interfejsie użytkownika.Następnie wprowadź wartości rozmiaru piksela i modułu Younga, jak wyjaśniono w manuskrypcie. Ustaw wartość współczynnika Poissona jako 0,3 i wykonaj oszacowanie siły, aby rozpocząć obliczenia. Oprogramowanie zapisze wyniki obliczeń w pliku w formacie arkusza kalkulacyjnego.Obrazy fluorescencyjne stożka wzrostu neuronów wykazały wysoką ekspresję Lifeact, co pozwoliło na wizualizację morfologii stożka wzrostu pod całkowicie otwartą i wąską membraną. Poziomy ekspresji aktyny HaloTag były bardzo niskie przy słabych sygnałach. Gdy membrana jest odpowiednio zwężona, sygnały tła zmniejszają się, a w stożku wzrostu pojawiają się pojedyncze plamki.Naukowcy, którzy odpowiednio wykonają wszystkie kroki, będą obserwować wsteczny przepływ F-aktyny w stożku wzrostu. Sztywność żelu poliakrylamidowego określono poprzez obliczenie głębokości wgniecenia spowodowanego ciężarem mikrosfery. Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny został wykorzystany do wykonania zdjęć powierzchni żelu i dna mikrosfery.Sygnały z kulek fluoryzacyjnych nie były widoczne na powierzchni żelu w obszarze wgłębienia. Obrazy fluorescencyjne kulek osadzonych w żelu poliakrylamidowym i stożku wzrostu neuronów pokazały koraliki w ich początkowych i przemieszczonych pozycjach. Zaobserwowano również sygnał EGFP stożka wzrostu.Kimografy pokazywały ruchy koralika w porównaniu z koralikiem referencyjnym. Podczas wykonywania obrazowania pojedynczej plamki ważne jest, aby wybrać neuron, który co tydzień wyraża, jak działać pod dwoma minimalnym obszarem. Podczas wykonywania mikroskopii siły pociągowej obrazowanie w dużym powiększeniu jest ważne dla dokładnej koncentracji siły pociągowej.

analyses-actin-dynamics-clutch-coupling-traction-force-for-growth

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano metodę wizualizacji i kwantyfikacji końców barbed F-aktyny w stożkach wzrostu neuronów. Po hodowli neuronów na szkiełkach podstawowych, komórki poddaje się permeabilizacji za pomocą roztworu zawierającego saponinę. Następnie krótka inkubacja w buforze z saponiną zawierającym rodaminę-aktynę pozwala na wbudowanie fluorescencyjnej aktyny w wolne końce barbed aktyny.

Znakowanie końców typu barbed F-aktyny rodaminą-aktyną w permeabilizowanych stożkach wzrostu neuronów

Mechaniczna sztywność w mikrośrodowisku guza odgrywa kluczową rolę w napędzaniu złośliwych zachowań poprzez zwiększanie aktywności inwadopodii i kurczliwości aktomiozyny. Za pomocą żeli poliakrylamidowych (PAA), testy inwadopodiów i siły trakcyjnej można wykorzystać do badania właściwości inwazyjnych i kurczliwych komórek rakowych w odpowiedzi na sztywność matrycy.

Żele poliakryloamidowe do oznaczania inwadopodiów i siły trakcyjnej na komórkach nowotworowych

Prezentujemy oprogramowanie do półautomatycznego śledzenia względnego stężenia białka na całej długości dynamicznych wypukłości komórkowych.

Graficzny interfejs użytkownika do wspomaganego programowo śledzenia stężenia białka w dynamicznych wypukłościach komórkowych

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

W tym protokole prezentujemy eksperymentalne procedury testu rozprzestrzeniania się komórek, który opiera się na mikroskopii żywych komórek. Dostarczamy narzędzie obliczeniowe typu open source do bezstronnej segmentacji komórek znakowanych fluorescencyjnie i ilościowej analizy dynamiki lamellipodiów podczas rozprzestrzeniania się komórek.

Analiza ilościowa dynamiki krawędzi komórek podczas rozprzestrzeniania się komórek

Prezentowany tutaj jest obszerny protokół do przeprowadzania ultraszybkich eksperymentów z zaciskiem siły na procesyjnych silnikach miozyny-5, który można łatwo rozszerzyć do badania innych klas silników procesowych. Protokół wyszczególnia wszystkie niezbędne kroki, od ustawienia aparatury doświadczalnej po przygotowanie próbki, gromadzenie danych i analizę.

Analiza właściwości mechanoenzymatycznych miozyn procesowych za pomocą ultraszybkiej spektroskopii siłowo-zaciskowej

Platforma iTACS (Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals) automatyzuje proces jednoczesnego pomiaru szerokiej gamy sygnałów chemicznych i mechanicznych w przylegających komórkach. iTACS został zaprojektowany, aby ułatwić rozwój kierowany przez społeczność i umożliwić naukowcom korzystanie ze wszystkich funkcji platformy, niezależnie od ich wykształcenia.

Zintegrowany zestaw narzędzi do analizy sygnałów komórkowych: sił, ruchu, morfologii i fluorescencji

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Prezentujemy protokoły prostych testów mikroprzepływowych filamentów aktynowych, w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, które pozwalają na dokładne monitorowanie poszczególnych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, podczas sekwencyjnego wystawiania ich na działanie różnych roztworów białkowych.

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

Ten artykuł przedstawia protokoły do inżynierii i charakteryzowania przestrajalnych trójwymiarowych sieci kompozytowych współsplątanych filamentów aktynowych i mikrotubul. Kompozyty przechodzą aktywną restrukturyzację i ruch balistyczny, napędzany silnikami miozyny II i kinezyny, a także są dostrojone przez względne stężenia aktyny, mikrotubul, białek motorycznych i pasywnych środków sieciujących.

Rekonstrukcja i charakterystyka kompozytów aktynowo-mikrotubulowych o regulowanej dynamice i mechanice napędzanej silnikiem

Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komety aktynowe na powierzchni koralików przy użyciu dostępnych na rynku składników białkowych. Takie systemy naśladują wystające struktury znajdujące się w komórkach i mogą być wykorzystywane do badania fizjologicznych mechanizmów wytwarzania siły w uproszczony sposób.

Rekonstrukcja ruchliwości opartej na aktynie za pomocą dostępnych na rynku białek

Poznaj analizę dynamiki aktyny i sił uciągu w stożkach wzrostu neuronów przy użyciu mikroskopii sił uciągu i obrazowania pojedynczych plamek. Ta metoda pozwala badać mechanizmy migracji komórek nerwowych.

Analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu

Przeglądaj więcej filmów