Analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu

Analiza sprzężenia obrazowania pojedynczej plamki i mikroskopijnej siły trakcyjnej może analizować maszynerię molekularną do wzrostu stożka wzrostu i nawigacji. Jako techniki wykorzystuje się dostępne na rynku materiały i standardowe mikroskopy. Naukowcy mogą dosłownie dostosować się do technik stosowanych w ich badaniach.

Rozpocząć od potraktowania neuronów tetrametylo-rodaminą lub ligandem TMR w rozcieńczeniu od 1 do 2000 w pożywce hodowlanej w dniu in vitro 3. Następnie utrzymuj neurony w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Po inkubacji przemyć ligand TMR trzykrotnie wstępnie podgrzanym PBS.

Usuń PBS przed dodaniem 0,5 mililitra podgrzanej pożywki L-15 Leibovitza do neuronów. Utrzymuj neurony w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie włącz mikroskop epifluorescencyjny i ustaw górny inkubator stanowy na 37 stopni Celsjusza.

Następnie umieść neurony traktowane ligandem TMR w szklanym naczyniu na podgrzewanym inkubatorze ze stopniem. Ustaw parametry akwizycji obrazu, takie jak czas naświetlania na 500 milisekund dla kanałów fluorescencyjnych Lifeact i HaloTag-aktyna oraz kategoryzacja jako 0,065 mikrona na 0,065 mikrona na piksel w interwale czasowym trzech sekund dla 50 klatek. Po wybraniu stożka wzrostu, który silnie wyraża Lifeact i co tydzień wyraża HaloTag-aktynę.

Zamknij pole na przysłonie, aby oświetlić minimalny obszar, który obejmuje stożek wzrostu i uzyskać obrazy poklatkowe. W dniu in vitro 3 zastąp pożywkę hodowlaną 0,5 mililitra podgrzanej pożywki L-15 Leibovitza i utrzymuj neurony przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby uzyskać mikroskopię sił trakcyjnych, włącz laserowy skaningowy mikroskop konfokalny i ustaw górny inkubator stopnia na 37 stopni Celsjusza.

Umieść neurony na szklanym naczyniu na uprzednim inkubatorze ze stopniem wstępnym. Ustaw parametry akwizycji obrazu zgodnie z opisem w skrypcie menu i wybierz stożek wzrostu, który silnie wyraża wzmocnione białko zielonej fluorescencji lub EGFP. Skoncentruj się na powierzchni żelu i uzyskaj zdjęcia poklatkowe.

Po zakończeniu użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby utworzyć jednokanałowe stosy obrazów poklatkowych RGB. Następnie zapisz obrazy jako pliki tiff. Następnie nałóż 100 mikrolitrów 10% wagowo dodecylosiarczanu sodu lub SDS rozpuszczonego w wodzie destylowanej do naczynia ze szklanym dnem, aby rozluźnić podłoże żelowe poprzez uwolnienie neuronów z podłoża.

Następnie inkubuj naczynie w inkubatorze stage top przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby ustabilizować temperaturę. W laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym skup się na powierzchni żelu, aby uzyskać obraz kulek w nienapiętym podłożu. Utwórz jednokanałowy obraz RGB ściegów na nienaprężonym podłożu i zapisz ten obraz jako plik tiff.

Pobierz kod analizy siły pociągowej TFM2021 i otwórz TFM2021 w MATLAB. Otwórz stronę główną. m w TFM2021 i uruchom go.

Gdy na ekranie pojawi się graficzny interfejs użytkownika. Kliknij na załaduj niewytrenowany obraz podłoża i wybierz obraz ściegu z korekcją pozycji X-Y na nienaprężonym podłożu. Przejdź do ładowania obrazów z koralików fluorescencyjnych i wybierz stos koralików obrazu poklatkowego.

Następnie kliknij załaduj obrazy w jasnym polu, aby wybrać obraz poklatkowy stosu jasnego pola i użyj załaduj obrazy GFP, aby wybrać obraz stosu poklatkowego EGFP. Z listy rozwijanej w graficznym interfejsie użytkownika wybierz GFP przed kliknięciem ROI, aby określić prostokątny obszar zainteresowania, w tym stożek wzrostu, klikając dwa punkty na wyświetlanym obrazie komórki. Po zakończeniu kliknij przycisk Zapisz w graficznym interfejsie użytkownika, aby zapisać wybrane obrazy stosu wraz z ROI w pliku maty.

Następnie kliknij wykrywanie punktowe i wprowadź żądaną wartość w oknie dialogowym, aby określić próg wykrywania ściegów. Naciśnij OK, aby rozpocząć obliczenia. Po zakończeniu obliczeń kliknij na ścieżkę kreślenia, aby powiększyć wybrany wcześniej obszar i wyświetlić wykryte koraliki jako białe kropki.

Użyj wybranych ściegów, aby wyznaczyć wielokątny obszar, który zawiera odpowiednie kropki pod stożkiem wzrostu. Następnie, naciskając Enter na klawiaturze, białe kropki w regionie wielokąta zmienią kolor na czerwony. Kliknij Oszacuj siłę w graficznym interfejsie użytkownika.

Następnie wprowadź wartości rozmiaru piksela i modułu Younga, jak wyjaśniono w manuskrypcie. Ustaw wartość współczynnika Poissona jako 0,3 i wykonaj oszacowanie siły, aby rozpocząć obliczenia. Oprogramowanie zapisze wyniki obliczeń w pliku w formacie arkusza kalkulacyjnego.

Obrazy fluorescencyjne stożka wzrostu neuronów wykazały wysoką ekspresję Lifeact, co pozwoliło na wizualizację morfologii stożka wzrostu pod całkowicie otwartą i wąską membraną. Poziomy ekspresji aktyny HaloTag były bardzo niskie przy słabych sygnałach. Gdy membrana jest odpowiednio zwężona, sygnały tła zmniejszają się, a w stożku wzrostu pojawiają się pojedyncze plamki.

Naukowcy, którzy odpowiednio wykonają wszystkie kroki, będą obserwować wsteczny przepływ F-aktyny w stożku wzrostu. Sztywność żelu poliakrylamidowego określono poprzez obliczenie głębokości wgniecenia spowodowanego ciężarem mikrosfery. Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny został wykorzystany do wykonania zdjęć powierzchni żelu i dna mikrosfery.

Sygnały z kulek fluoryzacyjnych nie były widoczne na powierzchni żelu w obszarze wgłębienia. Obrazy fluorescencyjne kulek osadzonych w żelu poliakrylamidowym i stożku wzrostu neuronów pokazały koraliki w ich początkowych i przemieszczonych pozycjach. Zaobserwowano również sygnał EGFP stożka wzrostu.

Kimografy pokazywały ruchy koralika w porównaniu z koralikiem referencyjnym. Podczas wykonywania obrazowania pojedynczej plamki ważne jest, aby wybrać neuron, który co tydzień wyraża, jak działać pod dwoma minimalnym obszarem. Podczas wykonywania mikroskopii siły pociągowej obrazowanie w dużym powiększeniu jest ważne dla dokładnej koncentracji siły pociągowej.