Name: Generowanie mutantów zerowych w celu wyjaśnienia roli glikozylotransferaz bakteryjnych w ruchliwości bakterii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-11T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Poznaj technikę tworzenia mutantów zerowych w bakterii Aeromonas w celu badania roli glikozylotransferaz w glikozylacji flagelli i patogenezie bakteryjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Kanadyjską Narodową Radę ds. Badań Naukowych, dla Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, Hiszpania) oraz dla Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia).

<ol><li>Schäffer, C., Messner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+facets+of+prokaryotic+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Review%22%5BJournal%5D)">Emerging facets of prokaryotic glycosylation.</a> FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).</li>
<li>De Maayer, P., Cowan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flashy+flagella%3A+flagellin+modification+is+relatively+common+and+highly+versatile+among+the+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae.</a> BMC Genomics. 17, 377(2016).</li>
<li>Nothaft, H., Szymanski, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+glycosylation+in+bacteria%3A+sweeter+than+ever%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever.</a> Nature Review Microbiology. 8 (11), 765-778 (2010).</li>
<li>Benz, I., Schmidt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Never+say+never+again%3A+protein+glycosylation+in+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria.</a> Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).</li>
<li>Guerry, P., Szymanski, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Campylobacter+sugars+sticking+out%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Campylobacter sugars sticking out.</a> Trends in Microbiology. 16 (9), 428-435 (2008).</li>
<li>Hug, I., Feldman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analogies+and+homologies+in+lipopolysaccharide+and+glycoprotein+biosynthesis+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria.</a> Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).</li>
<li>Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pour+some+sugar+on+it%3A+the+expanding+world+of+bacterial+protein+O-linked+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation.</a> Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).</li>
<li>Szymanski, C. M., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+glycosylation+in+bacterial+mucosal+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens.</a> Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).</li>
<li>Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+coating%3A+bacterial+protein+glycosylation+and+host-microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochemistry+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions.</a> Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).</li>
<li>Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosyltransferases%3A+structures%2C+functions%2C+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms.</a> Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).</li>
<li>Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carbohydrate-active+enzymes+database+%28CAZy%29+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013.</a> Nucleic Acids Research. 42, Database Issue 490-495 (2014).</li>
<li>Weerapana, E., Imperiali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asparagine-linked+protein+glycosylation%3A+from+eukaryotic+to+prokaryotic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems.</a> Glycobiology. 16 (6), 91(2006).</li>
<li>Faridmoayer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+substrate+promiscuity+of+the+Neisseria+oligosaccharyl+transferase+involved+in+protein+O-glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).</li>
<li>Wacker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+of+bacterial+oligosaccharyltransferase+suggests+a+common+transfer+mechanism+for+the+bacterial+and+eukaryotic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).</li>
<li>Scott, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+glycosylation+in+Burkholderia+pseudomallei+and+Burkholderia+thailandensis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).</li>
<li>Thibault, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+carbohydrate+moieties+and+glycosylation+motifs+in+Campylobacter+jejuni+flagellin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).</li>
<li>Schirm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural%2C+genetic+and+functional+characterization+of+the+flagellin+glycosylation+process+in+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori.</a> Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).</li>
<li>McNally, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+metabolomics+analysis+of+Campylobacter+coli+VC167+reveals+legionaminic+acid+derivatives+as+novel+flagellar+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).</li>
<li>Logan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+carbohydrate+modifications+on+Campylobacter+jejuni+11168+flagellin+using+metabolomics-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches.</a> FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).</li>
<li>Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+glycosylation+of+polar+and+lateral+flagellins+in+Aeromonas+hydrophila+AH-3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).</li>
<li>Canals, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-structural+flagella+genes+affecting+both+polar+and+lateral+flagella-mediated+motility+in+Aeromonas+hydrophila%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila.</a> Microbiology. 153, Pt 4 1165-1175 (2007).</li>
<li>Howard, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Campylobacter+jejuni+glycosylation+island+important+in+cell+charge%2C+legionaminic+acid+biosynthesis%2C+and+colonization+of+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens.</a> Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).</li>
<li>Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+specific+amino+acids+in+the+N-terminus+of+Pseudomonas+aeruginosa+flagellin+and+of+flagellin+glycosylation+in+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response.</a> Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).</li>
<li>Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aeromonas%3A+the+multifaceted+middleman+in+the+One+Health+world%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world.</a> Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).</li>
<li>Gavín, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+flagella+of+Aeromonas+species+are+essential+for+epithelial+cell+adherence+and+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation.</a> Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).</li>
<li>Altschul, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gapped+BLAST+and+PSI-BLAST%3A+a+new+generation+of+protein+database+search+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.</a> Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).</li>
<li>Forn-Cuní, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+flagella+glycosylation+in+Aeromonas%3A+Genomic+characterization+and+Involvement+of+a+specific+glycosyltransferase+%28Fgi-1%29+in+heterogeneous+flagella+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 595697(2021).</li>
<li>Milton, D. L., O'Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellin+A+is+essential+for+the+virulence+of+Vibrio+anguillarum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriol.ogy%22%5BJournal%5D)">Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum.</a> Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).</li>
<li>Kovács, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Pseudomonas+pyocyanea+by+the+oxidase+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction.</a> Nature. 178 (4535), 703(1956).</li>
<li>Fulton, K. M., Mendoza-Barberá, E., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+glycosylated+and+lateral+non-glycosylated+flagella+from+Aeromonas+hydrophila+strain+AH-1+%28Serotype+O11%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11).</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).</li>
<li>Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alternative+sigma+factor+RpoQ+regulates+colony+morphology%2C+biofilm+formation+and+motility+in+the+fish+pathogen+Aliivibrio+salmonicida%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida.</a> BMC Microbiology. 18 (1), 116(2018).</li>
<li>Pawar, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+genetic+tools+to+tackle+c-di-GMP-dependent+signalling+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).</li>
<li>Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+analysis+of+Burkholderia+pseuomallei+Bsa+Type+III+secretion+system+effectors+using+hypersecreting+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Society+for+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants.</a> The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Krytycznym wczesnym etapem tej metody jest identyfikacja regionów zaangażowanych w glikozylację wici i przypuszczalnych GT, ponieważ enzymy te wykazują wysoką homologię i biorą udział w wielu procesach. Analiza bioinformatyczna genomów Aeromonas w publicznych bazach danych pokazuje, że region ten sąsiaduje z regionem wici polarnej 2, który zawiera geny flageliny w wielu szczepach i zawiera geny zaangażowane w biosyntezę kwasu pseudodaminowego27. Umożliwiło to opracowanie wytycznych dotycz...

Glikozylacja białek została opisana zarówno u bakterii Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych i polega na kowalencyjnym przyłączeniu glikanu do łańcucha bocznego aminokwasu1,2. U prokariontów proces ten zwykle zachodzi poprzez dwa główne mechanizmy enzymatyczne: O- i N-glikozylację3. W O-glikozylacji glikan jest przyłączony do grupy hydroksylowej reszty seryny (Ser) lub treoniny (Thr). W N-glikozylacji glikan jest przyłączony do azotu amidowego o łańcuchu bocznym reszty asparaginy (Asn) w sekwencjach tripeptydowych Asn-X-Ser / Thr, gdzie X może być dowolnym aminokwasem z wyjątkiem proliny.
Glikany mogą przyjmować struktury liniowe lub rozgałęzione i składają się z monosacharydów lub polisacharydów kowalencyjnie połączonych wiązaniami glikozydowymi. U prokariontów glikany zwykle wykazują różnorodność składu i struktury cukrów w porównaniu z glikanami eukariotycznymi4. Ponadto opisano dwa różne szlaki glikozylacji bakteryjnej, które różnią się sposobem składania glikanu i przenoszenia go do białka akceptorowego: glikozylacja sekwencyjna i en bloc 5,6. W przypadku sekwencyjnej glikozylacji złożony glikan jest budowany bezpośrednio na białku przez kolejne dodawanie cukrów prostych. W glikozylacji en bloc wstępnie złożony glikan jest przenoszony do białka z oligosacharydu połączonego z lipidami przez wyspecjalizowaną oligosacharylotransferazę (OTazę). Wykazano, że oba szlaki są zaangażowane w procesy N- i O-glikozylacji7.
Glikozylacja białek odgrywa rolę w modulowaniu fizykochemicznych i biologicznych właściwości białek. Obecność glikanu może wpływać na to, jak białko oddziałuje ze swoim ligandem, co wpływa na aktywność biologiczną białka, ale może również wpływać na stabilność białka, rozpuszczalność, podatność na proteolizę, immunogenność i interakcje drobnoustroj-gospodarz8,9. Jednak kilka parametrów glikozylacji, takich jak liczba glikanów, skład glikanów, położenie i mechanizm przyłączania, może również wpływać na funkcję i strukturę białka.
Glikozylotransferazy (GT) są kluczowymi enzymami w biosyntezie złożonych glikanów i glikokoniugatów. Enzymy te katalizują tworzenie wiązania glikozydowego między ugrupowaniem cukrowym z aktywowanej cząsteczki donorowej a specyficznym akceptorem substratu. GT mogą wykorzystywać zarówno nukleotydy, jak i nienukleotydy jako cząsteczki donorowe i celować w różne akceptory substratów, takie jak białka, sacharydy, kwasy nukleinowe i lipidy10. Dlatego zrozumienie GT na poziomie molekularnym jest ważne dla zidentyfikowania ich mechanizmów działania i swoistości, a także umożliwia zrozumienie, w jaki sposób skład cukrów w glikanach, które modyfikują odpowiednie cząsteczki, jest powiązany z patogennością. Baza danych enzymów Carbohydrate Active (CAZy)11 klasyfikuje GT zgodnie z ich homologią sekwencji, co stanowi narzędzie predykcyjne, ponieważ w większości rodzin GT fałd strukturalny i mechanizmy działania są niezmienne. Jednak cztery powody utrudniają przewidzenie specyficzności substratowej wielu GT: 1) nie określono jasnego motywu sekwencji określającego specyficzność substratu u prokariontów12, 2) wiele GT i OTaz wykazuje rozwiązłość substratów13,14, 3) funkcjonalne GT są trudne do wytworzenia z wysoką wydajnością w formie rekombinowanej oraz 4) identyfikacja zarówno substratów donorowych, jak i akceptorowych jest złożona. Mimo to ostatnie badania mutagenezy umożliwiły uzyskanie znacznych postępów w zrozumieniu mechanizmów katalitycznych i odejmowaniu wiązania GT.
U bakterii O-glikozylacja wydaje się być bardziej rozpowszechniona niż N-glikozylacja. Miejsca O-glikozylacji nie wykazują sekwencji konsensusu, a wiele z białek O-glikozylowanych to białka wydzielane lub powierzchniowe komórek, takie jak wiciowce, pilusy lub autotransportery1. Glikozylacja witelliny wykazuje zmienność w liczbie miejsc akceptorowych, składzie glikanów i strukturze. Na przykład wiciowce Burkholderia spp mają tylko jedno miejsce akceptujące, podczas gdy u Campylobacter jejuni wiciowce mają aż 19 miejsc akceptujących15,16. Ponadto w przypadku niektórych bakterii glikan jest pojedynczym cukrem monosacharydowym, podczas gdy inne bakterie posiadają heterogeniczne glikany pozbawione różnych cukrów prostych, tworząc oligosacharydy. Ta niejednorodność występuje nawet wśród szczepów tego samego gatunku. Wiciowce Helicobacter są modyfikowane tylko przez kwas pseudaminowy (PseAc)17, a wiciowce Campylobacter mogą być modyfikowane przez PseAc, acetaminową formę kwasu pseudaminowego (PseAm) lub kwasu legionaminowego (LegAm), a glikany pochodzące z tych cukrów z acetylem, N-acetyloglukozaminą lub podstawieniami propionowymi18,19. W Aeromonas witelliny są modyfikowane przez glikany, których skład waha się od pojedynczej pochodnej kwasu PseAc do heteropolisacharydu20, a przyłączanie glikanów do monomerów flageliny odbywa się zawsze za pośrednictwem pochodnej PseAc.
Ogólnie, glikozylacja wiciowców jest niezbędna do składania włókien wiciowych, ruchliwości, zjadliwości i specyficzności gospodarza. Jednakże, podczas gdy wiciowce C. jejuni16, H. pylori17 i Aeromonas sp. 21 nie może złożyć się w filament, chyba że monomery białkowe są glikozylowane, Pseudomonas spp. i Burkholderia spp. 15 nie wymagają glikozylacji do montażu wici. Co więcej, w niektórych szczepach C. jejuni zmiany w składzie cukru gli wici wpływają na interakcję bakteria-gospodarz i mogą odgrywać rolę w unikaniu niektórych odpowiedzi immunologicznych16. Autoaglutynacja to kolejna cecha fenotypowa, na którą wpływają modyfikacje składu glikanów związanych z wiciowcami. Niższa autoaglutynacja prowadzi do zmniejszenia zdolności do tworzenia mikrokolonii i biofilmu22. U niektórych bakterii zdolność wici do wywoływania odpowiedzi prozapalnej była związana z glikozylacją flageliny. Tak więc u P. aeruginosa glikozylowana flagelina indukuje wyższą odpowiedź prozapalną niż niezluzylowana23.
Aeromonas to bakterie Gram-ujemne wszechobecne w środowisku, co pozwala im być na styku wszystkich komponentów One Health24. Mezofilne Aeromonas mają pojedynczą polarną wić, która jest wytwarzana konstytutywnie. Ponad połowa izolatów klinicznych wykazuje również ekspresję wiciowca bocznego, indukowaną w podłożach lub płytkach o wysokiej lepkości. Różne badania powiązały oba typy wici z wczesnymi etapami patogenezy bakteryjnej25. Podczas gdy zgłoszone do tej pory wiciowce polarne są O-glikozylowane przy resztach 5-8 Ser lub Thr ich centralnych domen immunogennych, wiciowce boczne nie są O-glikozylowane we wszystkich szczepach. Chociaż glikany wici polarnych z różnych szczepów wykazują różnorodność składu węglowodanowego i długości łańcucha20, wykazano, że cukier łączący jest pochodną kwasu pseudaminowego.
Celem tego manuskryptu jest opisanie metody uzyskiwania mutantów zerowych w określonych GT lub regionach chromosomalnych zawierających GT, aby przeanalizować ich udział w biosyntezie odpowiednich polisacharydów i patogenności bakteryjnej, a także rolę samego glikanu. Jako przykład identyfikujemy i usuwamy region chromosomalny zawierający GT Aeromonas, aby ustalić jego udział w polarnej glikozylacji witelliny i przeanalizować rolę glikanu witeliny. Pokazujemy, jak usunąć określony GT, aby ustalić jego funkcję w biosyntezie tego glikanu i rolę zmodyfikowanego glikanu. Chociaż na przykładzie Aeromonas, zasada ta może być wykorzystana do identyfikacji i badania wysp glikozylacji wici innych bakterii Gram-ujemnych oraz analizy funkcji GT zaangażowanych w biosyntezę innych glikanów, takich jak lipopolisacharyd antygenu O.

<table><tbody><tr><td>ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Zestaw reakcyjny gotowy do sekwencjonowania cyklu</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td>Używany do sekwencjonowania</td></tr><tr><td>AccuPrime Taq DNA Polimeraza, wysoka wierność</td><td>Invitrogen</td><td>12346-086</td><td>Używany do amplifikacji fragmentów AB, CD i AD</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Conda-Pronadise</td><td>8008</td><td>Stosowany do elektroforezy DNA</td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna, jelito cielęcia ()</td><td>Promega</td><td>M1821</td><td>Służy do usuwania fosforanu na końcu 5'</td></tr><tr><td>Agar Bacto</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td>Służy do analizy ruchliwości</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>Promega</td><td>R6021</td><td>Służy do ograniczania endonukleazy</td></tr><tr><td>BglII</td><td>Promega</td><td>R6081</td><td>Służy do ograniczania endonukleazy</td></tr><tr><td>BioDoc-It Imagin System</td><td>UVP</td><td></td><td>Stacja bioobrazowania używany do wizualizacji DNA</td></tr><tr><td>Polimeraza</td><td>Biotaq Bioline</td><td>BIO-21040</td><td>Używany do badań przesiewowych kolonii</td></tr><tr><td>Chlorek cezu</td><td>Applichem</td><td>A1126,0100</td><td>Używany do oczyszczania wici</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Applichem</td><td>A1806,0025</td><td>Używany do krycia trirodzicielskiego</td></tr><tr><td>Cytiva illustra GFX PCR DNA i zestaw do oczyszczania żelu</td><td>Cytivia</td><td>28-9034-71</td><td>Służy do oczyszczania amplikonów PCR i fragmentów DNA.</td></tr><tr><td>Aplikacja EDTA</td><td></td><td>131026.1211</td><td>Używana do elektroforezy DNA</td></tr><tr><td>Kuwety elektroporacyjne Odstęp 2 mm</td><td>VWR</td><td>732-1133</td><td>Używana do</td></tr><tr><td>transformacji Bromek etydyny</td><td>Applichem</td><td>A1152,0025</td><td>Służy do wizualizacji DNA</td></tr><tr><td>Marker HyperLadder 1 Kb</td><td>Marker Bioline</td><td>BIO-33053</td><td>Marker</td></tr><tr><td>DNA Zestaw do oczyszczania gDNA Invitrogen Easy-DNA</td><td>Invitrogen</td><td>10750204</td><td>Używany do bakteryjnego oczyszczania chromosomalnego DNA</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) Miller</td><td>agar Condalab</td><td>996</td><td>Używany do Escherichia coli kultura</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) Rosół młynarski</td><td>Condalab</td><td>1551</td><td>Używany do hodowli Escherichia coli culture</td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000</td><td>NanoDrop Techonologies Inc</td><td></td><td>Spektrofotometr używany do kwantyfikacji DNA</td></tr><tr><td>Ryfampicyna</td><td>Applichem</td><td>A2220,0005</td><td>Używany do krycia trójrodzicielskiego</td></tr><tr><td>SOC Medium</td><td>Invitrogen</td><td>15544034</td><td>Używany do odzyskiwania elektroporacji</td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Applichem</td><td>A3834,0005</td><td>Używany do krycia trójrodzicielskiego</td></tr><tr><td>SW 41 Ti Rotor wahadłowy</td><td>Beckman</td><td>331362</td><td>Służy do oczyszczania</td></tr> <tr>wici<td>Ligaza DNA T4</td><td>Invitrogen</td><td>15224017</td><td>Używany do reakcji ligacji</td></tr><tr><td>Tryptikazeina agar sojowy</td><td>Condalab</td><td>1068</td><td>Używany do uprawy Aeromonas</td></tr><tr><td>Tryptikazeina bulion sojowy</td><td>Condalab</td><td>1224</td><td>Używany do uprawy Aeromonas</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Condalab</td><td>1612</td><td>Służy do analizy ruchliwości</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Applichem</td><td>A2264,0500</td><td>Służy do elektroforezy DNA i oczyszczania wici</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Applichem</td><td>A4975,0100</td><td>Używany do lizy bakteryjnej</td></tr><tr><td>Ultra Clear probówki (14 mm x 89 mm)</td><td>Beckman</td><td>344059</td><td>Używany do oczyszczania wici</td></tr><tr><td>Veriti 96 well Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>Używany do reakcji</td></tr><tr><td>PCR Zyppy Plasmid Miniprep II Kit</td><td>Badania Zymmo</td><td>D4020</td><td>Służy do izolacji plazmidowego DNA</td></tr></tbody></table>

generowanie mutantów zerowych w celu wyjaśnienia roli glikozylotransferaz bakteryjnych w ruchliwości bakterii

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

Badania nad glikozylacją u prokariontów to szybko rozwijający się obszar. Bakterie mają na swojej powierzchni różne glikozylowane struktury, których glikany tworzą kod kreskowy specyficzny dla szczepu. Związane z nimi glikany wykazują większą różnorodność składu i struktury cukrów niż u eukariontów i są ważne w procesach rozpoznawania bakterii i gospodarza oraz interakcji ze środowiskiem. U bakterii chorobotwórczych glikoproteiny biorą udział w różnych etapach procesu zakaźnego, a modyfikacje glikanów mogą zakłócać określone funkcje glikoprotein. Jednak pomimo postępów poczynionych w zrozumieniu składu, struktury i szlaków biosyntezy glikanów, wiedza na temat roli glikoprotein w patogenności lub interakcji ze środowiskiem pozostaje bardzo ograniczona. Ponadto w przypadku niektórych bakterii enzymy wymagane do glikozylacji białek są wspólne z innymi szlakami biosyntezy polisacharydów, takimi jak szlaki biosyntezy lipopolisacharydów i kapsułek. Funkcjonalne znaczenie glikozylacji zostało wyjaśnione u kilku bakterii poprzez mutację określonych genów, które uważa się za zaangażowane w proces glikozylacji i badanie jej wpływu na ekspresję docelowej glikoproteiny i glikanu modyfikującego. Aeromony mezofilne mają pojedynczą i O-glikozylowaną wić polarną. Glikany wiciowe wykazują różnorodność składu węglowodanowego i długości łańcucha między szczepami Aeromonas. Jednak wszystkie analizowane do tej pory szczepy wykazują pochodną kwasu pseudaminowego jako cukier łączący, który modyfikuje reszty seryny lub treoniny. Pochodna kwasu pseudaminowego jest niezbędna do składania wici polarnych, a jej utrata ma wpływ na adhezję, tworzenie biofilmu i kolonizację. Protokół szczegółowo opisany w tym artykule opisuje, w jaki sposób konstrukcja mutantów zerowych może być wykorzystana do zrozumienia udziału genów lub regionów genomu zawierających przypuszczalne glikozylotransferazy w biosyntezie glikanu wiciowego. Obejmuje to możliwość zrozumienia funkcji zaangażowanych glikozylotransferaz i roli glikanu. Zostanie to osiągnięte poprzez porównanie mutanta z niedoborem glikanów ze szczepem typu dzikiego.

Niniejsza metodologia zapewnia skuteczny system generowania mutantów null w genach lub regionach chromosomalnych Aeromonas, które mogą wpływać na glikozylację wici oraz rolę włókien wiciowych (Rysunek 1).
Protokół rozpoczyna się od bioinformatycznej identyfikacji domniemanych FGIs oraz genów kodujących GTs występujących w tym regionie. W przypadku Aeromonas, lokalizacja chromosomalna FGIs opiera się na wykryciu trzech typów genów: genów zaangażow...

Tutaj opisujemy budowę mutantów zerowych Aeromonas w określonych glikozylotransferazach lub regionach zawierających glikozylotransferazy, testy ruchliwości i oczyszczanie wici przeprowadzone w celu ustalenia udziału i funkcji kodowanych przez nie enzymów w biosyntezie glikanu, a także rolę tego glikanu w patogenezie bakterii.

Generowanie mutantów zerowych w celu wyjaśnienia roli glikozylotransferaz bakteryjnych w ruchliwości bakterii

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Tak więc pochodna kwasu neurminowego jest obecna tylko w bakteriach chorobotwórczych, aminiglikozylowane wici zawierają ten cukier. W ramce delecja regionu zawartego w genach może pomóc w znalezieniu klastrów glikozylacji wici. Ta technika, najnowszy specyficzny region lub geny, takie jak glikozylotransferazy, które mają między sobą wysoką homologię i są zaangażowane w różne procesy, i analizują jego udział w procesie glikozylacji wici.Technika ta może również pomóc w ustaleniu roli glikozylotransferaz zaangażowanych w biosyntezę odpowiednich polisacharydów w bakteriach chorobotwórczych, a także roli białek kodujących geny zaangażowanych w tworzenie wici. Zademonstruje to Maite Polo, technik z mojego laboratorium. Zaprojektuj dwie pary starterów, które amplifikują regiony DNA przed i za wybranym genem lub regionem, który ma zostać usunięty.Startery A i D muszą zawierać na pięciu końcach pierwszych miejsce restrykcyjne dla endonukleazy, które umożliwia klonowanie w pDM4. Upewnij się, że startery B i C znajdują się w genie, który ma zostać usunięty, lub w pierwszym i ostatnim genie regionu, który ma zostać usunięty. Upewnij się, że oba startery znajdują się w ramce i znajdują się od pięciu do sześciu kodonów wewnątrz genu.Upewnij się, że oba startery zawierają 21 par zasad komplementarnej sekwencji na pięciu głównych końcach, aby połączyć amplikony DNA AB i CD. Użyj 100 nanogramów oczyszczonego chromosomalnego DNA jako matrycy w dwóch zestawach asymetrycznych PCR ze starterami AB i CD, a następnie przeprowadź analizę powstałych produktów w 1% żelu agarozowym. Oczyścić i oznaczyć ilościowo wycięte amplikony z żelu elektroforetycznego. Wymieszaj 100 nanogramów każdego amplikonu z odczynnikami PCR bez startera.Po jego rozszerzeniu dodaj startery A i D i amplifikuj je jako pojedynczy fragment. Następnie przeanalizuj, oczyść i określ ilościowo otrzymane produkty zgodnie z wcześniejszym opisem. Trawić jeden mikrogram pDM4 i 400 nanogramów amplikonu AD za pomocą endonukleazy.Połączyć strawiony pDM4 z amplikonem AD na wektorze molowym, aby wstawić stosunek jeden do czterech i przygotować reakcję ligacji. Inkubować przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Później dezaktywuj ligazę T4 w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 20 minut.Zaszczepić Escherichia coli w bulionie Luria Bertani Miller i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 200 obr./min, aż do uzyskania gęstości optycznej między 0,4 a 0,6. Osadzaj kulturę bakterii przez odwirowanie w temperaturze 5 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Zawieś granulat w schłodzonej wodzie destylowanej i powtórz proces czyszczenia jeszcze dwa razy.Przenieś zawiesinę bakterii do probówek do mikrofug i powtórz wirowanie w temperaturze 14 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Po ponownym zawieszeniu osadu w schłodzonej wodzie dodać około 3,5 mikrolitra mieszaniny ligacji i inkubować na lodzie przez pięć minut. Przenieść zawartość do schłodzonej kuwety elektroporacyjnej o odstępie dwóch milimetrów.Po elektroporacji dodać pożywkę SOC i przenieść zawartość do probówki hodowlanej. Inkubować przez godzinę w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Umieść przekształcone komórki na płytkach agarowych LB uzupełnionych chloramfenikolem.Sprawdź wstawienie konstruktu delecyjnego do pDM4 za pomocą PCR przy użyciu starterów, które flankują stronę klonującą pDM4. Przygotuj posiewy przez noc, aby biorca Aeromonas odtworzył szczep odporny na ryfampicynę i dwa różne szczepy Escherichia coli. Szczep dawcy z rekombinowanym plazmidem pDM4 i szczep pomocniczy z plazmidem PRK 2073 w temperaturze 30 stopni Celsjusza.Zawieś tę samą liczbę kolonii szczepów dawcy, biorcy i pomocnika w trzech probówkach LB ze 150 mikrolitrami LB. Następnie na płytce agarowej LB bez antybiotyków wymieszaj trzy zawiesiny bakteryjne w dwóch kroplach w stosunku biorcy do pomocnika do dawcy pięć do jednego do jednego i inkubuj płytkę twarzą do góry przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Zbierz bakterie, dodając jeden mililitr bulionu LB do płytki agarowej LB. Przenieś zawiesinę bakteryjną do stożkowej rurki do mikrofugi o pojemności 1,5 mililitra i energicznie wiruj.Rozprowadzić 100 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej na płytkach agarowych LB z ryfampicyną i chloramfenikolem. Odwirować 200 mikrolitrów i 600 mikrolitrów próbek, zawiesić granulat w 100 mikrolitrach bulionu LB i płytkę na agarze LB z ryfampicyną i chloramfenikolem, a następnie inkubować. Wykonaj test oksydazy, aby potwierdzić, że kolonie to Aeromonas.Ponadto potwierdź wprowadzenie rekombinowanego plazmidu pDM4 do określonego regionu chromosomalnego za pomocą PCR przy użyciu starterów E i F. Hoduj rekombinowane kolonie w dwóch mililitrach LB z 10% sacharozą i bez antybiotyków przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Po przygotowaniu różnych rozcieńczeń kultur, rozłóż 100 mikrolitrów kultur bakteryjnych i rozcieńczeń na płytce agarowej LB z 10% sacharozą i inkubuj przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza.Następnego dnia podnieś kolonie i przenieś je na płytki LB z chloramfenikolem i bez. Po inkubacji przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza wybierz kolonie wrażliwe na chloramfenikol. Przeanalizuj wrażliwe kolonie metodą PCR przy użyciu pary starterów EF i wybierz kolonie, których produkt PCR korelował z rozmiarem usuniętego konstruktu.Umieść małą kroplę silikonu w czterech rogach szkiełka wyjściowego i zamontuj wyhodowaną przez noc kulturę Aeromonas na szkiełku podstawowym. Umieść wykopany szkiełko na szkiełku pokrywy i odwróć suwak do góry nogami. Przeanalizuj ruchliwość pływania za pomocą mikroskopii świetlnej przy użyciu mikroskopu optycznego, a następnie przenieś trzy mikrolitry kultury na środek miękkiej płytki agarowej.Inkubuj płytkę twarzą do góry przez noc w temperaturze od 25 do 30 stopni Celsjusza. Za pomocą linijki na końcu inkubacji zmierz migrację bakterii od środka płytki w kierunku obwodu przez agar. Culture Aeromonas odcedza się przez noc w 900 mililitrach TSB w temperaturze od 25 do 30 stopni Celsjusza.Po odwirowaniu zawiesić osad w 20 mililitrach 100-milimolowego buforu chlorowodoru Tris o pH 7,8. Aby usunąć zakotwiczoną wici, należy przeciąć zawiesinę w wirze za pomocą szklanego pręta przez trzy do czterech minut, a następnie wielokrotnie przepuszczać przez strzykawkę o rozmiarze 21. Bakterie należy otopić przez dwa kolejne wirowania w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant do oddzielnej probówki.Po ultraodwirowaniu supernatantu zawiesić osad w 150 mikrolitrach 100-milimolowego chlorowodoru Tris zawierającego dwa milimolowe EDTA. Przenieś 150 mikrolitrów wzbogaconej frakcji wici do cienkościennej, ultra przezroczystej probówki i napełnij ją 12 mililitrami roztworu chlorku cezu. Ultraodwirować probówkę pod ciśnieniem 60 000 razy G przez 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza w kołyszącym się wirniku kubełkowym.Zebrać pasmo wici do gradientu chlorku cezu za pomocą strzykawki i przeprowadzić dializę ze 100-milimolowym chlorowodorem Tris i dwoma milimolowymi EDTA, a następnie przeprowadzić analizę za pomocą elektroforezy i barwienia błękitem Coomassie lub spektrometrii mas. Na poniższym rysunku pas WT to Aeromonas piscicola AH3. Pasy od pierwszego do ósmego pokazują wrażliwe na chloramfenikol kolonie drugiej rekombinacji.ST to marker hiperpęcherza moczowego 1KB. Pasy od pierwszego do trzeciego i od piątego do ósmego pokazują kolonie z genem FGI4 typu dzikiego jako pas WT. Tor czwarty pokazuje kolonię z usuniętym genem FGI4. Testy mikroskopii świetlnej wykazały, że modyfikacje wici polarnych lub bocznych prowadzą jedynie do zmniejszenia średnic migracji, dlatego mutanty AH-3 FGI i AH-3 FGI-4 wykazują jedynie zmniejszoną ruchliwość w stosunku do szczepu typu dzikiego.Rysunek przedstawia wić polarną z AH-3 na pierwszym pasie i brak mutantów w regionie FGI na drugim pasie i gen FGI-4 na trzecim pasie, przy czym oba mutanty mają polarne witelliny o niższej masie cząsteczkowej niż szczep typu dzikiego, co sugeruje zmiany w glikanie wici. Ważne jest, aby upewnić się, że mutacje nie wpływają na dalsze geny i nie prowadzą do niezdolności do składania wici lub niezdolności włókien wici. Gdy zmiany w białkach flageliny nie są wykrywalne, wymagana jest analiza spektrometrii mas przy użyciu całkowitego białka peptydów flageliny w celu poznania masy glikanów.

generation-null-mutants-to-elucidate-role-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Systematyczne, wielkoskalowe przesiewy syntetycznych interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych powiązań między szlakami sygnałowymi. W niniejszej pracy opisujemy opracowaną przez nas technologię wysokoprzepustowych ilościowych przesiewów macierzy syntetycznych interakcji genetycznych, nazwaną eSGA, służącą do wyjaśniania relacji epistatycznych i badania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

Źródło: Tomás, J. M., et al. Generowanie mutantów zerowych w celu wyjaśnienia roli glikozylotransferaz bakteryjnych w ruchliwości bakterii. J. Vis. Exp. (2022).Ten film pokazuje zależną od inicjatora amplifikację plazmidu samobójczego u E. coli. Plazmid, który jest nosicielem genu oporności na antybiotyki, replikuje się tylko w obecności białka inicjującego kodowanego przez gospodarza. Po elektroporacji i inkubacji w pożywce regeneracyjnej, mieszaninę umieszcza się na agarze zawierającym...

Amplifikacja plazmidu samobójczego w gospodarzu bakteryjnym

Enterobacter sp. YSU rośnie w pożywce z minimalnymi solami glukozy. Auksotrofy są generowane przez przekształcenie go w transposom, który losowo wstawia się do genomu gospodarza. Mutanty są znajdowane przez replikowanie posiewu ze złożonej pożywki do minimalnej pożywki. Przerwane geny są identyfikowane przez ratowanie genów i sekwencjonowanie.

Wytwarzanie auksotrofów Enterobacter sp. YSU z wykorzystaniem mutagenezy transpozonów

Na ruchliwość roju wpływają czynniki fizyczne i środowiskowe. Opisujemy dwufazowy protokół i wytyczne mające na celu obejście wyzwań powszechnie związanych z przygotowaniem testów roju i gromadzeniem danych. Technika obrazowania makroskopowego jest stosowana w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat zachowania roju, których nie zapewniają obecne techniki analizy.

Przygotowanie, obrazowanie i kwantyfikacja testów ruchliwości powierzchni bakterii

W tym badaniu, nano-mikroprzepływowa komora przepływowa została wykorzystana do wizualizacji i funkcjonalnego scharakteryzowania drgań Xylella fastidiosa, bakterii wywołującej chorobę Pierce'a u winorośli.

Wizualizacja ruchliwości drgań i charakterystyka roli PilG u Xylella fastidiosa

Opisujemy łatwą, szybką i stosunkowo tanią metodę generowania zaburzonych genami szczepów Streptococcus mutans; technika ta może być dostosowana do generowania zaburzonych genami szczepów różnych gatunków.

Wytwarzanie szczepu Streptococcus mutans z zaburzeniami genetycznymi bez klonowania genów

Wiele bakterii wykorzystuje ruchliwość sterowaną wiciami do poruszania się po swoim środowisku i kolonizowania korzystnego otoczenia, zarówno indywidualnie, jak i zbiorowo. Zademonstrowano tutaj zastosowanie trzech uznanych metod, które wykorzystują ruchliwość jako narzędzie selekcyjne do identyfikacji składników/ścieżek przyczyniających się do pływania i ruchliwości roju.

Badanie ruchliwości sterowanej wiciami u Escherichia coli poprzez zastosowanie trzech ustalonych technik w serii

Tutaj opisujemy użycie płytek gradientu induktora do oceny ruchliwości roju bakterii, jednocześnie uzyskując wiele odpowiedzi stężenia.

Kwantyfikacja ruchliwości roju powierzchni bakterii na płytkach gradientu induktora

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania ruchliwości bakterii na podstawie reakcji kolorystycznej. Kluczowymi zaletami tej metody jest to, że jest łatwa do oceny i dokładniejsza oraz nie wymaga specjalistycznego sprzętu.

Wizualizacja ruchliwości bakterii na podstawie reakcji kolorystycznej

Ten protokół opisuje procedurę trójwymiarowego (3D) drukowania kolonii bakteryjnych w celu zbadania ich ruchliwości i wzrostu w złożonych 3D porowatych matrycach hydrożelowych, które są bardziej zbliżone do ich naturalnych siedlisk niż konwencjonalne kultury płynów lub szalki Petriego.

Bakterie do drukowania 3D do badania ruchliwości i wzrostu w złożonych porowatych ośrodkach 3D

Protokół ten przedstawia szybką i skuteczną metodę identyfikacji czynników genetycznych zaangażowanych w różne typy ruchliwości u Pseudomonas aeruginosa.

Metoda wysokoprzepustowa do obserwacji fenotypów ruchliwości u Pseudomonas aeruginosa

Poznaj technikę tworzenia mutantów zerowych w bakterii Aeromonas w celu badania roli glikozylotransferaz w glikozylacji flagelli i patogenezie bakteryjnej.

Generowanie mutantów zerowych w celu wyjaśnienia roli glikozylotransferaz bakteryjnych w ruchliwości bakterii

Przeglądaj więcej filmów