Generowanie mutantów zerowych w celu wyjaśnienia roli glikozylotransferaz bakteryjnych w ruchliwości bakterii

Tak więc pochodna kwasu neurminowego jest obecna tylko w bakteriach chorobotwórczych, aminiglikozylowane wici zawierają ten cukier. W ramce delecja regionu zawartego w genach może pomóc w znalezieniu klastrów glikozylacji wici. Ta technika, najnowszy specyficzny region lub geny, takie jak glikozylotransferazy, które mają między sobą wysoką homologię i są zaangażowane w różne procesy, i analizują jego udział w procesie glikozylacji wici.

Technika ta może również pomóc w ustaleniu roli glikozylotransferaz zaangażowanych w biosyntezę odpowiednich polisacharydów w bakteriach chorobotwórczych, a także roli białek kodujących geny zaangażowanych w tworzenie wici. Zademonstruje to Maite Polo, technik z mojego laboratorium. Zaprojektuj dwie pary starterów, które amplifikują regiony DNA przed i za wybranym genem lub regionem, który ma zostać usunięty.

Startery A i D muszą zawierać na pięciu końcach pierwszych miejsce restrykcyjne dla endonukleazy, które umożliwia klonowanie w pDM4. Upewnij się, że startery B i C znajdują się w genie, który ma zostać usunięty, lub w pierwszym i ostatnim genie regionu, który ma zostać usunięty. Upewnij się, że oba startery znajdują się w ramce i znajdują się od pięciu do sześciu kodonów wewnątrz genu.

Upewnij się, że oba startery zawierają 21 par zasad komplementarnej sekwencji na pięciu głównych końcach, aby połączyć amplikony DNA AB i CD. Użyj 100 nanogramów oczyszczonego chromosomalnego DNA jako matrycy w dwóch zestawach asymetrycznych PCR ze starterami AB i CD, a następnie przeprowadź analizę powstałych produktów w 1% żelu agarozowym. Oczyścić i oznaczyć ilościowo wycięte amplikony z żelu elektroforetycznego. Wymieszaj 100 nanogramów każdego amplikonu z odczynnikami PCR bez startera.

Po jego rozszerzeniu dodaj startery A i D i amplifikuj je jako pojedynczy fragment. Następnie przeanalizuj, oczyść i określ ilościowo otrzymane produkty zgodnie z wcześniejszym opisem. Trawić jeden mikrogram pDM4 i 400 nanogramów amplikonu AD za pomocą endonukleazy.

Połączyć strawiony pDM4 z amplikonem AD na wektorze molowym, aby wstawić stosunek jeden do czterech i przygotować reakcję ligacji. Inkubować przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Później dezaktywuj ligazę T4 w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Zaszczepić Escherichia coli w bulionie Luria Bertani Miller i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 200 obr./min, aż do uzyskania gęstości optycznej między 0,4 a 0,6. Osadzaj kulturę bakterii przez odwirowanie w temperaturze 5 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Zawieś granulat w schłodzonej wodzie destylowanej i powtórz proces czyszczenia jeszcze dwa razy.

Przenieś zawiesinę bakterii do probówek do mikrofug i powtórz wirowanie w temperaturze 14 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Po ponownym zawieszeniu osadu w schłodzonej wodzie dodać około 3,5 mikrolitra mieszaniny ligacji i inkubować na lodzie przez pięć minut. Przenieść zawartość do schłodzonej kuwety elektroporacyjnej o odstępie dwóch milimetrów.

Po elektroporacji dodać pożywkę SOC i przenieść zawartość do probówki hodowlanej. Inkubować przez godzinę w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Umieść przekształcone komórki na płytkach agarowych LB uzupełnionych chloramfenikolem.

Sprawdź wstawienie konstruktu delecyjnego do pDM4 za pomocą PCR przy użyciu starterów, które flankują stronę klonującą pDM4. Przygotuj posiewy przez noc, aby biorca Aeromonas odtworzył szczep odporny na ryfampicynę i dwa różne szczepy Escherichia coli. Szczep dawcy z rekombinowanym plazmidem pDM4 i szczep pomocniczy z plazmidem PRK 2073 w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Zawieś tę samą liczbę kolonii szczepów dawcy, biorcy i pomocnika w trzech probówkach LB ze 150 mikrolitrami LB. Następnie na płytce agarowej LB bez antybiotyków wymieszaj trzy zawiesiny bakteryjne w dwóch kroplach w stosunku biorcy do pomocnika do dawcy pięć do jednego do jednego i inkubuj płytkę twarzą do góry przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Zbierz bakterie, dodając jeden mililitr bulionu LB do płytki agarowej LB. Przenieś zawiesinę bakteryjną do stożkowej rurki do mikrofugi o pojemności 1,5 mililitra i energicznie wiruj.

Rozprowadzić 100 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej na płytkach agarowych LB z ryfampicyną i chloramfenikolem. Odwirować 200 mikrolitrów i 600 mikrolitrów próbek, zawiesić granulat w 100 mikrolitrach bulionu LB i płytkę na agarze LB z ryfampicyną i chloramfenikolem, a następnie inkubować. Wykonaj test oksydazy, aby potwierdzić, że kolonie to Aeromonas.

Ponadto potwierdź wprowadzenie rekombinowanego plazmidu pDM4 do określonego regionu chromosomalnego za pomocą PCR przy użyciu starterów E i F. Hoduj rekombinowane kolonie w dwóch mililitrach LB z 10% sacharozą i bez antybiotyków przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Po przygotowaniu różnych rozcieńczeń kultur, rozłóż 100 mikrolitrów kultur bakteryjnych i rozcieńczeń na płytce agarowej LB z 10% sacharozą i inkubuj przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Następnego dnia podnieś kolonie i przenieś je na płytki LB z chloramfenikolem i bez. Po inkubacji przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza wybierz kolonie wrażliwe na chloramfenikol. Przeanalizuj wrażliwe kolonie metodą PCR przy użyciu pary starterów EF i wybierz kolonie, których produkt PCR korelował z rozmiarem usuniętego konstruktu.

Umieść małą kroplę silikonu w czterech rogach szkiełka wyjściowego i zamontuj wyhodowaną przez noc kulturę Aeromonas na szkiełku podstawowym. Umieść wykopany szkiełko na szkiełku pokrywy i odwróć suwak do góry nogami. Przeanalizuj ruchliwość pływania za pomocą mikroskopii świetlnej przy użyciu mikroskopu optycznego, a następnie przenieś trzy mikrolitry kultury na środek miękkiej płytki agarowej.

Inkubuj płytkę twarzą do góry przez noc w temperaturze od 25 do 30 stopni Celsjusza. Za pomocą linijki na końcu inkubacji zmierz migrację bakterii od środka płytki w kierunku obwodu przez agar. Culture Aeromonas odcedza się przez noc w 900 mililitrach TSB w temperaturze od 25 do 30 stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu zawiesić osad w 20 mililitrach 100-milimolowego buforu chlorowodoru Tris o pH 7,8. Aby usunąć zakotwiczoną wici, należy przeciąć zawiesinę w wirze za pomocą szklanego pręta przez trzy do czterech minut, a następnie wielokrotnie przepuszczać przez strzykawkę o rozmiarze 21. Bakterie należy otopić przez dwa kolejne wirowania w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant do oddzielnej probówki.

Po ultraodwirowaniu supernatantu zawiesić osad w 150 mikrolitrach 100-milimolowego chlorowodoru Tris zawierającego dwa milimolowe EDTA. Przenieś 150 mikrolitrów wzbogaconej frakcji wici do cienkościennej, ultra przezroczystej probówki i napełnij ją 12 mililitrami roztworu chlorku cezu. Ultraodwirować probówkę pod ciśnieniem 60 000 razy G przez 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza w kołyszącym się wirniku kubełkowym.

Zebrać pasmo wici do gradientu chlorku cezu za pomocą strzykawki i przeprowadzić dializę ze 100-milimolowym chlorowodorem Tris i dwoma milimolowymi EDTA, a następnie przeprowadzić analizę za pomocą elektroforezy i barwienia błękitem Coomassie lub spektrometrii mas. Na poniższym rysunku pas WT to Aeromonas piscicola AH3. Pasy od pierwszego do ósmego pokazują wrażliwe na chloramfenikol kolonie drugiej rekombinacji.

ST to marker hiperpęcherza moczowego 1KB. Pasy od pierwszego do trzeciego i od piątego do ósmego pokazują kolonie z genem FGI4 typu dzikiego jako pas WT. Tor czwarty pokazuje kolonię z usuniętym genem FGI4. Testy mikroskopii świetlnej wykazały, że modyfikacje wici polarnych lub bocznych prowadzą jedynie do zmniejszenia średnic migracji, dlatego mutanty AH-3 FGI i AH-3 FGI-4 wykazują jedynie zmniejszoną ruchliwość w stosunku do szczepu typu dzikiego.

Rysunek przedstawia wić polarną z AH-3 na pierwszym pasie i brak mutantów w regionie FGI na drugim pasie i gen FGI-4 na trzecim pasie, przy czym oba mutanty mają polarne witelliny o niższej masie cząsteczkowej niż szczep typu dzikiego, co sugeruje zmiany w glikanie wici. Ważne jest, aby upewnić się, że mutacje nie wpływają na dalsze geny i nie prowadzą do niezdolności do składania wici lub niezdolności włókien wici. Gdy zmiany w białkach flageliny nie są wykrywalne, wymagana jest analiza spektrometrii mas przy użyciu całkowitego białka peptydów flageliny w celu poznania masy glikanów.