Name: Testy ACT1-CUP1 określają specyficzną dla substratu wrażliwość mutantów spliceosomalnych w pączkujących drożdżach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Poznaj test ACT1-CUP1 do oceny mutacji spliceosomalnych w drożdżach pączkujących. Ta metoda identyfikuje defekty splicingowe pre-mRNA i określa, który etap procesu jest najbardziej zaburzony.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękuję Aaronowi Hoskinsowi i członkom laboratorium Hoskinsa z University of Wisconsin-Madison za użycie szczepów drożdży i sprzętu do generowania rysunków 3-5. Dziękuję Harpreet Kaur i Xingyang Fu za ich wnikliwe komentarze na temat rękopisu. Dziękuję wspierającym studentom, pracownikom i wykładowcom Uniwersytetu Północno-Zachodniego podczas pisania, redagowania i filmowania tego artykułu. Dziękuję Isabelle Marasigan za pomoc w sfilmowaniu tej metody.

1. Budowa szczepu drożdży
<ol>
	<li>Wytworzyć lub otrzymać szczep S. cerevisiae, którego tło obejmuje leu2 i cup1Δ. Aby wygenerować to tło, użyj dobrze znanej metody drożdżowej, która wykorzystuje octan litu i jednoniciowy DNA39. 
	UWAGA: Haploidalne szczepy drożdży mogą zawierać jedną, dwie lub więcej kopii CUP16,38. Zapoznaj się z informacjami genomicznymi dla wybranego szczepu drożdży podczas projektowania starterów knock-out w celu flankowania lokalizacji genu CUP1.</li>
	<li>Przeprowadzić transformację drożdży w celu włączenia QSP poprzez inkorporację genomową lub na plazmidzie. Użyj sprawdzonego protokołu, takiego jak te opisane w poprzednich badaniach40,41,42.</li>
	<li>Wykonaj transformację drożdży z otrzymanym szczepem (szczepami) z kroku 1.2., aby dodać żądany plazmid reporterowy ACT1-CUP1. 
	UWAGA: Komórki muszą być utrzymywane na płytkach i pożywkach z kroplą leucyny (-Leu), aby zapewnić zatrzymanie plazmidów reporterowych ACT1-CUP1 po tej transformacji.</li>
	<li>Wykonaj kroki 1.2 i 1.3 dla każdego QSP i każdego plazmidu reporterowego ACT1-CUP1, który ma być badany, w tym szczepów kontrolnych.</li>
</ol>
2. Przygotowanie płyty miedzianej
<ol>
	<li>Należy wybrać zakres stężeń miedzi, który odpowiada badanym osobom zgłaszającym (patrz Tabela 1, aby zapoznać się z często stosowanymi wskaźnikami śmiertelności). 
	UWAGA: Przykładem kompleksowego zakresu stężeń miedzi jest 30 różnych stężeń miedzi: 0 mM, 0,025 mM, 0,05 mM, 0,075 mM, 0,1 mM, 0,15 mM, 0,2 mM, 0,25 mM, 0,3 mM, 0,35 mM, 0,4 mM, 0,45 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM i 2,5 mM Cu2+.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 1 MCuSO4 i sterylnego filtra przez sterylny filtr PES (polieterosulfon) o wielkości 0,22 μm.</li>
	<li>Na żądaną płytkę miedzianą przygotuj 2 ml roztworu CuSO4 w sterylnej wodzie. 
	UWAGA: Ponieważ płytka z 0 mM Cu2+ będzie zawsze analizowana i obrazowana jako odniesienie, zaleca się wykonanie dwóch płytek 0 mM Cu2+, jednej na początku i jednej na końcu etapu powlekania (krok 3.4.).
	<ol>
		<li>Obliczyć ilość surowca dla końcowego pożądanego stężenia miedzi w 40 ml objętości płytki (tabela uzupełniająca 1).</li>
		<li>Dodaj obliczoną ilość sterylnej wody i 1 M bulionu CuSO4 do sterylnej probówki o pojemności 2 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wlać płytki do testu ACT1-CUP1. 
	UWAGA: Alternatywą dla poniższego protokołu jest wstępne połączenie pożywki i agaru w dużym pojemniku i podwielokrotności po autoklawowaniu do mniejszych pojemników w celu uzyskania różnych stężeń miedzi dla każdej płytki. Niezależnie od przyjętej metody ważne jest, aby upewnić się, że stężenie mediów jest spójne między wszystkimi płytkami, mimo że każda z nich ma inne stężenie miedzi.
	<ol>
		<li>Oznacz każdą pustą płytkę do nalania końcowym stężeniem miedzi, które będzie zawierać. Przygotuj co najmniej jedną kwadratową płytkę na każde stężenie miedzi, które ma być badane.</li>
		<li>Oznacz butelkę o pojemności 100 ml na stężenie miedzi, która ma być testowana.</li>
		<li>Do każdej butelki dodaj 790 mg agaru (2% w/v agaru) i mieszadło.</li>
		<li>W dużej zlewce połącz pożywkę wzrostową -Leu dla wszystkich miedzianych płytek, które mają zostać wylane. Na każdą płytkę, która ma być wykonana, rozpuść 265 mg drożdżowej zasady azotowej (YNB) i 64 mg mieszanki drop-out minus leucyna (i wszelkie inne składniki odżywcze, które mogą być wymagane do utrzymania plazmidu QSP w komórkach) w 34 ml wody dejonizowanej.</li>
		<li>Dodać 34 ml roztworu pożywki wzrostowej -Leu do każdej przygotowanej butelki o pojemności 100 ml i zakręcić folią aluminiową. Oznacz folię zamierzonym stężeniem miedzi.</li>
		<li>Autoklaw do sterylizacji i rozpuszczenia agaru przy użyciu zalecanego dla autoklawu cyklu cieczy.</li>
		<li>Tak szybko, jak to możliwe, dodaj 4 ml 20% w/v glukozy (sterylnie przefiltrowanej) do każdej butelki.</li>
		<li>Dopasuj etykiety i dodaj 2 ml rozcieńczeniaCuSO4 do przeznaczonej do tego butelki. 
		UWAGA: Ponieważ w tym samym czasie można wykonać dziesiątki miedzianych płytek, z których każda ma inne stężenie, wyraźne oznakowanie wszystkich butelek, probówek i talerzy zamierzonym stężeniem miedzi zapobiegnie pomyłkom podczas nalewania płytek.</li>
		<li>Użyj płytki mieszającej do mieszania przez ~30 s i wlej lub odpipetuj 35 ml do oznaczonej płytki, unikając pęcherzyków. Pozostawić do ostygnięcia przed przechowywaniem lub użyciem. 
		UWAGA: Często płytki są przygotowywane 1 dzień lub 2 dni przed testem i przechowywane w temperaturze 4 °C do kilku godzin przed użyciem. Płytki powinny mieć temperaturę pokojową (RT) przed rozpoczęciem powlekania (krok 3.4.).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test ACT1-CUP1
<ol>
	<li>Umieść pożądane szczepy na płytkach -Leu. 
	UWAGA: W przypadku pracy z wywarami kriogenicznymi należy zadbać o to, aby komórki zostały wystarczająco ożywione z przechowywania przed posiewem. Zalecaną procedurą jest usuwanie smug z materiału kriogenicznego i pozostawienie go do wzrostu przez 3-5 dni w temperaturze 30 °C. Następnie ponownie narysuj małą próbkę i pozwól jej rosnąć przez kolejne 2-3 dni w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Hoduj kultury przez noc w 10 ml pożywki.
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę wzrostową -Leu, stosując te same proporcje, jak opisano w kroku 2.4.2. Na 10 ml pożywki dodać 66 mg drożdżowej zasady azotowej (YNB) i 16 mg mieszanki drop-out minus leucyna do 9 ml wody dejonizowanej. Przepuścić przez sterylny filtr PES 0,22 μm.</li>
		<li>Na szczep drożdży dodać 9 ml pożywki wzrostowej -Leu i 1 ml 20% w/v glukozy (sterylnie przefiltrowanej) do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Za pomocą sterylnego patyczka lub końcówki pipety zbierz małą (~1 mm okrągłą) próbkę drożdży i zaszczep pożywkę.</li>
		<li>Wstrząśnij wszystkimi nocnymi kulturami przy 180 obr./min i temperaturze 30 °C. 
		UWAGA: Jeśli są dostępne, zamiast wytrząsarki można użyć rotatorów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć szczepy do OD600 0,5 ± 0,05 w 10% glicerolu.
	<ol>
		<li>Na szczep dodaj 100 μl kultury do kuwety zawierającej 900 μl wody.</li>
		<li>Zmierz OD600 za pomocą spektrofotometru.</li>
		<li>Obliczyć rozcieńczenie wymagane do osiągnięcia OD600 wynoszącego 0,5 w końcowej objętości 2 ml.</li>
		<li>Rozcieńczyć każdy szczep do OD600 0,5 w 10% glicerolu (sterylny).</li>
		<li>Ponownie zmierz OD600, aby potwierdzić, że gęstość komórek mieści się w pożądanym zakresie od 0,5 ± 0,05.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pokryj naprężenia na miedzianych płytkach. 
	UWAGA: Do powlekania szczepów można stosować różne metody, w tym pipetowanie ręczne objętości 5-10 μl, pipetator wielokrotny lub wielokanałowy lub tłoczenie za pomocą replikatora pinowego. Ta ostatnia metoda jest opisana poniżej, chociaż większość kroków będzie podobna niezależnie od metody.
	<ol>
		<li>Ustaw sterylne miejsce pracy i zapalony palnik Bunsena.</li>
		<li>W przypadku replikatora 48-pinowego odpipetuj 200 μl każdego rozcieńczonego szczepu do oddzielnego dołka na 96-dołkowej płytce. Wypełnij puste przestrzenie w siatce 6 x 8 200 μl 10% glicerolu (sterylnego). 
		UWAGA: Przykład schematu posiewu dla dziewięciu szczepów drożdży znajduje się w tabeli uzupełniającej 2.</li>
		<li>Zanurz replikator w płytkim naczyniu z 95% (v/v) etanolem i płomieniem w celu sterylizacji. Pozwól mu ostygnąć przez co najmniej 2 minuty po wygaśnięciu płomienia, aby uniknąć szoku cieplnego komórek.</li>
		<li>Umieść cztery talerze w pobliżu palnika i zdejmij pokrywki.</li>
		<li>Zanurz replikator w 96-dołkowej płytce i podnieś go jednym szybkim ruchem.</li>
		<li>Delikatnie połóż na talerzu i lekko kołysz się w przód iw tył, aby ułatwić dobre przenoszenie.</li>
		<li>Podnieś jednym szybkim ruchem i umieść w dokładnie tej samej orientacji na 96-dołkowej płytce.</li>
		<li>Powtórz tę czynność dla maksymalnie trzech innych talerzy. Powtórz proces zanurzania replikatora w etanolu, palenia w celu sterylizacji i czekania na ostygnięcie co cztery płytki.</li>
		<li>Po platerowaniu płytki przesuń płynnym ruchem w bok, ale nadal w parasolu sterylizacyjnym płomienia. 
		UWAGA: Zaleca się rozcieńczanie drożdży i powlekanie w pobliżu płomienia. Płytki mogą łatwo ulec zanieczyszczeniu podczas suszenia.</li>
		<li>Pozostaw talerze do całkowitego wyschnięcia przed nałożeniem pokrywek, zwykle 3-5 minut.</li>
		<li>Inkubować płytki przez 3 dni w temperaturze 30 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zbieranie i analiza danych
<ol>
	<li>Wyjmij płytki z inkubatora i sprawdź je wzrokowo.</li>
	<li>Rejestruj obrazy płyt za pomocą dostępnej kamery lub innego cyfrowego systemu obrazowania.</li>
	<li>Zapisz (lub uzyskaj wynik) dla każdego szczepu ostatnie stężenie miedzi, widoczny wzrost. 
	UWAGA: Komórki są w stanie łączyć się i pozostają żywotne aż do tego stężenia. Aby uzyskać spójność, zawsze używaj tej samej metody, na oko lub na podstawie obrazów z płyty, aby ocenić ostatnie żywe stężenie miedzi. Bardzo małe kolonie są czasami widoczne gołym okiem, ale nie na obrazie. Różnica między bezpośrednią inspekcją wizualną a zapisem z obrazów jest niewielka, zwykle jest to stopień w gradiencie. Ponieważ zdjęcia kolonii są często wykorzystywane w publikacjach, zaleca się ocenianie na podstawie obrazów.</li>
	<li>Połącz dane z wielu testów ACT1-CUP1 dla tego samego szczepu, aby wyciągnąć wnioski na temat tego, jak QSP wpływa na splicing. 
	UWAGA: Publikacje zwyczajowo pokazują obrazy kolonii drożdży przy stężeniu 0 mM Cu2+, ostatnim stężeniu żywej miedzi i kolejnym stężeniu, w którym kolonia padła. Dane mogą być również wyświetlane w postaci wykresu słupkowego ze słupkami błędów dla odchylenia standardowego między powtórzeniami. Dane nie muszą być znormalizowane, ale można je znormalizować, ustawiając żywotność kontroli czynnika splicingu WT na 1 i porównując wpływ wprowadzonej mutacji (mutacji).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

ACT1-CUP1 jest testem wzrostu i należy zachować ostrożność, aby upewnić się, że obserwowane różnice wzrostu można przypisać wyłącznie wadom splicingu. Wszystkie szczepy powinny być traktowane w podobny sposób przed posiewem, w tym powinny mieć podobną długość i rodzaj wzrostu oraz warunki przechowywania. W przypadku stosowania szczepów wrażliwych na temperaturę, testy ACT1-CUP1 powinny być wykonywane tylko w warunkach, w których szczepy te rosną porównywalnie do typu dzikiego. W związku z tym, w przypadku komponentu QSP,...

Spliceosom to duża, biologiczna maszyna, która katalizuje usuwanie intronów, regionów niekodujących w prekursorowym informacyjnym RNA (pre-mRNA)1,2. Charakterystyka wpływu pojedynczego punktowego mutanta w 1 z prawie 100 białek i 5 niekodujących RNA jest często niejednoznaczna podczas badania białka lub RNA w izolacji. Zmiana funkcji zmutowanego komponentu może być najlepiej oceniona in vivo w kontekście pełnego, funkcjonującego spliceosomu.
Opisany tutaj test wzrostu miedzi jest szybkim miernikiem efektywności splicingu u drożdży Saccharomyces cerevisiae lub pączkujących. Opracowany przez C.F. Lesser i C. Guthrie i opublikowany w 1993 roku, test ten łączy w sobie łatwość pracy z prostym organizmem modelowym i prostym odczytem żywotności komórek3. Żywotność koreluje z tym, jak dobrze spliceosomy w tych komórkach mogą rozpoznawać i łączyć transkrypt reporterowy.
Ten test wzrostu miedzi jest częściej nazywany testem ACT1-CUP1. Nazwa ACT1-CUP1 pochodzi od dwóch genów połączonych w celu stworzenia reportera wydajności splicingu. ACT1 to gen aktyny drożdży, który ulega silnej ekspresji i ma efektywnie splicingowany intron4,5. Cup1p to chelator miedzi, który sekwestruje miedź w komórce, aby zapobiec zakłóceniom w prawidłowych funkcjach komórkowych6,7,8. Reporter ACT1-CUP1 zawiera te geny w takiej sekwencji, że CUP1 znajduje się we właściwej ramce odczytu tylko wtedy, gdy następuje splicing intronu ACT1 przed mRNA (<silna klasa = "xfig">Figura 1). Powstałe białko fuzyjne zawiera pierwsze 21 aminokwasów aktyny i białko Cup1p o pełnej długości, które zwiększa żywotność drożdży w środowisku bogatym w miedź3. Zatem wzrost ilości splotów reportera skutkuje wyższym stężeniem Cup1p i wyższą odpornością na miedź (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). W porównaniu z innymi genami reporterowymi, CUP1 wpływa na żywotność komórek nawet na niskich poziomach, ma szeroki zakres czułości i może być używany do bezpośredniej selekcji mutacji splicingu3,6,7. Ponadto CUP1 nie jest niezbędny do standardowego wzrostu drożdży, a zatem homeostaza komórkowa nie jest zakłócona podczas przygotowania do tego testu. Uzupełnienie testów delecji lub wzrostu temperatury, ACT1-CUP1 dostarcza informacji o wpływie na splicing w optymalnych warunkach wzrostu drożdży.
Spliceosom rozpoznaje swój substrat poprzez trzy sekwencje introniczne, a mianowicie miejsce splicingu 5' (5' SS), miejsce rozgałęzienia (BS) i miejsce splicingu 3' (3' SS). Wygenerowano liczne reportery ACT1-CUP1 zawierające niezgodne sekwencje w tych miejscach. Wybór najpopularniejszych reporterów ACT1-CUP1 jest pokazany w Rysunek 1 i Tabela 1. Ponieważ spliceosom oddziałuje z każdym miejscem splicingu w unikalny sposób w różnych punktach cyklu splicingu, wytrzymałość spliceosomu można testować na różnych etapach, w oparciu o które używany jest reporter bez konsensusu. Reporterzy, którzy nie są zgodni, są nazywani na cześć zmutowanej pozycji w intronie i podstawy, do której został zmutowany. Na przykład A3c jest reporterem z mutacją w 5' SS, a konkretnie w pozycji 3 od konsensusu adenozyny do cytozyny. Ten reporter będzie silnie oddziaływał z mutacjami spliceosomów, które wpływają na selekcję i wykorzystanie 5' SS. W swoich wstępnych badaniach Lesser i Guthrie określili, które mutacje SS 5' hamowały splicing3. Później w tym samym roku, Burgess i Guthrie opublikowali niezgodne reporterzy we wszystkich trzech miejscach splicingu w badaniu przesiewowym supresorów mutacji w ATPase Prp16p9. Porównując konsensus z reporterami niejednomyślnymi, test ACT1-CUP1 był ważnym kluczem do zrozumienia wytrzymałości i selektywności spliceosomu drożdży oraz do wnioskowania o funkcji spliceosomów innych eukariontów.
Ponieważ reporterzy ACT1-CUP1 bez zgody uwrażliwiają spliceosom na dalsze perturbacje, wpływ pojedynczej mutacji czynnika splicingu można scharakteryzować poprzez reportery, na które wpływa pozytywnie lub negatywnie. Zostało to zastosowane do łączenia pytań badawczych na różne sposoby. Po pierwsze, test ACT1-CUP1 może być i był stosowany jako genetyczne badanie przesiewowe pod kątem mutacji w czynnikach splicingowych. Na przykład Prp8p, największe białko splicingowe, służy jako platforma, na której rdzeń RNA spliceosomu katalizuje reakcję splicingu. Zostało to częściowo wywnioskowane dzięki temu, w jaki sposób mutanty Prp8p poprawiły lub zmniejszyły splicing różnych reporterów ACT1-CUP110,11,12,13,14,15,16,17. Inne składniki białkowe spliceosomu zostały również zbadane przy użyciu ACT1-CUP1, w tym Hsh155p, Cwc2p, Cef1p i Ecm2p18,19,20,21,22,23,24,25. Progi energetyczne dla Prp16p i czterech innych ATPaz biorących udział w przejściu spliceosomalnym były również badane za pomocą tego testu9,26,27,28,29,30. Małe jądrowe RNA (snRNA) zostały również szeroko przebadane przy użyciu ACT1-CUP1 w celu identyfikacji sekwencji pre-mRNA, które koordynują, oraz zmian w strukturze drugorzędowej, którym ulegają snRNA podczas splicingu3,31,32,33,34,35,36,37.
Test ACT1-CUP1 wymaga szczepu drożdży, w którym wszystkie kopie genu CUP1 zostały znokautowane. Ponieważ CUP1 może mieć dużą liczbę kopii6,38, przygotowanie pełnego szczepu nokautującego może wymagać wielu rund lub obszernego badania. W rezultacie, cup1Δ szczepy drożdży były często współdzielone między laboratoriami, podobnie jak reporterzy.
Jeśli mutacje w czynniku splicingu są oceniane na podstawie kopii plazmidu, gen typu dzikiego dla tego czynnika powinien zostać wyeliminowany. Ponadto, tło drożdży powinno pozwolić na wybór co najmniej dwóch plazmidów, jednego zawierającego reporter ACT1-CUP1, historycznie na plazmidzie selekcyjnym leucyny, a drugiego zawierającego mutację lub zaburzenie w maszynerii splicingowej, która będzie badana (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Zwykle w jednym teście wiele szczepów drożdży, z których każdy zawiera perturbację splicingu zapytania (QSP) i inny reporter, przetestuje wpływ zapytania na splicing.
Zmienne niezależne w teście ACT1-CUP1 pozwalają badaczowi ocenić dotkliwość QSP. Te zmienne niezależne to stężenie miedzi i wybór wielu reporterów splicingu bez konsensusu. Po pierwsze, ponieważ szczepy drożdży są hodowane na płytkach zawierających różne stężenia miedzi (<silna klasa="xfig">Rysunek 2), ustawienie testu obejmuje wybór gradientu stosowanych stężeń. W badaniach można wykorzystać przebiegowy gradient stężenia miedzi, aby uzyskać wstępny odczyt żywotności, a następnie powtórzyć test z drobniejszym gradientem w celu zidentyfikowania subtelnych różnic w żywotności. Drugą zmienną jest szeroki zakres możliwych do przetestowania reporterów ACT1-CUP1 (Rysunek 1 i Tabela 1). Jeśli QSP wpływa na żywotność drożdży w różny sposób w obecności reportera bez konsensusu w porównaniu z typem dzikim, można wyciągnąć wniosek, że QSP wpływa na etap splicingu lub region spliceosomu ważny podczas rozpoznawania lub przetwarzania tego regionu intronu.
Zestaw narzędzi do produkcji drożdży jest obszerny, a test ACT1-CUP1 jest integralną częścią badań nad splotem. Test ACT1-CUP1 jest często wykonywany wraz z bardziej dogłębną analizą genetyczną, strukturalną i/lub biochemiczną wpływu QSP. Ponieważ te bardziej szczegółowe badania mają zazwyczaj dłuższą procedurę i/lub wyższą cenę, częstym podejściem jest najpierw badanie przesiewowe w kierunku interesujących mutantów z ACT1-CUP1.
Dostarczony tutaj jest protokół testu ACT1-CUP1, w tym przygotowanie płytki miedzianej. Test ten dostarcza naukowcom wstępnej odpowiedzi na pytanie o wpływ QSP na splicing i które regiony introniczne są najbardziej dotknięte zaburzeniami.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml sterylne probówki do mikrowirówek</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>Lub porównywalny przedmiot od innego producenta.</td></tr><tr><td>2 ml sterylne probówki do mikrowirówek</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td>Lub porównywalny produkt od innego producenta.</td></tr><tr><td>Sterylne probówki wirówkowe 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-201-332</td><td>Lub porównywalny przedmiot od innego producenta.</td></tr><tr><td>96-dołkowa mikropłytka z okrągłym dnem</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-760</td><td>Lub porównywalny produkt innego producenta.</td></tr><tr><td>190-procentowy etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-600</td><td>Lub porównywalny przedmiot od innego producenta.</td></tr><tr><td>System filtracyjny 500 ml (0,22 &mikro; m)</td> <td>CellTreat Scientific Products</td><td>229707</td><td>Lub porównywalny produkt innego producenta.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td>Każdy agar klasy molekularnej będzie działał.</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Tuttnauer</td><td>3870EA</td><td>Lub porównywalny produkt innego producenta.</td></tr><tr><td>Palnik</td><td>Bunsena Humboldt</td><td>PN6200.1</td><td>Lub porównywalny produkt innego producenta.</td></tr><tr><td>Miernik gęstości komórek</td><td>VWR</td><td>490005-906</td><td>Lub inne urządzenie spektralne, które może mierzyć absorbancję przy 595 nm.</td></tr><tr><td>Siarczan miedzi Pentahydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>LC134051</td><td>Lub porównywalny przedmiot innego producenta.</td></tr><tr><td>Cyfrowy system obrazowania</td><td>Cytiva</td><td>29399481</td><td>ImageQuant 4000 (wykorzystany na rysunku 3),&nbsp; Amersham ImageQuant 800 lub porównywalny produkt innego producenta.</td></tr><tr><td>Mieszanka rezygnacji (-Leu)</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>D9525</td><td>Użyj odpowiedniej mieszanki do rezygnacji do swojego eksperymentu. Możliwe, że będziesz używać markera składników odżywczych drożdży również do zaburzeń zapytania. W takim przypadku mieszanka odpadająca powinna być dla tego markera i Leu</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1682836</td><td>Lub porównywalnego produktu od innego producenta.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do kwantyfikacji opaski</td><td>żelowej Cytiva</td><td>29-0006-05</td><td>ImageQuant TL v8.1 (używane dla rysunku 5A) lub porównywalny produkt innego producenta.</td></tr><tr><td>Aparat ręczny</td><td>Nikon</td><td>D3500</td><td>Lub porównywalny przedmiot innego producenta.</td></tr><tr><td>Żelowe urządzenie do obrazowania w bliskiej podczerwieni</td><td>Cytiva</td><td>29238583</td><td>Amersham Typhoon NIR (użyte na rysunku 5a) lub porównywalny produkt innego producenta.</td></tr><tr><td>Zacisk laboratoryjny</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-7Q</td><td>Lub porównywalny przedmiot innego producenta.</td></tr><tr><td>Stojak i zacisk klasy laboratoryjnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-101</td><td>Lub porównywalny przedmiot od innego producenta.</td></tr><tr><td>Mieszadła magnetyczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-51</td><td>Lub porównywalny przedmiot od innego producenta.</td></tr><tr><td>Replikator sworzni</td><td>VP Scientific</td><td>VP 407AH</td><td></td></tr><tr><td>Półmikrokuwety jednorazowe</td><td>VWR</td><td>97000-590</td><td>Lub porównywalny produkt innego producenta.</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>JEIO Tech</td><td>IST-3075</td><td>Lub porównywalny produkt innego producenta.</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Biowave</td><td>80-3000-45</td><td>Lub dowolny spektrofotometr, który może zmierzyć absorbancję przy 600 nm.</td></tr><tr><td>Płyty kwadratowe</td><td>VWR</td><td>102091-156</td><td>Można również stosować płyty okrągłe, chociaż są one trudniejsze w przypadku korzystania z replikatora pinów.</td></tr><tr><td>Mieszaj płytkę</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-520-16S</td><td>Lub porównywalny produkt od innego producenta.</td></tr><tr><td>Drożdżowa baza azotowa</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>Y2025</td><td>Lub porównywalny produkt innego producenta.</td></tr></tbody></table>

testy act1-cup1 określają specyficzną dla substratu wrażliwość mutantów spliceosomalnych w pączkujących drożdżach

ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast

Mutacje wprowadzone w spliceosomie lub jego substracie znacząco przyczyniły się do naszego zrozumienia zawiłości funkcji spliceosomalnej. Niezależnie od tego, czy są one związane z chorobą, czy też są wyselekcjonowane funkcjonalnie, wiele z tych mutacji zostało przebadanych za pomocą testów wzrostu w organizmie modelowym Saccharomyces cerevisiae (drożdże). Test wzrostu miedzi specyficzny dla splicingu lub test ACT1-CUP1 zapewnia kompleksową analizę mutacji na poziomie fenotypowym. Test ACT1-CUP1 wykorzystuje reportery, które nadają tolerancję miedzi po prawidłowym łączeniu. Tak więc, w obecności miedzi, zmiany żywotności drożdży korelują ze zmianami w produkcji mRNA poprzez splicing. W typowym eksperymencie spliceosom drożdży jest poddawany próbie różnych niezgodnych reporterów splicingu i mutacji czynnika splicingu, która jest przedmiotem zainteresowania, w celu wykrycia jakiegokolwiek synergicznego lub przeciwstawnego wpływu na splicing. Tutaj podano pełny opis przygotowania płytki miedzianej, posiewu komórek drożdży i oceny danych. Opisano wybór uzupełniających się eksperymentów, podkreślając wszechstronność reporterów ACT1-CUP1. Test ACT1-CUP1 jest poręcznym narzędziem w zestawie narzędzi do splicingu dzięki bezpośredniemu odczytowi efektów mutacyjnych i możliwościom porównawczym wynikającym z dalszego stosowania w terenie.

Testy wzrostu, takie jak ACT1-CUP1, wymagają wizualnej, porównawczej oceny wielu kolonii. W tym przypadku każdy szczep hodowano przez noc do osiągnięcia stanu nasycenia, a następnie rozcieńczano do OD600 o wartości 0,5 i wysiano na 20 płytek zawierających stężenia miedzi w zakresie od 0 mM do 1,1 mM CuSO44 (Rycina 3). Zakres ten jest mniejszy niż wymieniony w protokole, co pozwoliło na pełną ocenę wpływu QSP oraz reporterów ACT1-CUP1, które zostały użyte i opisane poniż...

Test ACT1-CUP1, test wzrostu miedzi, zapewnia szybki odczyt splicingu prekursorowego informacyjnego RNA (pre-mRNA) i wpływu zmutowanych czynników splicingu na funkcję spliceosomalną. To badanie zawiera protokół i podkreśla możliwe dostosowanie, aby odpowiedzieć na interesujące nas pytanie dotyczące splingu.

Testy ACT1-CUP1 określają specyficzną dla substratu wrażliwość mutantów spliceosomalnych w pączkujących drożdżach

Mutations introduced in the spliceosome or its substrate have significantly contributed to our understanding of the intricacies of spliceosomal function. ...

Test ACT1-CUP1 może określić, czy mutacja wpływa na splicing pre-informacyjnego RNA i wskazać, który etap splicingu jest najbardziej dotknięty. Test ACT1-CUP1 łączy mutację czynnika splicingu z jego wpływem na złożony proces splicingu. Wykorzystuje prosty odczyt fenotypu wzrostu i ma szeroki zakres czułości.Efektywne wykorzystanie czasu jest ważne podczas przeprowadzania testu ACT1-CUP1. Zacznij od testu od pięciu do 10 szczepów, aby zminimalizować aberracje wzrostu wywołane stresem. Zademonstruję ten proces ja i Isabelle Marasigan, badaczka z mojego laboratorium.Na początek dodaj 790 miligramów agaru i mieszadło do każdej butelki. W dużej zlewce przygotuj pożywkę wzrostową z kropli leucyny dla wszystkich miedzianych płytek, które mają zostać wylane. Obejmuje to 265 miligramów drożdżowej zasady azotowej, 64 miligramy mieszanki dropout, minus leucyna i 34 mililitry wody dejonizowanej na każdą płytkę, która ma być nalewana.Mieszaj, aby się rozpuścić Następnie dodaj 34 mililitry roztworu pożywki wzrostowej leucyny do każdej przygotowanej 100-mililitrowej butelki i zakręć folią aluminiową. Następnie przeprowadź autoklaw w celu sterylizacji i rozpuszczenia agaru, używając zalecanego cyklu płynnego dla autoklawu. Tak szybko, jak to możliwe po autoklawowaniu, dodaj cztery mililitry 20% glukozy do każdej butelki.Następnie dopasuj etykietę probówki do etykiety butelki, aby dodać dwa mililitry rozcieńczeń siarczanu miedzi do przeznaczonej do tego butelki. Za pomocą płytki mieszającej mieszaj przez około 30 sekund i wlej lub odpipetuj 35 mililitrów do oznaczonej płytki, unikając pęcherzyków. Na szczep drożdży dodaj dziewięć mililitrów pożywki wzrostowej leucyny i jeden mililitr 20% glukozy do sterylnej, 50-mililitrowej stożkowej probówki.Za pomocą sterylnego patyczka lub końcówki pipety zbierz małą próbkę drożdży i zaszczep pożywkę. Następnie wstrząśnij wszystkimi kulturami przez noc w temperaturze 180 obr./min i 30 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 100 mikrolitrów kultury do kuwety zawierającej 900 mikrolitrów wody na szczep.Następnie zmierz gęstość optyczną za pomocą spektrofotometru i oblicz rozcieńczenie wymagane do uzyskania gęstości optycznej 0,5 w końcowej objętości dwóch mililitrów. Następnie rozcieńczyć każdy szczep do gęstości optycznej 0,5 w 10% glicerolu i ponownie zmierzyć gęstość optyczną, aby potwierdzić, że gęstość komórek mieści się w pożądanym zakresie. Po ustawieniu sterylnego miejsca pracy zapal palnik Bunsena.W przypadku 48-pinowego replikatora należy odpipetować 200 mikrolitrów każdego rozcieńczonego szczepu do oddzielnego dołka na 96-dołkowej płytce i wypełnić puste miejsca w siatce sześć na osiem 200 mikrolitrami 10% glicerolu. Następnie zanurz replikator w płytkim naczyniu z 95% etanolem i podpal w celu sterylizacji. Pozwól mu ostygnąć przez co najmniej dwie minuty po zgaśnięciu płomienia, aby uniknąć szoku cieplnego komórek.Umieść cztery talerze w pobliżu palnika i zdejmij pokrywki. Zanurz replikator w 96-dołkowej płytce i podnieś go jednym szybkim ruchem. Następnie delikatnie połóż na talerzu i lekko kołysz się w przód iw tył, aby ułatwić dobre przenoszenie.Podnieś jednym szybkim ruchem i umieść w dokładnie tej samej orientacji na 96-dołkowej płytce. Po platerowaniu płytki przesuń płynnym ruchem na bok, ale nadal w parasolu sterylizacyjnym płomienia. Pozostaw talerze do całkowitego wyschnięcia przed założeniem pokrywek, zwykle od trzech do pięciu minut.Następnie inkubuj płytki przez trzy dni w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Po wyjęciu płytek z inkubatora należy je obejrzeć. Test wzrostu wykazał, że wraz ze wzrostem stężenia miedzi, szczepy o niższym splicingu wykazują zmniejszoną konfluencję, do punktu, w którym stężenie miedzi staje się śmiertelne.Tło drożdży zawiera zaburzony gen ADE2, co powoduje, że kolonie mają różne odcienie czerwieni. A dojrzałe kolonie miały ciemnoczerwony kolor. Podczas posiewu, jeśli replikator zostanie podniesiony podczas ruchu w lewo lub w prawo, ustawiony pod kątem lub potrząśnięty nad płytką, możliwe jest utworzenie kolonii o owalnym kształcie lub mikrokolonii z małych kropelek roztworu komórkowego.Drożdże z reporterem A3c przetrwały do 0,15 milimolowej miedzi, podczas gdy komórki reporterowe typu dzikiego utrzymywały żywotność do końca badanego zakresu stężeń miedzi. Wyniki testu wykazały, że różne zasady w pozycji 57 snRNA U6 mają unikalny wpływ na spliceosom w połączeniu z mutacją 5 prime lub mutacją w miejscu rozgałęzienia. Podczas gdy U57c jest mutacją addytywną, zmniejszającą tolerancję miedzi, w połączeniu z A3c i reporterami rozgałęzienia G.W przeciwieństwie do tego, U57a zwiększa tolerancję miedzi, ponieważ sprzyja przejściu do drugiego etapu. Po zidentyfikowaniu perturbacji splicingu za pomocą ACT1-CUP1, badania mogą przejść do bardziej ilościowych metod, takich jak wydłużanie starterów i identyfikacja zakłóconych oddziaływań molekularnych za pomocą EMSA i sondowania enzymatycznego. ACT1-CUP1 był podstawowym testem, który poszerzył naszą wiedzę na temat odporności i selektywności spliceosomu drożdży.I nadal poszerza nasze zrozumienie funkcji splicyosomalnej.

act1-cup1-assays-determine-substrate-specific-sensitivities

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Opisano zestaw testów kolorymetrycznych do szybkiego rozróżniania białek, RNA, DNA i cukrów redukujących w potencjalnie heterogenicznych próbkach biomolekularnych.

Szybkie testy kolorymetryczne w celu jakościowego rozróżnienia RNA i DNA w próbkach biomolekularnych

Tutaj prezentujemy opłacalną metodę definiowania interakcji chemiczno-genetycznych w pączkujących drożdżach. Podejście to opiera się na podstawowych technikach biologii molekularnej drożdży i doskonale nadaje się do mechanistycznego badania małych i średnich zbiorów substancji chemicznych i innych środowisk pożywki.

Szybka identyfikacja chemicznych interakcji genetycznych u Saccharomyces cerevisiae

Ten artykuł opisuje test oparty na wzroście drożdży do określania wymagań genetycznych dla degradacji białek. Zademonstrowano również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży, nadającą się do western blot w celu biochemicznego potwierdzenia wymagań degradacji. Techniki te można dostosować do monitorowania degradacji różnych białek.

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Tutaj opisujemy protokół mający na celu zbadanie wpływu nieprawidłowego splicingu na lekooporność w guzach litych i nowotworach hematologicznych. W tym celu przeanalizowaliśmy profile transkryptomiczne rodzicielskich i opornych modeli in vitro za pomocą sekwencjonowania RNA i ustaliliśmy metodę opartą na qRT-PCR w celu walidacji genów kandydujących.

Wykorzystanie sekwencjonowania RNA do wykrywania nowych wariantów splicingu związanych z opornością na leki w modelach nowotworów in vitro

Rybonukleotydy są jednymi z najliczniejszych niekanonicznych nukleotydów włączonych do genomu podczas replikacji eukariotycznego jądrowego DNA. Jeśli rybonukleotydy nie zostaną prawidłowo usunięte, mogą powodować uszkodzenie DNA i mutagenezę. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia eksperymentalne, które są stosowane do oceny obfitości inkorporacji rybonukleotydów w DNA i ich skutków mutagennych.

Badanie inkorporacji rybonukleotydów: wykrywanie rybonukleotydów specyficznych dla nici w genomie drożdży i pomiar mutagenezy indukowanej rybonukleotydami

Przedstawione są tutaj cztery protokoły do konstruowania i wykorzystywania szczepów reporterowych drożdży Saccharomyces cerevisiae do badania potencjału transaktywacji ludzkiego P53, wpływu różnych mutacji związanych z rakiem, współekspresji białek oddziałujących oraz efektów określonych małych cząsteczek.

Drożdże jako podwozie do opracowywania testów funkcjonalnych do badania ludzkiego p53

Prezentujemy prosty protokół ekranu tłumiącego w drożdżach rozszczepienia. Metoda ta jest skuteczna, wolna od mutagenów i selektywna w przypadku mutacji, które często występują w pojedynczym locus genomu. Protokół jest odpowiedni do izolowania supresorów, które łagodzą defekty wzrostu w płynnej kulturze, które są spowodowane mutacją lub lekiem.

Wspomagane głębokim sekwencjonowaniem, spontaniczne badanie supresorowe w drożdżach rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe

Tutaj opisujemy wykorzystanie Grafix (Gradient Fixation), wirowania gradientu glicerolu w obecności środka sieciującego, do identyfikacji interakcji między czynnikami splicingowymi, które przejściowo wiążą się z kompleksem spliceosomów.

Wykorzystanie Grafixu do wykrywania przejściowych interakcji podkompleksów spliceosomów Saccharomyces cerevisiae

Ten protokół opisuje test reporterowy minigenu do monitorowania wpływu mutacji miejsca 5'-splicingu na splicing i rozwija supresorowe U1 snRNA w celu ratowania indukowanego mutacjami hamowania splicingu. Konstrukty reporterowe i supresorowe U1 snRNA ulegają ekspresji w komórkach HeLa, a splicing jest analizowany przez wydłużenie startera lub RT-PCR.

Test komórkowy oparty na reporterze do monitorowania wydajności splicingu

Poznaj test ACT1-CUP1 do oceny mutacji spliceosomalnych w drożdżach pączkujących. Ta metoda identyfikuje defekty splicingowe pre-mRNA i określa, który etap procesu jest najbardziej zaburzony.

Testy ACT1-CUP1 określają specyficzną dla substratu wrażliwość mutantów spliceosomalnych w pączkujących drożdżach

Przeglądaj więcej filmów