Testy ACT1-CUP1 określają specyficzną dla substratu wrażliwość mutantów spliceosomalnych w pączkujących drożdżach
30 czerwca 2022
Test ACT1-CUP1, test wzrostu miedzi, zapewnia szybki odczyt splicingu prekursorowego informacyjnego RNA (pre-mRNA) i wpływu zmutowanych czynników splicingu na funkcję spliceosomalną. To badanie zawiera protokół i podkreśla możliwe dostosowanie, aby odpowiedzieć na interesujące nas pytanie dotyczące splingu.
Test ACT1-CUP1 może określić, czy mutacja wpływa na splicing pre-informacyjnego RNA i wskazać, który etap splicingu jest najbardziej dotknięty. Test ACT1-CUP1 łączy mutację czynnika splicingu z jego wpływem na złożony proces splicingu. Wykorzystuje prosty odczyt fenotypu wzrostu i ma szeroki zakres czułości.
Efektywne wykorzystanie czasu jest ważne podczas przeprowadzania testu ACT1-CUP1. Zacznij od testu od pięciu do 10 szczepów, aby zminimalizować aberracje wzrostu wywołane stresem. Zademonstruję ten proces ja i Isabelle Marasigan, badaczka z mojego laboratorium.
Na początek dodaj 790 miligramów agaru i mieszadło do każdej butelki. W dużej zlewce przygotuj pożywkę wzrostową z kropli leucyny dla wszystkich miedzianych płytek, które mają zostać wylane. Obejmuje to 265 miligramów drożdżowej zasady azotowej, 64 miligramy mieszanki dropout, minus leucyna i 34 mililitry wody dejonizowanej na każdą płytkę, która ma być nalewana.
Mieszaj, aby się rozpuścić Następnie dodaj 34 mililitry roztworu pożywki wzrostowej leucyny do każdej przygotowanej 100-mililitrowej butelki i zakręć folią aluminiową. Następnie przeprowadź autoklaw w celu sterylizacji i rozpuszczenia agaru, używając zalecanego cyklu płynnego dla autoklawu. Tak szybko, jak to możliwe po autoklawowaniu, dodaj cztery mililitry 20% glukozy do każdej butelki.
Następnie dopasuj etykietę probówki do etykiety butelki, aby dodać dwa mililitry rozcieńczeń siarczanu miedzi do przeznaczonej do tego butelki. Za pomocą płytki mieszającej mieszaj przez około 30 sekund i wlej lub odpipetuj 35 mililitrów do oznaczonej płytki, unikając pęcherzyków. Na szczep drożdży dodaj dziewięć mililitrów pożywki wzrostowej leucyny i jeden mililitr 20% glukozy do sterylnej, 50-mililitrowej stożkowej probówki.
Za pomocą sterylnego patyczka lub końcówki pipety zbierz małą próbkę drożdży i zaszczep pożywkę. Następnie wstrząśnij wszystkimi kulturami przez noc w temperaturze 180 obr./min i 30 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 100 mikrolitrów kultury do kuwety zawierającej 900 mikrolitrów wody na szczep.
Następnie zmierz gęstość optyczną za pomocą spektrofotometru i oblicz rozcieńczenie wymagane do uzyskania gęstości optycznej 0,5 w końcowej objętości dwóch mililitrów. Następnie rozcieńczyć każdy szczep do gęstości optycznej 0,5 w 10% glicerolu i ponownie zmierzyć gęstość optyczną, aby potwierdzić, że gęstość komórek mieści się w pożądanym zakresie. Po ustawieniu sterylnego miejsca pracy zapal palnik Bunsena.
W przypadku 48-pinowego replikatora należy odpipetować 200 mikrolitrów każdego rozcieńczonego szczepu do oddzielnego dołka na 96-dołkowej płytce i wypełnić puste miejsca w siatce sześć na osiem 200 mikrolitrami 10% glicerolu. Następnie zanurz replikator w płytkim naczyniu z 95% etanolem i podpal w celu sterylizacji. Pozwól mu ostygnąć przez co najmniej dwie minuty po zgaśnięciu płomienia, aby uniknąć szoku cieplnego komórek.
Umieść cztery talerze w pobliżu palnika i zdejmij pokrywki. Zanurz replikator w 96-dołkowej płytce i podnieś go jednym szybkim ruchem. Następnie delikatnie połóż na talerzu i lekko kołysz się w przód iw tył, aby ułatwić dobre przenoszenie.
Podnieś jednym szybkim ruchem i umieść w dokładnie tej samej orientacji na 96-dołkowej płytce. Po platerowaniu płytki przesuń płynnym ruchem na bok, ale nadal w parasolu sterylizacyjnym płomienia. Pozostaw talerze do całkowitego wyschnięcia przed założeniem pokrywek, zwykle od trzech do pięciu minut.
Następnie inkubuj płytki przez trzy dni w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Po wyjęciu płytek z inkubatora należy je obejrzeć. Test wzrostu wykazał, że wraz ze wzrostem stężenia miedzi, szczepy o niższym splicingu wykazują zmniejszoną konfluencję, do punktu, w którym stężenie miedzi staje się śmiertelne.
Tło drożdży zawiera zaburzony gen ADE2, co powoduje, że kolonie mają różne odcienie czerwieni. A dojrzałe kolonie miały ciemnoczerwony kolor. Podczas posiewu, jeśli replikator zostanie podniesiony podczas ruchu w lewo lub w prawo, ustawiony pod kątem lub potrząśnięty nad płytką, możliwe jest utworzenie kolonii o owalnym kształcie lub mikrokolonii z małych kropelek roztworu komórkowego.
Drożdże z reporterem A3c przetrwały do 0,15 milimolowej miedzi, podczas gdy komórki reporterowe typu dzikiego utrzymywały żywotność do końca badanego zakresu stężeń miedzi. Wyniki testu wykazały, że różne zasady w pozycji 57 snRNA U6 mają unikalny wpływ na spliceosom w połączeniu z mutacją 5 prime lub mutacją w miejscu rozgałęzienia. Podczas gdy U57c jest mutacją addytywną, zmniejszającą tolerancję miedzi, w połączeniu z A3c i reporterami rozgałęzienia G.
W przeciwieństwie do tego, U57a zwiększa tolerancję miedzi, ponieważ sprzyja przejściu do drugiego etapu. Po zidentyfikowaniu perturbacji splicingu za pomocą ACT1-CUP1, badania mogą przejść do bardziej ilościowych metod, takich jak wydłużanie starterów i identyfikacja zakłóconych oddziaływań molekularnych za pomocą EMSA i sondowania enzymatycznego. ACT1-CUP1 był podstawowym testem, który poszerzył naszą wiedzę na temat odporności i selektywności spliceosomu drożdży.
I nadal poszerza nasze zrozumienie funkcji splicyosomalnej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Test ACT1-CUP1 jest testem wzrostu miedzi, który ocenia splicing pre-mRNA i wpływ mutacji czynników splicingowych na funkcję splejsosome. To badanie opisuje protokół testu i podkreśla jego przystosowanie do różnych pytań dotyczących splicingu.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Genetyka
- Biologia molekularna
Tło
- Test ACT1-CUP1 identyfikuje mutacje wpływające na splicing pre-mRNA.
- Daje wgląd w to, które kroki splicingu są najbardziej dotknięte przez mutacje.
- Test łączy mutacje czynników splicingowych z ich wpływem na procesy splicingu.
- Wykorzystuje odczyt fenotypu wzrostu, co sprawia, że jest wydajny i prosty.
Cel badania
- Dostarczyć szczegółowego protokołu testu ACT1-CUP1.
- Przedstawić dostosowanie testu do określonych pytań dotyczących splicingu.
- Podkreślić znaczenie minimalizowania aberracji wzrostu wywołanych stresem w projektowaniu eksperymentu.
Stosowane metody
- Wykorzystanie testu ACT1-CUP1 do oceny mutacji czynników splicingowych.
- Testowanie pięciu do dziesięciu szczepów w celu zmniejszenia zmienności wyników.
- Współpraca z badaczami na poziomie licencjackim do celów demonstracyjnych.
- Obserwacja fenotypów wzrostu jako odczyt efektywności splicingu.
Główne wyniki
- Test skutecznie identyfikuje mutacje, które zakłócają splicing pre-mRNA.
- Wyniki wskazują na konkretne kroki splicingu, które są dotknięte przez mutacje.
- Wykazano przystosowanie testu do różnych pytań badawczych.
- Zapewniono niezawodną metodę oceny wpływu czynników splicingowych.
Wnioski
- Test ACT1-CUP1 jest cennym narzędziem do badania mechanizmów splicingu.
- Dostosowanie testu pozwala na ukierunkowane pytania badawcze.
- Efektywne projektowanie eksperymentu jest kluczowe dla uzyskania dokładnych wyników.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The ACT1-CUP1 assay provides a phenotypic readout for spliceosomal function, enabling early-stage interrogation of therapeutic targets in RNA processing pathways. By linking genetic perturbations to measurable growth outcomes, it supports mechanistic de-risking of spliceosome-targeted hypotheses in discovery biology. This assay offers predictive confidence in target validation by quantifying substrate-specific sensitivities, informing portfolio triage for RNA-modulating therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating spliceosomal mutations with phenotypic sensitivity to copper, clarifying functional impact on pre-mRNA splicing.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct readout of mutational effects on splicing efficiency, supporting target confidence assessment.
- Predictive Value: Facilitates predictive confidence by identifying synergistic or antithetical interactions between spliceosomal components, informing lead identification strategies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline splicing phenotypes across mutant strains.
- Operational Value: Supports assay standardization and reproducibility via quantitative growth measurements under defined copper concentrations.
- Platform Utility: Enhances screening readiness and scalability through use of replicable yeast strains and defined reporter systems.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical validation by defining disease-relevant splicing perturbations.
- Biomarker Alignment: Enables identification of splicing-dependent phenotypic thresholds that may inform translational biomarker development.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying the impact of splicing factor mutations on substrate-specific splicing fidelity.
Pipeline & Workflow Integration
The ACT1-CUP1 assay operates within the discovery continuum, supporting hypothesis testing in Early Discovery, enabling assay readiness in Screening, and informing mechanistic de-risking prior to Lead Identification and Preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking spliceosomal mutations to phenotypic outputs via copper-sensitive growth assays.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized yeast strains, defined reporter constructs, and quantitative growth readouts across copper gradients.
- Analytics: Generates measurable dependent variables (growth confluency, survival thresholds) that enable comparison of splicing efficiency across genetic backgrounds.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by establishing disease-relevant splicing phenotypes that model substrate-specific vulnerabilities.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for splicing mechanism interrogation across multiple target classes and mutation panels.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in spliceosomal function through phenotypic correlation.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability via defined media formulations, replicator-based plating, and objective growth scoring.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of splicing defects, reducing late-stage biological risk in RNA-targeted programs.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by quantifying substrate-specific splicing sensitivities, guiding investment in spliceosome-modulating candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics, molecular cloning, and phenotypic assay execution.
- Dependent on sterile technique, autoclave access, spectrophotometry, and replicator instrumentation for consistent results.
- Necessitates cross-team standardization of strain handling, copper preparation, and incubation protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when extending to non-yeast systems or alternative reporters, as signal specificity relies on yeast splicing machinery.
- Practical limitations include assay duration (3+ days), sensitivity to environmental stressors, and dependence on correct splicing of ACT1-CUP1 reporters for valid readouts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:47
Pouring Plates for the ACT1-CUP1 Assay
2:13
ACT1-CUP1 Plate Preparation
3:26
Plating the Strains on the Copper Plates, Data Collection, and Analysis
5:09
Results: Impact of Mutant Splicing Factors on the Spliceosomal Function
6:50
Conclusion
