Zastosowanie otwartych podejść opartych na poszukiwaniach do identyfikacji glikopeptydów Acinetobacter baumannii sprzężonych z O

Protokół ten usprawnia identyfikację bakteryjnych glikop%eptydów, umożliwiając naukowcom identyfikację nowych zdarzeń glikozylacji, a także różnic w glikanach używanych do glikozylacji między szczepami. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona ekspertom niezajmującym się glikozylacją identyfikację potencjalnych zdarzeń glikozylacji w próbkach proteomu bakteryjnego. Otwarte wyszukiwanie jest ogólnie stosowanym podejściem, które może być stosowane do identyfikacji szeregu modyfikacji, nie tylko glikozylacji, i może być stosowane do dowolnej próbki proteomu.

Aby przygotować końcówki do ekstrakcji STB-RPS typu stop-and-go, użyj igły o rozmiarze 14 rozmiarów, aby wyciąć trzy krążki STB-RPS z membrany STB-RPS o średnicy 47 milimetrów kwadratowych w celu związania 50 mikrogramów peptydu. W przypadku większych ilości peptydów należy odpowiednio zwiększyć liczbę krążków. Przed użyciem końcówek do etapów SDB-RPS należy je umyć, dodając 150 mikrolitrów 100% acetonitrylu i obracając bufor przez odwirowanie lub delikatnie wywierając nacisk za pomocą strzykawki.

Następnie umyj końcówki 150 mikrolitrami 30% metanolu zawierającego 1% TFA, a następnie zrównoważ końcówki 150 mikrolitrami 90% izopropanolu zawierającego 1% TFA. Po zrównoważeniu załaduj próbki proteomu na końcówki stolika STB-RPS przez odwirowanie lub za pomocą strzykawki. Następnie umyj końcówki 150 mikrolitrami 90% izopropanolu zawierającego 1% TFA, a następnie 150 mikrolitrami 1% TFA.

Aby wymyć peptydy z końcówek stolika STB-RPS, użyj 150 mikrolitrów 5% wodorotlenku amonu i 80% acetonitrylu dodanych do jednej końcówki i zbierz wymyte próbki w osobnych probówkach, delikatnie wywierając nacisk za pomocą strzykawki. Alternatywnie, w przypadku elucji przez wirowanie, użyj 150 mikrolitrów w 5% wodorotlenku amonu w 80% acetonitrylu dodanym do wszystkich końcówek etapu i zbierz na czystej płytce. Wysuszyć eluowane peptydy przez wirowanie próżniowe w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Następnie, aby wzbogacić próbki glikopeptydu, należy przygotować końcówki do chromatografii cieczowej do obojczych jonowych oddziaływań hydrofilowych lub ZIC-HILIC. Wytnij jeden krążek C8 z membrany C8 o powierzchni 470 milimetrów kwadratowych za pomocą igły o rozmiarze 14 i zapakuj krążek w końcówkę P-200, aby uzyskać frytę. Następnie dodać około pięciu milimetrów materiału ZIC-HILIC zawieszonego w 50% acetonitrylu na frytkę, delikatnie uciskając za pomocą strzykawki.

Przed użyciem końcówek należy zrównoważyć żywicę z 20 objętościami złoża buforu elucyjnego ZIC-HILIC, pozostawiając 10 mikrolitrów objętości nad żywicą, aby upewnić się, że żywica nie wyschnie. Następnie kolejno przemyć żywicę 20 objętościami złoża buforu przygotowawczego ZIC-HILIC, a następnie 20 objętościami złoża buforu ładującego lub płuczącego ZIC-HILI. Następnie ponownie zawiesić strawione i wysuszone peptydy w buforze ładującym ZIC-HILIC do końcowego stężenia czterech mikrogramów na mikrolitr.

Wirować krótko przez jedną minutę, aby upewnić się, że próbki są ponownie zawieszone, a następnie obracać je przez jedną minutę w temperaturze 2000 razy G i 25 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu załadować zawieszoną próbkę peptydu na kondycjonowaną kolumnę ZIC-HILI, a następnie trzykrotnie umyć kolumnę 20 objętościami złoża buforu ładującego ZIC-HILIC, delikatnie wywierając nacisk za pomocą strzykawki. Na koniec wymyj glikopeptydy z 20 objętościami złoża buforu elucyjnego ZIC-HILIC do 1,5-mililitrowej probówki, delikatnie wywierając nacisk za pomocą strzykawki, a następnie wysusz eluent przez odwirowanie próżniowe w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

W przypadku analizy LC-MS należy ponownie zawiesić próbki w buforze A* do końcowego stężenia jednego mikrograma na mikrolitr, a następnie załadować próbki do HPLC-UPLC sprzężonego z MS, aby umożliwić oddzielenie i identyfikację glikopeptydów. Monitoruj wynikowe gromadzenie danych MS, upewniając się, że dane są zbierane z żądanymi parametrami. Aby przeanalizować próbki wzbogacone w proteom i glikopeptyd, otwórz FragPipe i kliknij kartę Przepływ pracy.

Z menu rozwijanego Przepływ pracy wybierz opcję Otwórz wyszukiwanie i kliknij Dodaj pliki, aby zaimportować pliki danych, które mają zostać przeszukane do FragPipe. Następnie kliknij kartę Baza danych, a następnie Pobierz, aby uruchomić menedżera pobierania do pobierania baz danych proteomu z UniProt przy użyciu numeru dostępu UniStron. W menedżerze pobierania kliknij opcję Dodaj wabiki i zanieczyszczenia, aby włączyć białka wabiące i zanieczyszczające do tej bazy danych.

Następnie kliknij kartę MSFragger, a następnie w polu Dopasowanie piku zwiększ tolerancję masy prekursora z domyślnej 500 daltonów do 2 000 daltonów, aby zidentyfikować duże modyfikacje. Kliknij kartę Uruchom, aby zdefiniować lokalizację danych wyjściowych FragPipe, a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć wyszukiwanie. Z przypisanymi glikopeptydami o wysokim poziomie ufności, zidentyfikuj powszechnie obserwowane jony związane z glikanami, aby poprawić identyfikację glikopeptydów.

Następnie kliknij kartę MSFragger i dodaj wyznaczone masy delta obserwowanych glikanów do sekcji Modyfikacje zmiennych i Przesunięcia mas z poszczególnymi masami oddzielonymi ukośnikiem. Następnie dodaj masy fragmentów tych glikanów związanych z glikanami do sekcji Glyco/Labile Mods programu MSFragger. Na koniec prześlij wszystkie dane dotyczące stwardnienia rozsianego związane z badaniami proteomicznymi do scentralizowanych repozytoriów proteomicznych, takich jak repozytoria PRIDE lub MassIVE.

Otwarte poszukiwania szczepu Acinetobacter baumannii AB307-0294 ujawniły dwie dominujące masy delta odpowiadające 648,25 i 692,28 daltonom. Wiadomo, że kapsułka ACICU składa się z jednostki tetrasacharydu K odpowiadającej przewidywanej masie 843,31 daltonu. Ta struktura kapsułki jest zgodna z najczęściej obserwowaną masą delta w obrębie ACICU.

Otwarta analiza badawcza D1279779 odkształcenia ujawniła obecność wielu mas delta zgodnych z daltonami 203,08, 794,31 i 1588,62. Korzystając z interaktywnego peptydowego adnotatora spektralnego, oceniono glikopeptydy zidentyfikowane w trzech szczepach A. baumannii, ujawniając potencjalne jony związane z glikanami. Poszukiwania skoncentrowane na glikanach doprowadziły do znacznego wzrostu całkowitej liczby dopasowań spektralnych glikopeptyd/peptyd zidentyfikowanych we wszystkich trzech szczepach A. baumannii, co odpowiada 37% wzrostowi ACICU, 117% wzrostowi AB307-0294 i 363% wzrostowi D1279779.

W przypadku poszczególnych zdarzeń stwardnienia rozsianego włączenie informacji specyficznych dla glikanów zazwyczaj zwiększa obserwowany Hyperscore, chociaż wzrost ten jest wysoce zależny od glikanów. Podczas wzbogacania ZIC-HILIC należy upewnić się, że żywica zawsze pozostaje mokra, ponieważ utrata rozpuszczalnika może zagrozić izolacji glikopeptydów. Dane dotyczące różnic w glikozylacji mogą być wykorzystane do prowadzenia badań mutagenezy lub identyfikacji klas genów odpowiedzialnych za biosyntezę glikanów.

Korzystając z otwartego przeszukiwania baz danych, zaczęliśmy charakteryzować różnorodność glikanów w różnych rodzajach bakterii. To pokazało, że glikozylacja bakteryjna jest zarówno bardziej powszechna, jak i znacznie bardziej zróżnicowana, niż kiedyś sądziliśmy.