Name: Zastosowanie otwartych podejść opartych na poszukiwaniach do identyfikacji glikopeptydów Acinetobacter baumannii sprzężonych z O (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Odkryj metodę otwartych poszukiwań do identyfikacji glikopeptydów Acinetobacter baumannii. Protokół umożliwia badaczom odkrywanie nowych zdarzeń glikozylacji i różnic w glikanach między szczepami bakterii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

N.E.S jest wspierany przez Australian Research Council Future Fellowship (FT200100270) oraz ARC Discovery Project Grant (DP210100362). Dziękujemy Zakładowi Spektrometrii Mas i Proteomiki w Melbourne Instytutu Nauk Molekularnych i Biotechnologii Bio21 za dostęp do oprzyrządowania do stwardnienia rozsianego.

UWAGA: Przygotowanie i analizę próbek bakteryjnego glikopeptydu można podzielić na cztery sekcje (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). W tym badaniu oceniono glikozylację trzech sekwencjonowanych szczepów A. baumannii (Tabela 1). Bazy danych Proteome FASTA każdego z tych szczepów są dostępne za pośrednictwem Uniprot. Patrz Tabela 2 w celu zapoznania się ze składem stosowanych w niniejszym protokole.
1. Przygotowanie próbek białek do analizy proteomicznej
<ol>
	<li>Izolacja próbek proteomu będących przedmiotem zainteresowania
	<ol>
		<li>W przypadku używania całych komórek należy upewnić się, że zostały one umyte roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) w celu usunięcia potencjalnych zanieczyszczeń białkowych obecnych w pożywce. Po umyciu należy zamrozić całe komórki i przechowywać je w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będą potrzebne.</li>
		<li>Jeśli używane są próbki frakcjonowane (takie jak preparaty membranowe), upewnij się, że użyte odczynniki nie będą zakłócać dalszej analizy chromatografii cieczowej MS (LC-MS) 50.</li>
		<li>Jeśli użyto detergentów, takich jak dodecylosiarczan sodu (SDS), Triton X-100, NP-40 lub lauroilosarkozyna, usuń te detergenty za pomocą wytrącania acetonu, metod przygotowania próbek SP351 lub komercyjnych proteomicznych kolumn czyszczących, takich jak S-traps52. Alternatywnie, niekompatybilne detergenty można zastąpić detergentem zgodnym ze stwardnieniem rozsianym lub usuwalnym, takim jak deoksycholan sodu (SDC) lub glukopiranozyd oktylu.</li>
		<li>Upewnij się, że wszystkie naczynia z tworzyw sztucznych i szkła, które mają być używane do przygotowania próbki, nie zostały sterylizowane w autoklawie. Autoklawowane wyroby szklane i tworzywa sztuczne są zazwyczaj silnie zanieczyszczone związkami o małej masie cząsteczkowej, takimi jak polimery, które są łatwo wykrywalne w stwardnieniu rozsianym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Solubilizacja próbek całokomórkowych
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić ~10 mg przemytych, zamrożonych komórek w 200 μl świeżo przygotowanego buforu do lizy deoksycholanu sodu (bufor do lizy SDC: 4% SDC w 100 mM Tris, pH 8,5). 
		UWAGA: Inhibitory proteazy można dodawać do buforu do lizy SDC w celu ograniczenia degradacji białek.</li>
		<li>Gotować próbki przez 10 minut w temperaturze 95 °C z wytrząsaniem (2000 obr./min na termomikserze), a następnie pozostawić na lodzie na 10 minut. Powtórzyć ten proces dwukrotnie, aby zapewnić efektywną lizę i rozpuszczalność próbek. 
		UWAGA: W tym momencie próbki mogą być przechowywane przez długi czas w temperaturze -80 °C. W przypadku przechowywania rozpuścić przez podgrzanie w temperaturze 95 °C przed dalszym przetwarzaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ ilościowo stężenie białka w próbce za pomocą testu białkowego kwasu bicinchoninowego (BCA)53. Przechowuj próbki na lodzie podczas wykonywania oceny ilościowej w celu ograniczenia degradacji białek. 
	UWAGA: Do całkowitej analizy proteomu 20-100 μg białka jest więcej niż wystarczające dla nano LC-MS, który zwykle wymaga mniej niż 2 μg trawienia białka na analizę. Przygotowanie nadmiaru peptydu pozwala na analizę replikacji lub dalsze frakcjonowanie, jeśli wymagane jest głębokie pokrycie proteomiczne. Do analizy opartej na wzbogacaniu glikopeptydów przy użyciu chromatografii oddziaływań hydrofilowych (HILIC) wymagane jest 100-500 μg białka.</li>
	<li>Próbki redukować i alkilować.
	<ol>
		<li>Dodać 1/10objętości 10-krotnego buforu redukcyjno-alkilacyjnego (100 mM chlorowodorku 2-karboksyetylofosfiny Tris; 400 mM 2-chloroacetamidu w 1 M Tris, pH 8,5) do próbek o końcowym stężeniu 1x i inkubować próbki w ciemności przez 30 minut w temperaturze 45 °C z wytrząsaniem przy 1 500 obr./min. 
		UWAGA: Sprawdź pH 10-krotnego buforu redukcyjnego/alkilacyjnego, aby upewnić się, że pH wynosi około 7,0-8,0 przed dodaniem do próbek, ponieważ niższe pH spowoduje wytrącanie się SDC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krótko odwiruj próbki i dodaj proteazy Trypsyna/Lys-C (~10 μL, ponownie zawieszone w 100 mM Tris, pH 8,5), aby uzyskać ostateczny stosunek proteazy do białka 1:100. Roztwory mineralne inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 1 500 obr./min (do 18 godzin). Aby zapewnić pełne trawienie białka, użyj stosunku proteazy trypsyny/Lys-C do białka 1:50 do 1:200.</li>
	<li>Trawienie hartowane przez dodanie do próbek 1,25 objętości 100% izopropanolu. Wirować próbki przez 1 minutę, aby je wymieszać i krótko je odwirować. 
	UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C w celu późniejszej obróbki.</li>
	<li>Zakwasić próbki, dodając 0,115 objętości 10% kwasu trifluorooctowego (TFA; końcowe stężenie ~1% TFA), zawirować próbki i krótko je odwirować.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie próbek proteomu
<ol>
	<li>Oczyszczanie peptydowe próbek proteomu
	<ol>
		<li>Przygotuj jedną końcówkę sulfonianu odwróconej fazy styrenydenylobenzenu (SDB-RPS) do ekstrakcji typu stop-and-go (Stage) dla każdej próbki, jak opisano wcześniej54.
		<ol>
			<li>Empirycznie, aby związać 50 μg peptydu, należy wyciąć trzy krążki SDB-RPS z membrany SDB-RPS o średnicy 47 mm2 za pomocą igły (14 G). W przypadku większych ilości peptydów należy odpowiednio zwiększyć liczbę krążków.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przed użyciem końcówek SDB-RPS należy przygotować końcówki, dodając kolejno co najmniej dziesięć objętości złoża następujących i albo obracając bufor przez kolumnę przez wirowanie (25 °C, 3 min, 500 × g), albo przepychając bufor przez kolumnę, delikatnie wywierając nacisk za pomocą strzykawki.
		<ol>
			<li>Zwilż końcówki 150 μl 100% acetonitrylu.</li>
			<li>Umyj końcówki 150 μl 30% metanolu, 1% TFA w 18,2 MΩH2O.</li>
			<li>Zrównoważyć końcówki 150 μl 90% izopropanolu, 1% TFA zrównoważonym 18,2 MΩ H2O.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Załadować próbki (zawierające 50% izopropanolu, 1% TFA) na końcówki stolika SDB-RPS przez odwirowanie (25 °C, 3 min, 500 × g) lub delikatnie naciskając za pomocą strzykawki.</li>
		<li>Umyj końcówki SDB-RPS Stage następującymi przez odwirowanie (25 °C, 3 min, 500 × g) lub delikatnie naciskając za pomocą strzykawki. 
		UWAGA: Do usunięcia zanieczyszczeń niepeptydowych można użyć dodatkowych płukań lub alternatywnych, takich jak użycie octanu etylu zamiast izopropanolu55.
		<ol>
			<li>Umyj końcówki 150 μl 90% izopropanolu, 1% TFA.</li>
			<li>Umyj końcówki 150 μl 1% TFA w 18,2 MΩH2O.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Eluować peptydy z końcówek SDB-RPS za pomocą 150 μl 5% wodorotlenku amonu w 80% acetonitrylu przez odwirowanie lub delikatne naciśnięcie za pomocą strzykawki. Próbki należy pobrać do pojedynczych probówek. 
		UWAGA: Przygotować 5% wodorotlenek amonu w 80% acetonitrylu w plastikowym pojemniku bezpośrednio przed użyciem w dygestorium.</li>
		<li>Wymyte peptydy wysuszyć przez odwirowanie próżniowe w temperaturze 25 °C. 
		UWAGA: Jeśli podejmujesz wzbogacanie HILI, 1-10% eluatów peptydowych można w tym momencie usunąć, wysuszyć i wykorzystać jako całkowitą kontrolę wejściową proteomu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzbogacanie próbek glikopeptydu
	<ol>
		<li>Przygotuj końcówki etapu chromatografii cieczowej z obojczojonową interakcją hydrofilową (ZIC-HILIC) zgodnie z wcześniejszym opisem54,56.
		<ol>
			<li>Krótko mówiąc, wyciąć jeden krążek C8 z membrany 47 mm2 C8 za pomocą igły (14 G) i umieścić krążek w końcówce P200, aby uzyskać frytę. Dodać około 5 mm materiału ZIC-HILIC, zawieszonego w 50% acetonitrylu, 50% 18,2 MΩH2O, na frytę, delikatnie dociskając strzykawką.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przed użyciem końcówek ZIC-HILIC Stage należy kondycjonować żywicę, dodając kolejno następujące i delikatnie wywierając nacisk za pomocą strzykawki. 
		UWAGA: Aby zapewnić integralność warstwy pseudo-wodnej na powierzchni żywicy ZIC-HILIC (wymaganej do wzbogacenia glikopeptydów), żywica musi zawsze pozostać mokra. Podczas mycia żywicy zawsze pozostawiaj ~10 μl rozpuszczalnika nad żywicą i upewnij się, że płyny/próbki są pipetowane bezpośrednio do tego pozostałego rozpuszczalnika.
		<ol>
			<li>Zrównoważyć żywicę z 20 objętościami złoża (200 μL) buforu elucyjnego ZIC-HILIC (0,1% TFA w 18,2 MΩ H2O).</li>
			<li>Przemyć żywicę 20 objętościami złoża (200 μL) buforu do przygotowania ZIC-HILIC (95% acetonitrylu w 18,2 MΩH2O).</li>
			<li>Przepłukać żywicę 20 objętościami złoża (200 μl) buforu załadowczo-płuczącego ZIC-HILIC (80% acetonitrylu, 1% TFA zrównoważone 18,2 MΩH2O).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zawiesić wysuszone przefermentowane próbki (z etapu 2.1.6) w buforze naładowującym/przemłuczającym ZIC-HILIC do końcowego stężenia 4 μg/μL (np. dla 200 μg peptydu zawiesić w 50 μl buforu ładującego/płuczącego ZIC-HILI). Wirować krótko przez 1 minutę, aby upewnić się, że próbki zostały ponownie zawieszone, a następnie wirować przez 1 minutę w temperaturze 2 000 × g w temperaturze 25 °C.</li>
		<li>Załadować zawieszoną próbkę peptydu do kondycjonowanej kolumny ZIC-HILI.
		<ol>
			<li>Przemyć trzykrotnie 20 objętości złoża (200 μl) buforu załadowczo-myjącego ZIC-HILIC (dla łącznie 60 prań objętościowych złoża), delikatnie uciskając za pomocą strzykawki.</li>
			<li>Eluować glikopeptydy z 20 objętościami złoża (200 μl) buforu elucyjnego ZIC-HILIC do probówki o pojemności 1,5 ml, delikatnie wywierając nacisk za pomocą strzykawki, a następnie wysuszyć eluat przez odwirowanie próżniowe w temperaturze 25 °C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. LC-MS próbek wzbogaconych w proteom/glikopeptyd
<ol>
	<li>Zawiesić próbki w buforze A* (2% acetonitrylu, 0,1% TFA) do końcowego stężenia 1 μg/μl (na przykład w przypadku 50 μg peptydu ponownie zawiesić w 50 μl buforu A*).</li>
	<li>Załadować próbki do HPLC/UPLC sprzężonego z MS, aby umożliwić oddzielenie i identyfikację glikopeptydów. 
	UWAGA: Parametry kolumny, w tym średnica wewnętrzna, długość, natężenie przepływu, rodzaj żywicy chromatograficznej i wymagane ilości iniekcji peptydów, powinny być zoptymalizowane pod kątem konfiguracji analitycznej i długości gradientu, które mają być zastosowane; Aby zapoznać się z przykładem, jak przeprowadzić optymalizację ustawień analitycznych, zobacz57.</li>
	<li>Monitoruj gromadzenie wynikowych danych MS, upewniając się, że dane są zbierane z żądanymi parametrami. 
	UWAGA: Do analizy składu wystarczające jest rozdrobnienie CID. Ze względu na dodanie glikanów do glikopeptydów, jony glikopeptydowe są zwykle obserwowane z wyższą m/z i niższą gęstością ładunku niż peptydy nieglikozylowane. Aby upewnić się, że jony te są obserwowalne, należy pozwolić na zakres masy MS1 od 400 do 2000 m/z.</li>
	<li>Fragmentacja wybranych jonów za pomocą CID, zapewniająca zbieranie jonów fragmentarycznych o niskiej zawartości m/z, które zawierają jony oksoniowe ważne dla charakterystyki glikanów. 
	UWAGA: Na fragmentację glikopeptydów za pomocą CID mają wpływ zarówno sekwencje peptydów i glikanów, jak i energia zastosowana podczas fragmentacji25,58,59. Chociaż można zastosować szereg różnych energii zderzeń, optymalną strategią fragmentacji glikopeptydów jest użycie stopniowanych energii zderzeń łączących użycie wielu energii zderzeń25,59,60.</li>
	<li>Użyj alternatywnych metod fragmentacji, jeśli są dostępne, takich jak ETD do lokalizacji miejsca lub IT-CID, aby pomóc w określeniu składu glikanów. 
	UWAGA: Żadne z tych podejść do fragmentacji nie jest niezbędne do analizy składowej, ale można je zebrać, aby umożliwić dalsze badanie interesujących nas glikopeptydów.</li>
</ol>
4. Analiza próbek wzbogaconych w proteom/glikopeptyd
<ol>
	<li>Wstępne filtrowanie plików danych w celu umożliwienia wyszukiwania w FragPipe
	<ol>
		<li>Jeśli skany ETD lub IT-CID zostały uzyskane w zestawach danych, przefiltruj te zdarzenia skanowania z plików danych przy użyciu MSConvert61 przed wyszukiwaniem za pomocą FragPipe. 
		UWAGA: W przypadku opisanych poniżej parametrów wyszukiwania otwartego wymagane są tylko dane CID typu belki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzanie otwartych wyszukiwań w FragPipe
	<ol>
		<li>Otwórz FragPipe i kliknij zakładkę Workflow. Z menu rozwijanego przepływu pracy wybierz opcję Otwórz wyszukiwanie i kliknij Dodaj pliki, aby zaimportować pliki danych, które mają być przeszukiwane do FragPipe (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
		<li>Kliknij kartę Baza danych i uruchom menedżera pobierania, klikając Pobierz. Pozwala to na pobieranie baz danych proteomu z Uniprot przy użyciu identyfikatora Uniprot Proteome ID. Kliknij opcję Dodaj wabiki i zanieczyszczenia w menedżerze pobierania, aby włączyć białka wabiące i zanieczyszczające do baz danych.</li>
		<li>Aby uzyskać bardziej rygorystyczne progi FDR, kliknij kartę Validation (Walidacja) i zmodyfikuj wartość Filter and report (Filtruj i raportuj) z 0,01 na wymaganą wartość FDR. 
		UWAGA: Domyślne ustawienia FragPipe zapewnią 1% FDR na poziomie białka.</li>
		<li>Kliknij kartę MSfragger. W polu Dopasowanie piku zwiększ tolerancję masy prekursora z domyślnej 500 Da do 2,000 Da, aby umożliwić identyfikację dużych modyfikacji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A).</li>
		<li>Kliknij zakładkę Uruchom i zdefiniuj lokalizację wyjść FragPipe. Kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć wyszukiwanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Korzystając z PSM zidentyfikowanych w zestawach danych (zawartych w danych wyjściowych psm.tsv z FragPipe), zidentyfikuj potencjalne glikany, wykreślając częstotliwość obserwowanych mas delta w zestawach danych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3). Tworzenie wykresów masy różnicowej na podstawie danych wyjściowych MSfragger przy użyciu skryptów języka R dostępnych za pośrednictwem PXD027820 przystąpienia do programu PRIDE 
	UWAGA: W tych skryptach odbywa się minimalne przetwarzanie końcowe otwartych wyników wyszukiwania, ponieważ głównym celem tych skryptów jest pomoc w wizualizacji profili masy delta. Co ważne, sama obserwacja obfitych mas delta nie jest dowodem na to, że modyfikacja jest potencjalnym glikanem, ponieważ przypisanie mas delta jako glikanów wymaga dalszej analizy odpowiadających im zdarzeń MS2.</li>
	<li>Aby umożliwić charakterystykę glikopeptydów w próbkach, należy skupić się na identyfikacji masy delta o wysokim poziomie ufności, odpowiadającej przypisaniom z wysokimi hiperwynikami.
	<ol>
		<li>Aby pomóc w ocenie widm glikopeptydów, użyj narzędzi do adnotacji peptydów, takich jak Interactive Peptide Spectral Annotator63, który umożliwia przypisanie jonów związanych z peptydami w widmach, umożliwiając ręczną identyfikację jonów związanych z glikanem (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4). 
		UWAGA: W przedstawionych tutaj zestawach danych hiperwyniki >30 są uważane za wysokie wyniki, ponieważ odpowiadają one wynikom w obrębie górnych 50% wszystkich zidentyfikowanych glikopeptydów (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mając przypisane glikopeptydy o wysokim poziomie ufności, zidentyfikuj powszechnie obserwowane jony związane z glikanami (<silna klasa="xfig">Rysunek 4), aby poprawić identyfikację glikopeptydów. 
	UWAGA: Poprzez włączenie jonów związanych z glikanem do wyszukiwań, znanych jako wyszukiwania skoncentrowane na glikanie, można poprawić jakość przypisań glikopeptydów.
	<ol>
		<li>Kliknij zakładkę MSfragger w FragPipe, włącz wyznaczone masy delta obserwowanych glikanów do sekcji Modyfikacje zmiennych i Przesunięcia masy. Dodaj te masy, wpisując wartości w sekcjach Modyfikacje zmiennych i Przesunięcia masy, oddzielając poszczególne bryły znakiem /. Dodaj masy fragmentów tych glikanów związanych z glikanami do sekcji Mody gliko/labilne w MSFragger. 
		UWAGA: Rysunek 2B przedstawia kluczowe informacje wymagane do skoncentrowanego na glikanie wyszukiwania szczepu A. baumannii AB307-0294.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prześlij wszystkie dane dotyczące stwardnienia rozsianego związane z badaniami proteomicznymi do scentralizowanych repozytoriów proteomicznych, takich jak repozytoria PRIDE lub MASSUARY. 
	UWAGA: Wszystkie dane związane z tym badaniem zostały zdeponowane w repozytorium proteomicznym PRIDE i można uzyskać do nich dostęp za pośrednictwem akcesji PRIDE: PXD027820.</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Otwarte wyszukiwanie to skuteczna i systematyczna metoda identyfikacji nieznanych modyfikacji. Podczas gdy identyfikacja nieznanych glikanów w próbkach proteomu bakteryjnego była tradycyjnie czasochłonnym i technicznie wyspecjalizowanym przedsięwzięciem, ostatnie osiągnięcia narzędzi takich jak MSfragger21,41 i Byonic31,38 umożliwiają teraz szybką i skuteczną identyfikację mas delta w celu dalszej charakt...

Glikozylacja białek, proces przyłączania węglowodanów do cząsteczek białka, jest jedną z najczęstszych modyfikacji potranslacyjnych (PTM) w przyrodzie1,2. We wszystkich dziedzinach życia rozwinął się szereg złożonych mechanizmów dedykowanych generowaniu glikoprotein, które wpływają na niezliczone funkcje komórkowe1,3,4,5. Podczas gdy glikozylacja białek zachodzi na wielu aminokwasach6,7, zdarzenia glikozylacji sprzężonej z N i O, są dwiema dominującymi formami obserwowanymi w przyrodzie. Glikozylacja sprzężona z N polega na przyłączeniu glikanów do atomu azotu reszt asparaginy (Asn), podczas gdy w glikozylacji sprzężonej z O glikany są przyłączane do atomu tlenu reszt seryny (Ser), treoniny (Thr) lub tyrozyny (Tyr)7. Pomimo podobieństw w resztach docelowych przez systemy glikozylacji, różnice w glikanach przyłączonych do białek powodują, że glikozylacja jest najbardziej zróżnicowaną chemicznie klasą PTM występującą w przyrodzie.
Chociaż systemy glikozylacji eukariotycznej posiadają różnorodność glikanów, systemy te są zazwyczaj ograniczone pod względem liczby wykorzystywanych unikalnych węglowodanów. Wynikająca z tego różnorodność wynika z tego, jak te węglowodany są ułożone w glikany8,9,10,11,12. W przeciwieństwie do tego, gatunki bakteryjne i archeonowe posiadają praktycznie nieograniczoną różnorodność glikanów ze względu na sam wachlarz unikalnych cukrów generowanych w tych systemach2,10,13,14,15,16,17. Te różnice w różnorodności glikanów obserwowane w różnych dziedzinach życia stanowią poważne wyzwanie analityczne dla charakterystyki i identyfikacji zdarzeń glikozylacji. W przypadku glikozylacji eukariotycznej zdolność do przewidywania składu glikanów ułatwiła rosnące zainteresowanie glikobiologią; Jednak to samo nie dotyczy glikozylacji bakteryjnej, która nadal jest w dużej mierze ograniczona do badań przez wyspecjalizowane laboratoria. Wraz ze wzrostem dostępności oprzyrządowania do spektrometrii mas (MS) w naukach biologicznych, podejścia oparte na stwardnieniu rozsianym są obecnie podstawową metodą analizy glikoproteomicznej.
MS stał się kwintesencją narzędzia do charakterystyki glikozylacji, z obecnie powszechnie stosowanymi metodami odgórnymi i oddolnymi do charakteryzowania glikoprotein6. Podczas gdy proteomika odgórna jest wykorzystywana do oceny globalnych wzorców glikozylacji określonych białek18,19, podejścia oddolne są stosowane, aby umożliwić specyficzną dla glikanów charakterystykę glikopeptydów, nawet z mieszanin złożonych6,20,21,22,23. Do analizy glikopeptydów generowanie informacyjnych informacji o fragmentacji jest niezbędne do scharakteryzowania zdarzeń glikozylacji24,25. Szereg podejść do fragmentacji jest obecnie rutynowo dostępnych w instrumentach, w tym dysocjacja wywołana zderzeniem oparta na rezonansowej pułapce jonowej (IT-CID), dysocjacja wywołana zderzeniem typu wiązki (CID) i dysocjacja transferu elektronów (ETD). Każde podejście ma różne mocne i słabe strony analizy glikopeptydu25,26, ze znaczącym postępem w ciągu ostatniej dekady w stosowaniu tych podejść fragmentacji do analizy glikozylacji6,20. Jednak w przypadku analizy glikozylacji bakteryjnej krytycznym ograniczeniem nie była zdolność do fragmentacji glikopeptydów, ale raczej niemożność przewidzenia potencjalnego składu glikanów w próbkach. W tych systemach nieznany charakter różnorodnych glikanów bakteryjnych ogranicza identyfikację glikopeptydów, nawet przy użyciu narzędzi wyszukiwania skoncentrowanych na glikozylacji, które są obecnie powszechne do analizy glikopeptydów eukariotycznych, takich jak O-Pair27, GlycopeptideGraphMS28 i GlycReSoft29. Aby przezwyciężyć ten problem, potrzebna jest alternatywna metoda wyszukiwania, z wykorzystaniem otwartych narzędzi wyszukiwania, które stają się potężnym podejściem do badania glikozylacji bakteryjnej30.
Otwarte wyszukiwanie, znane również jako wyszukiwanie ślepe lub wieloznaczne, pozwala na identyfikację peptydów z nieznanymi lub nieoczekiwanymi PTM-ami21,30,31,32. Otwarte wyszukiwania wykorzystują różne techniki obliczeniowe, w tym wyselekcjonowane wyszukiwanie modyfikacji, wieloetapowe przeszukiwanie baz danych lub wyszukiwanie o szerokiej tolerancji masowej33,34,35,36,37. Chociaż wyszukiwanie otwarte ma ogromny potencjał, jego zastosowanie było zazwyczaj utrudnione przez znaczne wydłużenie czasu analizy i utratę czułości wykrywania niezmodyfikowanych peptydów w porównaniu z wyszukiwaniami ograniczonymi31,32. Spadek wykrywalności niezmodyfikowanych dopasowań peptydowo-spektralnych (PSM) jest wynikiem zwiększonego odsetka fałszywie dodatnich PSM związanych z tymi technikami, co wymaga zwiększonego rygorystycznego filtrowania w celu utrzymania pożądanych wskaźników fałszywych wykryć (FDR)33,34,35,36,37. Ostatnio dostępnych jest kilka narzędzi, które znacznie poprawiają dostępność otwartego wyszukiwania, w tym Byonic31,38, Open-pFind39, ANN-SoLo40 i MSFragger21,41. Narzędzia te umożliwiają solidną identyfikację zdarzeń glikozylacji poprzez znaczne skrócenie czasu analizy i wdrożenie podejść do obsługi heterogenicznych kompozycji glikanów.
Ten artykuł przedstawia uproszczoną metodę identyfikacji bakteryjnych glikopeptydów za pomocą otwartego wyszukiwania, przy użyciu Gram-ujemnego patogenu szpitalnego, Acinetobacter baumannii, jako modelu. A. baumannii posiada konserwatywny system glikozylacji sprzężony z O, odpowiedzialny za modyfikację wielu substratów białkowych, znany jako system glikozylacji białek PglL42,43,44. Podczas gdy podobne białka są przeznaczone do glikozylacji między szczepami, system glikozylacji PglL jest bardzo zmienny ze względu na biosyntezę glikanu używanego do glikozylacji białek pochodzącego z locus kapsułki (znanego jako locus K)44,45,46. W ten sposób do substratów białkowych dodawane są różne glikany (znane również jako jednostka K), pochodzące z pojedynczych lub ograniczonych spolimeryzowanych jednostek K30,44,46. W ramach tej pracy wykorzystano otwarte narzędzie wyszukiwania, MSfragger, w oprogramowaniu FragPipe, do identyfikacji glikanów w szczepach A. baumannii. Łącząc otwarte wyszukiwanie i ręczne selekcjonowanie, można podjąć "poszukiwania skoncentrowane na glikanach" w celu dalszej poprawy identyfikacji bakteryjnych glikopeptydów. To wieloetapowe podejście do identyfikacji umożliwia identyfikację glikopeptydów bez dużego doświadczenia w charakteryzowaniu nowych zdarzeń glikozylacji.

<table><tbody><tr><td>14 G Kel-F Hub Point Style 3</td><td>Hamilton company</td><td>hanc90514</td><td></td></tr><tr><td>2-Chloroacetamid</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>C0267-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>34851-4L</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu (28%)</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>338818-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do oznaczania białek BCA A</td><td>Pierce</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do oznaczania białek BCA</td><td>B Pierce</td><td>23224</td><td></td></tr><tr><td>C8 Empore SPE</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>66882-U</td><td>Alternatywnym dostawcą materiału C8 jest Kwas powinowacy (https://www.affinisep.com/about-us/)</td></tr> <tr><td>mrówkowy</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>5.33002</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>650447-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>M/4058/17</td><td></td></tr><tr><td>SDB-RPS Empore SPE (sulfonian odwróconej fazy)</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>66886-U</td><td>Alternatywnym dostawcą dla SDB-RPS jest Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)</td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>2232000083</td><td></td></tr><tr><td>kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>302031-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek 2-karboksyetylofosfiny Tris</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>252859-500G</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina proteazy trypsyna/Lys-C</td><td>Promega</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator próżniowy</td><td>Labconco</td><td>7810040</td><td></td></tr><tr><td>materiał</td> <td>ZIC-HILICŻywicę Merck</td><td>1504580001</td><td>do stosowania w jednorazowych kolumnach SPE można uzyskać poprzez opróżnienie większej kolumny formularzowej i użycie wolnej żywicy</td></tr></tbody></table>

zastosowanie otwartych podejść opartych na poszukiwaniach do identyfikacji glikopeptydów acinetobacter baumannii sprzężonych z o

The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

Glikozylacja białek jest coraz częściej uznawana za powszechną modyfikację w organizmach bakteryjnych, przyczyniając się do fizjologii prokariotycznej i optymalnej zakaźności gatunków chorobotwórczych. Z tego powodu rośnie zainteresowanie charakteryzacją glikozylacji bakteryjnej i zapotrzebowanie na wysokoprzepustowe narzędzia analityczne do identyfikacji tych zdarzeń. Chociaż proteomika oddolna z łatwością umożliwia generowanie bogatych danych dotyczących glikopeptydów, zakres i różnorodność glikanów obserwowanych w gatunkach prokariotycznych sprawia, że identyfikacja zdarzeń glikozylacji bakteryjnej jest niezwykle trudna.
Tradycyjnie, ręczne określanie składu glikanów w zbiorach danych proteomicznych bakteryjnych sprawiało, że była to w dużej mierze analiza na zamówienie, ograniczona do ekspertów w danej dziedzinie. Ostatnio otwarte podejścia oparte na wyszukiwaniu pojawiły się jako potężna alternatywa dla identyfikacji nieznanych modyfikacji. Analizując częstotliwość unikalnych modyfikacji obserwowanych w sekwencjach peptydowych, otwarte techniki wyszukiwania pozwalają na identyfikację powszechnych glikanów przyłączonych do peptydów w złożonych próbkach. W artykule przedstawiono usprawniony proces interpretacji i analizy danych glikoproteomicznych, pokazując, w jaki sposób można wykorzystać techniki otwartego wyszukiwania do identyfikacji bakteryjnych glikopeptydów bez wcześniejszej wiedzy na temat składu glikanów.
Korzystając z tego podejścia, można szybko zidentyfikować glikopeptydy w próbkach, aby zrozumieć różnice w glikozylacji. Wykorzystując Acinetobacter baumannii jako model, podejścia te umożliwiają porównanie składu glikanów między szczepami i identyfikację nowych glikoprotein. Podsumowując, praca ta demonstruje wszechstronność technik przeszukiwania otwartych baz danych w celu identyfikacji glikozylacji bakteryjnej, dzięki czemu charakterystyka tych wysoce zróżnicowanych glikoproteomów jest łatwiejsza niż kiedykolwiek wcześniej.

Aby zilustrować użyteczność otwartego przeszukiwania (open searching) w analizie glikopeptydów bakteryjnych, oceniono różnorodność chemiczną glikanów związanych wiązaniem O w trzech szczepach A. baumannii – AB307-0294, ACICU oraz D1279779. Glikoproteomy z wiązaniem O- są wysoce zmienne pomiędzy szczepami A. baumannii, ponieważ glikany wykorzystywane do glikozylacji pochodzą z bardzo zmiennych loci kapsuły44,45,<sup c...

Otwarte wyszukiwanie umożliwia identyfikację glikopeptydów ozdobionych nieznanymi wcześniej kompozycjami glikanów. W tym artykule przedstawiono uproszczone podejście do podejmowania otwartych poszukiwań i późniejszych poszukiwań glikopeptydów skoncentrowanych na glikanie dla próbek bakteryjnych na przykładzie Acinetobacter baumannii.

Zastosowanie otwartych podejść opartych na poszukiwaniach do identyfikacji glikopeptydów Acinetobacter baumannii sprzężonych z O

Protein glycosylation is increasingly recognized as a common modification within bacterial organisms, contributing to prokaryotic physiology and optimal ...

Protokół ten usprawnia identyfikację bakteryjnych glikop%eptydów, umożliwiając naukowcom identyfikację nowych zdarzeń glikozylacji, a także różnic w glikanach używanych do glikozylacji między szczepami. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona ekspertom niezajmującym się glikozylacją identyfikację potencjalnych zdarzeń glikozylacji w próbkach proteomu bakteryjnego. Otwarte wyszukiwanie jest ogólnie stosowanym podejściem, które może być stosowane do identyfikacji szeregu modyfikacji, nie tylko glikozylacji, i może być stosowane do dowolnej próbki proteomu.Aby przygotować końcówki do ekstrakcji STB-RPS typu stop-and-go, użyj igły o rozmiarze 14 rozmiarów, aby wyciąć trzy krążki STB-RPS z membrany STB-RPS o średnicy 47 milimetrów kwadratowych w celu związania 50 mikrogramów peptydu. W przypadku większych ilości peptydów należy odpowiednio zwiększyć liczbę krążków. Przed użyciem końcówek do etapów SDB-RPS należy je umyć, dodając 150 mikrolitrów 100% acetonitrylu i obracając bufor przez odwirowanie lub delikatnie wywierając nacisk za pomocą strzykawki.Następnie umyj końcówki 150 mikrolitrami 30% metanolu zawierającego 1% TFA, a następnie zrównoważ końcówki 150 mikrolitrami 90% izopropanolu zawierającego 1% TFA. Po zrównoważeniu załaduj próbki proteomu na końcówki stolika STB-RPS przez odwirowanie lub za pomocą strzykawki. Następnie umyj końcówki 150 mikrolitrami 90% izopropanolu zawierającego 1% TFA, a następnie 150 mikrolitrami 1% TFA.Aby wymyć peptydy z końcówek stolika STB-RPS, użyj 150 mikrolitrów 5% wodorotlenku amonu i 80% acetonitrylu dodanych do jednej końcówki i zbierz wymyte próbki w osobnych probówkach, delikatnie wywierając nacisk za pomocą strzykawki. Alternatywnie, w przypadku elucji przez wirowanie, użyj 150 mikrolitrów w 5% wodorotlenku amonu w 80% acetonitrylu dodanym do wszystkich końcówek etapu i zbierz na czystej płytce. Wysuszyć eluowane peptydy przez wirowanie próżniowe w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Następnie, aby wzbogacić próbki glikopeptydu, należy przygotować końcówki do chromatografii cieczowej do obojczych jonowych oddziaływań hydrofilowych lub ZIC-HILIC. Wytnij jeden krążek C8 z membrany C8 o powierzchni 470 milimetrów kwadratowych za pomocą igły o rozmiarze 14 i zapakuj krążek w końcówkę P-200, aby uzyskać frytę. Następnie dodać około pięciu milimetrów materiału ZIC-HILIC zawieszonego w 50% acetonitrylu na frytkę, delikatnie uciskając za pomocą strzykawki.Przed użyciem końcówek należy zrównoważyć żywicę z 20 objętościami złoża buforu elucyjnego ZIC-HILIC, pozostawiając 10 mikrolitrów objętości nad żywicą, aby upewnić się, że żywica nie wyschnie. Następnie kolejno przemyć żywicę 20 objętościami złoża buforu przygotowawczego ZIC-HILIC, a następnie 20 objętościami złoża buforu ładującego lub płuczącego ZIC-HILI. Następnie ponownie zawiesić strawione i wysuszone peptydy w buforze ładującym ZIC-HILIC do końcowego stężenia czterech mikrogramów na mikrolitr.Wirować krótko przez jedną minutę, aby upewnić się, że próbki są ponownie zawieszone, a następnie obracać je przez jedną minutę w temperaturze 2000 razy G i 25 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu załadować zawieszoną próbkę peptydu na kondycjonowaną kolumnę ZIC-HILI, a następnie trzykrotnie umyć kolumnę 20 objętościami złoża buforu ładującego ZIC-HILIC, delikatnie wywierając nacisk za pomocą strzykawki. Na koniec wymyj glikopeptydy z 20 objętościami złoża buforu elucyjnego ZIC-HILIC do 1,5-mililitrowej probówki, delikatnie wywierając nacisk za pomocą strzykawki, a następnie wysusz eluent przez odwirowanie próżniowe w temperaturze 25 stopni Celsjusza.W przypadku analizy LC-MS należy ponownie zawiesić próbki w buforze A* do końcowego stężenia jednego mikrograma na mikrolitr, a następnie załadować próbki do HPLC-UPLC sprzężonego z MS, aby umożliwić oddzielenie i identyfikację glikopeptydów. Monitoruj wynikowe gromadzenie danych MS, upewniając się, że dane są zbierane z żądanymi parametrami. Aby przeanalizować próbki wzbogacone w proteom i glikopeptyd, otwórz FragPipe i kliknij kartę Przepływ pracy.Z menu rozwijanego Przepływ pracy wybierz opcję Otwórz wyszukiwanie i kliknij Dodaj pliki, aby zaimportować pliki danych, które mają zostać przeszukane do FragPipe. Następnie kliknij kartę Baza danych, a następnie Pobierz, aby uruchomić menedżera pobierania do pobierania baz danych proteomu z UniProt przy użyciu numeru dostępu UniStron. W menedżerze pobierania kliknij opcję Dodaj wabiki i zanieczyszczenia, aby włączyć białka wabiące i zanieczyszczające do tej bazy danych.Następnie kliknij kartę MSFragger, a następnie w polu Dopasowanie piku zwiększ tolerancję masy prekursora z domyślnej 500 daltonów do 2 000 daltonów, aby zidentyfikować duże modyfikacje. Kliknij kartę Uruchom, aby zdefiniować lokalizację danych wyjściowych FragPipe, a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć wyszukiwanie. Z przypisanymi glikopeptydami o wysokim poziomie ufności, zidentyfikuj powszechnie obserwowane jony związane z glikanami, aby poprawić identyfikację glikopeptydów.Następnie kliknij kartę MSFragger i dodaj wyznaczone masy delta obserwowanych glikanów do sekcji Modyfikacje zmiennych i Przesunięcia mas z poszczególnymi masami oddzielonymi ukośnikiem. Następnie dodaj masy fragmentów tych glikanów związanych z glikanami do sekcji Glyco/Labile Mods programu MSFragger. Na koniec prześlij wszystkie dane dotyczące stwardnienia rozsianego związane z badaniami proteomicznymi do scentralizowanych repozytoriów proteomicznych, takich jak repozytoria PRIDE lub MassIVE.Otwarte poszukiwania szczepu Acinetobacter baumannii AB307-0294 ujawniły dwie dominujące masy delta odpowiadające 648,25 i 692,28 daltonom. Wiadomo, że kapsułka ACICU składa się z jednostki tetrasacharydu K odpowiadającej przewidywanej masie 843,31 daltonu. Ta struktura kapsułki jest zgodna z najczęściej obserwowaną masą delta w obrębie ACICU.Otwarta analiza badawcza D1279779 odkształcenia ujawniła obecność wielu mas delta zgodnych z daltonami 203,08, 794,31 i 1588,62. Korzystając z interaktywnego peptydowego adnotatora spektralnego, oceniono glikopeptydy zidentyfikowane w trzech szczepach A. baumannii, ujawniając potencjalne jony związane z glikanami. Poszukiwania skoncentrowane na glikanach doprowadziły do znacznego wzrostu całkowitej liczby dopasowań spektralnych glikopeptyd/peptyd zidentyfikowanych we wszystkich trzech szczepach A. baumannii, co odpowiada 37% wzrostowi ACICU, 117% wzrostowi AB307-0294 i 363% wzrostowi D1279779.W przypadku poszczególnych zdarzeń stwardnienia rozsianego włączenie informacji specyficznych dla glikanów zazwyczaj zwiększa obserwowany Hyperscore, chociaż wzrost ten jest wysoce zależny od glikanów. Podczas wzbogacania ZIC-HILIC należy upewnić się, że żywica zawsze pozostaje mokra, ponieważ utrata rozpuszczalnika może zagrozić izolacji glikopeptydów. Dane dotyczące różnic w glikozylacji mogą być wykorzystane do prowadzenia badań mutagenezy lub identyfikacji klas genów odpowiedzialnych za biosyntezę glikanów.Korzystając z otwartego przeszukiwania baz danych, zaczęliśmy charakteryzować różnorodność glikanów w różnych rodzajach bakterii. To pokazało, że glikozylacja bakteryjna jest zarówno bardziej powszechna, jak i znacznie bardziej zróżnicowana, niż kiedyś sądziliśmy.

the-application-open-searching-based-approaches-for-identification

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Opisujemy metodę testową z wykorzystaniem czujnika elektrochemicznego do szybkiego wykrywania i identyfikacji bakterii. Badanie wykorzystuje macierz czujników z funkcjonalizowanymi sondami wychwytującymi w postaci oligonukleotydów DNA dla sekwencji specyficznych dla gatunku rybosomalnego RNA (rRNA). Hybrydyzacja typu kanapkowego docelowego rRNA z sondą wychwytującą oraz sondą detekcyjną w postaci oligonukleotydu DNA sprzężonego z peroksydazą chrzanową generuje mierzalny prąd amperometryczny.

Wykrywanie i identyfikacja bakterii z wykorzystaniem czujników elektrochemicznych

Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą spektrometria mas lotu (MALDI-TOF MS) oraz techniki molekularne (sekwencjonowanie genów 16S rRNA) pozwalają na identyfikację rzadkich patogenów bakteryjnych w rutynowej diagnostyce. Celem tego protokołu jest połączenie obu technik, co prowadzi do dokładniejszych i bardziej wiarygodnych danych.

Identyfikacja rzadkich patogenów bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA i MALDI-TOF MS

IDBac to open-source'owy potok bioinformatyczny oparty na spektrometrii mas, który integruje dane zarówno z nienaruszonych białek, jak i wyspecjalizowanych widm metabolitów, zebrane na materiale komórkowym zeskrobanym z kolonii bakteryjnych. Procedura ta pozwala naukowcom szybko zorganizować setki lub tysiące kolonii bakteryjnych w przypuszczalne grupy taksonomiczne i dalej je różnicować w oparciu o wyspecjalizowaną produkcję metabolitów.

Wykorzystanie potoku IDBac MALDI TOF-MS o otwartym kodzie źródłowym do analizy białek mikrobiologicznych i specjalistycznych danych metabolitowych

Bakterie Gram-ujemne wytwarzają dwie przestrzennie oddzielone błony. Błona zewnętrzna jest oddzielona od błony wewnętrznej warstwą peryplazmy i peptydoglikanu. Zdolność do wyizolowania podwójnych warstw tych drobnoustrojów miała kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich fizjologii i patogenezy.

Rozdzielenie otoczki komórkowej dla bakterii Gram-ujemnych na frakcje błony wewnętrznej i zewnętrznej z dostosowaniami technicznymi dla Acinetobacter baumannii

Ten protokół obejmuje szczegółową analizę składu peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem do ekstrakcji cech i analizy bioinformatycznej.

Półilościowa analiza peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i bioinformatyki

Tutaj prezentujemy protokół szybkiej identyfikacji białek wytwarzanych przez genomowo sekwencjonowane bakterie chorobotwórcze za pomocą tandemowej spektrometrii mas MALDI-TOF-TOF i odgórnej analizy proteomicznej za pomocą oprogramowania opracowanego przez nas. Metastabilne jony białkowe fragmentują się ze względu na działanie kwasu asparaginowego i ta specyficzność jest wykorzystywana do identyfikacji białek.

Identyfikacja białek odporności przeciwbakteryjnej w Escherichia coli za pomocą MALDI-TOF-TOF-MS/MS i odgórnej analizy proteomicznej

EUCAST opracował protokół bezpośredniego testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) dla automatycznych hodowli krwi. Jednak jego zależność od identyfikacji mikrobiologicznej opartej na spektrometrii mas można wyeliminować, stosując protokół bezpośredniego przygotowania inokulum w zautomatyzowanym systemie identyfikacji drobnoustrojów. Takie podejście może dostarczyć raporty AST w ciągu 24 godzin od pobrania próbki.

Bezpośrednia identyfikacja mikrobiologiczna przy użyciu zautomatyzowanego systemu identyfikacji drobnoustrojów w celu ułatwienia metody EUCAST RAST bez spektrometrii mas

Aby ułatwić szybkie i precyzyjne wykrywanie Acinetobacter baumannii, przedstawiamy protokół, który wykorzystuje amplifikację polimerazy rekombinazy (RPA) w połączeniu z endonukleazą LbaCas12a do identyfikacji infekcji A. baumannii.

Szybkie i swoiste wykrywanie zakażeń Acinetobacter baumannii za pomocą systemu opartego na amplifikacji polimerazy rekombinazy/Cas12a

Proponujemy protokół do identyfikacji kwasów tłuszczowych bez potrzeby ich oczyszczania. Łączy informacje o czasach retencji z widmami masowymi trzech rodzajów pochodnych kwasów tłuszczowych: estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME), pochodnych 4,4-dimetyloksazoliny (DMOX) i estrów 3-pirydylokarbinylu (pikolinylu).

Identyfikacja kwasów tłuszczowych w Bacillus cereus

Odkryj metodę otwartych poszukiwań do identyfikacji glikopeptydów Acinetobacter baumannii. Protokół umożliwia badaczom odkrywanie nowych zdarzeń glikozylacji i różnic w glikanach między szczepami bakterii.

Zastosowanie otwartych podejść opartych na poszukiwaniach do identyfikacji glikopeptydów Acinetobacter baumannii sprzężonych z O (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie otwartych podejść opartych na poszukiwaniach do identyfikacji glikopeptydów Acinetobacter baumannii sprzężonych z O

Przeglądaj więcej filmów