Ulepszony test chemotaksji do szybkiej identyfikacji chemoatraktantów ryzo bakteryjnych w wysiękach korzeniowych
25 marca 2022
Tutaj prezentujemy ulepszony protokół testu chemotaksji. Celem tego protokołu jest zmniejszenie liczby etapów i kosztów tradycyjnych metod chemotaksji bakteryjnej oraz służenie jako cenne źródło informacji o interakcjach między roślinami a mikroorganizmami.
W artykule opisano identyfikację chemoatraktantu ryzobakterii w wysiękach korzeniowych przy użyciu ulepszonego testu chemotaksji. Aktywacje korzenia implantu chemotaksji są istotne dla kolonizacji korzeni dla wzrostu roślin, promowania bakterii rhizobia i dostarczania pomocnych frakcji interakcji roślina-mikroorganizm. Do analizy chemotaksji bakteryjnej wykorzystano wiele metod.
Na przykład metoda płyty pływackiej, metoda podobna do Cappilary, mikroprzepływowe urządzenie ślizgowe. Cykl eksperymentu z zastosowaniem metody pływania na płycie był długi. Uruchomiono błąd eksperymentalny metody podobnej do Cappilary, mikroprzepływowe urządzenie ślizgowe jest drogie do eksperymentowania.
Opracowaliśmy prostą metodę szybkiej identyfikacji chemoatraktantu, który może indukować ruch chemotaktyczny bakterii stymulujących wzrost ryzosfery za pomocą sterylnych szkiełek podstawowych bez skomplikowanych kroków. Metoda ta zmniejszyła błąd liczenia płytek i skróciła cykl eksperymentu. Jeśli chodzi o identyfikację substancji chemoatraktantowej, nowa metoda może zaoszczędzić 2-3 dni, a także obniżyć koszty materiałów doświadczalnych.
Losowo rozprowadź nasiona ryżu w komorze uprawy, kultura rośnie przez tydzień i dwukrotnie dodaj sterylną wodę. Wybierz sadzonki ryżu o podobnej wielkości i posadź w 50 mililitrach płynnego podłoża Ms. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 22 stopni Celsjusza i warunkach septycznych.
Wysięki z korzenia ryżu zostaną uwolnione do podłoża Ms. Analizę spektrometrii mas metodą chromatografii cieczowej przeprowadzono przy użyciu systemu UHPLC. Przygotuj wodny roztwór chemoatraktantu, upewnij się, że jest sterylny.
Przefiltruj roztwór chemoatraktantu za pomocą filtra bakteryjnego o wielkości 0,22 mikrometra. Wodny roztwór chemoatraktantu był pojedynczą substancją otrzymaną w badaniach LCMS rozpuszczoną w wodzie. Jako przykład użyto roztworu kwasu cytrynowego.
Wszystkie czynności muszą być wykonywane z boku lampy. Zaznacz środkową pozycję szkiełka w odstępie 1 centymetra. Upewnij się, że szkiełko jest kilkakrotnie wysterylizowane na płomieniu.
W 30 mikrolitrowym roztworze chemoatraktantu po lewej stronie szkiełka upewnij się, że bakterie zostały wyhodowane do etapu logarytmicznego. Dodaj 30 mikrolitrów roztworu bakterii po prawej stronie szklanego szkiełka. Wysterylizuj pętlę zaszczepiającą kilka razy na płomieniu za pomocą pętli zaszczepiającej, aby połączyć wodny roztwór chemoatraktantu z roztworem bakterii i przechowywać go w temperaturze pokojowej przez 20 minut na czystej ławce.
Po 20 minutach odłącz przewód łączący bibułą filtracyjną. Upewnij się, że probówka wirówkowa o pojemności 1.5 mililitra jest sterylna. Zebrać wodny roztwór chemoatraktantu po lewej stronie szkiełka podstawowego.
Przenieś roztwór do sterylnej probówki wirowej o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj odpowiednią objętość barwnika z przodu komórki do odwirowanej probówki. Po 2 minutach zbierz brakujące płyny do zliczenia bakterii i obserwacji mikroskopowej za pomocą komory do liczenia krwi.
Określ liczbę przyciąganych żywych mikroorganizmów, korzystając z następującego równania. Wyższy RCI wskazuje na silną reakcję na chemoatraktant. Wyniki wykazały, że kwas cytrynowy i kwas kawowy mają najwyższe wskaźniki chemotaksji.
Wyniki nowej metody testu chemotaksji wykazały, że stężenie kwasu cytrynowego, kwasu kawowego i galaktozy w puszkach bakteryjnych było znacznie wyższe niż w grupie kontrolnej i kontroli pozytywnej. Kwas cytrynowy napisał najsilniejszą chemotaksję. Wyniki eksperymentu były zgodne z wynikami tradycyjnych metod.
Ten protokół wideo może być przedstawiony jako cenne źródło informacji na temat interakcji między roślinami a mikroorganizmami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia ulepszony protokół testu chemotaksji, mający na celu zwiększenie wydajności i opłacalności tradycyjnych metod badania chemotaksji bakterii. Opracowana metoda ułatwia identyfikację chemoatraktantów z eksudatów korzeniowych u ryzobakterii, przyczyniając się tym samym do lepszego zrozumienia interakcji między roślinami a mikroorganizmami.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Chemotaksja bakteryjna
- Interakcje roślina-mikrob
- Wydzieliny korzeniowe
Wstęp
- Tradycyjne metody oceny chemotaksji bakteryjnej są często czasochłonne i kosztowne.
- Niniejsze badanie koncentruje się na udoskonaleniu tych metod w celu rozszerzenia ich zastosowań praktycznych.
- Identyfikacja roli chemoatraktantów w interakcjach w ryzosferze ma kluczowe znaczenie dla wzrostu roślin.
Zastosowane metody
- Uproszczony protokół z wykorzystaniem sterylnych szkiełek przedmiotowych
- Badanie odpowiedzi bakteryjnych na różne chemoatraktanty
- Wykorzystanie chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrią mas do analizy
Główne wyniki
- Kwas cytrynowy i kwas kawowy zostały zidentyfikowane jako najskuteczniejsze chemoatraktanty stymulujące chemotaksję bakteryjną.
- Nowa metoda znacząco zredukowała wskaźniki błędów oraz czas trwania eksperymentu.
- Wyniki zweryfikowane w odniesieniu do metod tradycyjnych wykazały spójność i niezawodność.
Wnioski
- Badanie wprowadza cenny zasób do zrozumienia i usprawniania oddziaływań między roślinami a mikroorganizmami.
- Ten ulepszony protokół analizy może ułatwić dalsze badania w dziedzinie biotechnologii rolniczej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten ulepszony test chemotaksji umożliwia szybką i niskokosztową identyfikację związków bioaktywnych w eksudatach korzeniowych, które napędzają korzystne interakcje między roślinami a mikroorganizmami. Poprzez skrócenie ram czasowych eksperymentów i minimalizację błędów w liczeniu, metoda ta wspiera wczesną walidację celów w procesach biotechnologii rolniczej. Stanowi ona skalowalne i powtarzalne podejście do ograniczania ryzyka podczas identyfikacji wiodących cząsteczek sygnałowych bakterii ryzosferowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia funkcjonalną walidację chemoatraktantów ryzobakteryjnych jako bioaktywnych cząsteczek sygnałowych w komunikacji między rośliną a mikroorganizmami.
- Wartość operacyjna: Skraca czas analizy z dni do godzin, przyspieszając przesiewową weryfikację frakcji wysięków korzeniowych pod kątem aktywności chemotaktycznej.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na wyznaczenie ilościowych pomiarów indeksu chemotaksji (RCI) w celu uszeregowania siły działania związków w zestandaryzowanym formacie.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje sterylne szkiełka przedmiotowe oraz inokulację metodą kroplową, co umożliwia niskokosztowy, kompatybilny z wysoką przepustowością screening wodnych roztworów chemoatraktantów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy zidentyfikowane chemoatraktanty (np. kwas cytrynowy, kwas kawowy) z fenotypami kolonizacji mikrobiologicznej istotnymi dla wydajności w warunkach polowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia szybką iterację w cyklach optymalizacji związków wiodących poprzez skrócenie czasu trwania analizy o 2-3 dni w porównaniu z metodami opartymi na płytkach lub kapilarach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w procesy wczesnego etapu odkrywania, w których metabolity wysięków korzeniowych są przesiewane pod kątem aktywności w sygnalizacji mikrobiologicznej przed optymalizacją wiodących związków i opracowaniem formulacji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących chemotaksji indukowanej przez metabolity jako mechanizmu kolonizacji ryzosfery i stymulacji wzrostu.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty (liczenie bakterii za pomocą hemocytometru) w celu porównania skuteczności chemoatraktantów w różnych warunkach.
- Analityka: Generuje dane dotyczące względnego indeksu chemotaksji (RCI), co umożliwia uszeregowanie aktywności związków w celu ich priorytetyzacji.
- Badania translacyjne: Łączy identyfikację metabolitów z wynikiem funkcjonalnym, wspierając walidację składników wysięków w sygnalizacji roślina-mikrob w sposób analogiczny do walidacji biomarkerów.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Platforma może być ponownie wykorzystana dla różnych szczepów bakteryjnych i systemów roślinnych przy minimalnej rewalidacji, co wspiera standaryzację międzyprojektową.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celu poprzez redukcję wyników fałszywie dodatnich wynikających ze zmienności zliczania i błędu metodycznego.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje ocenę chemotaksji w różnych laboratoriach dzięki protokołowi z użyciem sterylnych szkiełek, minimalizując zmienność między użytkownikami.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji go/no-go w sprawie kandydatów na inokulanty mikrobiologiczne poprzez przyspieszenie mechanistycznego ograniczania ryzyka w obszarze sygnalizacji gospodarz-mikrob.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowane do ryzyka wdrażanie wiodących metabolitów lub szczepów mikrobiologicznych w oparciu o zwalidowane dane dotyczące odpowiedzi chemotaktycznej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest technika aseptyczna w celu sterylizacji szkiełek i roztworów, aby zapobiec kontaminacji.
- Metoda zależy od dostępu do narzędzi do pipetowania (pipety, pętle szczepielne) oraz mikroskopii (hemocytometr) w celu zliczania żywych komórek.
- W celu uzyskania powtarzalnych wyników niezbędna jest standaryzacja gęstości kultury bakterii (OD600 = 0.5) oraz czasu inkubacji (20 min, temp. pokojowa).
- Adaptacja do szczepów innych niż ryzobakterie może wymagać optymalizacji rozpuszczalności chemoatraktanta oraz warunków ruchliwości bakterii.
- Ograniczenie praktyczne: Metoda najlepiej nadaje się do rozpuszczalnych w wodzie chemoatraktantów o niskiej masie cząsteczkowej; związki nierozpuszczalne lub o wysokiej masie cząsteczkowej mogą wymagać alternatywnego sposobu dostarczenia.
