Name: Ulepszony test chemotaksji do szybkiej identyfikacji chemoatraktantów ryzo bakteryjnych w wysiękach korzeniowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Poznaj ulepszony test chemotaksji do identyfikacji chemoatraktantów ryzobakterii w wysiękach korzeniowych. Ta metoda skraca czas eksperymentu i zmniejsza koszty przy zachowaniu niezawodności wyników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 31870493), Kluczowe Projekty Badawczo-Rozwojowe w Heilongjiang w Chinach (GA21B007), oraz Podstawowe Opłaty Badawcze Uniwersytetów w Prowincji Heilongjiang w Chinach (Nr 135409103).

1. Materiały i sprzęt
UWAGA: Bacillus altitudinis LZP02 (CP075052) został wyizolowany na potrzeby niniejszego badania z ryzosfery ryżu w północno-wschodnich Chinach12,13.
<ol>
	<li>Hodować B. altitudinis LZP02 w pożywce Luria-Bertani (LB) (pepton, 10 g L-1; NaCl, 8 g L-1 oraz ekstrakt drożdżowy, 5 g L-1) przez 10 h. Zebrać komórki poprzez wirowanie przy 9,569 x g przez 2 min w 4 °C oraz przechowywać z 15% glicerolem w -80 °C. 
	UWAGA: Na potrzeby tego eksperymentu nasiona ryżu (Oryza sativa Longgeng 46) zostały dostarczone przez Rice Research Institute of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences.</li>
</ol>
2. Pobieranie wysięków korzeniowych
<ol>
	<li>Rozmieść losowo nasiona ryżu w komorze wzrostowej. 
	UWAGA: Nasiona ryżu wysterylizowano 30% H2O2 przez 30 min i namoczono w wodzie przez noc. Warunki były następujące: kontrolowane oświetlenie (cykl 16/8 h światła/ciemności), temperatura (22 ± 2 °C) oraz wilgotność względna (῀70%).</li>
	<li>Kultywuj nasiona ryżu przez tydzień, dodając dwukrotnie sterylną wodę.</li>
	<li>Wybierz siewki ryżu o podobnej wielkości i posadź je w 50 mL płynnej pożywki Murashige and Skoog (MS). Inkubuj przez 48 h w temperaturze 22 °C w warunkach aseptycznych. 
	UWAGA: Wydzieliny korzeni ryżu zostaną uwolnione do pożywki MS14,15,16.</li>
</ol>
3. Analiza wysięków korzeniowych przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrią mas
<ol>
	<li>Należy pobrać 100 µL próbki (pożywka MS zawierająca wysięki korzeniowe) do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mL. Dodać 20 µL rozpuszczalnika do ekstrakcji (acetonitryl-metanol-woda, 2:2:1, zawierający standard wewnętrzny). Próbkę homogenizować przy 45 Hz przez 4 min, a następnie poddać sonikacji w łaźni wodnej na lodzie przez 5 min.</li>
	<li>Cykl homogenizacji i sonikacji powtórzyć trzykrotnie. Próbkę inkubować w temperaturze -20 °C przez 1 h, a następnie odwirować przy 133 778 x g i 4 °C przez 15 min.</li>
	<li>Otrzymany naddatek przenieść do fiolek LC-MS i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy UHPLC-QE. Próbki kontroli jakości (QC) przygotować poprzez zmieszanie równych części naddatku ze wszystkich próbek. 
	UWAGA: W prezentowanym doświadczeniu objętość każdej próbki wynosiła 600 µL (sześć powtórzeń na doświadczenie).</li>
	<li>Przeprowadzić analizę LC-MS/MS przy użyciu systemu UHPLC, kolumny UPLC HSS T3 (2,1 mm x 100 mm, 1,8 µm) oraz spektrometru Q Exactive12.
	<ol>
		<li>Jako fazę ruchomą A zastosować 0,1% wodny roztwór kwasu mrówkowego oraz wodny roztwór octanu amonu 5 mmol/L, a jako fazę ruchomą B acetonitryl. Kwas mrówkowy i octan amonu zastosować odpowiednio w trybach jonizacji dodatniej i ujemnej.</li>
		<li>Gradient elucji ustawić w następujący sposób: 0 min, 1% B; 1 min, 1% B; 8 min, 99% B; 10 min, 99% B; 10,1 min, 1% B; 12 min, 1% B. Przepływ ustawić na 0,5 mL/min, a objętość iniekcji na 2 µL. 
		UWAGA: Makrocząsteczki (&gt;1 000 Daltonów) nie mogą zostać wykryte.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Test chemotaksji
<ol>
	<li>Przygotować wodny roztwór chemoatraktanta. Należy upewnić się, że jest on sterylny. Przefiltrować roztwór chemoatraktanta za pomocą filtra bakteryjnego 0,22 µm. 
	UWAGA: Wodny roztwór chemoatraktanta stanowił pojedynczą substancję otrzymaną z badań LC-MS rozpuszczoną w wodzie. Stężenie i objętość można odpowiednio dostosować w zależności od różnych badań. Jako przykład wykorzystano roztwór kwasu cytrynowego. Wszystkie czynności muszą być wykonywane w pobliżu lampy.</li>
	<li>Zaznaczyć środkową pozycję na szkiełku przedmiotowym w odstępach 1 cm. Należy upewnić się, że szkiełko przedmiotowe zostało kilka razy wysterylizowane w płomieniu.</li>
	<li>Nanieść 30 µL roztworu chemoatraktanta na lewą stronę szkiełka przedmiotowego. Upewnić się, że bakterie zostały wyhodowane do fazy logarytmicznej (2 x 108 CFU/mL) w pożywce LB. Nanieść 30 µL zawiesiny bakteryjnej na prawą stronę szkiełka przedmiotowego. 
	UWAGA: Przygotować grupę kontrolną negatywną z równą objętością sterylnej wody. Jako kontrolę pozytywną wykorzystano roztwór soli fizjologicznej (0,9% NaCI), aby wyeliminować wpływ sił międzycząsteczkowych na eksperyment.</li>
	<li>Wysterylizować pętlę szczepielniczą kilka razy w płomieniu. Za pomocą pętli szczepielniczej połączyć wodny roztwór chemoatraktanta z zawiesiną bakteryjną i pozostawić w temperaturze pokojowej przez 20 min w komorze z laminarnym przepływem powietrza. 
	UWAGA: Eksperyment musi być przeprowadzony w środowisku bez przeciągów. Czas przed przerwaniem linii połączenia należy odpowiednio dostosować dla szczepów o różnej zdolności ruchu.</li>
	<li>Po 20 min przerwać linię połączenia za pomocą papieru filtracyjnego.</li>
	<li>Upewnić się, że probówka do wirowania 1,5 mL jest sterylna. Zebrać wodny roztwór chemoatraktanta z lewej strony szkiełka przedmiotowego. Przenieść roztwór do sterylnej probówki do wirowania 1,5 mL.</li>
	<li>Dodać do probówki do wirowania odpowiednią objętość safraniny. Po 2 min zebrać wymieszane ciecze w celu zliczenia bakterii i obserwacji mikroskopowej przy użyciu komory counting chamber.</li>
</ol>
5. Analiza wyników
<ol>
	<li>Wyznacz liczbę żywotnych mikroorganizmów, które zostały zwabione, korzystając z następującego równania: 
	<img alt="Wzór obliczeniowy NBC, N/80×400×10^4×czynnik rozcieńczenia, wynik eksperymentu laboratoryjnego." src="/files/ftp_upload/63249/63249eq01v2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
	gdzie NBC: całkowita liczba komórek bakterii; N: liczba bakterii w 80 polach siatki. 
	UWAGA: Do analizy danych wykorzystano oprogramowanie do analizy statystycznej. Błąd oparto na trzech różnych powtórzeniach wartości eksperymentalnych i obliczono go za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA, a następnie analizy post-hoc Tukeya. Wartość P ≤ 0.05 uznano za istotną statystycznie.</li>
</ol>

<ol><li>Belas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%2C+flagella%2C+and+mechanosensing+of+surfaces+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria.</a> Trends in Microbiology. 22 (9), 517-527 (2014).</li>
<li>Haichar, Z., Santaella, C., Heulin, T., Achouak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+exudates+mediated+interactions+belowground%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Root exudates mediated interactions belowground.</a> Soil Biology and Biochemistry. 77 (7), 69-80 (2014).</li>
<li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+plant+root+exudates+and+their+organic+acid+components+on+chemotaxis%2C+biofilm+formation+and+colonization+by+beneficial+rhizosphere-associated+bacterial+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Soil%22%5BJournal%5D)">Effects of different plant root exudates and their organic acid components on chemotaxis, biofilm formation and colonization by beneficial rhizosphere-associated bacterial strains.</a> Plant and Soil. 374 (1-2), 689-700 (2014).</li>
<li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+transcriptomic+analysis+of+the+plant-beneficial+rhizobacterium+Bacillus+amyloliquefaciens+SQR9+during+enhanced+biofilm+formation+regulated+by+maize+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Whole transcriptomic analysis of the plant-beneficial rhizobacterium Bacillus amyloliquefaciens SQR9 during enhanced biofilm formation regulated by maize root exudates.</a> BMC Genomics. 16 (1), 685(2015).</li>
<li>Lui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+root-secreted+D-galactose+functions+as+a+chemoattractant+and+enhances+the+biofilm+formation+of+Bacillus+velezensis+SQR9+in+an+mcpa-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Induced root-secreted D-galactose functions as a chemoattractant and enhances the biofilm formation of Bacillus velezensis SQR9 in an mcpa-dependent manner.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (17), 785-797 (2020).</li>
<li>Vora, S. M., Joshi, P., Belwalkar, M., Archana, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+exudates+influence+chemotaxis+and+colonization+of+diverse+plant+growth-promoting+rhizobacteria+in+the+Cajanus+cajan+-+Zea+mays+intercropping+system%5BTitle%5D)+AND+%22Rhizosphere%22%5BJournal%5D)">Root exudates influence chemotaxis and colonization of diverse plant growth-promoting rhizobacteria in the Cajanus cajan - Zea mays intercropping system.</a> Rhizosphere. 18 (12), 100331(2021).</li>
<li>Sampedro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+halophyte+root+exudates+and+their+components+on+chemotaxis%2C+biofilm+formation+and+colonization+of+the+halophilic+bacterium+halomonas+anticariensis+FP35T%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Effects of halophyte root exudates and their components on chemotaxis, biofilm formation and colonization of the halophilic bacterium halomonas anticariensis FP35T.</a> Microorganisms. 8 (4), 575(2020).</li>
<li>Liu, X. L., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+role+amino+acid+from+sesbania+rostrata+seed+exudates+in+the+chemotaxis+response+of+Azorhizobium+caulinodans+ORS571%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">A dual role amino acid from sesbania rostrata seed exudates in the chemotaxis response of Azorhizobium caulinodans ORS571.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1134-1147 (2019).</li>
<li>Ling, N., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+role+of+organic+acids+in+watermelon+root+exudates+for+recruiting+Paenibacillus+polymyxa+SQR-21+in+the+rhizosphere%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Soil+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and role of organic acids in watermelon root exudates for recruiting Paenibacillus polymyxa SQR-21 in the rhizosphere.</a> European Journal of Soil Biology. 47 (6), 374-379 (2011).</li>
<li>Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root-secreted+malic+acid+recruits+beneficial+soil+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1547-1556 (2008).</li>
<li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+chemotaxis+on+Slipchip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Bacterial chemotaxis on Slipchip.</a> Lab on a Chip. 14 (16), 3074-3080 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+pumilus+LZP02+promotes+rice+root+growth+by+improving+carbohydrate+metabolism+and+phenylpropanoid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Bacillus pumilus LZP02 promotes rice root growth by improving carbohydrate metabolism and phenylpropanoid biosynthesis.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (10), 1222-1231 (2020).</li>
<li>Goswami, M., Deka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+novel+rhizobacteria+having+multiple+plant+growth+promoting+traits+and+antifungal+activity+against+certain+phytopathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation of a novel rhizobacteria having multiple plant growth promoting traits and antifungal activity against certain phytopathogens.</a> Microbiological Research. 240, 126516(2020).</li>
<li>Kaiira, M., Chemining'Wa, G., Ayuke, F., Baguma, Y., Nganga, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiles+of+compounds+in+root+exudates+of+rice%2C+cymbopogon%2C+desmodium%2C+mucuna+and+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+Sciences+Belgrade%22%5BJournal%5D)">Profiles of compounds in root exudates of rice, cymbopogon, desmodium, mucuna and maize.</a> Journal of Agricultural Sciences Belgrade. 64 (4), 399-412 (2019).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+rice+root+exudates+and+strain+combination+on+biofilm+formation+of+Paenibacillus+polymyxa+and+Paenibacillus+macerans%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Microbiology+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of rice root exudates and strain combination on biofilm formation of Paenibacillus polymyxa and Paenibacillus macerans.</a> African Journal of Microbiology Research. 6 (13), 3343-3347 (2012).</li>
<li>Lee, H. W., Ghimire, S. R., Shin, D. H., Lee, I. J., Kim, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelopathic+effect+of+the+root+exudates+of+K21%2C+a+potent+allelopathic+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Biology+and+Management%22%5BJournal%5D)">Allelopathic effect of the root exudates of K21, a potent allelopathic rice.</a> Weed Biology and Management. 8 (2), 85-90 (2008).</li>
<li>Belimov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizobacteria+that+produce+auxins+and+contain+1-amino-cyclopropane-1-carboxylic+acid+deaminase+decrease+amino+acid+concentrations+in+the+rhizosphere+and+improve+growth+and+yield+of+well-watered+and+water-limited+potato+%28Solanum+tuberosum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Applied+Biology%22%5BJournal%5D)">Rhizobacteria that produce auxins and contain 1-amino-cyclopropane-1-carboxylic acid deaminase decrease amino acid concentrations in the rhizosphere and improve growth and yield of well-watered and water-limited potato (Solanum tuberosum).</a> Annals of Applied Biology. 167 (1), 11-25 (2015).</li>
<li>Ankati, S., Podile, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+in+the+root+exudates+of+groundnut+change+during+interaction+with+plant+growth+promoting+rhizobacteria+in+a+strain-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Metabolites in the root exudates of groundnut change during interaction with plant growth promoting rhizobacteria in a strain-specific manner.</a> Journal of Plant Physiology. 243, 153057(2019).</li>
<li>Gordillo, F., Chavez, F., Jerez, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+and+chemotaxis+of+Pseudomonas+sp.+B4+towards+polychlorobiphenyls+and+chlorobenzoates%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">Motility and chemotaxis of Pseudomonas sp. B4 towards polychlorobiphenyls and chlorobenzoates.</a> FEMS Microbiology Ecology. 60 (2), 322-328 (2007).</li>
<li>Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+root+exudates+in+rhizosphere+interactions+with+plants+and+other+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 233-266 (2006).</li>
<li>Badri, D. V., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environment%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of root exudates.</a> Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).</li>
<li>Badri, D. V., Weir, T. L., Lelie, D., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizosphere+chemical+dialogues%3A+plant-microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotech.+Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rhizosphere chemical dialogues: plant-microbe interactions.</a> Curr Opin Biotech. Current Opinion in Biotechnology. 20 (6), 642-650 (2009).</li>
<li>Kamilova, F., Kravchenko, L. V., Shaposhnikov, A. I., Makarova, N., Lugtenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+tomato+pathogen+Fusarium+oxysporum+f.+sp.+radicis-lycopersici+and+of+the+biocontrol+bacterium+Pseudomonas+fluorescens+WCS365%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Effects of the tomato pathogen Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici and of the biocontrol bacterium Pseudomonas fluorescens WCS365.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (10), 1121-1126 (2006).</li>
<li>Kamilova, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+acids%2C+sugars%2C+and+L-tryptophane+in+exudates+of+vegetables+growing+on+stonewool+and+their+effects+on+activities+of+rhizosphere+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Organic acids, sugars, and L-tryptophane in exudates of vegetables growing on stonewool and their effects on activities of rhizosphere bacteria.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (3), 250-256 (2006).</li>
<li>Badri, D. V., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environment%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of root exudates.</a> Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).</li>
<li>Hao, W. Y., Ren, L. X., Ran, W., Shen, Q. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelopathic+effects+of+root+exudates+from+watermelon+and+rice+plants+on+Fusarium+oxysporum+f.sp.+Niveum%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Soil%22%5BJournal%5D)">Allelopathic effects of root exudates from watermelon and rice plants on Fusarium oxysporum f.sp. Niveum.</a> Plant and Soil. 336 (1-2), 485-497 (2010).</li>
<li>Hao, Z. P., Wang, Q., Christie, P., Li, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelopathic+potential+of+watermelon+tissues+and+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22Scientia+Horticulturae%22%5BJournal%5D)">Allelopathic potential of watermelon tissues and root exudates.</a> Scientia Horticulturae. 112 (3), 315-320 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Coraz więcej badań wskazuje, że interakcje roślina-bakteria zachodzą głównie w ryzosferze i mają na nie wpływ wysięki korzeniowe 20,21,22,23,24. Wysięki z korzeni roślin obejmują różnorodny wachlarz metabolitów pierwotnych, w tym kwasy fenolowe, kwasy organiczne i aminokwasy, a także bardziej złożone związki drugorzędowe 25,2...

Chemotaksja jest ważna dla kolonizacji roślinno-rozwojowej ryzobakteryjnej (PGPR) na korzeniach i dla zrozumienia interakcji roślina-mikroorganizm1. Klasa związków o niskiej masie cząsteczkowej (chemoatraktantów) w wysiękach z korzeni roślin indukuje ruch chemotaktyczny PGPR do ryzosfery2. Kwas jabłkowy, kwas cytrynowy i inne składniki wysięków korzeniowych stymulują chemotaksję szczepów Bacillus 3. Na przykład glukoza, kwas cytrynowy i kwas fumarowy w wysiękach z korzeni kukurydzy rekrutują bakterie na powierzchnię korzenia4. D-galaktoza, która pochodzi z wysięków korzeniowych, indukuje chemotaksję Bacillus velezensis SQR95. Kwasy organiczne, w tym fumaran, kwas jabłkowy i bursztynian, wpływają na chemotaksję i kolonizację różnych PGPR w systemie uprawy międzyplonowej Cajanus cajan - Zea mays6. Kwas oleanolowy w wysiękach z korzenia ryżu działa jako chemoatraktant dla szczepu FP357. Inne wysięki roślinne (w tym histydyna, arginina i asparaginian) mogą odgrywać kluczową rolę w odpowiedzi chemotaktycznej bakterii8. Wysięki roślinne działają jako sygnał do kierowania ruchem bakterii, co jest pierwszym krokiem podczas kolonizacji ryzosfery. Kolonizacja roślin przez PGPR jest procesem o ogromnym znaczeniu, ponieważ PGPR są korzystne dla gospodarza rośliny.
Do analizy bakteryjnej chemotaksji użyto wielu metod. Metoda płyty pływackiej jest jedną z metod opisanych wcześniej9. W tej metodzie płytki wykonywano z półstałym podłożem. Do płytki dodano bufor chemotaktyczny zawierający agar (1,0% m/v). Bufor jest podgrzewany, a następnie mieszany z chemoatraktantem. Następnie kroplami na środek płytki dodano 8 μl zawiesiny bakterii i umieszczono płytkę w inkubatorze w temperaturze 28 °C. Płyta była regularnie obserwowana i fotografowana. Cykl eksperymentalny metody płyty pływackiej był jednak bardzo długi. W metodzie kapilarnej10, końcówka pipety służy jako komora do przechowywania 100 μl zawiesiny bakteryjnej. Jako kapilary użyto igły do strzykawki o pojemności 1 ml. Do końcówki pipety o pojemności 100 μl włożono igłę strzykawki zawierającą chemoatraktanty o różnych gradientach stężeń. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 3 godziny wyjęto igłę strzykawki, zawartość rozcieńczono i posiano na pożywce. Nagromadzenie bakterii w strzykawce było reprezentowane przez jednostki tworzące kolonie (CFU) w płytkach. Jednak błąd eksperymentalny w powtórzeniach dla metody kapilarnej był duży. Inna metoda wykorzystywała mikroprzepływowe urządzenie SlipChip11. Krótko mówiąc, roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA) wstrzyknięto do wszystkich kanałów i usunięto za pomocą próżni. Roztwory zawierające różne chemoatraktanty (stężenie 1 mM tylko do wykrywania jakościowego), komórki bakteryjne zawieszone w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej i buforowanym fosforanem buforowanym solą fizjologiczną (kontrola ujemna) dodano odpowiednio do górnej, środkowej i dolnej mikrostudzienki. Następnie inkubację prowadzono w ciemnym środowisku w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Komórki bakteryjne zostały następnie wykryte w mikrostudzienkach. Mikroprzepływowe urządzenie SlipChip było jednak drogie. Dlatego każda z opisanych powyżej metod miała zalety i wady.
Stworzyliśmy ulepszony test chemotaksji do szybkiej identyfikacji chemoatraktantów ryzo bakteryjnych w wysiękach korzeniowych przy użyciu sterylnych szkiełek bez skomplikowanych kroków. W tym badaniu, poprzez wielokrotne porównania wyników eksperymentalnych, metoda przezwyciężyła wiele niedociągnięć tradycyjnych metod chemotaksji bakteryjnej. Metoda ta zmniejszyła błąd liczenia płytek i skróciła cykl doświadczalny. Dlatego, jeśli ta nowa metoda zostanie zastosowana do identyfikacji substancji chemoatraktantu, może zaoszczędzić 2-3 dni i obniżyć koszty materiałów eksperymentalnych.

<table><tbody><tr><td>Kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy</td><td>Pekin InnoChem Nauka & Technologia C.,Sp. z o.o.</td><td>490-79-9</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>CNW Technologies</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>CNW Technologies</td><td>631-61-8</td><td></td></tr><tr><td>Kwas kawowy</td><td>Beijing InnoChem Science & Technologia C.,Sp. z o.o.</td><td>331-39-5</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Fresco17</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Pekin InnoChem Science & Technologia C.,Sp. z o.o.</td><td>77-92-9</td><td></td></tr><tr><td>Czysta ławka</td><td>Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd.</td><td>BJ-CD</td><td></td></tr><tr><td>Kwas ferulowy</td><td>Pekin InnoChem Nauka & Technologia C.,Sp. z o.o.</td><td>1135-24-6</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>CNW Technologies</td><td>64-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Fruktoza</td><td>Pekin InnoChem Nauka & Technologia C.,Sp. z o.o.</td><td>57-48-7</td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Beijing InnoChem Nauka & Technologia C.,Sp. z o.o.</td><td>59-23-4</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Pekin InnoChem Nauka & Technologia C.,Sp. z o.o.</td><td>56-40-6</td><td></td></tr><tr><td>Młyn szlifierski</td><td>Szanghaj Jingxin Industrial Development Co., Ltd.</td><td>JXFSTPRP-24</td><td></td></tr><tr><td>Histydyna</td><td>Pekin InnoChem Nauka & Technologia C.,Sp. z o.o.</td><td>71-00-1</td><td></td></tr><tr><td>Standard wewnętrzny: 2-chloro-L-fenyloalanina</td><td>Shanghai Hengbai Biotech C., Ltd.</td><td>103616-89-3</td><td></td></tr><tr><td>Leucyna</td><td>Pekin InnoChem Nauka & Technologia C.,Sp. z o.o.</td><td>61-90-5</td><td></td></tr><tr><td>Kwas jabłkowy</td><td>Pekin InnoChem Nauka & Technologia C.,Sp. z o.o.</td><td>6915-15-7</td><td></td></tr><tr><td>Mannoza</td><td>Pekin InnoChem Nauka & Technologia C.,Sp. z o.o.</td><td>3458-28-4</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q Exactive Focus</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>CNW Technologies</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny</td><td>Olympus</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>Fenyloalanina</td><td>Pekin InnoChem Science & Technologia C.,Sp. z o.o.</td><td>63-91-2</td><td></td></tr><tr><td>Prolina</td><td>Pekin InnoChem Nauka & Technologia C.,Sp. z o.o.</td><td>147-85-3</td><td></td></tr><tr><td>Wagi</td><td>Sartorius</td><td>BSA124S-CW</td><td></td></tr><tr><td>Serine</td><td>Beijing InnoChem Science & Technologia C.,Sp. z o.o.</td><td>56-45-1</td><td></td></tr><tr><td>Treonina</td><td>Pekin InnoChem Nauka & Technologia C.,Sp. z o.o.</td><td>72-19-5</td><td></td></tr><tr><td>UHPLC</td><td>Agilent</td><td>1290 UHPLC</td><td></td></tr><tr><td>Instrument ultradźwiękowy</td><td>Shenzhen Leidebang Electronics Co., Ltd.</td><td>PS-60AL</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Walina Pekin InnoChem Nauka & Technologia C.,Sp. z o.o.</td><td>7004-03-7</td><td></td></tr></tbody></table>

ulepszony test chemotaksji do szybkiej identyfikacji chemoatraktantów ryzo bakteryjnych w wysiękach korzeniowych

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Identyfikacja chemotaksji jest bardzo ważna dla badań i zastosowania bakterii wspomagających wzrost ryzosfery. Opracowaliśmy prostą metodę szybkiej identyfikacji chemoatraktantów, które mogą indukować ruch chemotaktyczny bakterii stymulujących wzrost ryzosfery na sterylnych szkiełkach za pomocą prostych kroków. Roztwór bakterii (OD600 = 0,5) i sterylny roztwór wodny chemoatraktantu dodawano kroplami na szkiełko w odstępie 1 cm. Zastosowano pętlę inokulacyjną do połączenia wodnego roztworu chemoatraktantu z roztworem bakteryjnym. Zjeżdżalnia była przechowywana w temperaturze pokojowej przez 20 minut na czystej ławce. Na koniec pobrano wodny roztwór chemoatraktantu do zliczania bakterii i obserwacji mikroskopowej. W tym badaniu, poprzez wielokrotne porównania wyników eksperymentalnych, metoda przezwyciężyła wiele niedociągnięć tradycyjnych metod chemotaksji bakteryjnej. Metoda ta zmniejszyła błąd liczenia płytek i skróciła cykl doświadczalny. W przypadku identyfikacji substancji chemoatraktantowych ta nowa metoda może zaoszczędzić 2-3 dni w porównaniu z metodą tradycyjną. Dodatkowo metoda ta pozwala każdemu badaczowi na systematyczne przeprowadzanie eksperymentu chemotaksji bakteryjnej w ciągu 1-2 dni. Protokół można uznać za cenne źródło informacji na temat interakcji między roślinami a mikroorganizmami.

W indeksach jonów dodatnich i ujemnych wykryto odpowiednio łącznie 584 i 937 znanych metabolitów. Poprzednie badania wykazały, że chemoatraktanty to zazwyczaj kwasy organiczne, aminokwasy i węglowodany17,18.
W niniejszym badaniu do kolejnych eksperymentów wybrano 16 rodzajów chemoatraktantów zidentyfikowanych w badaniach LC-MS wydzielin ryzosfery ryżu (Tabela 1). Wykorzystując metodę płytki do pływania, przesiewaliśmy ...

Tutaj prezentujemy ulepszony protokół testu chemotaksji. Celem tego protokołu jest zmniejszenie liczby etapów i kosztów tradycyjnych metod chemotaksji bakteryjnej oraz służenie jako cenne źródło informacji o interakcjach między roślinami a mikroorganizmami.

Ulepszony test chemotaksji do szybkiej identyfikacji chemoatraktantów ryzo bakteryjnych w wysiękach korzeniowych

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

W artykule opisano identyfikację chemoatraktantu ryzobakterii w wysiękach korzeniowych przy użyciu ulepszonego testu chemotaksji. Aktywacje korzenia implantu chemotaksji są istotne dla kolonizacji korzeni dla wzrostu roślin, promowania bakterii rhizobia i dostarczania pomocnych frakcji interakcji roślina-mikroorganizm. Do analizy chemotaksji bakteryjnej wykorzystano wiele metod.Na przykład metoda płyty pływackiej, metoda podobna do Cappilary, mikroprzepływowe urządzenie ślizgowe. Cykl eksperymentu z zastosowaniem metody pływania na płycie był długi. Uruchomiono błąd eksperymentalny metody podobnej do Cappilary, mikroprzepływowe urządzenie ślizgowe jest drogie do eksperymentowania.Opracowaliśmy prostą metodę szybkiej identyfikacji chemoatraktantu, który może indukować ruch chemotaktyczny bakterii stymulujących wzrost ryzosfery za pomocą sterylnych szkiełek podstawowych bez skomplikowanych kroków. Metoda ta zmniejszyła błąd liczenia płytek i skróciła cykl eksperymentu. Jeśli chodzi o identyfikację substancji chemoatraktantowej, nowa metoda może zaoszczędzić 2-3 dni, a także obniżyć koszty materiałów doświadczalnych.Losowo rozprowadź nasiona ryżu w komorze uprawy, kultura rośnie przez tydzień i dwukrotnie dodaj sterylną wodę. Wybierz sadzonki ryżu o podobnej wielkości i posadź w 50 mililitrach płynnego podłoża Ms. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 22 stopni Celsjusza i warunkach septycznych.Wysięki z korzenia ryżu zostaną uwolnione do podłoża Ms. Analizę spektrometrii mas metodą chromatografii cieczowej przeprowadzono przy użyciu systemu UHPLC. Przygotuj wodny roztwór chemoatraktantu, upewnij się, że jest sterylny.Przefiltruj roztwór chemoatraktantu za pomocą filtra bakteryjnego o wielkości 0,22 mikrometra. Wodny roztwór chemoatraktantu był pojedynczą substancją otrzymaną w badaniach LCMS rozpuszczoną w wodzie. Jako przykład użyto roztworu kwasu cytrynowego.Wszystkie czynności muszą być wykonywane z boku lampy. Zaznacz środkową pozycję szkiełka w odstępie 1 centymetra. Upewnij się, że szkiełko jest kilkakrotnie wysterylizowane na płomieniu.W 30 mikrolitrowym roztworze chemoatraktantu po lewej stronie szkiełka upewnij się, że bakterie zostały wyhodowane do etapu logarytmicznego. Dodaj 30 mikrolitrów roztworu bakterii po prawej stronie szklanego szkiełka. Wysterylizuj pętlę zaszczepiającą kilka razy na płomieniu za pomocą pętli zaszczepiającej, aby połączyć wodny roztwór chemoatraktantu z roztworem bakterii i przechowywać go w temperaturze pokojowej przez 20 minut na czystej ławce.Po 20 minutach odłącz przewód łączący bibułą filtracyjną. Upewnij się, że probówka wirówkowa o pojemności 1.5 mililitra jest sterylna. Zebrać wodny roztwór chemoatraktantu po lewej stronie szkiełka podstawowego.Przenieś roztwór do sterylnej probówki wirowej o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj odpowiednią objętość barwnika z przodu komórki do odwirowanej probówki. Po 2 minutach zbierz brakujące płyny do zliczenia bakterii i obserwacji mikroskopowej za pomocą komory do liczenia krwi.Określ liczbę przyciąganych żywych mikroorganizmów, korzystając z następującego równania. Wyższy RCI wskazuje na silną reakcję na chemoatraktant. Wyniki wykazały, że kwas cytrynowy i kwas kawowy mają najwyższe wskaźniki chemotaksji.Wyniki nowej metody testu chemotaksji wykazały, że stężenie kwasu cytrynowego, kwasu kawowego i galaktozy w puszkach bakteryjnych było znacznie wyższe niż w grupie kontrolnej i kontroli pozytywnej. Kwas cytrynowy napisał najsilniejszą chemotaksję. Wyniki eksperymentu były zgodne z wynikami tradycyjnych metod.Ten protokół wideo może być przedstawiony jako cenne źródło informacji na temat interakcji między roślinami a mikroorganizmami.

an-improved-chemotaxis-assay-for-rapid-identification-rhizobacterial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje opracowanie urządzenia mikroprzepływowego do badania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń chemoefektorów.

Urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego oznaczania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

Ten film przedstawia chemotaksję u nicienia C. elegans i pokazuje przykładowy protokół testujący chemotaktyczną awersję do siarczanu miedzi.

C. elegans (C. elegans) Test chemotaksji: metoda testowania chemosensacji u robaków

Opisano metodę ilościowej oceny reakcji chemotaktycznej Caenorhabditis elegans. Zastosowano wskaźnik chemotaksyczny (CI) jako sposób dokładnej oceny reakcji robaków na określone cele oraz jako platformę porównawczą między odmianami i związkami interesującymi.

C. elegans Test chemotaktyksy

Wizualne testy chemotaksji są niezbędne do lepszego zrozumienia, w jaki sposób komórki eukariotyczne kontrolują kierunkową migrację komórek za pośrednictwem chemoatraktantu. W tym miejscu opisujemy szczegółowe metody dla: 1) monitorowania w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości wielu testów chemotaksji oraz 2) jednoczesnej wizualizacji gradientu chemoatraktantu i czasoprzestrzennej dynamiki zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilopodobnych komórkach HL60.

Obrazowanie chemotaksji sprzężonej z białkiem G i jej zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilowych komórkach HL60

Ten artykuł przedstawia szczegółową metodę przeprowadzania szybkiego testu chemotaksji neutrofili poprzez integrację wbudowanej izolacji neutrofili z krwi pełnej oraz testu chemotaksji na pojedynczym chipie mikroprzepływowym.

Kompleksowa metoda do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili bezpośrednio z kropli krwi

Prezentujemy konfigurację i protokół rejestracji zachowania, który umożliwia automatyczną analizę nicieni, preferencji Caenorhabditis elegans dla rozpuszczalnych związków w teście populacyjnym. W tym artykule opisano budowę komory behawioralnej, protokół testu behawioralnego i wykorzystanie oprogramowania do analizy wideo.

Zautomatyzowana analiza populacyjnego testu preferencji chemosensorycznej na podstawie populacji nicieni

Wizualizacja i pomiar wzrostu korzeni in situ jest niezwykle trudne. Przedstawiamy konfigurowalną metodę rhizobox do śledzenia rozwoju i proliferacji korzeni w czasie w odpowiedzi na wzbogacenie w składniki odżywcze. Metoda ta służy do analizy różnic genotypowych w plastyczności korzeni kukurydzy w odpowiedzi na organiczne źródło azotu.

Zoptymalizowany protokół Rhizobox do wizualizacji wzrostu korzeni i reakcji na zlokalizowane składniki odżywcze

Tutaj opisujemy hydroponiczny test wzrostu roślin, aby określić ilościowo obecność gatunków i zobrazować przestrzenne rozmieszczenie bakterii podczas początkowej kolonizacji korzeni roślin i po ich przeniesieniu do różnych środowisk wzrostu.

Monitorowanie kolonizacji i utrzymania kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w pływającym systemie hydroponicznym

Prezentowany jest tutaj protokół testu chemotaksji in situ, niedawno opracowanego urządzenia mikroprzepływowego, które umożliwia badanie zachowania mikroorganizmów bezpośrednio w środowisku.

Test chemotaksji in situ w celu zbadania zachowania mikroorganizmów w ekosystemach wodnych

W niniejszej pracy opisujemy szczegółowe metody obrazowania żywych komórek służące do badania chemotaksji. Przedstawiamy metody mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania dynamiki czasowo-przestrzennej zdarzeń sygnalizacyjnych w migrujących komórkach. Pomiar zdarzeń sygnalizacyjnych pozwala nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób sieć sygnalizacyjna GPCR umożliwia wyczuwanie gradientu chemoatraktantów i kontroluje kierunkową migrację komórek eukariotycznych.

Obrazowanie zdarzeń sygnalizacyjnych pośredniczonych przez receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), które kontrolują chemotaksję Dictyostelium discoideum

Poznaj ulepszony test chemotaksji do identyfikacji chemoatraktantów ryzobakterii w wysiękach korzeniowych. Ta metoda skraca czas eksperymentu i zmniejsza koszty przy zachowaniu niezawodności wyników.

Ulepszony test chemotaksji do szybkiej identyfikacji chemoatraktantów ryzo bakteryjnych w wysiękach korzeniowych

Przeglądaj więcej filmów