Stosowanie barwienia czerwienią alizarynową w celu wykrycia chemicznie wywołanej utraty masy kostnej u larw danio pręgowanego
28 grudnia 2021
Tutaj użyliśmy czerwonego barwienia alizaryną, aby pokazać, że ekspozycja na octan ołowiu powoduje zmianę masy kostnej u larw danio pręgowanego. Ta metoda barwienia może być dostosowana do badania utraty kości u larw danio pręgowanego wywołanej przez inne niebezpieczne substancje toksyczne.
Ta metoda może pomóc w wykryciu toksyczności kości wywołanej przez substancje chemiczne u danio pręgowanego. Barwienie utrwalonej tkanki czerwienią alizarynową generuje trwały zapis zmian w układzie kostnym, który może ułatwić porównanie kilku próbek. Technika ta może być pomocna w badaniu osteoporozy w modelu danio pręgowanego, ponieważ jedną z cech osteoporozy jest spadek masy kostnej.
Usuń losowo 10 larw danio pręgowanego z każdej grupy po dziewięciu dniach od zapłodnienia i utrwal ryby w jednym mililitrze 2% aldehydu paraform i 1X PBS przez dwie godziny. Zdekantować roztwór i umyć larwy danio pręgowanego za pomocą 100-milimolowego Tris HCL o pH 7,5 lub 10 milimolowym chlorku magnezu. W celu odbarwienia należy zdekantować roztwór i inkubować larwę przez pięć minut w serii roztworów, jak opisano w manuskrypcie.
Po końcowej inkubacji zdekantować roztwór i usunąć pigment przez wybielanie roztworem składającym się z 3% nadtlenku wodoru i 0,5% wodorotlenku potasu. Obserwuj raz na 10 minut, aż pigment zostanie całkowicie usunięty. Opłucz larwy danio pręgowanego kilka razy 25% gliceryną, 0,1% wodorotlenkiem potasu przez 10 minut, aż nie będzie pęcherzyków.
Zabarwić larwę przez namoczenie w jednym mililitrze 0,01% Alizaryny. Zdekantuj roztwór i dodaj jeden mililitr 50% gliceryny lub 0,1% wodorotlenku potasu, aby oczyścić tło. Przechowuj ryby w świeżej 50% glicerynie lub 0,1% wodorotlenku potasu do późniejszej obserwacji.
Przenoś jedną larwę na raz na szklane szkiełko, trzymając larwę w środku kropli płynu. Obserwuj larwę pod mikroskopem stereoskopowym. Włącz aparat.
Otwórz oprogramowanie i zachowaj ustawienia domyślne. Kliknij AE i wybierz odpowiedni czas naświetlania, aby uzyskać najlepszy obraz. Przechwyć wszystkie obrazy przy tych samych ustawieniach.
Zapisz obrazy w formacie dot tiff do późniejszej analizy. Kliknij dwukrotnie ikonę imageJ. Aby przeanalizować zapisane obrazy, kliknij plik, a następnie otwórz, a następnie kliknij obraz, a następnie wpisz i wybierz ośmiobitowy.
Kliknij edytuj i odwróć. Kliknij Analizuj, a następnie Skalibruj. Wybierz Nieskalibrowana średnica zewnętrzna w wyskakującym interfejsie.
Sprawdź kalibrację globalną w lewym dolnym rogu dolnego interfejsu i kliknij OK. Kliknij analizuj, ustaw skalę, a następnie usuń skalę. Sprawdź globalnie poniżej i kliknij OK.
Kliknij analizuj, a następnie ustaw pomiary. Zaznacz obszar elementu w wyskakującym interfejsie. Zaznacz poniżej limit do progu, aby zmierzyć tylko wybrany zakres, a następnie kliknij przycisk OK.
Kliknij obraz, dostosuj, a następnie próg i przesuń suwak na środku wyskakującego interfejsu. Aby wybrać odpowiedni próg, aby wybrano wszystkie obiekty docelowe do przetestowania na jednym obrazie. I kliknij ustaw.
Kliknij analizuj, a następnie zmierz, zapisz daty. Barwienie czerwienią alizaryny jest czułą i specyficzną metodą pomiaru zmian w mineralizacji kości u larw danio pręgowanego. Po dziewięciu dniach od zapłodnienia wiele kości szkieletu głowy, takich jak kości przyklinowe, wieczko, ceratobranchialne i struna grzbietowa, jest zmineralizowanych i dlatego zabarwionych na czerwono.
Natomiast struktury niekostne, takie jak otolity, wydają się brązowo-czarne. Analiza cyfrowa przeprowadzona w celu ilościowego określenia całkowitego zabarwionego obszaru wykazała znaczny spadek zabarwionego obszaru w grupach traktowanych octanem ołowiu w dawkach 10 i 20 miligramów na litr. Zmiany w mineralizacji kości wykazały zależność od dawki.
Aby uzyskać lepszy efekt barwienia i obserwację, ważne jest, aby usunąć oryginalny pigment larw danio pręgowanego i usunąć pęcherzyki po wybieleniu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym badaniu wykorzystano barwienie alizaryną czerwoną, aby wykazać, że ekspozycja na octan ołowiu prowadzi do zmian w masie kostnej u larw zebrafish. Metoda ta może być dostosowana do badania utraty kości spowodowanej przez różne toksyczne substancje niebezpieczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Toksykologia
- Biologia rozwoju
Wstęp
- Barwienie alizaryną czerwoną jest techniką stosowaną do wizualizacji struktur szkieletowych.
- Danio przebrany jest organizmem modelowym do badania rozwoju kości oraz toksyczności.
- Wiadomo, że octan ołowiu wykazuje działanie toksyczne na układy biologiczne.
- Osteoporoza charakteryzuje się zmniejszeniem masy kostnej, co można modelować u danio przebranego.
Cel badania
- Ocena wpływu octanu ołowiu na masę kostną u larw zebrafish.
- Opracowanie metody wykrywania toksyczności kostnej indukowanej przez związki chemiczne.
- Umożliwienie porównania zmian w szkielecie pomiędzy poszczególnymi okazami.
Zastosowane metody
- Barwienie alizaryną czerwienią utrwalonej tkanki danio pręgowanego.
- Utrwalanie larw danio pręgowanego w paraformaldehydzie i PBS.
- Przemywanie larw buforem Tris HCl lub chlorkiem magnezu.
- Procedury odbarwiania zgodnie z opisem w manuskrypcie.
Główne wyniki
- Ekspozycja na octan ołowiu doprowadziła do zauważalnych zmian w masie kostnej.
- Metoda barwienia zapewniła trwały zapis zmian w szkielecie.
- Wyniki potwierdzają zasadność wykorzystania danio-ostrosejana jako modelu do badania osteoporozy.
- Metodologia ta umożliwia badanie innych toksycznych substancji niebezpiecznych.
Wnioski
- Barwienie aliczeryną czerwoną jest skuteczną metodą oceny toksyczności kostnej u rybek zebrafish.
- Badanie to podkreśla potencjał rybek zebrafish w badaniach toksykologicznych.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć wiedzę na temat wpływu różnych substancji toksycznych na zdrowie kości.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia wczesne wykrywanie chemicznie indukowanej utraty masy kostnej u larw zebrafish, wspierając mechanistyczne ograniczanie ryzyka w toksykologii oraz walidację celów dla szlaków zdrowia szkieletu. Poprzez ilościowe określanie zmian w zmineralizowanej tkance za pomocą barwienia alizaryną czerwoną, zapewnia ona powtarzalny, zależny od dawki odczyt do oceny wpływu związków na mineralizację kości. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w optymalizacji wiodących kandydatów na leki oraz w przedklinicznym badaniu bezpieczeństwa związków aktywnych wobec tkanki kostnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych związanych z mineralizacją kości i integralnością szkieletu.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez zapewnienie trwałego, mierzalnego zapisu zmian szkieletowych w badanych okazach.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję portfolio poprzez wczesną identyfikację związków wykazujących zależne od dawki efekty na masę kostną na etapie odkrywania.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Dostarcza ilościowych pomiarów obszaru barwienia opartych na wartościach progowych, co pozwala na obiektywne porównanie grup badawczych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły przygotowania próbek i obrazowania, zapewniając powtarzalność i skalowalność w formatach wielodobkowych.
- Gotowość analizy: Generuje wyniki cyfrowe kompatybilne z analizą w programie ImageJ, umożliwiając wysokoprzepustowe badanie fenotypów toksyczności kości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje istotne dla ludzi reakcje szkieletu na toksykanty, wspierając dostosowanie translacyjnych biomarkerów utraty masy kostnej.
- Wartość operacyjna: Łączy etapy odkrywania i analiz przedklinicznych, dostarczając konserwatywny test mineralizacji kości oparty na organizmach kręgowców.
- Łagodzenie ryzyka: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o ocenę ryzyka dzięki wykrywaniu sygnałów utraty masy kostnej przed rozpoczęciem badań na ssakach.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w proces badawczy obejmujący etapy od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczną ocenę bezpieczeństwa, szczególnie w przypadku związków wykazujących potencjalne efekty poza celowe w obrębie układu szkieletowego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wpływu substancji chemicznych na rozwój kości i szlaki mineralizacji w modelu kręgowca.
- Przesiewy: Umożliwia standaryzację testów i ilościowe odczyty w celu wykrywania zmian w obszarze barwienia zależnych od dawki.
- Analityka: Zapewnia skalibrowane pomiary obszaru oparte na wartościach progowych, co pozwala na statystyczne porównanie mineralizacji kości w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy z ciągłością przedkliniczną poprzez modelowanie zachowanych reakcji szkieletowych na toksykanty u larw danio pręgowanego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do przesiewania różnorodnych bibliotek chemicznych pod kątem ryzyka toksyczności dla kości.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach związanych z kośćmi.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność dzięki standaryzacji etapów fiksacji, barwienia i kwantyfikacji cyfrowej.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczanie wczesnych, ilościowych sygnałów dotyczących podatności na utratę masy kostnej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez identyfikację ryzyka toksyczności szkieletowej przed poniesieniem znacznych nakładów inwestycyjnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z danio przebrzanym, histologii oraz obrazowaniu fluorescencyjnym i kolorymetrycznym.
- Zależny od stereomikroskopii i oprogramowania do analizy obrazu (np. ImageJ) w celu przeprowadzenia standaryzowanej kwantyfikacji.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji protokołów barwienia i ustawień progowych w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy rozszerzeniu badań na inne systemy modelowe lub klasy związków chemicznych poza octan ołowiu.
- Ograniczony koniecznością usuwania pigmentu i etapami klarowania tła w celu zapewnienia dokładnej detekcji sygnału.
