Name: Stosowanie barwienia czerwienią alizarynową w celu wykrycia chemicznie wywołanej utraty masy kostnej u larw danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Poznaj metodę barwienia czerwienią alizarynową do wykrywania toksyczności kostnej u larw Danio rerio. Technika ta pozwala na trwałą dokumentację zmian szkieletowych i badanie osteoporozy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81872646; 81811540034; 81573173) oraz Priorytetowy Program Rozwoju Instytucji Szkolnictwa Wyższego w Jiangsu (PAPD).

Wszystkie opisane tutaj procedury dla zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytut Opieki nad Zwierzętami Komisji Etyki Uniwersytetu Soochow.
1. Hodowla ryb i zbieranie zarodków 14
<ol>
	<li>Karm ryby trzy razy dziennie; upewnić się, że danio pręgowany jest utrzymywany w temperaturze 28,5 ± 0,5 °C w cyklu 14:10 godzin światła/ciemności.</li>
	<li>Dorosłe samce i samice należy oddzielić deskami izolacyjnymi w zbiornikach tarłowych w stosunku 2:1 samce do samic wieczorem.</li>
	<li>Następnego ranka usuń tablice izolacyjne o 9:00 i zbierz zarodki 2 godziny później.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem doświadczenia umieścić zarodki w inkubatorze biochemicznym utrzymywanym w temperaturze 28,5 °C.</li>
</ol>
2. Narażenie na działanie substancji chemicznych
<ol>
	<li>Przygotować wywar macierzysty: zważyć trójwodny octan ołowiu (5 g) i rozpuścić go w ultraczystej wodzie (50 ml), mieszając. 
	UWAGA: PbAc jest toksyczny. Nosić odpowiednie maski przeciwpyłowe, odzież ochronną i rękawice. Wykonaj eksperyment pod wyciągiem.</li>
	<li>Wybierz i losowo rozmieść zarodki danio pręgowanego na czystych płytkach 6-dołkowych (30 zarodków na studzienkę w 3 ml wody hodowlanej danio pręgowanego; patrz tabela 1, aby zapoznać się z ich składem). Traktować zarodki PbAc (0, 5, 10, 20 mg/l) od 2 do 120 godzin po zapłodnieniu (hpf). 
	UWAGA: Stężenia PbAc zostały wybrane zgodnie z eksperymentami ustalającymi zakres dawek. Wyniki wykazały, że LC50 octanu ołowiu na zarodkach danio pręgowanego wynosił 41,044 mg/l przy 120 hpf. Stąd najwyższe stężenie ustalono na połowę LC50 i szereg roztworów przygotowanych przez 2-krotne rozcieńczenie.</li>
	<li>Karm larwy dwa razy dziennie od 5 dni po zapłodnieniu (dpf). Utrzymuj zarodki danio pręgowanego w temperaturze 28,5 ± 0,5 °C w cyklu 14:10 godzin światła/ciemności.</li>
	<li>Pożywkę wolną od Pb (wodę hodowlaną danio pręgowanego) należy odświeżać co 24 godziny do godziny 9 dpf. 
	UWAGA: Po zakończeniu eksperymentów wszystkie roztwory zawierające ołów zostały przelane do wyznaczonego zbiornika na ciecz i poddane obróbce przez centrum zarządzania eksperymentem.</li>
</ol>
3. Czerwone zabarwienie alizaryny
UWAGA: Noś odpowiednie maski przeciwpyłowe, odzież ochronną i rękawice podczas całego procesu barwienia. Składy wszystkich roztworów przedstawiono w tabeli 1.
<ol>
	<li>Specjalne etapy barwienia 
	UWAGA: Proces barwienia przeprowadzono na 24-dołkowej płytce w temperaturze pokojowej. Po dodaniu każdego roztworu umieścić 24-dołkową płytkę na stole do wytrząsania ustawionym na niską prędkość.
	<ol>
		<li>Usuń losowo 10 larw danio pręgowanego z każdej grupy przy 9 dpf i utrwal ryby w 1 ml 2% paraformaldehydu/1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem na 2 godziny.</li>
		<li>Zdekantować roztwór i przemyć larwy danio pręgowanego 100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2 przez 10 minut.</li>
		<li>Zdekantować roztwór i inkubować larwy w następujących roztworach przez 5 minut każde w celu odbarwienia: bezwodny roztwór etanolu (EtOH) (80% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2, 50% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH = 7,5) i 25% EtOH / 100 mM Tris-HCl (pH = 7,5).</li>
		<li>Zdekantować roztwór, usunąć pigment przez wybielanie roztworem składającym się z 3%H2O2i 0,5% KOH i obserwować raz na 10 minut, aż pigment zostanie całkowicie usunięty.</li>
		<li>Opłucz larwy danio pręgowanego kilka razy 25% gliceryną/0,1% KOH przez 10 minut, aż nie będzie pęcherzyków. 
		UWAGA: Ważne jest, aby unikać pęcherzyków; W przeciwnym razie pęcherzyki w ciele danio pręgowanego pojawią się pod mikroskopem jako czarne pole widzenia, co wpłynie na obserwacje i analizę ilościową.</li>
		<li>Zabarwić larwy, mocząc je w 1 ml 0,01% alizaryny przez 50 minut.</li>
		<li>Zdekantuj roztwór i dodaj 1 ml 50% gliceryny/0,1% KOH przez 10 minut, aby oczyścić tło. Przechowuj ryby w świeżej 50% glicerynie/0,1% KOH do późniejszej obserwacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Za każdym razem przenoś jedną larwę na szkiełko podstawowe, trzymając larwę w środku kropli płynu.</li>
	<li>Obserwuj larwy pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Włącz aparat, otwórz oprogramowanie (patrz Spis materiałów) i zachowaj ustawienia domyślne.</li>
	<li>Kliknij AE i wybierz odpowiedni czas naświetlania (60 ms w tym eksperymencie), aby uzyskać najlepszy obraz.</li>
	<li>Przechwyć wszystkie obrazy przy tych samych ustawieniach. Zapisz obrazy w .tif formacie do późniejszej analizy.</li>
</ol>
5. Analiza obrazu
UWAGA: Zobacz plik uzupełniający dla przykładu z zestawem przykładowych wykresów do analizy obrazu.
<ol>
	<li>Kliknij dwukrotnie ikonę ImageJ i przeanalizuj obrazy zapisane w kroku 4.5.
	<ol>
		<li>Kliknij Plik | Otwórz, aby otworzyć obrazy zapisane w kroku 4.5.</li>
		<li>Kliknij na Obrazek | Wpisz i wybierz opcję 8-bitowy.</li>
		<li>Kliknij Edytuj | Odwrócić.</li>
		<li>Kliknij Analizuj | Kalibruj, wybierz Nieskalibrowany OD w wyskakującym interfejsie, zaznacz Kalibracja globalna w lewym dolnym rogu dolnego interfejsu i kliknij OK.</li>
		<li>Kliknij Analizuj | Ustawianie skali | Kliknij, aby usunąć skalę w wyskakującym interfejsie, zaznacz Globalne poniżej i kliknij OK.</li>
		<li>Kliknij Analizuj | Ustaw Pomiary, wybierz obszar elementu w wyskakującym interfejsie, zaznacz Ogranicz do progu poniżej (aby mierzyć tylko wybrany zakres) i kliknij OK.</li>
		<li>Kliknij na Obrazek | Dostosuj| Próg, przesuń suwak na środku interfejsu wyskakującego, aby wybrać odpowiedni próg (zmień próg dla każdego obrazu), tak aby wszystkie obiekty docelowe do przetestowania na jednym obrazie zostały wybrane, a następnie kliknij przycisk Ustaw.</li>
		<li>Kliknij Analizuj | Miara. Zapisz daty każdej grupy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj jednoczynnikowej ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya, aby przeanalizować różnice i ustaw poziom istotności na p < 0,001 (***).</li>
</ol>

<ol><li>Compston, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+registration+of+agents+for+prevention+and+treatment+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis%3A+an+update+from+the+Group+for+the+Respect+of+Ethics+and+Excellence+in+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporosis+International%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science.</a> Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).</li>
<li>Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+preventing+bone+loss+induced+by+aromatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors.</a> Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).</li>
<li>Kataba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+exposure+to+environmentally+relevant+lead+levels+induces+oxidative+stress+and+neurobehavioral+alterations+in+larval+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio).</a> Aquatic Toxicology. 227, 105607(2020).</li>
<li>Morin, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+fracture+prevalence+and+in+bone+mineral+density+between+Chinese+and+White+Canadians%3A+the+Canadian+Multicentre+Osteoporosis+Study+%28CaMos%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Osteoporosis%22%5BJournal%5D)">Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos).</a> Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147(2020).</li>
<li>Lee, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lead+poisoning+magnifies+bone+detrimental+effects+in+an+ovariectomized+rat+model+of+postmenopausal+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis.</a> Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).</li>
<li>Theppeang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+bone+mineral+density+and+lead+levels+in+blood%2C+tibia%2C+and+patella+in+urban-dwelling+women%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women.</a> Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoporosis+in+a+Chinese+population+due+to+occupational+exposure+to+lead%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Industrial+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead.</a> American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).</li>
<li>Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+and+bone+mass+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Exercise and bone mass in adults.</a> Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).</li>
<li>Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+structure+and+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Collagen structure and functional implications.</a> Micron. 32 (3), 251-260 (2001).</li>
<li>Kelly, W. L., Bryden, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+differential+stain+for+cartilage+and+bone+in+whole+mount+preparations+of+mammalian+fetuses+and+small+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates.</a> Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).</li>
<li>Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+high+content%2C+in+vivo+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+as+a+model+to+assess+chemical+toxicity+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Fish as a model to assess chemical toxicity in bone.</a> Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GH%2FIGF+axis+in+arsenite-induced+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos.</a> Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820(2020).</li>
<li>Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+emerging+model+for+osteoporosis%3A+a+primary+testing+platform+for+screening+new+osteo-active+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, 6(2019).</li>
<li>Charles, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+quantitative+micro-computed+tomographic+analysis+in+zebrafish+to+define+gene+function+during+skeletogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis.</a> Bone. 101, 162-171 (2017).</li>
<li>Hammond, C. L., Moro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+transgenic+reporters+to+visualize+bone+and+cartilage+signaling+during+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 91(2012).</li>
<li>Bensimon-Brito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+in+vivo+staining+with+alizarin+red+S--a+valuable+approach+to+analyse+zebrafish+skeletal+mineralization+during+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration.</a> BMC Developmental Biology. 16, 2(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Danio pręgowany jest odpowiednim modelem do badania chorób metabolicznych kości. W porównaniu z modelami gryzoni, modele danio pręgowanego są stosunkowo szybkie do ustalenia, a pomiar ciężkości choroby jest łatwiejszy. U larw danio pręgowanego typu dzikiego mineralizacja szkieletu głowy zachodzi przy 5 dpf, a szkieletu osiowego przy 7 dpf15. Tak więc kości czaszki, takie jak PS, OP, CB i NC, są dobrze rozwinięte przy 9 dpf. Po całkowitym odbarwieniu i wybieleniu larw tkanki miękkie zostały oczyszc...

Ostatnie badania potwierdziły, że osteoporoza spowodowana glikokortykosteroidami, inhibitorami aromatazy i nadmiernym spożyciem alkoholu jest powszechna1,2. Ołów (Pb) jest toksycznym metalem występującym w roślinach, glebie i środowisku wodnym3. Chociaż niekorzystny wpływ Pb na organizm ludzki przyciągnął wiele uwagi, jego nieodwracalny wpływ na kości wymaga dalszych badań. Zatrucie ołowiem powoduje różnorodny szereg zmian patologicznych zarówno w rozwijającym się, jak i dorosłym szkielecie, wpływając na normalne czynności życiowe. Badania wykazały związek między przewlekłym narażeniem na Pb a uszkodzeniem kości4, w tym upośledzone struktury kostne5,6, zmniejszona gęstość mineralna kości, a nawet zwiększone ryzyko osteoporozy7.
Zmineralizowana tkanka ma ogromne znaczenie dla wytrzymałości kości8, a osadzanie się matrycy mineralizacji kości jest krytycznym wskaźnikiem tworzenia kości9. Czerwień alizarynowa ma wysokie powinowactwo do jonów wapnia, a barwienie czerwienią alizarynową jest standardową procedurą oceny tworzenia się kości10. Zgodnie z tą metodą zmineralizowana tkanka jest barwiona na czerwono, podczas gdy cała inna tkanka pozostaje przezroczysta. Zabarwiony obszar jest następnie określany ilościowo za pomocą cyfrowej analizy obrazu11.
Danio pręgowany jest ważnym organizmem modelowym, szeroko wykorzystywanym w odkrywaniu leków i modelach chorób. Badania genetyczne na danio pręgowanym i ludziach wykazały podobieństwa w mechanizmach leżących u podstaw morfogenezy szkieletu na poziomie molekularnym12. Co więcej, wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków lub biomolekuł są bardziej wykonalne w dużych lęgach danio pręgowanego niż w modelach mysich, ułatwiając mechanistyczne badanie cząsteczek proosteogennych lub osteotoksycznych13. Barwienie różnicowe szkieletu w tototo10 jest często używane w badaniu dysplazji szkieletowej u małych kręgowców i płodów ssaków. Barwienie czerwienią alizaryny przeprowadzono w celu zbadania toksyczności rozwojowej kości substancji chemicznych u larw danio pręgowanego. W tym artykule użyliśmy ołowiu jako przykładu do opisania protokołu wykrywania wad kostnych wywołanych octanem ołowiu u larw danio pręgowanego.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl (pH = 7,5)</td> <td>Solarbio, Pekin, Chiny</td><td>21</td><td>do zatrzymywania</td></tr><tr><td>4% roztworu utrwalającego paraformaldehyd</td><td>BBI, Szanghaj, Chiny</td><td>14</td><td>tkanek utrwalających</td></tr><tr><td>10x bufor PBS</td><td>BBI, Szanghaj, Chiny</td><td>15</td><td>do mocowania</td></tr><tr><td>35% H2O2</td><td>Yonghua, Jiangsu, Chiny</td><td>8</td><td>usuwanie pigmentu</td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 50 ml</td><td>AKX, Jiangsu, Chiny</td><td>4</td><td></td></tr><tr><td>95% bezwodny etanol</td><td>Enox, Jiangsu, Chiny</td><td>2</td><td>odbarwiające</td></tr><tr><td>czerwień alizarynową (czystość 99,5%)</td> <td>Solarbio, Pekin, Chiny</td><td>1</td><td>barwienie</td></tr><tr><td>Inkubator biochemiczny</td><td>Yiheng, Szanghaj, Chiny</td><td>3</td><td>hodowla zarodków danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Waga elektroniczna</td><td>Sartorius, Niemcy</td><td>5</td><td>ważenie surowców stałych</td></tr><tr><td>Gliceryna (czystość 99,5%)</td><td>BBI, Szanghaj, Chiny</td><td>7</td><td>przechowywanie barwionych ryb</td></tr><tr><td>ImageJ (oprogramowanie)</td><td>USA</td><td>9</td><td>analiza cyfrowa</td></tr><tr><td>KOH (czystość 99,9%)</td><td>Sigma, Ameryka</td><td>10</td><td>roztwór wybielający</td></tr><tr><td>Trójwodny octan ołowiu (czystość 99,5%)</td><td>Aladyn, Szanghaj, Chiny</td><td>11</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (Czystość 99,9%)</td><td>Aladyn,Szanghaj,Chiny</td><td>12</td><td>roztwór czyszczący</td></tr><tr><td>NIS-Elements F (oprogramowanie)</td><td>Nikon, Japonia</td><td>13</td><td>obserwacji i robienia zdjęć</td></tr><tr><td>Rura</td><td>AKX, Jiangsu, Chiny</td><td>18</td><td>usuwanie zarodków i</td></tr><tr><td>płytek roztworu (24-dołkowe)</td><td>Corning, Ameryka</td><td>17</td><td>pojemnik do barwienia płytek zarodkowych</td></tr><tr><td>(6-dołkowy)</td><td>Corning, Ameryka</td><td>16</td><td>pojemnik do hodowli zarodków</td></tr><tr><td>Stół do wytrząsania</td><td>Beyotime, Chiny</td><td>19</td><td>mieszanie roztworu</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon, Japonia</td><td>20</td><td>obserwacji i robienia zdjęć</td></tr><tr><td>Danio pręgowany</td><td>Centrum Doświadczalne Danio Pręgowanego Uniwersytetu Soochow, Suzhou, Chiny</td><td>22</td><td>zwierzę doświadczalne</td></tr></tbody></table>

stosowanie barwienia czerwienią alizarynową w celu wykrycia chemicznie wywołanej utraty masy kostnej u larw danio pręgowanego

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

Chemicznie wywołana utrata masy kostnej spowodowana ekspozycją na ołów (Pb) może wywołać szereg niekorzystnych skutków zarówno dla ludzkich, jak i zwierzęcych układów kostnych. Jednak konkretne skutki i mechanizmy u danio pręgowanego pozostają niejasne. Czerwień alizarynowa ma wysokie powinowactwo do jonów wapnia i może pomóc w wizualizacji kości i zilustrowaniu masy mineralnej szkieletu. W tym badaniu naszym celem było wykrycie utraty masy kostnej wywołanej octanem ołowiu (PbAc) u larw danio pręgowanego za pomocą barwienia czerwienią alizarynową. Zarodki danio pręgowanego traktowano serią stężeń PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) między 2 a 120 godzinami po zapłodnieniu. Barwienie całego szkieletu przeprowadzono na larwach po 9 dniach od zapłodnienia, a całkowity obszar barwienia określono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ. Wyniki wskazały, że zmineralizowane tkanki były zabarwione na czerwono, a zabarwiony obszar zmniejszył się znacznie w grupie ekspozycji na PbAc, z zależną od dawki zmianą mineralizacji kości. W pracy przedstawiono protokół barwienia do badania zmian szkieletowych w ubytkach kostnych wywołanych przez PbAc. Metoda może być również stosowana u larw danio pręgowanego do wykrywania utraty masy kostnej wywołanej przez inne substancje chemiczne.

Barwienie alizaryną czerwoną jest czułą i swoistą metodą pomiaru zmian w mineralizacji kości u larw danio pręgowanego. W niniejszym badaniu zaobserwowaliśmy, że PbAc wywiera niekorzystny wpływ na larwy danio pręgowanego, objawiający się śmiercią, malformacjami, zmniejszeniem częstości akcji serca oraz skróceniem długości ciała. Ponadto oceniono obszary szkieletu zmineralizowanego u larw danio pręgowanego, aby zbadać utratę kości wywołaną przez PbAc. W 9 dpf (Rysunek 1A) wiele kości szkieletu...

Tutaj użyliśmy czerwonego barwienia alizaryną, aby pokazać, że ekspozycja na octan ołowiu powoduje zmianę masy kostnej u larw danio pręgowanego. Ta metoda barwienia może być dostosowana do badania utraty kości u larw danio pręgowanego wywołanej przez inne niebezpieczne substancje toksyczne.

Stosowanie barwienia czerwienią alizarynową w celu wykrycia chemicznie wywołanej utraty masy kostnej u larw danio pręgowanego

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

Ta metoda może pomóc w wykryciu toksyczności kości wywołanej przez substancje chemiczne u danio pręgowanego. Barwienie utrwalonej tkanki czerwienią alizarynową generuje trwały zapis zmian w układzie kostnym, który może ułatwić porównanie kilku próbek. Technika ta może być pomocna w badaniu osteoporozy w modelu danio pręgowanego, ponieważ jedną z cech osteoporozy jest spadek masy kostnej.Usuń losowo 10 larw danio pręgowanego z każdej grupy po dziewięciu dniach od zapłodnienia i utrwal ryby w jednym mililitrze 2% aldehydu paraform i 1X PBS przez dwie godziny. Zdekantować roztwór i umyć larwy danio pręgowanego za pomocą 100-milimolowego Tris HCL o pH 7,5 lub 10 milimolowym chlorku magnezu. W celu odbarwienia należy zdekantować roztwór i inkubować larwę przez pięć minut w serii roztworów, jak opisano w manuskrypcie.Po końcowej inkubacji zdekantować roztwór i usunąć pigment przez wybielanie roztworem składającym się z 3% nadtlenku wodoru i 0,5% wodorotlenku potasu. Obserwuj raz na 10 minut, aż pigment zostanie całkowicie usunięty. Opłucz larwy danio pręgowanego kilka razy 25% gliceryną, 0,1% wodorotlenkiem potasu przez 10 minut, aż nie będzie pęcherzyków.Zabarwić larwę przez namoczenie w jednym mililitrze 0,01% Alizaryny. Zdekantuj roztwór i dodaj jeden mililitr 50% gliceryny lub 0,1% wodorotlenku potasu, aby oczyścić tło. Przechowuj ryby w świeżej 50% glicerynie lub 0,1% wodorotlenku potasu do późniejszej obserwacji.Przenoś jedną larwę na raz na szklane szkiełko, trzymając larwę w środku kropli płynu. Obserwuj larwę pod mikroskopem stereoskopowym. Włącz aparat.Otwórz oprogramowanie i zachowaj ustawienia domyślne. Kliknij AE i wybierz odpowiedni czas naświetlania, aby uzyskać najlepszy obraz. Przechwyć wszystkie obrazy przy tych samych ustawieniach.Zapisz obrazy w formacie dot tiff do późniejszej analizy. Kliknij dwukrotnie ikonę imageJ. Aby przeanalizować zapisane obrazy, kliknij plik, a następnie otwórz, a następnie kliknij obraz, a następnie wpisz i wybierz ośmiobitowy.Kliknij edytuj i odwróć. Kliknij Analizuj, a następnie Skalibruj. Wybierz Nieskalibrowana średnica zewnętrzna w wyskakującym interfejsie.Sprawdź kalibrację globalną w lewym dolnym rogu dolnego interfejsu i kliknij OK. Kliknij analizuj, ustaw skalę, a następnie usuń skalę. Sprawdź globalnie poniżej i kliknij OK.Kliknij analizuj, a następnie ustaw pomiary. Zaznacz obszar elementu w wyskakującym interfejsie. Zaznacz poniżej limit do progu, aby zmierzyć tylko wybrany zakres, a następnie kliknij przycisk OK.Kliknij obraz, dostosuj, a następnie próg i przesuń suwak na środku wyskakującego interfejsu. Aby wybrać odpowiedni próg, aby wybrano wszystkie obiekty docelowe do przetestowania na jednym obrazie. I kliknij ustaw.Kliknij analizuj, a następnie zmierz, zapisz daty. Barwienie czerwienią alizaryny jest czułą i specyficzną metodą pomiaru zmian w mineralizacji kości u larw danio pręgowanego. Po dziewięciu dniach od zapłodnienia wiele kości szkieletu głowy, takich jak kości przyklinowe, wieczko, ceratobranchialne i struna grzbietowa, jest zmineralizowanych i dlatego zabarwionych na czerwono.Natomiast struktury niekostne, takie jak otolity, wydają się brązowo-czarne. Analiza cyfrowa przeprowadzona w celu ilościowego określenia całkowitego zabarwionego obszaru wykazała znaczny spadek zabarwionego obszaru w grupach traktowanych octanem ołowiu w dawkach 10 i 20 miligramów na litr. Zmiany w mineralizacji kości wykazały zależność od dawki.Aby uzyskać lepszy efekt barwienia i obserwację, ważne jest, aby usunąć oryginalny pigment larw danio pręgowanego i usunąć pęcherzyki po wybieleniu.

using-alizarin-red-staining-to-detect-chemically-induced-bone-loss

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film demonstruje technikę barwienia do wykrywania stopnia mineralizacji lub depozycji wapnia w hodowanych pierwotnych osteoblastach za pomocą barwnika Alizarin Red.

Barwienie czerwienią alizaryny: technika wizualizacji mineralizacji przez hodowane osteoblasty

W tym filmie opisujemy metodę wykrywania złogów wapnia wydzielanych przez osteoblasty za pomocą barwnika anionowego, Alizarin Red S. Wyhodowane osteoblasty są najpierw barwione, a następnie barwnik jest odzyskiwany w celu kolorymetrycznego oznaczania ilościowego depozytów wapnia lub stopnia mineralizacji osteoblastów.

Test mineralizacji in vitro: metoda kolorymetryczna do ilościowego oznaczania złogów wapnia w osteoblastach na substytucie przeszczepu kostnego przez barwienie i ekstrakcję czerwieni alizarynowej

Ponieważ wiele modeli chorób neurologicznych i nieneurologicznych u danio pręgowanego jest badanych na dorosłych rybach, a nie na zarodkach/larwach, opracowaliśmy ilościowy test regeneracyjny linii bocznej, który może być zastosowany do modeli chorób u dorosłych ryb danio pręgowanego. Test polegał na rozdzielczości na poziomie 1) neuromastu i 2) poszczególnych komórek rzęsatych.

Test do regeneracji linii bocznej u dorosłych danio pręgowanych

W tym badaniu opisujemy prostą metodę przeprowadzania analizy Evans Blue Dye (EBD) na larwach danio pręgowanego.  Technika ta jest potężnym narzędziem do charakteryzowania integralności mięśni szkieletowych i wyznaczania modeli dystrofii mięśniowej danio pręgowanego, a także jest cenną metodą opracowywania nowych metod terapeutycznych.

Analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa

Małe ryby laboratoryjne stały się popularnymi modelami do badań nad mechanizmami leżącymi u podstaw zaburzeń kości u ludzi oraz do badań przesiewowych leków modulujących kości. W niniejszym raporcie opisano protokół oceny wpływu alendronianu na komórki kostne larw medaka ze zmianami osteoporotycznymi.

Leczenie farmakologiczne i obrazowanie in vivo interakcji osteoblast-osteoklast w modelu osteoporozy ryb Medaka

Celem tego protokołu jest zmiana penetracji śmiercionośnych zmutowanych fenotypów szkieletowych u danio pręgowanego poprzez selektywną hodowlę. Śmiertelne mutanty nie mogą być dorosłe do dorosłości i rozmnażane samodzielnie, dlatego ten protokół opisuje metodę śledzenia i selekcji penetracji przez wiele pokoleń za pomocą testów potomstwa.

Przesuwająca się penetracja śmiertelnych mutantów szkieletowych danio pręgowanego za pomocą testów potomstwa

Tutaj opisujemy 3 modele uszkodzeń dorosłego danio pręgowanego i ich łączne stosowanie z leczeniem lekami immunosupresyjnymi. Udzielamy wskazówek w zakresie obrazowania regenerujących się tkanek oraz wykrywania w nich mineralizacji kości.

Modele urazów dorosłych danio pręgowanego w celu zbadania wpływu prednizolonu na regenerację tkanki kostnej

Ten protokół opisuje zbieranie i wizualizację elasmoidalnych łusek danio pręgowanego podczas regeneracji in vivo. Ponadto przedstawiono hodowlę ex vivo tych łusek do 7 dni po zbiorach.

Regeneracja łusek danio pręgowanego w kulturze łusek toto i ex vivo

Ten protokół oferuje metodę badania dynamiki komórkowej za pomocą prostej techniki hodowli in vitro. Jest to okazja dla badaczy i edukatorów danio pręgowanego do badania procesów komórkowych, takich jak te związane z homeostazą kości i podstawową biologią komórki, poprzez wizualizację jąder fluorescencyjnych i komórek apoptotycznych w łuskach.

Technika hodowli in vitro do badania dynamiki komórkowej w łuskach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje dwufotonową ablację laserową przeprowadzaną na larwach danio pręgowanego, która służy jako model do badania regeneracji kości i efektów odpowiedzi immunologicznej na ablację.

Dwufotonowa, laserowa ablacja osteoblastów w rozwijających się larwach danio pręgowanego

Opisany tutaj protokół przedstawia prostą i łatwą do wykonania procedurę barwienia i preparowania chrząstek twarzoczaszki u 5-dniowej larwy danio pręgowanego. Może być używany do badania anatomii, kształtu i wielkości tych struktur w różnych warunkach rozwojowych.

Rozwarstwienie tkanek twarzoczaszki danio pręgowanego po zabarwieniu błękitem alcyjskim

Poznaj metodę barwienia czerwienią alizarynową do wykrywania toksyczności kostnej u larw Danio rerio. Technika ta pozwala na trwałą dokumentację zmian szkieletowych i badanie osteoporozy.

Stosowanie barwienia czerwienią alizarynową w celu wykrycia chemicznie wywołanej utraty masy kostnej u larw danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów