Izolacja pierwotnych komórek śródbłonka płuc myszy

Protokół przedstawia wiarygodną i powtarzalną metodę izolowania i hodowli komórek śródbłonka o wysokiej czystości od myszy, które mogą mieć wiele zastosowań. Ta technika jest prostszą metodą, która pozwala zachować wydajność i czystość komórek śródbłonka. Procedurę zademonstruje Nina Nguyen, pracownik naukowy z mojego laboratorium.

Na początek wiruj koraliki magnetyczne przez kilka sekund. Odpipetuj 50 mikrolitrów kulek do dwóch 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych do CD31 i CD102. Dodaj jeden mililitr buforu do płukania kulek i dobrze wymieszaj.

Umieścić probówki na separatorze magnetycznym i usunąć supernatant szklaną pipetą Pasteura. Ponownie zawiesić kulki w 50 mikrolitrach bufora do płukania kulek. Następnie dodaj pięć mikrolitrów lub 2,5 mikrograma przeciwciała CD31 lub CD102 na każde 50 mikrolitrów kulek.

Inkubować zawiesinę kulek z delikatnym obrotem na rotatorze końcowym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub przez trzy godziny w temperaturze pokojowej. Umyj granulki immunologiczne cztery razy, a następnie ponownie zawieś je w 50 mikrolitrach bufora do płukania kulek. W dniu izolacji dodać 25 mililitrów HBSS do 25 miligramów kolagenazy typu pierwszego i inkubować ją z delikatnym obracaniem.

Następnie przefiltruj za pomocą filtra o średnicy 22 mikrometrów. Po eutanazji pięcio- lub siedmiodniowego szczeniaka myszy spryskaj tuszę 70% etanolem. Następnie przetnij przeponę wyżej w górę wzdłuż całych bocznych ścian klatki piersiowej, aby odsłonić jamę klatki piersiowej.

Wstrzyknij pięć mililitrów zimnego DMEM do prawej komory serca, aż płuca staną się białe. Następnie przetnij płaty dystalnie do odpowiednich oskrzeli jeden po drugim, aby usunąć płuca. Wyciągnij płaty płuc w stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów, wypełnionej 20 mililitrami lodowatego podłoża podstawowego.

Delikatnie mieszaj probówkę ręcznie przez 10 do 15 sekund, aby zmyć nadmiar czerwonych krwinek. Usuń płuca z pożywki za pomocą sitka do komórek i zmiel wysterylizowanymi nożyczkami. Przenieś zmieloną tkankę do 50-mililitrowej stożkowej rurki z 25 mililitrami podgrzanego roztworu kolagenazy.

Delikatnie zamieszaj na obracającym się mikserze. Podłącz 20-mililitrową strzykawkę do kaniuli o rozmiarze 15 i energicznie rozprowadź zawiesinę bez spieniania 10 do 15 razy do zawiesiny komórkowej. Przefiltruj zawiesinę przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

Następnie przepłucz stożkową rurkę używaną do trawienia i sitko komórkowe 15 mililitrami podłoża podstawowego. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 400 razy G przez osiem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zawiesić osad w dwóch mililitrach kompletnego podłoża.

Dodaj osiem mililitrów kompletnego podłoża i inkubuj. Następnego dnia przemyć kolby dwukrotnie 10 mililitrami HBSS bez wapnia i magnezu i dodać 10 mililitrów kompletnego podłoża. Gdy komórki są w 90 do 95% zlewne, są gotowe do pierwotnej izolacji immunobeadów.

Dwukrotnie przemyć przylegające komórki śródbłonka 10 mililitrami HBSS bez wapnia i magnezu. Dodać dwa mililitry roztworu do odrywania komórek bez trypsyny i inkubować go, aby zapewnić podniesienie wszystkich komórek z kolby. Dodaj osiem mililitrów podłoża podstawowego.

Następnie odwiruj komórki w temperaturze 400 razy G przez cztery minuty w temperaturze pokojowej i ponownie zawieś je w dwóch mililitrach podłoża podstawowego. Woruj koraliki pokryte anty-CD31 przez kilka sekund, aby ponownie zawiesić koraliki. Dodaj 30 mikrolitrów kulek na każde dwa mililitry zawiesiny komórek i zabezpiecz pokrywkę.

Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze typu end over end. Następnie umieść probówki na separatorze magnetycznym na dwie minuty. Odessać supernatant i wyjąć rurkę z magnesu.

Zawiesić osad komórek perełkowych, dodając trzy mililitry podłoża podstawowego do probówki i kilkakrotnie pipetując w górę iw dół. Wymień rurkę na separatorze magnetycznym na dwie minuty. Następnie ostrożnie odessać supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura.

Po ostatnim przemyciu, gdy supernatant stanie się klarowny, ponownie zawiesić osad komórek perełkowych w trzech mililitrach kompletnej pożywki wzrostowej i przenieść go do kolby T75. Dodaj siedem mililitrów kompletnej pożywki wzrostowej i inkubuj ją. Następnego dnia ponownie umyj komórki HBSS bez wapnia i magnezu.

Następnie dodaj 10 mililitrów kompletnego podłoża. Gdy komórki są w 90 do 95% zlewne, są gotowe do wtórnej izolacji immunobeadów. Pierwsza selekcja immunobeadów identyfikuje komórki CD31-dodatnie, które rosną w formacji brukowej.

Druga selekcja immunokulek z kulkami pokrytymi anty-CD102 zwiększa czystość komórek śródbłonka, a sortowanie komórek aktywowane fluorescencją służy do potwierdzenia, że populacja komórek jest CD31 dodatnia i CD102-dodatnia. Aby zbadać śródbłonkowe szlaki zapalne i funkcję bariery śródbłonka, zastosowano leczenie mysim Cytomixem w celu wywołania znacznej produkcji IL-6 przez komórki śródbłonka o wartości P mniejszej niż 0,01. Ponadto zmniejszył się opór prześródbłonkowy, co świadczy o zwiększonej przepuszczalności śródbłonka.

Wyizolowane komórki śródbłonka mogą być wykorzystywane w stymulacji komórek śródbłonka lub testach funkcji barierowych w celu odkrycia celów terapeutycznych opartych na śródbłonku w zaburzeniach dysfunkcji śródbłonka.