Ilościowa ocena reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym ekspresji mikroRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek

Ta metoda qRT-PCR może odpowiedzieć na pytania związane z profilowaniem ekspresji mikroRNA w surowicy myszy w stanach takich jak zależna od wieku niewydolność nerek. Technika ta umożliwia wykrywanie ekspresji mikroRNA z dużą dokładnością i czułością za pomocą prostego procesu, który oszczędza czas i zapobiega błędom technicznym. Na początek naciąć skórę brzucha za pomocą pęsety i nożyczek chirurgicznych.

Przetnij mięśnie błony otrzewnej od pęcherza moczowego do lewej dolnej krawędzi żeber. Podnieś błonę otrzewnową za pomocą pęsety i wykonaj boczne nacięcie w górnej krawędzi nożyczkami chirurgicznymi. Kontynuuj nacięcie wzdłuż najniższej krawędzi żeber.

Zidentyfikuj żyłę główną dolną za pomocą dwóch wacików zwilżonych PBS. Wprowadzić igłę 30 G dołączoną do 1-mililitrowej strzykawki do żyły głównej dolnej i pociągnąć strzykawkę. Powoli wyciągnij igłę, aby uniknąć hemolizy.

Przenieś krew do 1-mililitrowej probówki szpica z heparyną i wymieszaj, odwracając. Odwirować probówkę szpica przez 10 minut w temperaturze 3000 razy G w temperaturze pokojowej. Przenieść supernatant do świeżej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki.

Weź 200 mikrolitrów próbki surowicy i dodaj 1 000 mikrolitrów odczynnika do lizy na bazie fenolu/guanidyny. Wiruj mieszaninę przez 5 sekund i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dodaj 200 mikrolitrów chloroformu i wymieszaj, odwracając rurkę 15 razy.

Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, a następnie odwirować. Nie naruszając osadu, przenieś supernatant do świeżej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Dodaj 450 mikrolitrów 100% etanolu i wiruj rurkę przez 5 sekund.

Następnie załadować 700 mikrolitrów próbki na zakotwiczoną w membranie kolumnę wirową i odwirować ją. Wyrzuć przepływ i dodaj 700 mikrolitrów buforu do płukania 1 dostarczonego w zestawie. Ponownie odwirować i wyrzucić przepływ.

Powtórz mycie z 500 mikrolitrami buforu do płukania 2, aby usunąć sole śladowe. Dodaj 500 mikrolitrów 80% etanolu, odwiruj i wyrzuć przepływ z probówki zbiorczej. Ponownie odwirować kolumnę wirową i przenieść kolumnę do świeżej 1,5-mililitrowej probówki zbiorczej.

Następnie dodaj 14 mikrolitrów wody wolnej od RNaz i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie wirować kolumnę przez 1 minutę w temperaturze 15000 razy G w temperaturze pokojowej. Przygotuj roztwór mieszanki głównej i dodaj 8 mikrolitrów na studzienkę do 8-dołkowej probówki paskowej.

Dodać 12 mikrolitrów wyekstrahowanego całkowitego RNA do każdej probówki i odwirować probówkę przez 15 sekund w temperaturze 2000 razy G w temperaturze pokojowej. Umieść probówkę w termocyklerze i rozpocznij inkubację w celu syntezy cDNA. Po inkubacji przenieś cDNA do świeżej probówki do mikrowirówki.

Rozcieńczyć cDNA dziesięciokrotnie wodą destylowaną. Następnie wirować, a następnie wirować przez 5 sekund w temperaturze 2000 razy G w temperaturze pokojowej. W probówce do mikrowirówek przygotować roztwór mieszanki głównej zgodnie z opisem w protokole tekstowym i zawirować roztwór.

Dodaj 22,5 mikrolitra podwielokrotności do każdej studzienki 96-dołkowej płytki, a następnie 2,5 mikrolitra cDNA. Uszczelnij płytkę za pomocą folii samoprzylepnej i odwiruj płytkę przez 30 sekund w temperaturze 1000 razy G. Umieść płytkę w systemie PCR w czasie rzeczywistym. Zmodyfikuj ustawienia, podając nazwę eksperymentu.

Następnie wybierz 96-dołkowe 0,2 mililitra jako typ eksperymentu, porównawczy CT jako metodę oznaczania ilościowego, standard jako tryb pracy systemu i odczynniki SYBR Green jako odczynniki do wykrywania sekwencji docelowej. Podaj nazwy próbki i docelowego miRNA w każdym dołku. Przypisz zduplikowane próbki, wybierz próbkę referencyjną i kontrolę endogenną, a następnie wybierz brak dla barwnika, który ma być używany jako pasywne odniesienie.

Aby wyeliminować zanieczyszczenie krzyżowe odczynników, należy ustawić ujemną odwrotną transkryptazę i kontrolę bez matrycy dla ekspresji miRNA. Następnie upewnij się, że objętość reakcji jest ustawiona na 20 mikrolitrów, a warunki cyklu PCR są ustawione na 95 stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 94 stopni Celsjusza przez 15 sekund, wyżarzanie w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 30 sekund i rozciąganie w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 30 sekund. Po zakończeniu procesu kliknij Analizuj, aby przeanalizować dane qRT-PCR.

Upewnij się, że linia progowa automatycznie wybrana przez program jest odpowiednia dla każdej studzienki. Sprawdź wartość progową cyklu endogennej kontroli i docelowych miRNA analizowanych w każdej próbce. Określ wartości CT przez przecięcie krzywej wzmocnienia i linii progowej.

Dane miRNA qRT-PCR dla zależnego od wieku modelu niewydolności nerek wykazały, że w porównaniu z myszami kontrolnymi SAMR1, poziom miRNA-7219-5p w nerkach znacznie wzrósł u myszy eksperymentalnych SAMP1, podczas gdy poziom miRNA-7218-5p w nerkach zmniejszył się. Poziomy ekspresji miRNA-223-3p nie zmieniły się w żadnym ze szczepów. Poziomy w surowicy zarówno miRNA-7219-5p, jak i miRNA-7218-5p były znacznie zwiększone u myszy SAMP1, podczas gdy poziomy miRNA-223-3p pozostały niezmienione.

Należy wprowadzić igłę do żyły głównej dolnej i pobrać krew bez przenikania do naczynia. Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące profilowania ekspresji mikroRNA w surowicy myszy w szerokim zakresie stanów patologicznych.