Name: Ilościowa ocena reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym ekspresji mikroRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Poznaj metodę qRT-PCR do ilościowej oceny ekspresji mikroRNA w nerkach i surowicy myszy z wiekową niewydolnością nerek. Technika ta umożliwia precyzyjne wykrywanie biomarkerów z wysoką czułością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+regulatory+role+of+lncRNA-miRNA-mRNA+axis+in+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The novel regulatory role of lncRNA-miRNA-mRNA axis in cardiovascular diseases.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (12), 5768-5775 (2018).</li>
<li>Yang, C., Dou, R., Yin, T., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNA-106b-5p+in+human+cancers%3A+diverse+functions+and+promising+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+and+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">MiRNA-106b-5p in human cancers: diverse functions and promising biomarker.</a> Biomedicine and Pharmacotherapy. 127, 110211(2020).</li>
<li>Lu, T. X., Rothenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">MicroRNA.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1202-1207 (2018).</li>
<li>McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+breast+cancer%3A+the+potential+of+miRNA+for+diagnosis+and+treatment+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 145-155 (2015).</li>
<li>Bjorkman, S., Taylor, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+endometriosis%3A+biological+function+and+emerging+biomarker+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in endometriosis: biological function and emerging biomarker candidates.</a> Biology of Reproduction. 100 (5), 1135-1146 (2019).</li>
<li>Zhou, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA+and+circRNA+expression+patterns+in+mouse+brain+during+toxoplasmosis+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">miRNA and circRNA expression patterns in mouse brain during toxoplasmosis development.</a> BMC Genomics. 21 (1), 46(2020).</li>
<li>Jing, R., Zhong, Q. Q., Long, T. Y., Pan, W., Qian, Z. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulated+miRNA-26a-5p+induces+the+apoptosis+of+endothelial+cells+in+coronary+heart+disease+by+inhibiting+PI3K%2FAKT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22European+Review+for+Medical+and+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Downregulated miRNA-26a-5p induces the apoptosis of endothelial cells in coronary heart disease by inhibiting PI3K/AKT pathway.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 23 (11), 4940-4947 (2019).</li>
<li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34b-5p+inhibition+attenuates+lung+inflammation+and+apoptosis+in+an+LPS-induced+acute+lung+injury+mouse+model+by+targeting+progranulin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).</li>
<li>Bala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+exosomes+indicate+hepatocyte+injury+and+inflammation+in+alcoholic%2C+drug-induced%2C+and+inflammatory+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases.</a> Hepatology. 56 (5), 1946-1957 (2012).</li>
<li>Ishii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+in+diabetic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease.</a> Translational Research. 237, 31-52 (2021).</li>
<li>Latorre Luque, J. Relevance of the epigenetic regulation exercised by hepatic microRNAs in the fatty liver arena: from the bedside to the bench. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://hdl.handle.net/10803/671499">http://hdl.handle.net/10803/671499</a> (2019).</li>
<li>Mastropasqua, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+microRNA+levels+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Serum microRNA levels in diabetes mellitus.</a> Diagnostics (Basel). 11 (2), 284(2021).</li>
<li>Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+detection+in+prostate+tumors+by+quantitative+real-time+PCR+%28qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">MicroRNA detection in prostate tumors by quantitative real-time PCR (qPCR).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3874(2012).</li>
<li>Ahn, J. H., Kwak, J., Lee, J. H., Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+accurate+analysis+of+microRNA+using+a+specific+extension+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient and accurate analysis of microRNA using a specific extension sequence.</a> Molecular Biology Reports. 45 (4), 611-619 (2018).</li>
<li>Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+changes+With+the+aging+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Chronic+Kidney+Disease%22%5BJournal%5D)">Structural and functional changes With the aging kidney.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).</li>
<li>Weinstein, J. R., Anderson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aging+kidney%3A+physiological+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Chronic+Kidney+Disease%22%5BJournal%5D)">The aging kidney: physiological changes.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 17 (4), 302-307 (2010).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Rajeevan, M. S., Vernon, S. D., Taysavang, N., Unger, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+array-based+gene+expression+profiles+by+real-time+%28kinetic%29+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Validation of array-based gene expression profiles by real-time (kinetic) RT-PCR.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 3 (1), 26-31 (2001).</li>
<li>Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+of+quantitative+RT-PCR+array+in+miRNA+expression+profiling+and+comparison+with+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis.</a> BMC Genomics. 10, 407(2009).</li>
<li>Dallas, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+levels+assessed+by+oligonucleotide+microarray+analysis+and+quantitative+real-time+RT-PCR+--+how+well+do+they+correlate%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate.</a> BMC Genomics. 6, 59(2005).</li>
<li>Petriella, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA+profiling+in+serum+and+tissue+samples+to+assess+noninvasive+biomarkers+for+NSCLC+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biology%22%5BJournal%5D)">miRNA profiling in serum and tissue samples to assess noninvasive biomarkers for NSCLC clinical outcome.</a> Tumour Biology. 37 (4), 5503-5513 (2016).</li>
<li>Skrzypa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA-146a-5p+is+upregulated+in+serum+and+cartilage+samples+of+patients+with+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Polski+Przeglad+Chirurgiczny%22%5BJournal%5D)">miRNA-146a-5p is upregulated in serum and cartilage samples of patients with osteoarthritis.</a> Polski Przeglad Chirurgiczny. 91 (3), 1-5 (2019).</li>
<li>Farzanehpour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+and+tissue+miRNAs%3A+potential+biomarkers+for+the+diagnosis+of+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Serum and tissue miRNAs: potential biomarkers for the diagnosis of cervical cancer.</a> Journal of Virology Journal. 16 (1), 116(2019).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Poziomy ekspresji docelowych miRNA udało się określić za pomocą opisanego powyżej protokołu z wykorzystaniem qRT-PCR. Ocena wyekstrahowanych miRNA jest ważnym krokiem w uzyskaniu znaczących danych qRT-PCR. Aby potwierdzić odpowiednią jakość miRNA przed wykonaniem qRT-PCR, należy zastosować spektrofotometrię w celu określenia stosunku absorbancji przy 260 nm do tej przy 280 nm. Może dojść do zanieczyszczenia DNA i/lub dimerów starterów w każdym dołku płytki reakcyjnej może być obecny, jeśli qRT-PCR nie zapewnia pojedynczej amplifikacji PCR o oczekiwanej długości i temperaturze topnienia lub jeśli zapewnia monomodalną krzywą topnienia.
Poziomy ekspresji MiRNA można ocenić za pomocą kilku metod innych niż qRT-PCR, w tym northern blot, mikromacierzy i testów ochrony rybonukleazami. Jednak metoda qRT-PCR jest czułą, dokładną, prostą i powtarzalną procedurą, która wymaga mniejszej objętości próbki niż te, które są wymagane do testów ochrony przed northern blotting i rybonukleazą19. Ponieważ mikromacierze mogą jednocześnie mierzyć ekspresję dziesiątek tysięcy miRNA, można je wykorzystać do identyfikacji potencjalnych markerów miRNA. Dane z mikromacierzy wykazują również wysoką ogólną korelację z danymi uzyskanymi za pomocą qRT-PCR20. Nie osiągnięto jednak konsensusu co do optymalnej metodologii porównywania danych z mikromacierzy uzyskanych w różnych badaniach21.
Ocena miRNA w surowicy ma następujące cechy. Po pierwsze, łatwo jest zebrać surowicę, a ponieważ miRNA surowicy są odporne na zamarzanie i rozmrażanie, temperaturę i kwas, miRNA mogą być dobrymi biomarkerami. Po drugie, istnieje wysoka homologia miRNA między gatunkami, a wyniki eksperymentów na zwierzętach można łatwo ekstrapolować na ludzi. Po trzecie, miRNA w surowicy wykazały potencjał do wykorzystania jako leki terapeutyczne3. Kilka badań wykazało również, że poziom ekspresji miRNA w narządach jest skorelowany z miRNA w surowicy 22,23,24. W niniejszym badaniu miRNA-223-3p, którego poziomy w nerkach nie wykazały znaczącej różnicy między myszami SAMR1 i SAMP1, nie wykazały również znaczącej różnicy między szczepami w surowicy. Natomiast miRNA-7218-5p i miRNA-7219-5p, których poziomy nerek wykazały istotną różnicę między myszami SAMR1 i SAMP1, wykazały znaczne różnice między szczepami w surowicy.
Ten protokół ma następujące ograniczenia. Po pierwsze, jego przydatność nie została zweryfikowana w innych narządach, takich jak wątroba i płuca, a po drugie, nie została przetestowana na innych zwierzętach laboratoryjnych, takich jak szczury, psy i świnie. Kilka grup badawczych wykorzystało ten protokół do oczyszczania i wykrywania miRNA za pomocą qRT-PCR i poinformowało, że protokół ten umożliwił oczyszczenie wysokiej jakości RNA z tkanek i surowicy 13,14,22,23,24. Wykazano, że metoda ta ma wysoką dokładność i czułość w wykrywaniu ekspresji miRNA 13,14,22,23,24. Wyniki niniejszego badania pokazują, że protokół ten może z powodzeniem wykrywać ekspresję miRNA w surowicy i nerkach myszy. Dlatego protokół może być stosowany do określania profili ekspresji miRNA w surowicy i nerkach u myszy z różnymi patologiami. Ze względu na prostotę protokołu, jednocześnie można przetwarzać dużą liczbę próbek. Analizy ekspresji wielu miRNA w różnych stanach patologicznych nerki mogą zatem wykorzystywać opisany w niniejszym dokumencie protokół.
Istnieją pewne aspekty protokołu, o których należy pamiętać. Aby uniknąć degradacji oczyszczonych miRNA, która nastąpiłaby w temperaturze pokojowej, miRNA muszą być przechowywane na lodzie. Próbki nerek muszą być homogenizowane aż do całkowitego rozpuszczenia w odczynniku do lizy. Nerka myszy zawiera znaczną ilość tkanki łącznej, która jest nierozpuszczalna w odczynniku do lizy, a zatem do dalszej homogenizacji wymagany jest rozdrabniacz kolumnowy. Ponadto odpowiednie endogenne kontrolne miRNA (o stabilnej ekspresji wśród próbek) powinno być walidowane przez cały czas trwania eksperymentu qRT-PCR. Dzieje się tak, ponieważ interferencja różnych substancji podczas wykonywania tego protokołu może zmienić poziomy ekspresji endogennych kontrolnych miRNA, co może pogorszyć wyniki. Podsumowując, w artykule opisano protokół qRT-PCR do wykrywania, oczyszczania i oceny ekspresji miRNA w surowicy i nerkach myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek.

Wiadomo, że ekspresja różnych mRNA, które odgrywają ważną rolę zarówno w fizjologii, jak i chorobie (np. zapaleniu, zwłóknieniu, zaburzeniach metabolicznych i raku) jest regulowana przez miRNA, które są krótkimi, niekodującymi RNA, które powodują degradację i hamują transkrypcję mRNA1. W związku z tym możliwe jest, że niektóre miRNA mogą służyć jako nowi kandydaci na biomarkery i/lub cele terapeutyczne dla różnych chorób2,3,4,5. Przeprowadzono badania nad profilami ekspresji miRNA w różnych narządach i tkankach myszy (w tym brain6, heart7, lung8, liver9 i kidney10). Nie ma jednak standardowych ani ustalonych metod ekstrakcji i oceny miRNA w nerkach lub surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek.
Dlatego stworzyliśmy protokół, który może być używany do niezawodnego oczyszczania i wykrywania ekspresji miRNA w surowicy i nerkach myszy z niewydolnością nerek zależną od wieku. Protokół składa się z sześciu głównych etapów: (1) przygotowanie zarówno 50-tygodniowych samców myszy SAMR1, jak i samców myszy SAMP1; (2) ekstrakcja próbek krwi z żyły głównej dolnej obu szczepów myszy, a następnie użycie probówki szpica z heparyną, a następnie odwirowanie, w celu uzyskania próbki surowicy; (3) Ekstrakcja próbki nerki od myszy - homogenizator krzemowy A służy do oddzielnej homogenizacji próbki nerki, a następnie próbka jest przenoszona do systemu rozdrabniania biopolimerów na kolumnie wirowej mikrowirówki<klasa SUP = "xref">11; (4) ekstrakcja całkowitego RNA (zawierającego miRNA) z próbek surowicy za pomocą kolumny spinowej opartej na błonie krzemionkowej12 oraz ekstrakcja całkowitego RNA zawierającego miRNA z próbek nerek za pomocą kolumny spinowej opartej na błonie krzemionkowej11; (5) synteza komplementarnego DNA (cDNA) z całkowitego RNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy, polimerazy poli(A) i startera oligo-dT13,14; i (6) wreszcie, określenie ekspresji miRNA za pomocą qRT-PCR i barwnika interkalacyjnego 13,14.
Ten nowy protokół został oparty na badaniach, które doprowadziły do ekstrakcji i oceny miRNA w różnych typach tkanek11,12,13. Wykazano, że opracowany w protokole system rozdrabniania biopolimerów jest w stanie oczyścić wysokiej jakości całkowite RNA z tkanek11. Ustalono dokładność i czułość aspektów tego protokołu stosowanego do oceny ekspresji miRNA metodą qRT-PCR z barwnikiem interkalacyjnym 13,14, na przykład synteza cDNA z odwrotną transkryptazą, polimerazą poli(A) i starterami oligo-dT z wyekstrahowanego całkowitego RNA. Nowy protokół ma kilka zalet: prostotę, oszczędność czasu i mniej błędów technicznych. Dzięki temu może być stosowany do badań, które wymagają dokładnej i czułej identyfikacji profili miRNA nerek i surowicy. Badania nad wieloma stanami patologicznymi mogą również wykorzystywać nowy protokół.
Profile ekspresji miRNA u myszy SAMP1, które są modelem zależnej od wieku niewydolności nerek, można określić jak pokazano poniżej. U ludzi zależna od wieku niewydolność nerek wiąże się z postępem niewydolności nerek i charakteryzuje się zarówno zwiększeniem obszaru zwłóknienia śródmiąższowego nerek, jak i postępem stwardnienia kłębuszków nerkowych15,16. Niewydolność nerek zależna od wieku jest również ważną i częstą cechą przewlekłej choroby nerek i schyłkowej niewydolności nerek15,16.

<table><tbody><tr><td>1,0 ml szpica z heparyną</td><td>Greiner-bio-one</td><td>450534</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RPE (bufor płuczący #2 zawierający guanidynę i etanol w stosunku 1:4)</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Bufor płuczący 2</td></tr><tr><td>Bufor RWT (bufor płuczący #1 zawierający guanidynę i etanol w stosunku 1:2)</td><td>Qiagen</td><td>1067933</td><td>Bufor do płukania 1</td></tr><tr><td>MicroAmp Optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna do qRT-PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316813</td><td>96-dołkowa płytka reakcyjna</td></tr><tr><td>Optyczna folia samoprzylepna MicroAmp</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>Folia samoprzylepna do 96-dołkowej płytki reakcyjnej</td></tr><tr><td>miRNA-223-3p starter</td><td>Qiagen</td><td>MS00003871</td><td>5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGU G-3'miRNA-423-5p</td></tr> <tr><td>Primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00012005</td><td>5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU UU-3'</td></tr><tr><td>Starter miRNA-7218-5p</td><td>Qiagen</td><td>MS00068067</td><td>5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG -</td>3'miRNA-7219-5p</tr> <tr><td>starter</td><td>Qiagen</td><td>MS00068081</td><td>5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA GA-3'miRNeasy</td></tr> <tr><td>Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Kolumna wirowa zakotwiczona w membranie w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml</td></tr><tr><td>miRNeasy Zestaw Serum/Plasma</td><td>Qiagen</td><td>217184</td><td>Kolumna wirowa zakotwiczona w membranie w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml</td></tr><tr><td>Zestaw miScript II RT (bufor do odwrotnej transkrypcji)</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>Zestaw do odwrotnej transkryptazy</td></tr><tr><td>miScript SYBR Zielony zestaw do PCR</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>Zestaw do PCR na bazie zielonego barwnika</td></tr><tr><td>Niszczarka</td><td>QIA Qiagen</td><td>79654</td><td>Biopolimerowe kolumny wirowe w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml</td></tr><tr><td>Odczynnik do lizy QIAzol (liza na bazie fenolu/guanidyny odczynnik)</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Odczynnik do lizy na bazie fenolu/guanidyny</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex System Real-Time PCR Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>Narzędzie do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex w wersji oprogramowania 1.2.1.</td><td>Thermo Fisher Scientific 4472380</td><td></td><td>Oprogramowanie instrumentu do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>Woda wolna od RNaz</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>RNU6-2 starter</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td>Nieujawnione ze względu na poufność</td></tr><tr><td>Myszy męskie SAMP1</td><td>Nippon SLC Corporation</td><td>Nie przypisano</td><td></td></tr><tr><td>Samce myszy</td><td>Samr1 Nippon SLC Corporation</td><td>Nie przypisano</td><td></td></tr><tr><td>Standard biomasy Takara</td><td>Takara Bio</td><td>9790B</td><td>Homogenizator krzemu</td></tr></tbody></table>

ilościowa ocena reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym ekspresji mikrorna w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek

Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment

MikroRNA (miRNA) to małe, niekodujące RNA składające się z 21-25 zasad. Nie są one przekształcane w białka, ale raczej działają w celu utrudnienia funkcjonowania docelowych informacyjnych RNA (mRNA) poprzez ich destabilizację i zakłócenie ich translacji. Chociaż zbadano profile ekspresji miRNA w różnych narządach i tkankach myszy, nie było standardowych metod oczyszczania i ilościowego oznaczania miRNA nerek i surowicy myszy. Opracowaliśmy skuteczną i wiarygodną metodę ekstrakcji i oceny ekspresji miRNA w surowicy i nerkach myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek. 
Metoda wykorzystuje ilościową reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR), a protokół wymaga sześciu kroków: (1) przygotowanie myszy z przyspieszoną rezygencją starzenia 1 (SAMR1) i myszy podatnych na starzenie (SAMP1); (2) ekstrakcja próbek surowicy od tych myszy; (3) pobranie próbki nerki od każdej myszy; (4) ekstrakcja całkowitego RNA (w tym miRNA) z próbek nerek i surowicy od każdej myszy; (5) synteza komplementarnego DNA (cDNA) z odwrotną transkrypcją z miRNA; (6) przeprowadzenie qRT-PCR z wykorzystaniem uzyskanego cDNA. 
Ten protokół został użyty do potwierdzenia, że w porównaniu z kontrolami, ekspresja miRNA-7218-5p i miRNA-7219-5p została znacząco zmieniona w nerkach i surowicy mysiego modelu niewydolności nerek zależnej od wieku. Protokół ten wyjaśnił również związek między nerką a surowicą mysiego modelu zależnej od wieku niewydolności nerek. Protokół ten można wykorzystać do określenia ekspresji miRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek.

W modelu mysim z wiekowo-zależnym upośledzeniem funkcji nerek wykorzystano 50-tygodniowe samce myszy SAMP1 o masie 40-45 g. Od każdej myszy pobrano około 0,8 mL krwi, którą przeniesiono do probówki spitz o pojemności 1,0 mL z heparyną, wymieszano przez odwracanie i odwirowano. Każką nerkę przepłukano PBS, wypreparowano i przechowywano w ciekłym azocie do dalszych analiz. Jako kontrolę zastosowano 50-tygodniowe myszy SAMR1. Na podstawie danych z miRNA qRT-PCR uzyskanych w tym modelu wiekowo-zależnego upośledzenia funkcji nerek zaobserwowano, że poziom miRNA-7219-5p w nerkach był znacząco podwyższony, a poziom miRNA-7218-5p w nerkach był wyraźnie obniżony u myszy SAMP1 w porównaniu z grupą kontrolną (Rysunek 1). Poziomy surowicze zarówno miRNA-7219-5p, jak i miRNA-7218-5p były znacznie podwyższone u myszy SAMP1 w porównaniu z kontrolą (Rysunek 2). Poziomy ekspresji miRNA-223-3p nie uległy zmianie w żadnej z linii oraz pomiędzy nerkami a surowicą (Rysunek 1 oraz Rysunek 2).
<img alt="Analiza ekspresji mikroRNA; wykresy słupkowe; porównanie danych w grupie SAMR1 i SAMP1; badania biologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63258/63258fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Różnicowo wyrażane mikroRNA w nerkach myszy SAMP1. Analiza qRT-PCR ekspresji miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p oraz miRNA-7219-5p u myszy SAMR1 (kontrola, n = 4) i myszy SAMP1 (n = 4). Dane przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy (słupki błędów); do analizy różnic między grupami zastosowano testy t; za istotne uznano p &lt; 0.05 (*p &lt; 0.05), n.s.: brak istotności. Skróty: miRNA = mikroRNA; SAMP1 = senescence-accelerated mouse prone; SAMR1 = senescence-accelerated mouse resistance 1; qRT-PCR = ilościowa reakcja polimerazy w łańcuchu z odwrotną transkrypcją. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63258/63258fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza ekspresji miRNA; wykres przedstawiający ekspresję względną w grupie SAMR1 w porównaniu z SAMP1; wyniki statystyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63258/63258fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Różnicowo eksprimowane miRNA w surowicy myszy SAMP1. Analiza qRT-PCR ekspresji miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p oraz miRNA-7219-5p u myszy SAMR1 (kontrola, n = 4) i myszy SAMP1 (n = 4). Dane przedstawiono jako średnia ± SE (słupki błędów); do badania istotnych różnic między grupami zastosowano testy t. *p &lt; 0.05 w teście t. Skróty: miRNA = microRNA; SAMP1 = senescence-accelerated mouse prone; SAMR1 = senescence-accelerated mouse resistance 1; qRT-PCR = ilościowa reakcja polimerazy w łańcuchu z odwrotną transkrypcją <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63258/63258fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Przedstawiamy metodę oceny ekspresji mikroRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją.

Ilościowa ocena reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym ekspresji mikroRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek

MicroRNAs (miRNAs) are small, noncoding RNAs consisting of 21-25 bases. They are not translated into proteins but rather work to impede the functioning of ...

Ta metoda qRT-PCR może odpowiedzieć na pytania związane z profilowaniem ekspresji mikroRNA w surowicy myszy w stanach takich jak zależna od wieku niewydolność nerek. Technika ta umożliwia wykrywanie ekspresji mikroRNA z dużą dokładnością i czułością za pomocą prostego procesu, który oszczędza czas i zapobiega błędom technicznym. Na początek naciąć skórę brzucha za pomocą pęsety i nożyczek chirurgicznych.Przetnij mięśnie błony otrzewnej od pęcherza moczowego do lewej dolnej krawędzi żeber. Podnieś błonę otrzewnową za pomocą pęsety i wykonaj boczne nacięcie w górnej krawędzi nożyczkami chirurgicznymi. Kontynuuj nacięcie wzdłuż najniższej krawędzi żeber.Zidentyfikuj żyłę główną dolną za pomocą dwóch wacików zwilżonych PBS. Wprowadzić igłę 30 G dołączoną do 1-mililitrowej strzykawki do żyły głównej dolnej i pociągnąć strzykawkę. Powoli wyciągnij igłę, aby uniknąć hemolizy.Przenieś krew do 1-mililitrowej probówki szpica z heparyną i wymieszaj, odwracając. Odwirować probówkę szpica przez 10 minut w temperaturze 3000 razy G w temperaturze pokojowej. Przenieść supernatant do świeżej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki.Weź 200 mikrolitrów próbki surowicy i dodaj 1 000 mikrolitrów odczynnika do lizy na bazie fenolu/guanidyny. Wiruj mieszaninę przez 5 sekund i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dodaj 200 mikrolitrów chloroformu i wymieszaj, odwracając rurkę 15 razy.Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, a następnie odwirować. Nie naruszając osadu, przenieś supernatant do świeżej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Dodaj 450 mikrolitrów 100% etanolu i wiruj rurkę przez 5 sekund.Następnie załadować 700 mikrolitrów próbki na zakotwiczoną w membranie kolumnę wirową i odwirować ją. Wyrzuć przepływ i dodaj 700 mikrolitrów buforu do płukania 1 dostarczonego w zestawie. Ponownie odwirować i wyrzucić przepływ.Powtórz mycie z 500 mikrolitrami buforu do płukania 2, aby usunąć sole śladowe. Dodaj 500 mikrolitrów 80% etanolu, odwiruj i wyrzuć przepływ z probówki zbiorczej. Ponownie odwirować kolumnę wirową i przenieść kolumnę do świeżej 1,5-mililitrowej probówki zbiorczej.Następnie dodaj 14 mikrolitrów wody wolnej od RNaz i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie wirować kolumnę przez 1 minutę w temperaturze 15000 razy G w temperaturze pokojowej. Przygotuj roztwór mieszanki głównej i dodaj 8 mikrolitrów na studzienkę do 8-dołkowej probówki paskowej.Dodać 12 mikrolitrów wyekstrahowanego całkowitego RNA do każdej probówki i odwirować probówkę przez 15 sekund w temperaturze 2000 razy G w temperaturze pokojowej. Umieść probówkę w termocyklerze i rozpocznij inkubację w celu syntezy cDNA. Po inkubacji przenieś cDNA do świeżej probówki do mikrowirówki.Rozcieńczyć cDNA dziesięciokrotnie wodą destylowaną. Następnie wirować, a następnie wirować przez 5 sekund w temperaturze 2000 razy G w temperaturze pokojowej. W probówce do mikrowirówek przygotować roztwór mieszanki głównej zgodnie z opisem w protokole tekstowym i zawirować roztwór.Dodaj 22,5 mikrolitra podwielokrotności do każdej studzienki 96-dołkowej płytki, a następnie 2,5 mikrolitra cDNA. Uszczelnij płytkę za pomocą folii samoprzylepnej i odwiruj płytkę przez 30 sekund w temperaturze 1000 razy G. Umieść płytkę w systemie PCR w czasie rzeczywistym. Zmodyfikuj ustawienia, podając nazwę eksperymentu.Następnie wybierz 96-dołkowe 0,2 mililitra jako typ eksperymentu, porównawczy CT jako metodę oznaczania ilościowego, standard jako tryb pracy systemu i odczynniki SYBR Green jako odczynniki do wykrywania sekwencji docelowej. Podaj nazwy próbki i docelowego miRNA w każdym dołku. Przypisz zduplikowane próbki, wybierz próbkę referencyjną i kontrolę endogenną, a następnie wybierz brak dla barwnika, który ma być używany jako pasywne odniesienie.Aby wyeliminować zanieczyszczenie krzyżowe odczynników, należy ustawić ujemną odwrotną transkryptazę i kontrolę bez matrycy dla ekspresji miRNA. Następnie upewnij się, że objętość reakcji jest ustawiona na 20 mikrolitrów, a warunki cyklu PCR są ustawione na 95 stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 94 stopni Celsjusza przez 15 sekund, wyżarzanie w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 30 sekund i rozciąganie w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 30 sekund. Po zakończeniu procesu kliknij Analizuj, aby przeanalizować dane qRT-PCR.Upewnij się, że linia progowa automatycznie wybrana przez program jest odpowiednia dla każdej studzienki. Sprawdź wartość progową cyklu endogennej kontroli i docelowych miRNA analizowanych w każdej próbce. Określ wartości CT przez przecięcie krzywej wzmocnienia i linii progowej.Dane miRNA qRT-PCR dla zależnego od wieku modelu niewydolności nerek wykazały, że w porównaniu z myszami kontrolnymi SAMR1, poziom miRNA-7219-5p w nerkach znacznie wzrósł u myszy eksperymentalnych SAMP1, podczas gdy poziom miRNA-7218-5p w nerkach zmniejszył się. Poziomy ekspresji miRNA-223-3p nie zmieniły się w żadnym ze szczepów. Poziomy w surowicy zarówno miRNA-7219-5p, jak i miRNA-7218-5p były znacznie zwiększone u myszy SAMP1, podczas gdy poziomy miRNA-223-3p pozostały niezmienione.Należy wprowadzić igłę do żyły głównej dolnej i pobrać krew bez przenikania do naczynia. Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące profilowania ekspresji mikroRNA w surowicy myszy w szerokim zakresie stanów patologicznych.

quantitative-real-time-polymerase-chain-reaction-evaluation-microrna

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten artykuł opisuje protokół hybrydyzacji in situ zoptymalizowany do kolormetrycznego wykrywania ekspresji mikroRNA w stałych odcinkach nerki z formaliną.

Hybrydyzacja in situ mikroRNA dla tkanek nerek utrwalonych formaliną

Ten protokół opisuje pełne badanie nerek, które powinno być przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu ostrego uszkodzenia nerek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Protokół ten kładzie nacisk na mysi model niedokrwiennego uszkodzenia nerek i staranną ekstrakcję próbek mikroRNA.

Ilościowa metoda wykrywania mikroRNA w nerce mysiego modelu niedokrwiennego uszkodzenia nerki

Opisujemy metodę oceny ekspresji mikroRNA w nerkach myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu (UUO) za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją. Protokół ten jest odpowiedni do badania profili ekspresji mikroRNA nerek u myszy z UUO oraz w kontekście innych stanów patologicznych.

Ilościowa ocena ekspresji mikroRNA PCR w czasie rzeczywistym w nerce myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu

mikroRNA biorą udział w patogenezie nefropatii IgA. Opracowaliśmy niezawodną metodę wykrywania poziomów ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu nefropatii IgA (myszy HIGA). Ta nowa metoda ułatwi sprawdzenie udziału miRNA w nefropatii IgA.

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w nerkach myszy nefropatycznych z immunoglobuliną A

Tutaj dostarczamy egzogenne, sztucznie syntetyzowane mimiki miRNA do nerki poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej wektora niewirusowego i nanocząsteczek polietyleniminy w kilku modelach myszy z chorobą nerek. Doprowadziło to do znacznej nadekspresji docelowego miRNA w nerce, co spowodowało zahamowanie progresji choroby nerek w kilku modelach mysich.

Dostarczanie egzogennego, sztucznie syntetyzowanego miRNA naśladującego mimikę do nerki przy użyciu nanocząstek polietyleniminy w kilku mysich modelach choroby nerek

Opisana jest ulepszona metoda polimorfizmu długości fragmentów ograniczających reakcję łańcuchową polimerazy do genotypowania gatunków rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas. Kolumna monolitu krzemionkowego z odwróconymi fazami służy do oddzielania strawionych amplikonów. Metoda ta może wyjaśnić monoizotopowe masy oligonukleotydów, co jest przydatne do identyfikacji składu zasadowego.

Ulepszone polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych reakcji łańcuchowej polimerazy Genotypowanie toksycznych rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas

To badanie opisuje metody koekspresji wielu genów z pojedynczego plazmidu w Escherichia coli za pośrednictwem T7 przy użyciu systemu plazmidowego pMGX.

Indukowalny wielogenowy system ekspresji za pośrednictwem polimerazy RNA T7, pMGX

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczura za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Metoda ta nadaje się do badania profilu ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczura w kilku stanach patologicznych.

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczurów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Tutaj moc losowej insercji niekodującego elementu DNA za pośrednictwem transpozonu została wykorzystana do określenia jego optymalnej pozycji chromosomalnej.

Określenie optymalnej lokalizacji chromosomalnej dla elementu DNA w Escherichia coli przy użyciu nowatorskiego podejścia opartego na transpozonach

Poznaj metodę qRT-PCR do ilościowej oceny ekspresji mikroRNA w nerkach i surowicy myszy z wiekową niewydolnością nerek. Technika ta umożliwia precyzyjne wykrywanie biomarkerów z wysoką czułością.

Ilościowa ocena reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym ekspresji mikroRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowa ocena reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym ekspresji mikroRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek

Przeglądaj więcej filmów