Name: Kontrolowane półautomatyczne urazy indukowane laserem do badania regeneracji rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Naucz się kontrolowanej metody laserowej do indukowania urazów rdzenia kręgowego u larw Danio rerio. Technika zwiększa powtarzalność i minimalizuje uszkodzenia tkanek sąsiednich w badaniach nad regeneracją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez BBSRC (BB/S0001778/1). CR jest finansowany przez Program Stypendialny Badań Medycznych Princess Royal TENOVUS Scotland. Dziękujemy Davidowi Greenaldowi (CRH, Uniwersytet w Edynburgu) i Katy Reid (CDBS, Uniwersytet w Edynburgu) za miły dar w postaci transgenicznych ryb (Zobacz plik uzupełniający). Dziękujemy Danielowi Soongowi (CRH, Uniwersytet w Edynburgu) za uprzejmy dostęp do konfokalu 3i spinning-disk.

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych i zgodnie z jego przepisami, na podstawie licencji projektu PP8160052. Projekt został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Edynburgu. Do analiz eksperymentalnych wykorzystano larwy danio pręgowanego w wieku do 5 dni obu płci z następujących dostępnych linii transgenicznych: Tg(Xla.Tubb:DsRed; mpeg1:GFP), Tg(Xla.Tubb:DsRed), Tg(betaaktyna:utrofina-mCherry), Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) i Tg(mnx1:gfp) (patrz Plik Uzupełniający 1 dotyczący generowania transgenicznych linii do danio pręgowanego). Schemat protokołu wykorzystującego zautomatyzowaną platformę do obsługi larw danio pręgowanego pokazano na Rysunek 1. Wszystkie niestandardowe oprogramowanie, skrypty i szczegółowe protokoły eksperymentalne użyte w tej pracy są dostępne na stronie https://github.com/jasonjearly/micropointpy/.
1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Po 5 godzinach od zapłodnienia posortuj zarodki pod kątem prawidłowego etapu rozwoju21. Wyrzuć martwe jaja oraz słabo rozwinięte i nadmiernie rozwinięte zarodki.</li>
	<li>Po 3 dniach od zapłodnienia (dpf) znieczulij larwy, dodając 2 ml 0,4% estru metylowego kwasu aminobenzoesowego do 50 ml wody z pomieszczenia rybnego na szalce Petriego o średnicy 90 mm. Należy używać zwierząt hodowanych z fenylotiomocznikiem (PTU) (patrz tabela materiałów), aby zapobiec pigmentacji skóry, jeśli stanowi ona problem, co nie ma miejsca w przypadku urazów rdzenia kręgowego u 3 larw dpf opisanych w niniejszym protokole. 
	UWAGA: To stosunkowo wysokie stężenie środka znieczulającego służy do zapobiegania ruchom larw po uderzeniu lasera.</li>
	<li>Przebadać zarodki pod kątem fluorescencyjnej ekspresji reporterowej (plik uzupełniający 1). 
	UWAGA: Reporter fluorescencyjny dla rdzenia kręgowego (lub innej struktury będącej przedmiotem zainteresowania) jest często wymagany do oceny skuteczności urazu. Zastosowanie tg(Xla.Tubb:DsRed) pomaga zidentyfikować rdzeń kręgowy.</li>
	<li>Przenieść wybrane larwy na 96-dołkową płytkę do wykorzystania w systemie VAST (patrz Tabela Materiałów) z 300 μl wody w pomieszczeniu dla ryb na studzienkę. Bezpośrednio użyć pożywki zawierającej środek znieczulający z płytki Petriego o średnicy 90 mm. Upewnij się, że masz tylko jedną larwę na studzienkę. Przygotować jedną dodatkową pustą płytkę 96-dołkową, aby zebrać zmienione larwy. 
	UWAGA: W przypadku korzystania z innego laserowego systemu do usuwania uszkodzeń, zamontuj larwy w 1% żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia (LMP) w odpowiedniej komorze obserwacyjnej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mikroskopu
<ol>
	<li>Włącz wszystkie elementy systemu (VAST, mikroskop, laser, komputer), w tym laser do ablacji.</li>
	<li>Gdy sprzęt zostanie w pełni zainicjowany, uruchom oprogramowanie mikroskopu, ImageJ/Fiji, zintegrowane środowisko programistyczne (IDE) Pythona oraz oprogramowanie do automatycznego obrazowania danio pręgowanego (system VAST), jeśli korzystasz z tej platformy (patrz Spis materiałów).</li>
	<li>Skonfiguruj oprogramowanie VAST, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Po uruchomieniu oprogramowania VAST wybierz opcję Plate w pierwszym oknie i kliknij przycisk Gotowe (Rysunek 2A). Pojawi się kolejne małe okienko z pytaniem, czy kapilara jest pusta i czysta. Sprawdź, patrząc na obraz kapilary, czy w środku nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli nie, kliknij Tak. Jeśli są jakieś bąbelki, kliknij Nie i postępuj zgodnie z krokami 2.3.2-2.3.3 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
		<li>W oknie Próbnik dużych cząstek (LP) kliknij Prime, aby usunąć pęcherzyki powietrza (Rysunek 2C).</li>
		<li>Przejdź do głównego okna oprogramowania (z obrazem kapilarnym) i kliknij obraz prawym przyciskiem myszy. Wybierz opcję Nagraj obraz pustej kapilary w menu podręcznym (Rysunek 2B).</li>
		<li>W oknie LP Sampler przejdź do menu Plik i wybierz opcję Otwórz skrypt. Wybierz plik zawierający skrypt odpowiadający eksperymentowi, który chcesz przeprowadzić.</li>
		<li>W oknie głównym oprogramowania VAST przejdź do Plik i wybierz Otwórz eksperyment. Wybierz plik eksperymentu odpowiadający planowanemu eksperymentowi. 
		UWAGA: Upewnij się, że pola Automatyczny rozładunek i Zbiorcze wyjście do odpadów NIE są zaznaczone.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj oprogramowanie mikroskopu do obrazowania.
	<ol>
		<li>Uruchom oprogramowanie do obrazowania mikroskopem (patrz Tabela materiałów), aby zainicjować sprzęt. Może to potrwać kilka minut, w zależności od systemu.</li>
		<li>Przejdź do ustawień akwizycji i ustaw mikroskop do obrazowania fluoroforu wyrażonego w larwach. Użyj obiektywu zanurzającego 10x NA 0,5 w wodzie, aby upewnić się, że objętość ogniskowej jest wystarczająco wydłużona wzdłuż osi optycznej, aby uszkodzić całą głębokość rdzenia kręgowego lub docelowej tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj ImageJ/Fiji pod kątem zmian laserowych.
	<ol>
		<li>Przejdź do menu Plik, wybierz Nowy/Skrypt, aby otworzyć okno skryptu.</li>
		<li>W oknie Nowy przejdź do menu Plik i wybierz Otwórz, aby załadować skrypt zmiany laserowej (Manual_MP_Operation.ijm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj środowisko IDE języka Python.
	<ol>
		<li>Uruchom środowisko IDE języka Python.</li>
		<li>Przejdź do menu Plik i wybierz Otwórz plik, aby załadować skrypt do zarządzania laserem (Watch_for_ROIs_py3.py).</li>
		<li>Przejdź do menu Uruchom i wybierz polecenie Uruchom bez debugowania, aby uruchomić skrypt. Sprawdź, czy podczas inicjalizacji tłumika laserowego w panelu TERMINAL pojawia się sekwencja komunikatów wraz z pewnym szumem (Rysunek 2D).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wykonywanie uszkodzeń laserowych w systemie VAST
<ol>
	<li>Wyśrodkuj kapilarnę względem obiektywu mikroskopu, przesuwając stolik, klikając przyciski strzałek w głównym oknie oprogramowania VAST (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Skoncentruj się na górnej części kapilary, patrząc przez okulary i używając światła przechodzącego mikroskopu. 
	UWAGA: Kapilara jest bardzo delikatna i może pęknąć w przypadku dotknięcia obiektywem. Powoli przesuwaj pokrętłem mikroskopu podczas ustawiania ostrości do wewnątrz i na zewnątrz.</li>
	<li>Umieść 96-dołkowe płytki na uchwycie płytki próbnika LP systemu VAST. Umieść płytkę zawierającą larwy po lewej stronie, a płytkę do zbierania po prawej. Upewnij się, że płytki są prawidłowo zorientowane: studzienka A1 musi znajdować się w lewym przednim rogu uchwytu.</li>
	<li>W oprogramowaniu VAST, w oknie LP Sampler kliknij na przycisk Plate Template i zaznacz wszystkie studzienki zawierające larwy. Kliknij przycisk OK, aby zatwierdzić i zamknąć okno (Rysunek 2C).</li>
	<li>W oknie LP Sampler kliknij przycisk Run Plate, aby rozpocząć ładowanie larva. 
	UWAGA: Po pewnym czasie larwa powinna być widoczna w kapilarze w pozycji (predefiniowanej w pliku definicji eksperymentu), co pozwala na uszkodzenie rdzenia kręgowego. Lampka tacki VAST wyłączy się po kilku obrotach, aby ustawić larwę boczną stroną skierowaną w stronę obiektywu mikroskopu.</li>
	<li>Przejdź do oprogramowania mikroskopu i kliknij przycisk Na żywo, aby zobrazować larwę.</li>
	<li>Przekręć pokrętło ostrości mikroskopu, aż widoczny będzie centralny kanał rdzenia kręgowego. 
	UWAGA: Łatwiej jest najpierw ustawić ostrość za pomocą światła przechodzącego, a następnie udoskonalić za pomocą fluorescencji.</li>
	<li>Zrób migawkę we fluorescencji i zapisz obraz w dedykowanym folderze.</li>
	<li>Otwórz obraz w ImageJ i w razie potrzeby dostosuj kontrast (za pomocą opcji Obraz/Dostosuj/Jasność/Kontrast...w ImageJ).</li>
	<li>Kliknij narzędzie do wyznaczania linii obszaru zainteresowania (ROI) i narysuj krótką linię (20 μm) wyśrodkowaną na rdzeniu kręgowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>Ustaw mikroskop w pozycji lustra w 100% odblaskowego.</li>
	<li>Załaduj skrypt ImageJ i kliknij przycisk Uruchom. Użyj następujących parametrów: Powtórzenie - 2; Próbka - 1; szerokość - 40 mikronów; Tłumienie - 89 (pełna moc lasera) (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C).</li>
	<li>Po zakończeniu sekwencji strzału laserowego przełącz się na obrazowanie fluorescencyjne w oprogramowaniu do obrazowania i w razie potrzeby dostosuj ostrość. 
	UWAGA: Często obserwuje się przesunięcie ostrości z powodu przemieszczenia ogona podczas ekspozycji lasera.</li>
	<li>Zrób nową migawkę i zapisz ją.</li>
	<li>Otwórz ten nowy obraz w ImageJ i narysuj nową linię, która powinna być większa niż sam rdzeń kręgowy (~80 μm), zaczynając poniżej brzusznej strony rdzenia kręgowego w górnej części struny grzbietowej i biegnąc w kierunku strony grzbietowej, aby zakończyć się w przestrzeni między rdzeniem kręgowym a skórą (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3B).</li>
	<li>Ustaw mikroskop w pozycji lustra w 100% odblaskowego.</li>
	<li>Przejdź do okna skryptu ImageJ i kliknij przycisk Uruchom. Użyj następujących parametrów: Powtórzenie - 2; Próbka - 1; szerokość - 40 mikronów; Tłumienie - 89 (pełna moc lasera).</li>
	<li>Po zakończeniu (dłuższej) sekwencji strzału laserowego sprawdź jakość przecięcia, obrazując fluorescencję i skupiając. Upewnij się, że żadna komórka lub aksony nie pozostały nienaruszone w miejscu uszkodzenia, które powinno wyglądać jako ciemny lub jako słaby i jednorodny obszar fluorescencyjny (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3D, dolny panel).</li>
	<li>Zbierz uszkodzone larwy do pustej płytki 96-dołkowej (z tymi samymi współrzędnymi studzienki, co w oryginalnej studzience), przechodząc do głównego okna oprogramowania VAST i klikając przycisk Zbierz.</li>
	<li>Włącz ponownie podświetlenie systemu VAST, klikając pole wyboru Podświetlenie zasobnika w lewym dolnym rogu okna.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.3-3.17 dla każdej nowej larwy, która ma zostać zraniona.</li>
</ol>
4. Postępowanie po zmianie chorobowej i dodatkowe eksperymenty
<ol>
	<li>Jak najszybciej wyjąć larwy z 96-dołkowej płytki i przenieść je na czystą szalkę Petriego ze świeżą wodą z pomieszczenia dla ryb, aby larwy mogły dojść do siebie po zmianie. Umieścić szalkę Petriego w inkubatorze w temperaturze 28 °C. 
	UWAGA: Uszkodzenie często kontynuuje rozprzestrzenianie się w ciągu pierwszej godziny po zmianie. Rzeczywisty zakres zmiany należy zatem ocenić za pomocą obrazowania fluorescencyjnego z opóźnieniem około 1 godziny.</li>
</ol>
5. Rozwiązywanie problemów
<ol>
	<li>Jeśli w rurkach i kapilarze systemu VAST znajdują się pęcherzyki powietrza, kliknij przycisk Prime w oknie LP Sampler, aby je usunąć.</li>
	<li>Należy wziąć pod uwagę nieudane zmiany chorobowe (oceniane na podstawie pozostałej fluorescencji w miejscu zmiany, poza oczekiwanym resztkowym i jednorodnym tłem), które mogą wynikać z kilku przyczyn wymienionych poniżej.
	<ol>
		<li>Niska moc lasera: W takim przypadku spróbuj użyć wyższej wartości. 
		UWAGA: System VAST wyposażony jest w laser barwnikowy. Oznacza to, że stężenie roztworu barwnika używanego do generowania światła laserowego może zmieniać się w czasie, prowadząc do spadku mocy lasera. Zastąpienie go nowym rozwiązaniem zwykle rozwiązuje problem22.</li>
		<li>Słaba kalibracja: W takim przypadku sprawdź kalibrację i moc systemu laserowego zgodnie z krokami 5.2.2.1-5.2.2.4. Jeśli nie zostanie prawidłowo skalibrowany, laser nie zostanie skierowany w pożądane miejsce, co prowadzi do nieudanych zmian lub niepożądanych uszkodzeń sąsiednich tkanek.
		<ol>
			<li>Umieść szkiełko lustrzane na górze komory kapilarnej. Skoncentruj się na powlekanej stronie (powinna być skierowana w stronę obiektywu). Użyj poprzedniego ustawienia domyślnego na slajdzie, aby łatwiej ustawić ostrość.</li>
			<li>Zastosuj wzór ablacji laserowej za pomocą skryptu kalibracyjnego.</li>
			<li>Oceń jakość wzoru. Plamy lub linie powinny być ostre i nie rozmyte.</li>
			<li>Użyj rampy o rosnącej mocy, aby ocenić, czy moc lasera zmieniła się w porównaniu z poprzednimi sesjami.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przemieszczanie się larw podczas zmian chorobowych: Larwy różnie reagują na znieczulenie, dlatego zmiana laserowa może wywoływać ruchy ogona podczas procesu, uniemożliwiając w ten sposób udaną transsekcję. Kiedy tak się stanie, wykonaj dodatkową iterację kroków zmiany laserowej, aby ją zakończyć, unikając uszkodzenia otaczających tkanek.</li>
		<li>Złe skupienie: Kiedy tak się stanie, skup się na środku kanału centralnego, aby uzyskać najlepsze wyniki.</li>
		<li>Rysunek, pozycja i rozmiar ROI: Pozycja i rozmiar ROI mają kluczowe znaczenie dla udanych przecięć. Zwrot z inwestycji powinien być większy niż rdzeń kręgowy i wyśrodkowany na środku rdzenia kręgowego. Aby rozwiązać ten problem, zacznij rysować ROI od brzusznej strony rdzenia kręgowego i idź w górę w kierunku strony grzbietowej, aby uzyskać udaną transcięcję. Jest to prawdopodobnie spowodowane ruchami ogona wywołanymi sekwencją strzałów laserowych podczas procedury ablacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+as+a+model+for+successful+central+nervous+system+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Restorative+Neurology+and+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration.</a> Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).</li>
<li>Ohnmacht, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+motor+neurons+are+regenerated+after+mechanical+lesion+and+genetic+ablation+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish.</a> Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).</li>
<li>Anguita-Salinas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dynamics+during+spinal+cord+regeneration+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish.</a> Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).</li>
<li>Chapela, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+drug+screening+platform+boosts+the+discovery+of+novel+therapeutics+for+spinal+cord+injury+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals.</a> Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).</li>
<li>Schlüßler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+mapping+of+spinal+cord+growth+and+repair+in+living+zebrafish+larvae+by+brillouin+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging.</a> Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).</li>
<li>Cavone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+macrophage+subpopulation+signals+directly+to+progenitor+cells+to+promote+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord.</a> Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).</li>
<li>Keatinge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+gRNA+phenotypic+screening+in+zebrafish+reveals+pro-regenerative+genes+in+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury.</a> PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).</li>
<li>National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nc3rs.org.uk">https://nc3rs.org.uk</a> (2021).</li>
<li>Hui, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+wide+expression+profiling+during+spinal+cord+regeneration+identifies+comprehensive+cellular+responses+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish.</a> PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).</li>
<li>Vasudevan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerated+interneurons+integrate+into+locomotor+circuitry+following+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).</li>
<li>Becker, T., Becker, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cell+interactions+allow+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).</li>
<li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+controls+pro-regenerative+Collagen+XII+in+functional+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).</li>
<li>Briona, L. K., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+transection+in+the+larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualised+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Spinal cord transection in the larval Zebrafish.</a> Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).</li>
<li>Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+regeneration+in+adult+Zebrafish+by+gentamicin+induced+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).</li>
<li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305 (5681), 254-258 (2004).</li>
<li>Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+mitochondrial+transport+in+single-axon+regeneration+of+zebrafish+mauthner+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).</li>
<li>Nichols, E. L., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regeneration+of+the+sensory+root+via+axonal+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion.</a> Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).</li>
<li>Ellström, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury+in+zebrafish+induced+by+near-infrared+femtosecond+laser+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).</li>
<li>Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+exit+the+CNS+in+spinal+root+avulsion%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia exit the CNS in spinal root avulsion.</a> PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).</li>
<li>Early, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+high-resolution+in+vivo+screen+in+zebrafish+to+identify+chemical+regulators+of+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination.</a> eLife. , 1-31 (2018).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>AndOr Micropoint Manual. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual">https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual</a> (2021).</li>
<li>Knafo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensory+neurons+control+the+timing+of+spinal+microcircuit+selection+during+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion.</a> eLife. 6, 25260(2017).</li>
<li>Tsarouchas, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+control+of+proinflammatory+cytokines+Il-1%CE%B2+and+Tnf-%CE%B1+by+macrophages+in+zebrafish+spinal+cord+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Howell, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHowell%2C+D+%22Statistical+methods+for+psychology%22">Statistical methods for psychology</a>. , Duxbury. 324-325 (2002).</li>
<li>Tukey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+individual+means+in+the+analysis+of+variance%5BTitle%5D)+AND+%22Biometrics%22%5BJournal%5D)">Comparing individual means in the analysis of variance.</a> Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).</li>
<li>Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+development+of+voltage-gated+Na%2B+and+K%2B+currents+regulates+functional+maturation+of+forebrain+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).</li>
<li>Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+long-term%2C+multi-channel+and+non-invasive+electrophysiology+platform+for+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li>
<li>Menelaou, E., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+control+of+locomotion+by+distinct+types+of+spinal+V2a+interneurons+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish.</a> Nature Communications. 10, 1-12 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieje pilna potrzeba głębszego zrozumienia procesów zachodzących podczas regeneracji u danio pręgowanego. Ten model zwierzęcy oferuje wiele korzyści dla badań biomedycznych, w szczególności w przypadku urazów rdzenia kręgowego1. Większość badań dotyczy zmian manualnych, które wymagają dobrze wyszkolonego operatora i wywołują uszkodzenia wielotkankowe. Przedstawiono tutaj protokół laserowego usuwania zmian, który pozwala na kontrolę charakterystyki zmiany i zmniejszenie uszkodzeń otaczających tk...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63259">Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae</a>. The title was&#160;updated.
The title was updated from:
Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
to:
Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63259">Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae</a>. The Title was&#160;updated.

Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

W przeciwieństwie do ssaków, danio pręgowany (Danio rerio) może naprawić swój centralny układ nerwowy (OUN) po urazie1. Wykorzystanie larw danio pręgowanego jako modelu regeneracji rdzenia kręgowego jest stosunkowo nowe. Okazało się to cenne w badaniu komórkowych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw naprawy2. Wynika to z łatwości manipulacji, krótkiego cyklu eksperymentalnego (nowe larwy co tydzień), optycznej przezroczystości tkanek i niewielkich rozmiarów larw, idealnie nadających się do mikroskopii fluorescencyjnej in vivo.
W przypadku regeneracji rdzenia kręgowego, dwie dodatkowe zalety korzystania z larw to szybkość rekonwalescencji, kilka dni w porównaniu do kilku tygodni u dorosłych, oraz łatwość wywoływania urazów przy użyciu technik manualnych. Zostało to z powodzeniem wykorzystane w wielu badaniach3,4,5, w tym w ostatnich badaniach6,7. Ogólnie rzecz biorąc, prowadzi to do zwiększenia produkcji znaczących danych, wysokiej zdolności adaptacyjnej protokołów eksperymentalnych i zmniejszenia kosztów eksperymentalnych. Wykorzystanie larw młodszych niż 5 dni po zapłodnieniu również zmniejsza wykorzystanie zwierząt zgodnie z zasadami 3R w badaniach na zwierzętach8.
Po urazie rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego zachodzi wiele procesów biologicznych, w tym reakcja zapalna, proliferacja komórek, neurogeneza, migracja ocalałych lub nowo powstałych komórek, reformacja funkcjonalnych aksonów oraz globalna przebudowa obwodów procesów nerwowych i tkanek kręgosłupa6,7,9,10. Aby procesy te mogły być skutecznie zaaranżowane, obejmują precyzyjnie regulowaną interakcję między szeregiem typów komórek, składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej i sygnałami biochemicznymi11,12. Odkrycie szczegółów tej znaczącej reorganizacji złożonej tkanki, takiej jak rdzeń kręgowy, wymaga zastosowania i opracowania precyzyjnych i kontrolowanych podejść eksperymentalnych.
Podstawowym eksperymentalnym paradygmatem używanym do badania regeneracji rdzenia kręgowego u ryb pręgowanych jest użycie środków chirurgicznych do wywołania uszkodzenia tkanek przez resekcję, dźgnięcie lub kriouraz3,13. Podejścia te mają tę wadę, że wymagają specjalnego szkolenia w zakresie umiejętności mikrochirurgicznych, co jest czasochłonne dla każdego nowego operatora i może uniemożliwić ich wykorzystanie w krótkoterminowych projektach. Ponadto zwykle wywołują uszkodzenia otaczających tkanek, co może wpływać na regenerację.
Innym podejściem jest chemiczne wywołanie uszkodzenia komórek14 lub za pomocą manipulacji genetycznych15. To ostatnie pozwala na zadawanie wysoce ukierunkowanych obrażeń. Jednak taka technika wymaga długich prac przygotowawczych, aby wygenerować nowe transgeniczne ryby przed przeprowadzeniem jakiegokolwiek eksperymentu, odnawiane za każdym razem, gdy celem jest unikalny typ komórek.
Istnieje zatem potrzeba metody pozwalającej na celowane, ale wszechstronne zmiany chorobowe, odpowiednie do różnych badań nad regeneracją. Rozwiązaniem jest użycie lasera do wywołania miejscowego uszkodzenia w tkance będącej przedmiotem zainteresowania16,17,18,19,20. Rzeczywiście, zastosowanie uszkodzeń tkanek wywołanych laserem stanowi solidne podejście do generowania uszkodzeń rdzenia kręgowego z wieloma zaletami. Mikroskopy wyposażone w takie moduły do manipulacji laserowej pozwalają na określenie niestandardowego kształtu obszaru, w którym nastąpi ablacja komórek, z dodatkową korzyścią w postaci kontroli czasowej. W ten sposób można dostosować wielkość i położenie zmiany do odpowiedzi na wszelkie pytania.
Brakującą cechą większości laserowych systemów do wykrywania uszkodzeń jest możliwość wywoływania urazów w wysoce powtarzalny sposób dla serii larw. Tutaj opisano oryginalny protokół wykorzystujący laser UV do indukowania półautomatycznych, precyzyjnych i kontrolowanych zmian u larw danio pręgowanego w oparciu o platformę mikroprzepływową zaprojektowaną do automatycznego obchodzenia się z larwami21. Co więcej, w prezentowanym tutaj systemie larwy są umieszczane w szklanej kapilarze, która umożliwia swobodne obracanie się zwierzęcia wokół jego osi ogonowej. Użytkownik może wybrać, którą stronę larwy zaprezentuje laserowi, jednocześnie umożliwiając obrazowanie fluorescencyjne w celu precyzyjnego wycelowania w wiązkę laserową i oceny uszkodzeń po zmianie.
Opisany tutaj protokół jest używany z półautomatycznym systemem obrazowania larw danio pręgowanego połączonym z wirującym dyskiem wyposażonym w laser UV (zwanym dalej systemem VAST). Jednak główne punkty protokołu i większość twierdzeń dotyczących tej techniki są ważne dla każdego systemu wyposażonego w laser zdolny do ablacji komórek, w tym dwufotonowych laserowych mikroskopów skaningowych, mikroskopów z wirującym dyskiem wyposażonych w laser UV (moduł FRAP) lub wideomikroskopów z modułem laserowym do obróbki zdjęć. Jedną z głównych różnic między systemem VAST a konwencjonalną obsługą próbek będzie to, że w przypadku tych drugich wymagane będzie umieszczenie larw w agarozie o niskiej temperaturze topnienia na szklanych szkiełkach nakrywkowych/szalkach Petriego ze szklanym dnem zamiast umieszczania ich na 96-dołkowej płytce.
Korzyści oferowane przez tę metodę otwierają możliwości dla innowacyjnych badań nad mechanizmami komórkowymi i molekularnymi podczas procesu regeneracji. Co więcej, wysoka jakość danych pozwala na prowadzenie badań ilościowych w kontekście multidyscyplinarnym.

<table><tbody><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Oprogramowanie Zen Blue 2.0</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/FIJI</td><td>Open-Source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visual Studio Code</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope i akcesoria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ApoTome</td> <td>mikroskopObiektyw do zanurzania Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-Plan-Apochromat 10X (0,5NA)</td> Podwójne kamery CCD <td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioCam 506 m</td> Carl Zeiss Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny <td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM880</td> Moduł wirującego <td>dysku Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop pionowyAxio Examiner D1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser UV</td><td>Micropoint</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VAST BioImager</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>90 mm szalka Petriego</td><td>Thermo-Fisher</td><td>101R20</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3841</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do obrazowania Click-It EdU</td><td>Invitrogen</td><td>C10637</td><td></td></tr><tr><td>ester metylowy kwasu aminobenzoesowego (MS222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>fenylotiomocznik (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey anty-kurczak Alexa Fluor 488</td><td>Jackson</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-mysz Cy3</td><td>Jackson</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-GFP</td><td>Abcam</td><td>AB13970</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało acetylowane antytubulinowe</td><td>Sigma</td><td>T6793</td><td></td></tr><tr><td>Transgeniczne linie danio pręgowanego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg(beta-aktyna:utrofina-mCherry)</td><td></td><td>N/A</td><td>Założona przez Davida Greenhalda, Uniwersytet w Edynburgu</td></tr><tr><td>Tg(mnx1:gfp)</td><td></td><td>N/A Po</td><td>raz pierwszy opisany w [Flanagan-Steet et al. 2005]</td></tr><tr><td>Tg(Xla.Tubb:DsRed)</td><td></td><td>N/A</td><td>Po raz pierwszy opisany w [Peri i Nusslein-Volhard 2008]</td></tr><tr><td>Tg(Xla.Tubb:DsRed; mpeg1:GFP)</td><td></td><td>N/A</td><td>Założona przez Katy Reid, Uniwersytet w Edynburgu</td></tr><tr><td>Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)</td><td></td><td>N/A</td><td>Założona przez Davida Greenhalda, Uniwersytet w Edynburgu</td></tr></tbody></table>

kontrolowane półautomatyczne urazy indukowane laserem do badania regeneracji rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Larwy danio pręgowanego posiadają w pełni funkcjonalny centralny układ nerwowy (OUN) o wysokiej zdolności regeneracyjnej zaledwie kilka dni po zapłodnieniu. To sprawia, że ten model zwierzęcy jest bardzo przydatny do badania urazów i regeneracji rdzenia kręgowego. Standardowym protokołem wywoływania takich zmian jest ręczna transekcja grzbietowej części tułowia. Jednak ta technika wymaga intensywnego treningu i uszkadza dodatkowe tkanki. Aby obejść te ograniczenia, opracowano protokół dla zmian wywołanych laserem, co pozwala na wysoką odtwarzalność i kompletność przecięcia rdzenia kręgowego u wielu zwierząt i między różnymi sesjami, nawet dla nieprzeszkolonego operatora. Co więcej, uszkodzenie tkanek ogranicza się głównie do samego rdzenia kręgowego, co zmniejsza mylące skutki uszkodzenia różnych tkanek, np. skóry, mięśni i OUN. Ponadto możliwe są uszkodzenia połowicze rdzenia kręgowego. Lepsze zachowanie integralności tkanek po urazie laserowym ułatwia dalsze sekcje potrzebne do dodatkowych analiz, takich jak elektrofizjologia. W związku z tym metoda ta zapewnia precyzyjną kontrolę zakresu urazu, który jest nieosiągalny ręcznie. Pozwala to w przyszłości na nowe paradygmaty eksperymentalne w tym potężnym modelu.

Walidacja przecięcia rdzenia kręgowego 
Przeprowadzono badania strukturalne i funkcjonalne, aby ocenić, czy protokół umożliwia całkowite przecięcie rdzenia kręgowego.
Po pierwsze, aby zweryfikować, czy utrata fluorescencji w miejscu zmiany wynikała z uszkodzenia tkanki neuronalnej, a nie z fotowyblaknięcia fluorescencji wywołanego naświetlaniem laserem, przeprowadzono immunobarwienie z użyciem przeciwciała przeciwko tubulinie acetylowanej (patrz Tabela materiałów<...

Obecny protokół opisuje metodę wywoływania specyficznych tkankowo i wysoce powtarzalnych urazów u larw danio pręgowanego za pomocą laserowego systemu uszkodzeń połączonego z automatyczną platformą mikroprzepływową do obsługi larw.

Kontrolowane półautomatyczne urazy indukowane laserem do badania regeneracji rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

Proponowana przez nas technika pozwala nam przezwyciężyć ograniczenia manualnych protokołów zmian chorobowych poprzez zmniejszenie uszkodzeń sąsiednich tkanek i poprawę odtwarzalności, nawet dla niedoświadczonych operatorów. Technika ta pozwala nam precyzyjnie wybrać, gdzie wywołać zmianę bez uszkadzania otaczających tkanek dzięki obrotowej szklanej kapilarze połączonej z celowanym laserem UV. Obsługa sprzętu VAST wiąże się z wieloma krokami, więc zalecałbym odhaczanie każdego kroku na bieżąco, aby upewnić się, że wszystko zostało wykonane poprawnie.Rozpocznij od znieczulenia larw za pomocą pożywki zawierającej środek znieczulający, a następnie przenieś je na 96-dołkową płytkę zawierającą 300 mikrolitrów pożywki na studzienkę. Włącz wszystkie elementy systemu, w tym laser do ablacji. Następnie uruchom automatyczne obrazowanie danio pręgowanego lub oprogramowanie VAST, wybierz Płyta w pierwszym oknie i kliknij przycisk Gotowe.Pojawi się małe okienko z pytaniem, czy kapilara jest pusta i czysta. Sprawdź obraz kapilary pod kątem pęcherzyków powietrza w środku. Jeśli w środku nie ma pęcherzyków powietrza, kliknij Tak w wyskakującym oknie.Następnie w oknie LP Sampler przejdź do menu Plik i wybierz opcję Otwórz skrypt. Wybierz plik zawierający skrypt odpowiadający eksperymentowi, który chcesz przeprowadzić. Następnie w głównym oknie oprogramowania VAST przejdź do Plik i wybierz Otwórz eksperyment.Wybierz plik eksperymentu odpowiadający planowanemu eksperymentowi. Uruchom oprogramowanie ImageJ/Fiji, przejdź do menu Plik i wybierz Nowy skrypt, aby otworzyć okno skryptu. Następnie przejdź do menu Plik i wybierz Otwórz, aby załadować skrypt zmiany laserowej.Następnie, aby uruchomić IDE języka Python, przejdź do menu Plik i wybierz Otwórz plik, aby załadować skrypt do zarządzania laserem. Następnie kliknij menu Uruchom i wybierz opcję Uruchom bez debugowania, aby uruchomić skrypt. Upewnij się, że podczas inicjalizacji tłumika laserowego na panelu terminali pojawia się sekwencja komunikatów wraz z pewnym szumem.W oknie głównym oprogramowania VAST kliknij przyciski strzałek, aby przesunąć stolik i wyśrodkować kapilarnę względem obiektywu mikroskopu. Spójrz przez okulary i skup się na górnej części kapilary za pomocą przechodzącego światła mikroskopu. Umieścić 96-dołkową płytkę zawierającą larwy na lewym uchwycie płytki próbnika LP.Następnie umieść kolejną płytkę do pobrania na prawym uchwycie płytki próbnika. Upewnij się, że wgłębienie A1 płytki znajduje się w lewym przednim rogu uchwytu. W oknie LP Sampler w oprogramowaniu VAST kliknij przycisk Szablon płytki i zaznacz wszystkie studzienki zawierające larwy.Kliknij przycisk OK, aby zatwierdzić i zamknąć okno. Następnie kliknij przycisk Uruchom płytkę w oknie LP Sampler, aby rozpocząć ładowanie larwy. Następnie przejdź do oprogramowania mikroskopu i kliknij przycisk Na żywo, aby zobrazować larwę.Przekręć pokrętło ostrości mikroskopu, aż widoczny będzie centralny kanał rdzenia kręgowego. Zrób migawkę we fluorescencji i zapisz obraz w folderze. Otwórz obraz w ImageJ i w razie potrzeby dostosuj kontrast.Kliknij narzędzie linii obszaru zainteresowania i narysuj krótką linię wyśrodkowaną na rdzeniu kręgowym. Przełącz mikroskop na 100% odblaskowe położenie lustra. Załaduj skrypt ImageJ i ustaw Powtórzenie na 2, Próbka na 1, Szerokość na 40 mikronów i Tłumienie na 89.Po ustawieniu wszystkich parametrów kliknij przycisk OK. Po zakończeniu sekwencji strzału laserowego przełącz się na obrazowanie fluorescencyjne w oprogramowaniu do obrazowania i dostosuj ostrość. Zrób nową migawkę i zapisz ją.Otwórz ten nowy obraz w ImageJ i narysuj nową linię większą niż sam rdzeń kręgowy. Przełącz mikroskop na 100% odblaskowe położenie lustra. Przejdź do okna skryptu ImageJ i ustaw Powtórzenie na 2, Próbka na 1, Szerokość na 40 mikronów i Tłumienie na 89.Po ustawieniu wszystkich parametrów kliknij przycisk OK. Po zakończeniu sekwencji strzału laserowego sprawdź jakość przecięcia, obrazując fluorescencję i ogniskując. Upewnij się, że żadne komórki ani aksony nie pozostały nienaruszone w miejscu uszkodzenia.Przejdź do głównego okna oprogramowania VAST i kliknij przycisk Zbierz, aby zebrać zmienione larwy do pustej płytki 96-dołkowej. Następnie kliknij pole wyboru podświetlenia zasobnika, aby ponownie włączyć podświetlenie systemu VAST. Jak najszybciej wyjmij larwę z 96-dołkowej płytki i przenieś ją na czystą szalkę Petriego ze świeżą wodą dla ryb, aby larwa mogła dojść do siebie po zmianie.Umieść szalkę Petriego w inkubatorze w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Barwienie immunologiczne acetylowanych tubuliny i obrazowanie wapnia wskazują, że zmiana laserowa całkowicie zaburza ciągłość tkanki rdzeniowej. Na tym zdjęciu pokazano nienaruszony rdzeń kręgowy.Całkowite przerwanie aksonów między stroną ogonową i rostralną zmiany potwierdza całkowite przecięcie rdzenia kręgowego. Przykład niepełnego przecięcia jest pokazany tutaj. Przecięty rdzeń kręgowy larwy larwy NBTG cAMP 6-S pokazano na tym obrazie.Prostokąty pokazują ROI używane do ilościowego określania intensywności fluorescencji po stronie rostralnej i ogonowej zmian. Obraz graficzny przedstawia zmianę intensywności fluorescencji w czasie w ROI analizy rostralnej i ogonowej. Pokazano tutaj obrazy fluorescencji projekcyjnej o maksymalnej intensywności larwy NBT:dsRed przed zmianą laserową, po trzech godzinach, 24 godzinach i 48 godzinach od zmiany laserowej.Po 24 godzinach od urazu rany zaczęły się zamykać, co doprowadziło do częściowego przywrócenia początkowej struktury rdzenia kręgowego po 48 godzinach. Częściowe przywrócenie funkcjonalne zostało potwierdzone po 48 godzinach od urazu za pomocą obrazowania wapniowego. Stosunek amplitudy kolców w okolicy ogonowej do obszaru rostralnego wykazał wzrost między 3, 24 i 48 godzinami po urazie.Rekrutację makrofagów obserwowano po zmianach laserowych przy użyciu zmian laserowych larw NBT:dsRed mpeg1 GFP. Nie zaobserwowano różnicy w liczbie znakowanych komórek między zmianami manualnymi i laserowymi. Ryby nieuszkodzone wykazywały mniej podwójnie znakowanych komórek niż ryby zmienione chorobowo w obu stanach zmiany.Zmiana laserowa powoduje mniejsze uszkodzenia mięśni i skóry niż zmiana manualna. Bardzo ważne jest, aby sprawdzić, czy zmiana jest całkowita, czy nie. W obszarze zmiany nie powinna być widoczna żadna nienaruszona komórka ani struktura, a jedynie przyciemnione tło.Do badania regeneracji rdzenia kręgowego wykorzystujemy wiele metod, w tym immunohistochemię i obrazowanie wapnia. Co ważne, możemy również wykonać elektrofizjologię, ponieważ tkanka jest odporna na preparację, w przeciwieństwie do zwierząt poddanych ręcznym zmianom. Ta nowa technika pozwala nam na ilościowe badanie strukturalnej i funkcjonalnej organizacji tkanek w rdzeniu kręgowym po urazie, umożliwiając powtarzalne i kontrolowane zmiany chorobowe.

controlled-semi-automated-laser-induced-injuries-for-studying-spinal

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W niniejszej pracy opisujemy metodę montowania embrionów zebrafish do długotrwałego obrazowania, obrazowania dwufotonowego, technik uszkadzania tkanek oraz konfokalnego obrazowania time-lapse.

Dwufotonowa aksotomia i konfokalne obrazowanie time-lapse w żywych embrionach danio pręgowanego

Przedstawiona tutaj metoda obejmuje precyzyjne uszkadzanie żywych zarodków rybek danio (*zebrafish*) za pomocą wysokenergetycznych impulsów laserowych oraz późniejszą analizę tych obrażeń i ich regeneracji w czasie. Pokazujemy również, w jaki sposób można śledzić pojedyncze lub grupy genetycznie znakowanych komórek mięśni szkieletowych podczas i po uszkodzeniu indukowanym światłem laserowym.

Laserowe uszkodzenie szkieletowej muskulatury embrionów danio-ostrolepnego

Ten film demonstruje procedurę wywoływania zwyrodnienia siatkówki u dorosłych ryb pręgowanych za pomocą uszkodzenia laserowego. Laser celuje w komórki fotoreceptorowe w siatkówce, wywołując śmierć komórki i proces zwyrodnieniowy. To uszkodzenie aktywuje komórki glejowe Müllera (MG), prowadząc do ich odróżnicowania w komórki progenitorowe komórek macierzystych, które pomagają w regeneracji siatkówki.

Modelowanie zwyrodnienia i regeneracji siatkówki u danio pręgowanego za pomocą ogniskowego urazu laserowego

Źródło: Volpe, B. A., et al.  Test ablacji i regeneracji laserowej oparty na mikroskopie konfokalnym w komórkach międzynerwowych danio pręgowanego. J. vis. exp.{{TAG_ 31}} (2020) Ten film pokazuje monitorowanie odzyskiwania komórek międzynerwowych u danio pręgowanego za pomocą mikroskopii konfokalnej, śledzenie śmierci i naprawy komórek za pomocą poklatkowego obrazowania fluorescencyjnego.

Monitorowanie odzyskiwania komórek międzynerwowych ablowanych laserowo u danio pręgowanego za pomocą mikroskopii konfokalnej

Chociaż obwodowy układ nerwowy (PNS) jest zdolny do znacznej naprawy po urazie, niewiele wiadomo o komórkowych i molekularnych mechanizmach rządzących tym zjawiskiem. Korzystając z żywego, transgenicznego danio pręgowanego i powtarzalnego testu przecięcia nerwów, możemy badać dynamiczne zachowania komórek glejowych podczas degeneracji i regeneracji nerwów.

Przekrój nerwu ruchowego i obrazowanie poklatkowe zachowań komórek glejowych u żywych danio pręgowanego

Po przecięciu kręgosłupa, dorosłe rybki pręgowane wracają do stanu funkcjonalnego w ciągu sześciu tygodni po urazie. Aby wykorzystać przezroczystość larw i szybszy powrót do zdrowia, przedstawiamy metodę transekcji rdzenia kręgowego larwy. Po przecięciu obserwujemy regenerację czuciową rozpoczynającą się po 2 dniach od urazu i ruch zgięcia C po 3 dniach od urazu.

Przekrój rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Aby rzucić światło na komórkowe i molekularne mechanizmy neurogenezy i regeneracji dorosłego danio pręgowanego, opracowaliśmy protokół inwazyjnej chirurgii powodującej mechaniczne urazy u dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego i późniejszego monitorowania zmian w ugodzonej półkuli za pomocą immunohistochemii lub hybrydyzacji in situ.

Rana kłuta dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego: metoda badania neurogenezy i regeneracji mózgu kręgowców

Ukierunkowane manipulacje mające na celu wywołanie ukierunkowanego stresu lub śmierci w poszczególnych komórkach były stosunkowo trudne do osiągnięcia. W tym artykule opisano metodę ablacji w rozdzielczości pojedynczej komórki, polegającą na selektywnym stresowaniu i zabijaniu pojedynczych komórek w hodowli komórkowej i żywych zwierzętach, w oparciu o standardowy konfokalny laser UV.

Wyzwalanie stresu i śmierci komórek za pomocą konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej z laserem UV

Danio pręgowany jest popularnym modelem zwierzęcym do badania mechanizmów degeneracji/regeneracji siatkówki u kręgowców. Protokół ten opisuje metodę wywoływania miejscowego urazu zakłócającego zewnętrzną siatkówkę przy minimalnym uszkodzeniu wewnętrznej siatkówki. Następnie monitorujemy in vivo morfologię siatkówki i odpowiedź glejową Müllera przez cały okres regeneracji siatkówki.

Aktywacja komórek glejowych Müllera w indukowanym laserowo modelu zwyrodnienia i regeneracji siatkówki u danio pręgowanego

Laserowa ablacja jest szeroko stosowaną technologią do badania regeneracji w systemach biologicznych. Prezentowany protokół opisuje zastosowanie standardowego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego do ablacji laserowej, a następnie obrazowania poklatkowego regenerujących się komórek międzynerwowych w linii bocznej danio pręgowanego.

Test ablacji i regeneracji laserowej oparty na mikroskopie konfokalnym w komórkach międzynerwowych danio pręgowanego

Ten protokół opisuje dwufotonową ablację laserową przeprowadzaną na larwach danio pręgowanego, która służy jako model do badania regeneracji kości i efektów odpowiedzi immunologicznej na ablację.

Dwufotonowa, laserowa ablacja osteoblastów w rozwijających się larwach danio pręgowanego

Naucz się kontrolowanej metody laserowej do indukowania urazów rdzenia kręgowego u larw Danio rerio. Technika zwiększa powtarzalność i minimalizuje uszkodzenia tkanek sąsiednich w badaniach nad regeneracją.

Kontrolowane półautomatyczne urazy indukowane laserem do badania regeneracji rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów