Kontrolowane półautomatyczne urazy indukowane laserem do badania regeneracji rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Proponowana przez nas technika pozwala nam przezwyciężyć ograniczenia manualnych protokołów zmian chorobowych poprzez zmniejszenie uszkodzeń sąsiednich tkanek i poprawę odtwarzalności, nawet dla niedoświadczonych operatorów. Technika ta pozwala nam precyzyjnie wybrać, gdzie wywołać zmianę bez uszkadzania otaczających tkanek dzięki obrotowej szklanej kapilarze połączonej z celowanym laserem UV. Obsługa sprzętu VAST wiąże się z wieloma krokami, więc zalecałbym odhaczanie każdego kroku na bieżąco, aby upewnić się, że wszystko zostało wykonane poprawnie.

Rozpocznij od znieczulenia larw za pomocą pożywki zawierającej środek znieczulający, a następnie przenieś je na 96-dołkową płytkę zawierającą 300 mikrolitrów pożywki na studzienkę. Włącz wszystkie elementy systemu, w tym laser do ablacji. Następnie uruchom automatyczne obrazowanie danio pręgowanego lub oprogramowanie VAST, wybierz Płyta w pierwszym oknie i kliknij przycisk Gotowe.

Pojawi się małe okienko z pytaniem, czy kapilara jest pusta i czysta. Sprawdź obraz kapilary pod kątem pęcherzyków powietrza w środku. Jeśli w środku nie ma pęcherzyków powietrza, kliknij Tak w wyskakującym oknie.

Następnie w oknie LP Sampler przejdź do menu Plik i wybierz opcję Otwórz skrypt. Wybierz plik zawierający skrypt odpowiadający eksperymentowi, który chcesz przeprowadzić. Następnie w głównym oknie oprogramowania VAST przejdź do Plik i wybierz Otwórz eksperyment.

Wybierz plik eksperymentu odpowiadający planowanemu eksperymentowi. Uruchom oprogramowanie ImageJ/Fiji, przejdź do menu Plik i wybierz Nowy skrypt, aby otworzyć okno skryptu. Następnie przejdź do menu Plik i wybierz Otwórz, aby załadować skrypt zmiany laserowej.

Następnie, aby uruchomić IDE języka Python, przejdź do menu Plik i wybierz Otwórz plik, aby załadować skrypt do zarządzania laserem. Następnie kliknij menu Uruchom i wybierz opcję Uruchom bez debugowania, aby uruchomić skrypt. Upewnij się, że podczas inicjalizacji tłumika laserowego na panelu terminali pojawia się sekwencja komunikatów wraz z pewnym szumem.

W oknie głównym oprogramowania VAST kliknij przyciski strzałek, aby przesunąć stolik i wyśrodkować kapilarnę względem obiektywu mikroskopu. Spójrz przez okulary i skup się na górnej części kapilary za pomocą przechodzącego światła mikroskopu. Umieścić 96-dołkową płytkę zawierającą larwy na lewym uchwycie płytki próbnika LP.

Następnie umieść kolejną płytkę do pobrania na prawym uchwycie płytki próbnika. Upewnij się, że wgłębienie A1 płytki znajduje się w lewym przednim rogu uchwytu. W oknie LP Sampler w oprogramowaniu VAST kliknij przycisk Szablon płytki i zaznacz wszystkie studzienki zawierające larwy.

Kliknij przycisk OK, aby zatwierdzić i zamknąć okno. Następnie kliknij przycisk Uruchom płytkę w oknie LP Sampler, aby rozpocząć ładowanie larwy. Następnie przejdź do oprogramowania mikroskopu i kliknij przycisk Na żywo, aby zobrazować larwę.

Przekręć pokrętło ostrości mikroskopu, aż widoczny będzie centralny kanał rdzenia kręgowego. Zrób migawkę we fluorescencji i zapisz obraz w folderze. Otwórz obraz w ImageJ i w razie potrzeby dostosuj kontrast.

Kliknij narzędzie linii obszaru zainteresowania i narysuj krótką linię wyśrodkowaną na rdzeniu kręgowym. Przełącz mikroskop na 100% odblaskowe położenie lustra. Załaduj skrypt ImageJ i ustaw Powtórzenie na 2, Próbka na 1, Szerokość na 40 mikronów i Tłumienie na 89.

Po ustawieniu wszystkich parametrów kliknij przycisk OK. Po zakończeniu sekwencji strzału laserowego przełącz się na obrazowanie fluorescencyjne w oprogramowaniu do obrazowania i dostosuj ostrość. Zrób nową migawkę i zapisz ją.

Otwórz ten nowy obraz w ImageJ i narysuj nową linię większą niż sam rdzeń kręgowy. Przełącz mikroskop na 100% odblaskowe położenie lustra. Przejdź do okna skryptu ImageJ i ustaw Powtórzenie na 2, Próbka na 1, Szerokość na 40 mikronów i Tłumienie na 89.

Po ustawieniu wszystkich parametrów kliknij przycisk OK. Po zakończeniu sekwencji strzału laserowego sprawdź jakość przecięcia, obrazując fluorescencję i ogniskując. Upewnij się, że żadne komórki ani aksony nie pozostały nienaruszone w miejscu uszkodzenia.

Przejdź do głównego okna oprogramowania VAST i kliknij przycisk Zbierz, aby zebrać zmienione larwy do pustej płytki 96-dołkowej. Następnie kliknij pole wyboru podświetlenia zasobnika, aby ponownie włączyć podświetlenie systemu VAST. Jak najszybciej wyjmij larwę z 96-dołkowej płytki i przenieś ją na czystą szalkę Petriego ze świeżą wodą dla ryb, aby larwa mogła dojść do siebie po zmianie.

Umieść szalkę Petriego w inkubatorze w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Barwienie immunologiczne acetylowanych tubuliny i obrazowanie wapnia wskazują, że zmiana laserowa całkowicie zaburza ciągłość tkanki rdzeniowej. Na tym zdjęciu pokazano nienaruszony rdzeń kręgowy.

Całkowite przerwanie aksonów między stroną ogonową i rostralną zmiany potwierdza całkowite przecięcie rdzenia kręgowego. Przykład niepełnego przecięcia jest pokazany tutaj. Przecięty rdzeń kręgowy larwy larwy NBTG cAMP 6-S pokazano na tym obrazie.

Prostokąty pokazują ROI używane do ilościowego określania intensywności fluorescencji po stronie rostralnej i ogonowej zmian. Obraz graficzny przedstawia zmianę intensywności fluorescencji w czasie w ROI analizy rostralnej i ogonowej. Pokazano tutaj obrazy fluorescencji projekcyjnej o maksymalnej intensywności larwy NBT:dsRed przed zmianą laserową, po trzech godzinach, 24 godzinach i 48 godzinach od zmiany laserowej.

Po 24 godzinach od urazu rany zaczęły się zamykać, co doprowadziło do częściowego przywrócenia początkowej struktury rdzenia kręgowego po 48 godzinach. Częściowe przywrócenie funkcjonalne zostało potwierdzone po 48 godzinach od urazu za pomocą obrazowania wapniowego. Stosunek amplitudy kolców w okolicy ogonowej do obszaru rostralnego wykazał wzrost między 3, 24 i 48 godzinami po urazie.

Rekrutację makrofagów obserwowano po zmianach laserowych przy użyciu zmian laserowych larw NBT:dsRed mpeg1 GFP. Nie zaobserwowano różnicy w liczbie znakowanych komórek między zmianami manualnymi i laserowymi. Ryby nieuszkodzone wykazywały mniej podwójnie znakowanych komórek niż ryby zmienione chorobowo w obu stanach zmiany.

Zmiana laserowa powoduje mniejsze uszkodzenia mięśni i skóry niż zmiana manualna. Bardzo ważne jest, aby sprawdzić, czy zmiana jest całkowita, czy nie. W obszarze zmiany nie powinna być widoczna żadna nienaruszona komórka ani struktura, a jedynie przyciemnione tło.

Do badania regeneracji rdzenia kręgowego wykorzystujemy wiele metod, w tym immunohistochemię i obrazowanie wapnia. Co ważne, możemy również wykonać elektrofizjologię, ponieważ tkanka jest odporna na preparację, w przeciwieństwie do zwierząt poddanych ręcznym zmianom. Ta nowa technika pozwala nam na ilościowe badanie strukturalnej i funkcjonalnej organizacji tkanek w rdzeniu kręgowym po urazie, umożliwiając powtarzalne i kontrolowane zmiany chorobowe.