Name: Oczyszczanie endogennych kanałów potencjału przejściowego receptora Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania pełnowymiarowych kanałów TRP z głów muszki owocówki Drosophila wykorzystującą kompleks białkowy INAD i niklowe koraliki. Ta technika umożliwia badanie właściwości elektrofizjologicznych i strukturalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Guangdong, Chiny (nr 2021A1515010796) dla W. L. Dziękujemy LetPub (www.letpub.com) za pomoc językową podczas przygotowywania tego manuskryptu.

1. Oczyszczanie fragmentów TRP i NORPA oznaczonych tagiem GST
<ol>
	<li>Oczyść fragment TRP 1261-1275 oznaczony GST
	<ol>
		<li>Przekształć plazmid pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 class10 w komórki Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) przy użyciu metody transformacji szoku cieplnego CaCl221. Zaszczepić pojedynczą kolonię w 10 ml pożywki Luria Bertani (LB) i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C. Następnie amplifikować 10 ml kultury siewnej w 1 l pożywki LB w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Gdy gęstość optyczna (OD600) komórek osiągnie 0,5, schłodzić komórki do 16 °C i dodać 0,1 mM izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG; stężenie końcowe) w celu wywołania nadekspresji białka docelowego i inkubować w temperaturze 16 °C przez 18 godzin.</li>
		<li>Po nadekspresji, osadzać 1 l hodowanych komórek przez odwirowanie przy 3,993 × g przez 20 minut i ponownie zawiesić w 40 ml buforowanego fosforanem buforu soli fizjologicznej (PBS).</li>
		<li>Załadować zawieszone komórki do homogenizatora wysokociśnieniowego wstępnie schłodzonego w temperaturze 4 °C. Powoli zwiększać ciśnienie homogenizatora do 800 barów. Otwórz kran wlotowy i pozwól zawieszonym komórkom przejść okrężnie przez zawór z bardzo wąskimi szczelinami. 
		UWAGA: Ogniwa są homogenizowane przez duże siły ścinające spowodowane dużym spadkiem ciśnienia i kawitacją.</li>
		<li>Załaduj 5 ml kulek glutationu do kolumny przepływu grawitacyjnego i przemyj kulki 50 ml buforu PBS w sumie trzy razy.</li>
		<li>Odwirować lizat komórkowy z homogenizatora wysokociśnieniowego przy 48,384 x g. Dodać supernatant z odwirowanego lizatu komórkowego (40 ml) do zrównoważonych kulek glutationu w kolumnie grawitacyjnej i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić kulki glutationu co 10 minut.</li>
		<li>Po 30 minutach inkubacji otwórz kurek wylotowy kolumny, aby oddzielić kulki i frakcję przepływową. Odrzuć frakcję przepływową. Pozostałe kulki glutationu przepłukać dwukrotnie 50 ml buforu PBS.</li>
		<li>Dodać 15 ml buforu elucyjnego do kulek glutationu i inkubować przez 30 minut. Ponownie zawiesić kulki co 10 minut.</li>
		<li>Po 30 minutach inkubacji eluować fragment TRP 1261-1275 oznaczony GST w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i załadować do kolumny wykluczającej wielkość (stopień przygotowania), która jest równoważona przy użyciu buforu 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).</li>
		<li>Utrzymuj natężenie przepływu elucji w kolumnie wykluczającej wielkość na poziomie 3 ml/min. Zebrać eluowane białka z szybkością 5 ml / probówkę.</li>
		<li>Zidentyfikować pik białka docelowego w kolumnie wykluczającej rozmiar, analizując sygnały absorpcyjne UV przy 280 nm i zweryfikować za pomocą analizy żelu SDS-PAGE (parametry elektroforezy: 150 V dla żelu do układania; 200 V dla żelu rozdzielczego). Żel zabarwić kolorem Coomassie blue R250.</li>
		<li>Zagęścić oczyszczony fragment TRP 1261-1275 oznaczony GST z kolumny wykluczającej wielkość do 1 ml za pomocą 15 ml ultrafiltracyjnej kolumny wirowej odwirowanej przy 3 000 x g w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem biurkowym.</li>
		<li>Określ stężenie skoncentrowanego białka za pomocą prawa Beera-Lamberta. Zmierz absorpcję promieniowania UV fragmentu TRP 1261-1275 oznaczonego GST przy długości fali 280 nm za pomocą spektrofotometru.</li>
		<li>Uzyskaj współczynnik ekstynkcji przy 280 nm, importując sekwencje białek do programu Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Zazwyczaj 1 l kultury TRP 1261-1275 oznaczonego GST daje 1 ml 600 μM białka (6 x 10-7 mol). Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z potrzebnymi materiałami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczenie oznaczonego przez niego fragmentu NORPA 863-1095
	<ol>
		<li>Przekształć plazmid20 plazmidu pETM.3C NORPA 863-1095 w komórki E. coli BL21 (DE3) za pomocą metody transformacji szoku cieplnego CaCl221. Zaszczepić pojedynczą kolonię w 10 ml pożywki LB i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C. Następnie amplifikować 10 ml kultury siewnej w 1 l pożywki LB w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Gdy OD600 komórek osiągnie 0,5, schłodzić komórki do 16 °C i dodać 0,1 mM IPTG (stężenie końcowe) w celu wywołania nadekspresji białka docelowego i inkubować w temperaturze 16 °C przez 18 godzin.</li>
		<li>Po nadekspresji, osadzać 1 l hodowanych komórek przez odwirowanie przy 3,993 x g przez 20 minut i ponownie zawiesić w 40 ml buforu wiążącego. Następnie poddać lizie zawieszone komórki w homogenizatorze wysokociśnieniowym w temperaturze 4 °C, jak opisano w kroku 1.1.4.</li>
		<li>Załaduj 5 ml kulek niklu do kolumny przepływu grawitacyjnego i przemyj trzykrotnie 50 ml buforu wiążącego.</li>
		<li>Odwirować lizat komórkowy z homogenizatora wysokociśnieniowego przy 48,384 x g. Dodać supernatant z odwirowanego lizatu komórkowego do zrównoważonych kulek niklu w kolumnie grawitacyjnej i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić kulki niklu co 10 minut.</li>
		<li>Po 30 minutach inkubacji otwórz kurek wylotowy kolumny, aby oddzielić kulki i frakcję przepływową. Odrzucić frakcję przepływową i dwukrotnie przepłukać pozostałe kulki niklu 50 ml buforu do mycia.</li>
		<li>Dodać 15 ml buforu elucyjnego do kulek niklu i inkubować przez 30 minut. Ponownie zawiesić kulki niklu co 10 minut.</li>
		<li>Po 30 minutach inkubacji zebrać wymyty fragment NORPA 863-1095 znakowany Hisem w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i załadować do kolumny wykluczającej wielkość (stopień przygotowania), która jest równoważona przy użyciu 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).</li>
		<li>Utrzymuj natężenie przepływu elucji w kolumnie wykluczającej wielkość na poziomie 3 ml/min. Zebrać eluowane białko z szybkością 5 ml / probówkę.</li>
		<li>Zidentyfikować pik białka docelowego w kolumnie wykluczającej rozmiar, analizując sygnały absorpcyjne UV przy 280 nm i zweryfikować za pomocą analizy żelu SDS-PAGE (parametry elektroforezy: 150 V dla żelu do układania; 200 V dla żelu rozdzielczego). Odbarwić żel za pomocą Coomassie blue R250.</li>
		<li>Zagęścić oczyszczony fragment NORPA 863-1095 oznaczony znakiem His z kolumny wykluczającej wielkość do 1 ml za pomocą 15 ml ultrafiltracyjnej kolumny wirowej odwirowanej przy 3 000 x g w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem biurkowym.</li>
		<li>Określ stężenie skoncentrowanego białka za pomocą prawa Beera-Lamberta. Zmierz absorpcję promieniowania UV fragmentu NORPA 863-1095 oznaczonego przez Hisa przy długości fali 280 nm za pomocą spektrofotometru.</li>
		<li>Uzyskaj współczynnik ekstynkcji przy 280 nm, importując sekwencje białek do programu Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Zazwyczaj 1 l kultury znakowanego przez Hisa fragmentu NORPA 863-1095 daje 1 ml 600 μM białka (6 x 10-7 mol). Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z potrzebnymi materiałami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie głów Drosophila
<ol>
	<li>Dorosłe muchy należy zebrać do stożkowych probówek wirujących o pojemności 50 ml przy użyciu metody znieczulaniaCO2 22,23; natychmiast zamrozić w ciekłym azocie na 10 minut i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80°C.</li>
	<li>Po zebraniu wystarczającej liczby much energicznie potrząśnij ręcznie zamrożonymi stożkowymi probówkami o pojemności 50 ml, aby oddzielić nogi, głowy, skrzydła i ciała much. Przenieś mieszaninę na trzy kolejno ułożone w stosy, wstępnie schłodzone sita ze stali nierdzewnej (odpowiednio rozmiar oczek 20/30/40) i potrząśnij sitami.</li>
	<li>Następnie, ponieważ głowice nie mogą przejść przez sito o oczkach 40, należy użyć szczotki, aby zmieść głowice muchowe z sita o oczkach 40, przenieść je do probówek stożkowych o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Ciągle zbieraj muchy i ich głowy i przechowuj je w zamrażarce o temperaturze -80 °C, aż osiągną wymaganą ilość potrzebną do eksperymentów (0,5 g). Zazwyczaj, aby zebrać 0,5 g głów, potrzeba 35 ml much w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Patrz Tabela 3, aby zapoznać się z potrzebnymi materiałami.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie kanału TRP Drosophila
<ol>
	<li>Zważyć łącznie 0,5 g główek i całkowicie zhomogenizować w ciekłym azocie za pomocą wstępnie schłodzonego tłuczka moździerzowego. Rozpuścić homogenizowane głowice w 10 x v/w buforze do lizy (5 ml), inkubować w wytrząsarce w temperaturze 4 °C przez 20 minut, a następnie odwirować w temperaturze 20,817 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać supernatant z odwirowaniem ("20817 g S", Rysunek 4) i dalej odwirować go przy 100 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C. Użyć supernatantu z odwirowaniem ("100 000 g S", Rysunek 4) do następnego testu pull-down.</li>
	<li>Dodać 1 ml kulek niklu do kolumny przepływu grawitacyjnego i przemyć kulki 10 ml podwójnie destylowanegoH2O(ddH2O) w temperaturze 4 °C, w sumie trzykrotnie. Zrównoważyć kulki trzykrotnie w 10 objętościach kolumny buforu do lizy w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 500 μl oczyszczonego białka NORPA 863-1095 znakowanego Hisem (3 x 10-7 mol) o stężeniu 600 μM do kolumny niklu i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić kulki co 10 minut.</li>
	<li>Otwórz kran wylotowy kolumny, aby oddzielić kulki i frakcję przepływową. Weźmy frakcję przepływową do analizy SDS-PAGE (NORPA F, <silna klasa="xfig">Rysunek 4). W tej sekcji białka przynęty są unieruchomione na kulkach Ni.</li>
	<li>Przemyć kulki niklu 10 objętościami kolumny buforu do lizy (10 ml) w temperaturze 4 °C i zachować frakcję płuczącą do analizy SDS-PAGE (Wash 1, <silna klasa="xfig">Rysunek 4A). Powtórz powyższe kroki i zachowaj próbkę do analizy SDS-PAGE (Wash 2, Rysunek 4A). W tej sekcji usuwane są nadmierne białka przynęty na kulkach Ni.</li>
	<li>Dodać supernatant homogenatu głowy Drosophila po odwirowaniu 100 000 x g do kolumny niklu w temperaturze 4 °C, gdzie unieruchomiony został fragment NORPA 863-1095 oznaczony przez Hisa.</li>
	<li>Inkubować supernatant z kulkami niklu w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Ponownie zawiesić kulki co 10 minut. Następnie otwórz kran wylotowy kolumny, aby oddzielić kulki i frakcję przepływową.</li>
	<li>Zebrać supernatant do analizy SDS-PAGE (Dro head lysis F, Rysunek 4A). W tej sekcji kompleksy białkowe INAD (INAD/TRP/EPKC) w homogenatach głowy są wychwytywane przez unieruchomione fragmenty NORPA 863-1095 na kulkach Ni.</li>
	<li>Przemyć kulki niklu 10 objętościami kolumny buforu do lizy (10 ml) w temperaturze 4 °C i chronić supernatant przed wytrącaniem grawitacyjnym do analizy SDS-PAGE (Wash 3, <silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A). Powtórz powyższe kroki i zbierz supernatant do analizy SDS-PAGE (Wash 4, Rysunek 4A). W tej sekcji niezwiązane białka na kulkach Ni są usuwane.</li>
	<li>Dodać 500 μl z 600 μM białka TRP 1261-1275 znakowanego GST (3 x 10-7 mol) do kulek niklu i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić kulki co 10 minut.</li>
	<li>Zbierz eluowaną frakcję z kolumny grawitacyjnej (TRP E1, <silna klasa="xfig">Rysunek 4B), która zawiera endogenny kanał TRP Drosophila. Powtórz powyższe kroki i zbierz frakcję elucyjną (TRP E2, <silna klasa="xfig">Rysunek 4B). W tym etapie, używając fragmentów TRP 1261-1275 oznaczonych GST jako konkurenta, kanały TRP są eluowane z przechwyconych kompleksów białkowych INAD (INAD/TRP/EPKC) na kulkach Ni.</li>
	<li>Przemyć kulki niklowe 10 objętościami kolumny buforu wiążącego (10 ml; Tabela 1) w temperaturze 4 °C i zebrać frakcję płuczącą do analizy SDS-PAGE (Wash 5, <silna klasa="xfig">Rysunek 4B).</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu elucyjnego (Tabela 1) do kulek niklu i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać frakcję elucyjną z kolumny przepływu grawitacyjnego (NORPA E1, <klasa silna = "xfig">Rysunek 4B). Powtórz powyższe kroki i zbierz frakcję elucyjną (NORPA E2, <silna klasa="xfig">Rysunek 4B).</li>
	<li>Za pomocą buforu elucyjnego eluować znakowany Hisem fragment NORPA 863-1095 w towarzystwie kompleksów białkowych INAD/ePKC. Następnie ponownie zawieś kulki niklowe w 500 μl buforu wiążącego.</li>
	<li>Weź ponownie zawieszone kulki Ni, aby uruchomić SDS-PAGE (barwiony na niebiesko Coomassie R250), aby przeanalizować wydajność elucji i ocenić, czy bufor elucji działa (koraliki, <silna klasa = "xfig">Rysunek 4B). Patrz Tabela 4, aby zapoznać się z potrzebnymi materiałami.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie kanału TRP Drosophila w kolumnie wykluczającej rozmiar
<ol>
	<li>Zainstalować kolumnę wykluczającą wielkość (klasa analityczna) w systemie oczyszczania białek. Zrównoważyć kolumnę z buforem kolumny (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM), który jest filtrowany przez filtr 0,45 μm.</li>
	<li>Zagęścić frakcję TRP E1 i E2 z kroku 3.14 za pomocą 4 ml ultrafiltracyjnej kolumny wirowej, odwirowanej przy 3 000 x g w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem.</li>
	<li>Przepłukać pętlę próbki za pomocą buforu kolumny i załadować próbkę do pętli próbki. Wstrzyknąć próbkę do kolumny wykluczającej wielkość i wymyć białka z odpowiednią szybkością przepływu (0,5 ml/min).</li>
	<li>Zidentyfikuj pik białka docelowego przez absorpcję przy 280 nm i uruchom żel SDS-PAGE w celu wykrycia oczyszczonego endogennego kanału TRP Drosophila (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5). Patrz Tabela 5, aby zapoznać się z potrzebnymi materiałami.</li>
</ol>

<ol><li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).</li>
<li>Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyunsaturated+fatty+acids+activate+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL.</a> Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).</li>
<li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+binds+to+Drosophila+TRP+with+an+unexpected+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode.</a> Structure. 29 (4), 330-344 (2021).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intracellular+Ca2%2B+chelation+on+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).</li>
<li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li>
<li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide-mediated+phototransduction+in+Drosophila+photoreceptors%3A+the+role+of+Ca2%2B+and+trp%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp.</a> Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).</li>
<li>Delgado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+opening+of+the+TRP+channel+in+isolated+membrane+patches+excised+from+photosensitive+microvilli+from+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors.</a> Neuroscience. 396, 66-72 (2019).</li>
<li>Lev, S., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activity+of+the+TRP-like+channel+depends+on+its+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">The activity of the TRP-like channel depends on its expression system.</a> Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).</li>
<li>Hardie, R. C., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+heterologously+expressed+Drosophila+TRPL+channels%3A+Ca2%2B+is+not+required+and+InsP3+is+not+sufficient%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient.</a> Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).</li>
<li>Gutorov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+transient+receptor+potential+C+channel+activity+by+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 1487(2019).</li>
<li>Yagodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thapsigargin+and+receptor-mediated+activation+of+Drosophila+TRPL+channels+stably+expressed+in+a+Drosophila+S2+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line.</a> Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).</li>
<li>Guo, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+structural+studies+on+canonical+TRP+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels.</a> Cell Calcium. 83, 102075(2019).</li>
<li>Li, X., Fine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRP+channel%3A+The+structural+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">TRP channel: The structural era.</a> Cell Calcium. 87, 102191(2020).</li>
<li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li>
<li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+INAD+scaffold+is+a+dynamic%2C+redox-regulated+modulator+of+signaling+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye.</a> Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).</li>
<li>Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+exquisitely+specific+PDZ%2Ftarget+recognition+revealed+by+the+structure+of+INAD+PDZ3+in+complex+with+TRP+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel.</a> Structure. 24 (3), 383-391 (2016).</li>
<li>Ye, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+INAD+PDZ+tandem-mediated+plc%CE%B2+binding+in+Drosophila+photo+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+heat+shock+step+on+bacterial+transformation+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency.</a> Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+laboratory+handbook.+Second+Edition%22">Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition</a>. 80 (2), The Quarterly Review of Biology. (2005).</li>
<li>Nicolas, G., Sillans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+and+latent+effects+of+carbon+dioxide+on+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).</li>
<li>Arachea, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+selection+for+enhanced+extraction+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins.</a> Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).</li>
<li>Hellmich, U. A., Gaudet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+TRP+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Structural biology of TRP channels.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

INAD, który zawiera pięć domen PDZ, jest głównym organizatorem maszynerii fototransdukcji Drosophila. Wcześniejsze badania wykazały, że INAD PDZ3 wiąże się z C-końcowym ogonem kanału TRP z wyjątkową specyficznością (K, D = 0,3 μM)18. Tandem INAD PDZ45 oddziałuje z fragmentem NORPA 863-1095 o wyjątkowo wysokim powinowactwie wiązania (KD = 30 nM). Odkrycia te stanowią solidną podstawę biochemiczną do zaprojektowania strategii oczyszczania powinowactwa i konkurencji, kt...

Fototransdukcja to proces, w którym pochłonięte fotony są przekształcane w kody elektryczne neuronów. Przekazuje wyłącznie opsyny i następującą po nich kaskadę sygnalizacyjną sprzężoną z białkiem G zarówno u kręgowców, jak i bezkręgowców. U Drosophila, wykorzystując swoje pięć domen PDZ, inaktywacja białka rusztowania bez dodatkowego potencjału D (INAD) organizuje supramolekularny kompleks sygnalizacyjny, który składa się z kanału przejściowego potencjału receptorowego (TRP), fosfolipazy Cβ/No potencjału receptora A (PLCβ/NORPA) i specyficznej dla oka kinazy białkowej C (ePKC)1. Powstanie tego supramolekularnego kompleksu sygnalizacyjnego gwarantuje prawidłową lokalizację subkomórkową, wysoką wydajność i specyficzność maszynerii fototransdukcji Drosophila. W tym kompleksie światłoczułe kanały TRP działają jako efektory dolne do NORPA i pośredniczą w napływie wapnia i depolaryzacji fotoreceptorów. Wcześniejsze badania wykazały, że w otwarciu kanału TRP Drosophila pośredniczą protony, zakłócenie lokalnego środowiska lipidowego lub siła mechaniczna2,3,4. Kanał TRP Drosophila oddziałuje również z kalmoduliną5 i jest modulowany przez wapń zarówno przez pozytywne, jak i ujemne sprzężenie zwrotne6,7,8.
Do tej pory badania elektrofizjologiczne nad mechanizmem bramkowania kanałów TRP i TRP podobnych do TRP (TRPL) opierały się na wyciętych plamach błony, zapisach całych komórek z dysocjowanych fotoreceptorów Drosophila typu dzikiego oraz kanałach o heteroekspresji w komórkach S2, SF9 lub HEK2,9,10,11,12,13, ale nie na oczyszczonych kanałach. Informacje strukturalne kanału TRP Drosophila na całej długości również pozostają niejasne. W celu zbadania właściwości elektrofizjologicznych oczyszczonego białka w odtworzonym środowisku błonowym i uzyskania informacji strukturalnych o pełnej długości kanału TRP Drosophila, uzyskanie oczyszczonych kanałów TRP o pełnej długości jest niezbędnym pierwszym krokiem, podobnym do metodologii stosowanych w badaniach kanałów TRP u ssaków14,15,16,17.
Niedawno, w oparciu o mechanizm składania kompleksu białkowego INAD18,19,20, po raz pierwszy opracowano strategię oczyszczania powinowactwa i konkurencji, aby oczyścić kanał TRP z homogenatów głowy Drosophila za pomocą kulek streptawidyny5. Biorąc pod uwagę niską pojemność i wysoki koszt kulek streptawidyny, wprowadzono tutaj ulepszony protokół oczyszczania, który wykorzystuje białko przynęty znakowane przez Hisa i odpowiadające mu tanie kulki Ni o znacznie większej pojemności. Proponowana metoda pomoże w zbadaniu mechanizmu bramkowania kanału TRP pod kątem strukturalnym oraz w pomiarze właściwości elektrofizjologicznych kanału TRP z oczyszczonymi białkami.

<table><tbody><tr><td>Szczepy bakteryjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Kompetentne komórki</td><td>Novagen</td><td>69450</td><td>Nadekspresja białka</td></tr><tr><td>Modele eksperymentalne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D.melanogaster: szczep W1118</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>BDSC:3605</td><td>Drosophila przygotowanie głowy</td></tr><tr><td>< mocny>Materiał< / mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>siatki ze stali nierdzewnej 20/30/40 siatka</td> metalowa <td>firmy Jiufeng</td><td>GB / T6003.1</td><td>Drosophila przygotowanie głowy</td></tr><tr><td>30% Akrylamid-N,N & prime;-metylenobisakryloamid (29:1)</td><td>Lablead</td><td>A3291</td><td>SDS-PAGE preparat żelowy</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td> Preparat żelowy <td>Invitrogen</td><td>HC2005</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy koktajlowej</td><td>Roche</td><td>05892953001</td><td>Inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Coomassie błękit brylantowy R-250</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100472-0025</td><td>Barwienie żelem SDS-PAGE</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A620058-0100</td><td>Przygotowanie</td></tr> <tr><td>buforu kolumny wykluczającej rozmiarSól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500838-0500</td><td>Przygotowanie buforu kolumny wykluczającej wielkość</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610235-0005</td><td>Preparat buforowy SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Glutation Sepharose 4 kulki Fast Flow</td><td>Cytiva</td><td>17513202</td><td>Chromatografia powinowactwa</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500529-0001</td><td>Bufor elucyjny preparat do kolumny Ni</td></tr><tr><td>izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600168-0025</td><td>Indukcja nadekspresji białek</td></tr><tr><td>LB Bulion w proszku</td><td>Sangon Biotech</td><td>A507002-0250</td><td>E.coli. kultura komórkowa</td></tr><tr><td>zredukowana L-glutationem (GSH)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G4251-100G</td><td>Bufor elucyjny preparat do kulek</td></tr> <tr><td>glutationuKoraliki Ni-Sepharose excel</td><td>Cytiva</td><td>17371202</td><td>Chromatografia powinowactwa</td></tr><tr><td>N-dodecyl beta-D-maltozyd (DDM)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610424-001</td><td>Detergent do oczyszczania białek</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T9281-100ML</td><td>SDS-PAGE preparat żelowy</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607008-0500</td><td>Bufor homogenizacyjny dla komórek E.coli.</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Lablead</td><td>P0754-25G</td><td>Inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Wstępnie wybarwiony marker białkowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>26619/26616</td> Wstępnie <td>wybarwiona drabinka białkowa</td></tr><tr><td>Kolumna wykluczająca rozmiar (klasa preparatu)</td><td>Cytiva</td><td>28989336</td><td>Kolumna HiLoad 26/60 Superdex 200 PG</td></tr><tr><td>Kolumna wykluczająca rozmiar (klasa analityczna)</td><td>Cytiva</td><td>29091596</td><td>Kolumna Superose 6 Increase 10/300 GL</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501218-0001</td><td>Preparat buforowy do oczyszczania białek</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500228-0001</td><td>SDS-PAGE preparat żelowy/buforowy</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T1503-10KG</td><td>Preparat buforowy do oczyszczania białek</td></tr><tr><td>Ultrafiltracja spinowa kolumna</td><td>Millipore</td><td>UFC901096/801096</td><td>Stężenie białka</td></tr> <tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>DENVER</td><td>APX-60</td><td>Metage of Drosophila head</td></tr><tr><td>Biurkowa wirówka z chłodzeniem o dużej prędkości do stożkowych probówek wirowych 15 ml i 50 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Stężenie białka</td></tr><tr><td>Biurkowa wirówka z chłodzeniem o dużej prędkości 1,5 ml Probówki wirówkowe</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Wirowanie lizatu głowy Drosophila po homogenizacji</td></tr><tr><td>Pusta kolumna przepływu grawitacyjnego (średnica wewnętrzna = 1,0 cm)</td> <td>Bio-Rad</td><td>738-0015</td><td>Oczyszczanie białka TRP</td></tr><tr><td>Pusta kolumna przepływu grawitacyjnego (średnica wewnętrzna = 2,5 cm)</td> <td>Bio-Rad</td><td>738-0017</td><td>Oczyszczanie przynęty i białka konkurencji z E.coli.</td></tr><tr><td>Gel System</td><td>Dokumentacja Bio-Rad</td><td>Universal Hood II Gel Doc XR System Obrazowanie</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Szybkoobrotowa wirówka z chłodzeniem</td><td>Redlica Beckman</td><td>Avanti J-26 XP</td><td>Wirowanie komórek E.coli. komórek/lizatu komórkowego</td></tr><tr><td>Homogenizator wysokociśnieniowy</td><td>UNION-BIOTECH</td><td>UH-05</td><td>Homogenizacja komórek E.coli.</td></tr><tr><td>Zbiornik ciekłego azotu</td><td>Taylor-Wharton</td><td>CX-100</td><td>Drosophila head preparat</td></tr><tr><td>System oczyszczania białek</td><td>Cytiva</td><td>AKTA</td><td>Oczyszczacz białka</td></tr><tr><td>Lodówka (-80&deg; C)</td> <td>Thermo</td><td>900GP</td><<td>em>Drosophila head Przygotowanie</td></tr><tr><td>spektrofotometru</td><td>MAPADA</td><td>UV-1200</td><td>OD600 pomiar komórek E.coli.</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000c</td><td>Oznaczanie stężenia białka</td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima XPN-100 Ultrawirówka</td><td>Ultrawirowanie</td></tr></tbody></table>

oczyszczanie endogennych kanałów potencjału przejściowego receptora drosophila

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Fototransdukcja Drosophila jest jednym z najszybszych znanych szlaków sygnałowych sprzężonych z białkiem G. Aby zapewnić specyficzność i skuteczność tej kaskady, przepuszczalny dla wapnia (Ca2 +) kanał kationowy, przejściowy potencjał receptorowy (TRP), ściśle wiąże się z białkiem rusztowania, inaktywacją bez potencjału wtórnego D (INAD) i tworzy duży kompleks białek sygnałowych ze specyficzną dla oka kinazą białkową C (ePKC) i fosfolipazą Cβ/No potencjał receptora A (PLCβ/NORPA). Jednak właściwości biochemiczne kanału TRP Drosophila pozostają niejasne. W oparciu o mechanizm składania kompleksu białkowego INAD opracowano zmodyfikowaną strategię oczyszczania powinowactwa i konkurencji w celu oczyszczenia endogennego kanału TRP. Po pierwsze, oczyszczony fragment NORPA 863-1095 znakowany histydyną (His) został związany z kulkami Ni i użyty jako przynęta do ściągania endogennego kompleksu białkowego INAD z homogenatów głowy Drosophila. Następnie, nadmiernie oczyszczony fragment TRP 1261-1275 oznaczony s-transferazą glutationową (GST) został dodany do kulek Ni, aby konkurować z kanałem TRP. Wreszcie, kanał TRP w supernatancie został oddzielony od nadmiaru peptydu TRP 1261-1275 za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar. Metoda ta umożliwia zbadanie mechanizmu bramkowania kanału TRP Drosophila zarówno pod kątem biochemicznym, jak i strukturalnym. W przyszłości można również zmierzyć właściwości elektrofizjologiczne oczyszczonych kanałów TRP Drosophila.

W niniejszym artykule zaprezentowano metodę oczyszczania białek w celu wyizolowania endogennego kanału TRP z Drosophila (Rysunek 1).
W pierwszej kolejności zastosowano ekspresję i oczyszczanie białek rekombinowanych w celu otrzymania białek przynęty (bait) oraz białek konkurencyjnych. Następnie fragment TRP 1261-1275 z tagiem GST wyeksprymowano w komórkach E. coli BL21 (DE3) w medium LB i oczyszczono przy użyciu kulek z glutationem oraz kolumny d...

Na podstawie mechanizmu składania kompleksu białkowego INAD, w tym protokole, zmodyfikowano strategię oczyszczania powinowactwa i konkurencji w celu oczyszczenia endogennego kanału TRP Drosophila.

Oczyszczanie endogennych kanałów potencjału przejściowego receptora Drosophila

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

W tym protokole demonstrujemy proces oczyszczania w celu uzyskania oczyszczonych kanałów TRP o pełnej długości, co jest niezbędnym pierwszym krokiem do zbadania właściwości elektrofizjologicznych i uzyskania informacji strukturalnych kanału TRP o pełnej długości. Opierając się na mechanizmie pobierania próbek kompleksu białkowego INAD i przy użyciu tanich kulek niklowych o znacznie większej pojemności, można oczyścić wystarczającą ilość kanałów TRP z głów much. Procedurę zademonstruje Yuyang Liu, technik z naszego laboratorium.Na początek przekształć plazmid pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 w komórki E.coli BL21, stosując metodę transformacji szoku cieplnego chlorku wapnia. Zaszczep pojedynczą kolonię w 10 mililitrach pożywki Luria Bertani i rośnij przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj 10 mililitrów kultury siewnej do jednego litra pożywki Luria Bertani i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Gdy gęstość optyczna komórek osiągnie 0,5, schłodzić komórki do 16 stopni Celsjusza i dodać 0,1 milimolowy izopropylo-beta-D-1-tiogalaktopiranozyd. Po nadekspresji osadzać jeden litr hodowanych komórek przez wirowanie i ponownie zawieś w 40 mililitrach soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Załaduj zawieszone komórki do homogenizatora wysokociśnieniowego, wstępnie schłodzonego do czterech stopni Celsjusza.Powoli zwiększaj ciśnienie homogenizatora do 800 barów. Otwórz klapkę wlotową i pozwól zawieszonym komórkom okrężnie przejść przez zawór z wąskimi szczelinami. Załaduj pięć mililitrów kulek glutationu do kolumny grawitacyjnej i umyj kulki 50 mililitrami buforowanego fosforanem buforu soli fizjologicznej, w sumie trzy razy.Odwirować lizat komórkowy z homogenizatora wysokociśnieniowego przy 48, 384 razy G. Dodać około 40 mililitrów supernatantu odwirowanego lizatu komórkowego do zrównoważonych kulek glutationu w kolumnie grawitacyjnej i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Zawieszaj kulki glutationu co 10 minut. Po 30 minutach inkubacji otwórz klapkę wylotu kolumny, aby oddzielić kulki i frakcję przepływową.Odrzuć frakcję przepływową i dwukrotnie przepłucz pozostałe kulki glutationu 50 mililitrami buforowanego fosforanem buforu soli fizjologicznej. Dodaj 15 mililitrów buforu elucyjnego do kulek glutationu i ponownie zawieszaj kulki co 10 minut. Odeluj oznaczony GST fragment TRP 1261-1275 do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i załaduj go do kolumny wykluczającej rozmiar.Zebrać pięć mililitrów eluowanych białek na probówkę i skoncentrować oczyszczone fragmenty do jednego mililitra przez odwirowanie w ultrafiltracyjnej kolumnie wirowej w wirówce z chłodzeniem. Aby oczyścić oznaczony przez Niego fragment NORPA 863-1095, należy postępować zgodnie z wcześniej zademonstrowaną procedurą z użyciem kulek niklowych. Zbierz dorosłe muchy do 50-mililitrowych stożkowych probówek wirówkowych i zamroź je w ciekłym azocie na 10 minut.Energicznie potrząśnij ręcznie zamrożonymi probówkami i przenieś mieszaninę na trzy, kolejno ułożone, wstępnie schłodzone sita ze stali nierdzewnej. Potrząśnij sitami i zmieść główki muchy z sita o oczkach 40 za pomocą szczotki. Przenieś je do pięciomililitrowych stożkowych probówek i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Homogenizuj 0,5 grama główek w ciekłym azocie za pomocą wstępnie schłodzonego moździerza i tłuczka. Rozpuść homogenizowane głowy w pięciu mililitrach 10-krotnego buforu do lizy, a następnie odwiruj w temperaturze 20 817 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Supernatant z odwirowaniem jest następnie odwirowywany 100 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 60 minut.Dodaj jeden mililitr kulek niklu do kolumny przepływu grawitacyjnego i umyj kulki trzy razy 10 mililitrami podwójnie destylowanej wody o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zrównoważyć kulki z 10 objętościami kolumny buforu do lizy, trzy razy w czterech stopniach Celsjusza. Dodaj 500 mikrolitrów 600 mikromolowych, oczyszczonych białek NORPA 863-1095 oznaczonych przez Hisa do kolumny niklowej i inkubuj kolumnę.Zawieszaj koraliki co 10 minut. Otwórz kran wylotowy kolumny, aby oddzielić kulki i frakcję przepływową, a następnie umyj kulki niklu 10 mililitrami zimnego buforu do lizy. Następnie dodać zimny supernatant homogenatu głowy Drosophila do kolumny niklowej.Po inkubacji przemyj kulki 10 mililitrami buforu do lizy i dodaj 500 mikrolitrów 600 mikromolowego białka TRP 1261-1275 znakowanego GST do kulek. Zebrać eluowaną frakcję z kolumny grawitacyjnej. Umyj kulki niklowe 10 mililitrami bufora wiążącego.Następnie dodaj bufor elucyjny i zbierz frakcję elucyjną z kolumny przepływu grawitacyjnego. Zagęścić frakcje wymyte z oczyszczania kanału Drosophila TRP za pomocą czteromililitrowej ultrafiltracyjnej kolumny wirowej. Wstrzyknąć próbkę do kolumny wykluczającej wielkość i wymyć białka z rozsądną szybkością przepływu.Fragment TRP 1261-1275 oznaczony GST poddano ekspresji w komórkach E. coli i oczyszczono za pomocą kulek glutationu i kolumny wykluczającej rozmiar. Podobnie, oznaczony przez Hisa fragment NORPA 863-1095 został wyrażony i oczyszczony za pomocą kulek niklowych i kolumny wykluczającej rozmiar. Eluowany kanał TRP jest oddzielany od nadmiaru peptydu TRP 1261-1275 znakowanego GST za pomocą chromatografii wykluczania wielkości.Jako produkt uboczny kompleksy INAD, ePKC, NORPA 863-1095 otrzymuje się po konkurencji peptydowej TRP 1261-1275. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas próbowania tego protokołu, jest homogenizacja główek muchowych w ciekłym azocie i rozpuszczenie homogenatu w buforze zawierającym detergent o nazwie DDM. Po tej procedurze możemy również oczyścić cały kompleks białkowy INAD, który można wykorzystać do badania jego mechanizmów składania i regulacji.Potencjalnym przyszłym zastosowaniem tej metody będzie badanie informacji strukturalnych endogennego kanału TRP Drosophila przy użyciu technik Cryo-EM. Ponadto możliwy jest również pomiar właściwości elektrofizjologicznych oczyszczonych endogennych kanałów TRP Drosophila w sztucznej dwuwarstwowej błonie lipidowej.

purification-endogenous-drosophila-transient-receptor-potential

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszej procedurze wykorzystano aktywowany niebieskim światłem kanał glonowy oraz narzędzia do specyficznej dla komórek ekspresji genetycznej w celu wywołania potencjałów synaptycznych za pomocą impulsów świetlnych w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) u larw Drosophila. Technika ta stanowi niedrogą i łatwą w użyciu alternatywę dla stymulacji elektrodami ssącymi w badaniach nad fizjologią synaptyczną w laboratoriach badawczych i dydaktycznych.

Stymulacja potencjałów synaptycznych w złączach nerwowo-mięśniowych Drosophila za pośrednictwem kanalorodopsyny 2

In situ rejestracje metodą patch clamp są wykorzystywane do charakterystyki elektrofizjologicznej neuronów w nienaruszonych obwodach. W modelu genetycznym Drosophila technika patch clamp jest trudna, ponieważ OUN jest mały i otoczony wytrzymałą osłoną. Niniejszy artykuł opisuje procedurę usuwania osłony oraz oczyszczania neuronów w celu przeprowadzenia późniejszych rejestracji metodą patch clamp.

Przygotowanie neuronów ośrodkowych Drosophila do metody in situ patch clamp

Ten film demonstruje eksperymentalny protokół badania przedłużonego depolaryzującego potencjału (PDA) u białookich Drosophila. Oko muchy jest wystawione na intensywne impulsy niebieskiego światła w celu przekształcenia fotopigmentu rodopsyny w metarodopsynę, inicjując kaskadę sygnalizacyjną, która otwiera kanały jonów dodatnich i powoduje depolaryzację błony. Ponieważ niebieskie światło zapobiega rekonwersji metarodopsyny do rodopsyny, ciągły napływ jonów dodatnich powoduje trwałą...

Badanie przedłużonego depolaryzacyjnego potencjału wtórnego (PDA) w fotoreceptorach Drosophila

Źródło: Wagner, K.  i inni., Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP. J. Vis. Exp. (2022). Ten film przedstawia wizualizację transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorów Drosophila przy użyciu białek TRPL znakowanych eGFP. Szczegółowo opisano w nim przygotowanie transgenicznych muszek do obrazowania, przechwytywanie obrazów fluorescencyjnych komórek fotoreceptorowych oraz ilościowe określenie transportu TRPL...

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila

Zapisy całokomórkowe z fotoreceptorów Drosophila melanogaster umożliwiają pomiar spontanicznych ciemnych guzków, wybrzuszeń kwantowych, makroskopowych reakcji na światło i zależności prąd-napięcie w różnych warunkach. W połączeniu z narzędziami manipulacji genetycznej D. melanogaster, metoda ta umożliwia badanie wszechobecnego szlaku sygnałowego inozytol-lipid i jego celu, czyli kanału TRP.

Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila

Celem tego protokołu jest zapewnienie prostego i taniego podejścia do zbierania zarodków Drosophila na średnią skalę (0,5-1 g) i przygotowywania ekstraktów białkowych, które mogą być używane w dalszych zastosowaniach proteomicznych, takich jak spektrometria mas z oczyszczaniem powinowactwa (AP-MS).

Przygotowanie na średnią skalę ekstraktów z zarodków Drosophila do eksperymentów proteomicznych

Ten artykuł przedstawia metodę testowania połączeń monosynaptycznych między neuronami za pomocą tetrodotoksyny i kanału sodowego opornego na tetrodotoksynę, NaChBac.

Badanie połączeń monosynaptycznych u Drosophila przy użyciu kanałów sodowych opornych na tetrodotoksynę

Ten artykuł opisuje konkretne metody uzyskiwania biochemicznych ilości TRPV1 rozpuszczonego w detergentach do analizy spektroskopowej. Połączone protokoły zapewniają narzędzia biochemiczne i biofizyczne, które można dostosować w celu ułatwienia badań strukturalnych i funkcjonalnych kanałów jonowych ssaków w środowisku kontrolowanym przez błonę.

Oczyszczanie i rekonstytucja TRPV1 do analizy spektroskopowej

Ten protokół opisuje metodę rejestrowania malejącej aktywności elektrycznej ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster, aby umożliwić ekonomiczne i wygodne testowanie środków farmakologicznych, mutacji genetycznych białek nerwowych i/lub roli niezbadanych ścieżek fizjologicznych.

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

Przedstawiamy protokół do elektrofizjologicznego charakterystyki bistabilnych fotopigmentów: (i) wykorzystanie przemieszczeń ładunku w cząsteczkach fotopigmentu po absorpcji fotonów i ich ogromnej ilości w fotoreceptorach, oraz (ii) wykorzystanie różnic w widmach absorpcyjnych rodopsyny i metarodopsyny. Protokoły te są przydatne do badań przesiewowych pod kątem mutacji wpływających na bistabilne systemy fotopigmentowe.

Elektrofizjologiczne metody pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach Drosophila

Poznaj metodę oczyszczania pełnowymiarowych kanałów TRP z głów muszki owocówki Drosophila wykorzystującą kompleks białkowy INAD i niklowe koraliki. Ta technika umożliwia badanie właściwości elektrofizjologicznych i strukturalnych.

Oczyszczanie endogennych kanałów potencjału przejściowego receptora Drosophila

Przeglądaj więcej filmów