Oczyszczanie endogennych kanałów potencjału przejściowego receptora Drosophila

W tym protokole demonstrujemy proces oczyszczania w celu uzyskania oczyszczonych kanałów TRP o pełnej długości, co jest niezbędnym pierwszym krokiem do zbadania właściwości elektrofizjologicznych i uzyskania informacji strukturalnych kanału TRP o pełnej długości. Opierając się na mechanizmie pobierania próbek kompleksu białkowego INAD i przy użyciu tanich kulek niklowych o znacznie większej pojemności, można oczyścić wystarczającą ilość kanałów TRP z głów much. Procedurę zademonstruje Yuyang Liu, technik z naszego laboratorium.

Na początek przekształć plazmid pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 w komórki E.coli BL21, stosując metodę transformacji szoku cieplnego chlorku wapnia. Zaszczep pojedynczą kolonię w 10 mililitrach pożywki Luria Bertani i rośnij przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj 10 mililitrów kultury siewnej do jednego litra pożywki Luria Bertani i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Gdy gęstość optyczna komórek osiągnie 0,5, schłodzić komórki do 16 stopni Celsjusza i dodać 0,1 milimolowy izopropylo-beta-D-1-tiogalaktopiranozyd. Po nadekspresji osadzać jeden litr hodowanych komórek przez wirowanie i ponownie zawieś w 40 mililitrach soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Załaduj zawieszone komórki do homogenizatora wysokociśnieniowego, wstępnie schłodzonego do czterech stopni Celsjusza.

Powoli zwiększaj ciśnienie homogenizatora do 800 barów. Otwórz klapkę wlotową i pozwól zawieszonym komórkom okrężnie przejść przez zawór z wąskimi szczelinami. Załaduj pięć mililitrów kulek glutationu do kolumny grawitacyjnej i umyj kulki 50 mililitrami buforowanego fosforanem buforu soli fizjologicznej, w sumie trzy razy.

Odwirować lizat komórkowy z homogenizatora wysokociśnieniowego przy 48, 384 razy G. Dodać około 40 mililitrów supernatantu odwirowanego lizatu komórkowego do zrównoważonych kulek glutationu w kolumnie grawitacyjnej i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Zawieszaj kulki glutationu co 10 minut. Po 30 minutach inkubacji otwórz klapkę wylotu kolumny, aby oddzielić kulki i frakcję przepływową.

Odrzuć frakcję przepływową i dwukrotnie przepłucz pozostałe kulki glutationu 50 mililitrami buforowanego fosforanem buforu soli fizjologicznej. Dodaj 15 mililitrów buforu elucyjnego do kulek glutationu i ponownie zawieszaj kulki co 10 minut. Odeluj oznaczony GST fragment TRP 1261-1275 do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i załaduj go do kolumny wykluczającej rozmiar.

Zebrać pięć mililitrów eluowanych białek na probówkę i skoncentrować oczyszczone fragmenty do jednego mililitra przez odwirowanie w ultrafiltracyjnej kolumnie wirowej w wirówce z chłodzeniem. Aby oczyścić oznaczony przez Niego fragment NORPA 863-1095, należy postępować zgodnie z wcześniej zademonstrowaną procedurą z użyciem kulek niklowych. Zbierz dorosłe muchy do 50-mililitrowych stożkowych probówek wirówkowych i zamroź je w ciekłym azocie na 10 minut.

Energicznie potrząśnij ręcznie zamrożonymi probówkami i przenieś mieszaninę na trzy, kolejno ułożone, wstępnie schłodzone sita ze stali nierdzewnej. Potrząśnij sitami i zmieść główki muchy z sita o oczkach 40 za pomocą szczotki. Przenieś je do pięciomililitrowych stożkowych probówek i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Homogenizuj 0,5 grama główek w ciekłym azocie za pomocą wstępnie schłodzonego moździerza i tłuczka. Rozpuść homogenizowane głowy w pięciu mililitrach 10-krotnego buforu do lizy, a następnie odwiruj w temperaturze 20 817 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Supernatant z odwirowaniem jest następnie odwirowywany 100 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 60 minut.

Dodaj jeden mililitr kulek niklu do kolumny przepływu grawitacyjnego i umyj kulki trzy razy 10 mililitrami podwójnie destylowanej wody o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zrównoważyć kulki z 10 objętościami kolumny buforu do lizy, trzy razy w czterech stopniach Celsjusza. Dodaj 500 mikrolitrów 600 mikromolowych, oczyszczonych białek NORPA 863-1095 oznaczonych przez Hisa do kolumny niklowej i inkubuj kolumnę.

Zawieszaj koraliki co 10 minut. Otwórz kran wylotowy kolumny, aby oddzielić kulki i frakcję przepływową, a następnie umyj kulki niklu 10 mililitrami zimnego buforu do lizy. Następnie dodać zimny supernatant homogenatu głowy Drosophila do kolumny niklowej.

Po inkubacji przemyj kulki 10 mililitrami buforu do lizy i dodaj 500 mikrolitrów 600 mikromolowego białka TRP 1261-1275 znakowanego GST do kulek. Zebrać eluowaną frakcję z kolumny grawitacyjnej. Umyj kulki niklowe 10 mililitrami bufora wiążącego.

Następnie dodaj bufor elucyjny i zbierz frakcję elucyjną z kolumny przepływu grawitacyjnego. Zagęścić frakcje wymyte z oczyszczania kanału Drosophila TRP za pomocą czteromililitrowej ultrafiltracyjnej kolumny wirowej. Wstrzyknąć próbkę do kolumny wykluczającej wielkość i wymyć białka z rozsądną szybkością przepływu.

Fragment TRP 1261-1275 oznaczony GST poddano ekspresji w komórkach E. coli i oczyszczono za pomocą kulek glutationu i kolumny wykluczającej rozmiar. Podobnie, oznaczony przez Hisa fragment NORPA 863-1095 został wyrażony i oczyszczony za pomocą kulek niklowych i kolumny wykluczającej rozmiar. Eluowany kanał TRP jest oddzielany od nadmiaru peptydu TRP 1261-1275 znakowanego GST za pomocą chromatografii wykluczania wielkości.

Jako produkt uboczny kompleksy INAD, ePKC, NORPA 863-1095 otrzymuje się po konkurencji peptydowej TRP 1261-1275. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas próbowania tego protokołu, jest homogenizacja główek muchowych w ciekłym azocie i rozpuszczenie homogenatu w buforze zawierającym detergent o nazwie DDM. Po tej procedurze możemy również oczyścić cały kompleks białkowy INAD, który można wykorzystać do badania jego mechanizmów składania i regulacji.

Potencjalnym przyszłym zastosowaniem tej metody będzie badanie informacji strukturalnych endogennego kanału TRP Drosophila przy użyciu technik Cryo-EM. Ponadto możliwy jest również pomiar właściwości elektrofizjologicznych oczyszczonych endogennych kanałów TRP Drosophila w sztucznej dwuwarstwowej błonie lipidowej.