Bakteryjna ekspresja i oczyszczanie metaloproteinazy ludzkiej macierzy-3 za pomocą chromatografii powinowactwa

Ten szczegółowy protokół opisuje wysoce wydajną i opłacalną metodę ekspresji bakteryjnej rekombinowanej domeny katalitycznej MMP-3 w E. Coli, która może być stosowana do innych celów terapeutycznych MMP. E. coli nie ma złożonego systemu fałdowania białek i przetwarzania potranslacyjnego. Metoda ta wykorzystuje szczep komórek R2DP w celu zwiększenia ekspresji białek eukariotycznych w E. coli.

Nadprodukcja określonych MMP prowadzi do wielu chorób, takich jak rak, choroby sercowo-naczyniowe i neurodegeneracyjne. Aktywne rozpuszczalne MMP są potrzebne do opracowania leków hamujących MMP. Zaszczepić pojedynczą izolowaną kolonię transformantu katalitycznego domeny pET His-tag pro MMP-3 z płytki opornej na ampicylinę LB chloramfenikolu w pięciu mililitrach pożywki odpornej na ampicylinę LB w temperaturze chloramfenikolu w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Zachowaj porcje z każdej kultury i przygotuj 40% zapasy glicerolu. Zaszczepić jednolitrową kolbę zawierającą 500 mililitrów pożywki LB odpornej na ampicylinę, chloramfenikol, do gęstości optycznej od 0,05 do 0,1 przy 600 nanometrach za pomocą kultury nocnej. Zmierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach w kilku punktach czasowych, zwykle przez trzy do czterech godzin, aż spadnie między 0,4 a 0,6.

Indukować hodowle z jednym molowym zapasem IPTG do końcowego stężenia jednego milimola. Inkubować w wytrząsarce o temperaturze 37 stopni przez dodatkowe trzy do czterech godzin. Odwirować komórki w stożkowych butelkach o pojemności 250 mililitrów w temperaturze 13 000 G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, powtarzając, aż kultury zostaną całkowicie granulowane.

Dodać trzy mililitry buforu do lizy na gram osadu i ponownie zawiesić osad przez wirowanie lub pipetowanie. Dodaj 1,25 mililitra deoksycholanu sodu o stężeniu 10% na jeden litr kultury. Dodać 10 mikrolitrów DNazy I na jeden litr kultury.

Wstrząsaj w temperaturze pokojowej przez 30 minut przy 150 obr./min. Wirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 g i czterech stopniach Celsjusza. Odrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić osad w 100 mililitrach na litr bufora do kultury inkluzji, pipetując w górę iw dół. Podczas sonikacji próbki należy przechowywać na lodzie, aby zapobiec przegrzaniu. Poddaj każdą próbkę sonifikacji przez sześć cykli po 15 sekund, wyjście pięć i 50% impulsu.

Odwirowywać próbki przez 10 minut w temperaturze 13 000 g i czterech stopniach Celsjusza. Sprawdź pellet. Jeśli osad jest zwarty, wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić każdą osadkę z jednolitrowej kultury i pięciu mililitrów buforu do solubilizacji. Inkubować przez co najmniej 30 minut na lodzie, aby umożliwić rozpuszczenie białek. Odwiruj komórki przez 10 minut w temperaturze 13 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza.

Jeśli osad tworzy się po odwirowaniu, wlej supernatant do oddzielnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Zawiesić osad w kolejnych pięciu mililitrach buforu do rozpuszczania na jeden litr kultury, pipetując w górę iw dół. Wirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 g i czterech stopniach Celsjusza.

Następnie wyciągnij supernatanty. Wyrzuć osad lub przechowuj go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu dodatkowej sonikacji. Przeprowadzić ślepą próbę w stosunku do buforu płuczącego HT i zapisać A280 pierwszej frakcji płukania.

Powtarzaj z innymi frakcjami, aż A280 zbliży się do linii podstawowej. Natychmiast wymyj białka znakowane przez His, dodając pięć mililitrów buforu elucyjnego HT. Zebrać przepływ o frakcjach od 0,5 do jednego mililitra w probówkach do mikrofug oznaczonych elucjącją.

Zmierzyć A280 frakcji elucyjnej. Jeśli A280 jest większy niż 0,3 miligrama na mililitr, rozcieńczyć frakcję buforem równowagi HT. Zanurzyć wyluzowane frakcje MMP w rurkach dializacyjnych w jednym litrze pierwszego buforu do dializy i mieszać rurkę i jej zawartość na mieszadle magnetycznym przez co najmniej osiem godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przenieść do jednego litra buforu dializacyjnego dwa i mieszać rurkę i jej zawartość na mieszadle magnetycznym przez co najmniej osiem godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przenieść do jednego litra buforu do dializy trzy i mieszać rurkę i jej zawartość na mieszadle magnetycznym przez nie mniej niż osiem godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść próbkę do odpowiedniego pojemnika i oznaczyć ją jako wydializowany MMP.

Zbadaj probówkę pod kątem osadów. Na jeden mililitr podwielokrotności jednego miligrama na mililitr MMP dodać 50 mikrolitrów 20-milimolowego APMA, aby osiągnąć końcowe stężenie APMA wynoszące jeden milimol. Jeśli utworzy się osad, odwiruj go z maksymalną prędkością przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przechowywać supernatant w 1,5-mililitrowej probówce do mikrofugi oznaczonej jako aktywowany MMP. Wyrzucić osad do pojemnika oznaczonego jako odpady APMA. SDS-PAGE uruchomiono w celu porównania frakcji elucji oczyszczania His-tag domeny katalitycznej His-tag pro MMP-3 z komórek BL21 DE3 w komórkach R2DP.

Pierwsze osiem frakcji elucyjnych domeny katalitycznej MMP znakowanej His i komórek BL21 DE3 wykazało mniej białka niż te w domenie katalitycznej MMP znakowanej Hisem w komórkach R2DP. Pokazano indukowane, ponownie złożone, zagęszczone, aktywowane i odsolone frakcje komórek MMP3 CD i R2DP. Po aktywacji masa cząsteczkowa aktywowanego pasma CD MMP-3 wynosi około 20 kilodaltonów, w przeciwieństwie do zymogena znakowanego Hisem, który pozostaje na poziomie około 30 kilodaltonów.

Podczas wirowania lizatów komórkowych granulki mogą nie być zwarte. Kiedy tak się stanie, należy poddać sonikacji więcej i odwirować dłużej. Podczas ponownego zagęszczania białka może dojść do wytrącania się.

Rozpuść go w buforze do rozpuszczania i powtórz proces. Opisana tutaj procedura zapewnia szczegółową metodę rozpuszczalnej ekspresji aktywnych ludzkich MMP, która może ostatecznie zostać wykorzystana do zrozumienia molekularnego mechanizmu aktywności enzymatycznej MMP. Alternatywne metody oczyszczania białek, takie jak FPLC, mogą być stosowane w celu oczyszczenia białek MMP.