Name: Bakteryjna ekspresja i oczyszczanie metaloproteinazy ludzkiej macierzy-3 za pomocą chromatografii powinowactwa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj metodę ekspresji i oczyszczania metaloproteinazy MMP-3 w bakteriach E. coli z wykorzystaniem szczepu R2DP. Protokół obejmuje chromatografię powinowactwa, dializę oraz aktywację białka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować dr Evette Radisky i Alexandrze Hockla z Mayo Clinic w Jacksonville na Florydzie za dostarczenie plazmidu pET-3a-pro-MMP-3cd jako szablonu do klonowania genu Hisx6pro-MMP-3cd, oraz ich komentarze, a także dr Paulowi Hartleyowi z Nevada Genomics Center na University of Nevada, Reno, za sekwencjonowanie DNA. Autorzy chcieliby również podziękować Cassandrze Hergenrader za pomoc w części ekspresji białek. M.R.-S. pragnie podziękować grantowi NIH-P20 GM103650-COBRE Integrative Neuroscience oraz nagrodzie UNR R&D mICRO SEED Grant Award.

<ol><li>Portolano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+for+structural+biology+in+HEK+293F+suspension+cells%3A+A+novel+and+accessible+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897(2014).</li>
<li>Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+expression+of+recombinant+human+proteins+with+the+transient+transfection+of+HEK293+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53568(2015).</li>
<li>Nilvebrant, J., Alm, T., Hober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+protein+purification+facilitated+by+a+small+bispecific+affinity+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3370(2012).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+production+of+soluble+proteins+from+insoluble+inclusion+bodies+by+a+two-step-denaturing+and+refolding+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method.</a> PLoS One. 6 (7), 22981(2011).</li>
<li>Hu, X., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+functional+matrix+metalloproteinases+by+zymography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Detection of functional matrix metalloproteinases by zymography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2445(2010).</li>
<li>Radisky, E. S., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+matrix+metalloproteinase+inhibition+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibition in breast cancer.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (11), 3531-3548 (2017).</li>
<li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Do, L. D., Hritz, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloproteinases+and+their+inhibitors%3A+Potential+for+the+development+of+new+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Metalloproteinases and their inhibitors: Potential for the development of new therapeutics.</a> Cells. 9 (5), 1313(2020).</li>
<li>Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+matrix+metalloproteinases+and+TIMPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs.</a> Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).</li>
<li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+the+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+reveals+that+its+N-+and+C-terminal+domains+cooperate+in+matrix+metalloproteinase+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 reveals that its N- and C-terminal domains cooperate in matrix metalloproteinase recognition.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9476-9488 (2019).</li>
<li>Batra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-10+%28MMP-10%29+interaction+with+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+TIMP-1+and+TIMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15935-15946 (2012).</li>
<li>Singh, K. K., Jain, R., Ramanan, H., Saini, D. K. Expression and purification of matrix metalloproteinases in Escherichia coli. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSingh%2C+KK+%22Matrix+Metalloproteases%22">Matrix Metalloproteases</a>. Galea, C. A. , Humana Press. New York, NY. 3-16 (2017).</li>
<li>Manka, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+triple-helical+collagen+cleavage+by+matrix+metalloproteinase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural insights into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12461-12466 (2012).</li>
<li>Gomis-Ruth, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inhibition+of+the+human+matrix+metalloproteinase+stromelysin-1+by+TIMP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1.</a> Nature. 389 (6646), 77-81 (1997).</li>
<li>Shirian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converting+a+broad+matrix+metalloproteinase+family+inhibitor+into+a+specific+inhibitor+of+MMP-9+and+MMP-14%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Converting a broad matrix metalloproteinase family inhibitor into a specific inhibitor of MMP-9 and MMP-14.</a> FEBS Letters. 592 (7), 1122-1134 (2018).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+histidine-tagged+catalytic+domain+of+MMP-13+in+one+step+using+affinity+column+and+renaturation+of+it+with+histidine+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Liquid+Chromatography+%26+Related+Technologies%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant histidine-tagged catalytic domain of MMP-13 in one step using affinity column and renaturation of it with histidine tag.</a> Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 37 (15), 2118-2130 (2014).</li>
<li>Aydin, H., Azimi, F. C., Cook, J. D., Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+convenient+and+general+expression+platform+for+the+production+of+secreted+proteins+from+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4041(2012).</li>
<li>McNiff, M. L., Haynes, E. P., Dixit, N., Gao, F. P., Laurence, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+fusion+construct+enables+high-yield+production+of+soluble%2C+active+matrix+metalloproteinase-8+%28MMP-8%29+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin fusion construct enables high-yield production of soluble, active matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) in Escherichia coli.</a> Protein Expression and Purification. 122, 64-71 (2016).</li>
<li>Maity, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GST-His+purification%3A+A+two-step+affinity+purification+protocol+yielding+full-length+purified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">GST-His purification: A two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50320(2013).</li>
<li>Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Montón Silva, A., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+benefits+of+protein+co-expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">The multifaceted benefits of protein co-expression in Escherichia coli.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52431(2015).</li>
<li>Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HeLa+based+cell+free+expression+systems+for+expression+of+Plasmodium+rhoptry+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">HeLa based cell free expression systems for expression of Plasmodium rhoptry proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52772(2015).</li>
<li>Zeytuni, N., Zarivach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+M.+magneticum+strain+AMB-1+magnetosome+associated+protein+MamA%CE%9441%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of the M. magneticum strain AMB-1 magnetosome associated protein MamAΔ41.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1844(2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Produkcja na dużą skalę rozpuszczalnych, ludzkich, rekombinowanych MMP pozostaje trudnym zadaniem. Komórki ssaków mogą wyrażać funkcjonalne MMP przy wysokich kosztach i długim czasie oczekiwania, podczas gdy E. coli szybko wytwarzają duże ilości ciał inkluzyjnych MMP, które muszą zostać oczyszczone i ponownie złożone11,16. Ogniwa R2DP znacznie zwiększają wydajność ciał inkluzyjnych MMP, umożliwiając bardziej opłacalny i produktywny proces ponownego fałdo...

Większość złożonych białek eukariotycznych ulega rozbudowanym modyfikacjom potranslacyjnym po ekspresji, co sprawia, że do ich prawidłowego funkcjonowania niezbędne są zaawansowane mechanizmy fałdowania białek oraz kofaktory1. Produkcja dużych ilości rozpuszczalnego ludzkiego białka w gospodarzach bakteryjnych pozostaje znacznym wyzwaniem ze względu na wysokie koszty oraz brak skutecznych metod ekspresji i oczyszczania, nawet w przypadku eksperymentów laboratoryjnych na mniejszą skalę2,3. MMP, ludzkie endopeptydazy o wysokiej masie cząsteczkowej, podczas ekspresji w E. coli zazwyczaj występują w formie nierozpuszczalnych ciałek inkluzyjnych. Pozyskiwanie rozpuszczalnych ludzkich MMP często wiąże się z żmudnym i czasochłonnym procesem solubilizacji i refoldingu4.
MMP pełnią kluczową rolę w procesach fizjologicznych i patogennych. Ludzkie MMP stanowią rodzinę 23 endopeptydaz cynkowych, sklasyfikowanych według struktury i specyficzności substratowej, wykazujących różną ekspresję mimo silnie konserwatywnej domeny katalitycznej5,6. MMP są wydzielane jako nieaktywne zymogeny, regulowane poprzez aktywację potranslacyjną oraz ich endogenne inhibitory, tkankowe inhibitory metaloproteinaz (TIMP)7,8,9,10. Choć początkowo rozpoznano je ze względu na rolę w przebudowie ECM, MMP są również zaangażowane w rozwój, morfogenezę, naprawę i remodelowanie tkanek8. Rozregulowanie MMP zostało wyraźnie powiązane z nowotworami, a także z chorobami neurodegeneracyjnymi, sercowo-naczyniowymi i włóknistymi, wśród innych schorzeń5,7.
Opracowanie skutecznych metod wielkoskalowej produkcji MMP jest kluczowe dla zapewnienia sukcesu przyszłych badań nad mechanizmami działania MMP za pomocą analiz biochemicznych i komórkowych. Różne MMP były wcześniej ekspresjonowane w bakteriach11, w tym MMP z dodatkiem znacznika Hisx6, bez zmiany aktywności MMP12,13,14,15. Jednakże metody te obejmują żmudne i długotrwałe etapy, które mogą być trudne do powtórzenia.
Komórki ssaków mogą być również wykorzystywane do ekspresji wielu różnych ludzkich białek, zapewniając przy tym prawidłowe modyfikacje potranslacyjne16. Chociaż system ekspresyjny ssaków jest idealnym wyborem do produkcji rekombinowanych ludzkich białek z odpowiednimi modyfikacjami potranslacyjnymi, głównymi wadami tej metody są początkowo niskie wydajności, kosztowne pożywki i odczynniki, długi czas potrzebny na uzyskanie stabilnych linii ekspresyjnych oraz ryzyko kontaminacji innymi gatunkami, takimi jak grzyby lub bakterie2,11. Co więcej, produkcja MMP w liniach komórkowych ssaków prowadzi do powstania zanieczyszczeń z powiązanych białek komórkowych, takich jak TIMPy lub fibronektyny11. W przeciwieństwie do powolnego wzrostu komórek obserwowanego w przypadku komórek ssaków, bakteryjny system ekspresyjny oferuje wielkoskalową produkcję białek w krótkim czasie, przy prostszych wymaganiach dotyczących pożywek i wzrostu. Jednak ze względu na brak innych powiązanych białek komórkowych (np. TIMP) w bakteryjnych systemach ekspresyjnych, aktywne MMP w wyższych stężeniach ulegają degradacji poprzez autoproteolizę, co skutkuje niską wydajnością MMP17.
Niniejsza praca opisuje szczegółową metodę ekspresji bakteryjnej, oczyszczania i aktywacji rekombinowanego Hisx6-pro-MMP-3cd z wykorzystaniem E. coli jako gospodarza ekspresyjnego ze względu na przystępność, prostotę oraz skuteczność w uzyskiwaniu wyższych wydajności MMP2,3,18. Ponieważ E. coli nie posiada mechanizmów fałdowania białek ani procesów potranslacyjnych wymaganych dla rekombinowanych MMP i innych złożonych białek, wiele szczepów E. coli zostało zmodyfikowanych genetycznie, aby przezwyciężyć te ograniczenia, co czyni E. coli bardziej odpowiednim gospodarzem do ekspresji rekombinowanego ludzkiego MMP-3cd,19,20. Na przykład szczep R2DP zastosowany w niniejszym badaniu usprawnia ekspresję eukariotyczną poprzez dostarczenie plazmidu opornego na chloramfenikol, zawierającego kodony rzadko występujące w E. coli.
Zgodnie z opisem w niniejszym protokole, po nadekspresji względnie czystych ciał inkluzyjnych z wektora pET-3a (Rysunek 1) w komórkach R2DP, białka katalitycznej domeny pro-MMP-3 z Hisx6 (MMP-3cd) są ekstrahowane i denaturowane4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 oczyszczono za pomocą chromatografii z użyciem znaczników powinowactwa. Po refoldingu i dializie pro-MMP-3cd (zymogen) został aktywowany za pomocą octanu 4-aminofenylomrturowego (APMA), a analiza SDS-PAGE służy do oceny wydajności i konieczności dalszego oczyszczania5,21. Niniejszy protokół opisuje ekspresję, oczyszczanie i aktywację rozpuszczalnego MMP-3cd jako przykładu. Może on jednak służyć jako wskazówka do ekspresji innych MMP oraz ludzkich proteaz o podobnych mechanizmach ekspresji i aktywacji (Rysunek 2). W przypadku białek innych niż MMP-3cd zaleca się określenie optymalnych składów buforów i metod dla białka docelowego przed przystąpieniem do realizacji niniejszego protokołu.
<img alt="Schemat mapy plazmidu wektora pET3a przedstawiający miejsca restrykcyjne, geny oporności na antybiotyki, promotory." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Mapa plazmidu pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd. Wektor pET-3a zawiera gen oporności na ampicylinę. Sekwencja znacznika Hisx6 na N-końcu została sklonowana do wektora opartego na pET-3a, wraz z pro-MMP-3cd, w celu otrzymania konstrukcji pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd pod kontrolą promotora T7 pomiędzy miejscami restrykcyjnymi BamHI i NdeI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat klonowania, refoldingu białka i oczyszczania; proces obejmuje powinowactwo do znacznika His oraz ciałka inkluzyjne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Bakteryjna ekspresja pro-MMP-3cd, oczyszczanie, refolding i aktywacja. 1.1: Plazmid pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd został przetransformowany do komórek BL21(DE3) lub R2DP. 1.2: Ekspresję białka Pro-MMP-3cd indukowano przy użyciu IPTG. 1.3: Do ekstrakcji białek Hisx6-pro-MMP-3cd, które są głównie nierozpuszczalne i znajdują się w ciałkach inkluzyjnych, zastosowano lizę chemiczną i sonikację. Mocznik posłużył do denaturacji i solubilizacji białka z ciałek inkluzyjnych. 2.1. Zdenaturowane białko Hisx6-pro-MMP-3cd zostało oczyszczone za pomocą chromatografii powinowactwa. 3. Eluowane białko Hisx6-pro-MMP-3cd poddano powolnemu refoldingowi podczas dializy poprzez stopniowe usuwanie mocznika z buforu. 4. Na koniec zrefoldowane białko MMP-3cd aktywowano za pomocą APMA poprzez usunięcie N-terminalnej domeny pro-peptydowej. APMA usunięto następnie z roztworu poprzez odsalanie. Numery odpowiadają sekcjom protokołu opisującym te etapy. Skróty: MMP-3cd = domena katalityczna metaloproteinazy macierzy 3; APMA = octan 4-aminofenylomerkurowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m sterylny filtr</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLGP033RS</td><td>Służy do usuwania niektórych zanieczyszczeń z ekstraktu białkowego przed oczyszczeniem i zapobiegania zatykaniu się kolumny Ni-NTA</td></tr><tr><td>1 L Termosy</td><td>Fisher Scientific</td><td>S76106F</td><td>n/a</td></tr><tr><td>1 L szklane butelki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>06-414-1D</td><td>n/a</td></tr><tr><td>1,5 ml probówki do mikrofuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-682-002</td><td>N/a</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>n/a</td></tr><tr><td>18 G, igła skośna</td><td>1 cal Amazon</td><td>B07S7VBHM2</td><td>Używany w połączeniu z kasetą dializacyjną</td></tr><tr><td>2 ml kolumna odsalająca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89890</td><td>Usuwa APMA po aktywacji</td></tr><tr><td>Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAA1610422</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Stożkowe poduszki na butelki 250 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-538-53A</td><td>Stabilizacja stożkowych butelek podczas wirowania o dużej objętości</td></tr><tr><td>Butelki stożkowe 250 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-538-53</td><td>n/a</td></tr><tr><td>400 mL mieszadło komórkowe</td><td>Sigma</td><td>Aldrich UFSC40001</td><td>Ponownie zagęszcza znacznie większą objętość niż filtr odśrodkowy. Komórki Rosetta2(DE3)pLysS wytwarzają duże ilości białka, które mogą przekraczać limit 15 ml odśrodkowego jednostki filtrującej</td></tr><tr><td>Octan 4-aminofenylortęci (APMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9563-5G</td><td>Aktywuje MMP-3 poprzez rozszczepienie strzykawki propeptyd</td></tr><tr><td>5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0829167</td><td>Używany w połączeniu z kasetą do dializy</td></tr><tr><td>50 ml rurki stożkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>Służy do przechowywania na wielu etapach oczyszczania</td></tr><tr><td>50 ml probówka do ponownego zatężania</td><td>Sigma Aldrich</td><td>UFC901024D</td><td>Służy do ponownego zagęszczania próbek białek po dializach lub usuwania zanieczyszczeń</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td>Składnik buforowy, który zestala autoklawowane podłoże LB po schłodzeniu</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td>Antybiotyk stosowany z wektorem pET3a; używany przy 100 &mikro; g/ml w pożywce LB</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td>Enzym restrykcyjny do stosowania z wektorem pET3a</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>600-30-23</td><td>Jon wapnia stabilizuje strukturę MMP</td></tr><tr><td>Rozsiewacze komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-189-7544</td><td>Może być stosowany do rozprowadzania komórek na szalce Petriego po transformacji</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-055-125GM</td><td>Antybiotyk stosowany z wektorem pET3a; stosowany w 34 &mikro; g/ml w pożywce LB</td></tr><tr><td>Bufor do dializy 1</td><td>n/a</td><td>n/d</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &mikro; M ZnCl2, 4 M Mocznik.</td></tr><tr><td>Bufor do dializy 2</td><td>n/a</td><td>n/d</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &mikro; M ZnCl2, 2 M Mocznik.</td></tr><tr><td>Bufor do dializy 3</td><td>n/d</td><td>n/d</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 &mikro; M ZnCl2.</td></tr><tr><td>Klipsy do dializy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>68011</td><td>Używany w połączeniu z rurkami dializacyjnymi ze skóry węża Rurki</td></tr><tr><td>do dializy Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>88243</td><td>Alternatywna metoda dializy, która utrzymuje znacznie większe objętości próbek, ale z większym ryzykiem utraty próbki</td></tr><tr><td>Bufor trawienny</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>Bufor używany do trawienia wektora pET3a</td></tr><tr><td>Kuwety jednorazowe</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>21-200-257</td><td>Służy do pomiaru OD kultury bakteryjnej podczas wzrostu i ekspresji</td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D107125G</td><td>Pomaga w denaturacji białek poprzez redukcję wiązań dwusiarczkowych</td></tr><tr><td>Mieszanka montażowa DNA</td><td></td><td>NEB E2621S</td><td>Służy do ligacji produktu Hisx6-pro-MMP-3cd PCR i strawionego wektora pET3a</td></tr><tr><td>DNazy I</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td>Endonukleaza do degradacji niekorzystnych zanieczyszczeń DNA, które mogą później wpływać na oczyszczanie białek</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A995-4</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J15694-AE</td><td>Stosowany w denaturacji. Zapobiega utlenianiu i późniejszemu tworzeniu się wiązań dwusiarczkowych</td></tr><tr><td>Zestaw do odzyskiwania żelu</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Izoluje i oczyszcza DNA z żeli agarozowych</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td>Służy do wytwarzania zapasów glicerolu, które są zamrażane w temperaturze -80 &; C</td></tr><tr><td>Kolumna przepływu grawitacyjnego</td><td>BioRad</td><td>7321010</td><td>Służy do oczyszczania Ni-NTA rekombinowanych białek znakowanych Hisem Ogniwa</td></tr><tr><td>o wysokiej wydajności transformacji</td><td>NEB</td><td>C2987</td><td>Ogniwa o wysokiej wydajności transformacji z większą szansą na powodzenie w klonowaniu N-końcowego znacznika Hisa do konstruktu pET3a-pro-MMP-3cd</td></tr><tr><td>Bufor elucyjny HT</td><td>nie</td> dotyczy <td>nie dotyczy</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 6 M mocznik, 250 mM imidazol. Dostosować pH do 7,4</td></tr><tr><td>HT Bufor równowagowy</td><td>n/a</td><td>n/d</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 6 M mocznik. Dostosować pH do 7,4</td></tr><tr><td>HT Bufor regeneracyjny</td><td>nie</td> dotyczy <td>nie dotyczy</td><td>20 mM MES, 0,1 M NaCl. Dostosuj pH do 5,0</td></tr><tr><td>HT Bufor płuczący</td><td>nie</td><td></td> dotyczy <td>20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 6 M mocznika, 25 mM imidazolu. Dostosuj pH do 7,4</td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A144C-212</td><td>Służy do buforowania</td></tr><tr><td>pH Imidazol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAA1022122</td><td>Naśladuje grupę boczną histydyny. Służy do oddzielania białek niewiążących niespecyficznie od znakowanego przez niego białka docelowego</td></tr><tr><td>Inclusion Body Buffer</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0,5 M mocznik. Dostosuj pH do 8,0</td></tr><tr><td>Izopropylo-&szlig;-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERR0392</td><td>Odczynnik, który indukuje ekspresję docelowego genu w pET3a. Przygotować 0,5 ml 1 M porcji, przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>LB Amp CamR media</td><td>nie</td><td></td> dotyczy <td>Nie dotyczy Wlać do sterylnej butelki o pojemności 1 l lub kolby o pojemności 1 l. Na 1 l dodaj 25 g bulionu LB. Sterylizuj w autoklawie. Po schłodzeniu do temperatury poniżej 50 stopni C, dodaj ampicylinę do 100 i mikro; g / ml i chloramfenikolu do 34 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>LB Amp CamR płytki</td><td>nie</td><td></td> dotyczy <td>Nie dotyczy Do wlania do sterylnych szalek Petriego. Wlewać, aż pokrywka szalki Petriego zostanie całkowicie zakryta. Z 1 l podłoża wystarcza na 40-60 płytek. Na 1 l: 25 g bulionu LB, 16 g agaru. Sterylizuj w autoklawie. Po schłodzeniu do temperatury poniżej 50 stopni C, dodaj ampicylinę do 100 i mikro; g / ml i chloramfenikolu do 34 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>LB Bulion</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td>Wstępnie zmieszany z tryptonem, ekstraktem drożdżowym i chlorkiem sodu</td></tr><tr><td>Bufor do lizy</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0,133 g/ml lizozymu, 0,49% v/v Triton X-100. Dostosuj pH do 8,0</td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>MP Biomedicals</td><td>195303</td><td>Stosowany w ekstrakcji białek. Enzym lizujący ściany komórkowe bakterii</td></tr><tr><td>Zestaw miniprep</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td>Jeśli się powiedzie, ekstrahuje konstrukt pET3a-pro-MMP-3cd z transformantów</td></tr><tr>Enzym restrykcyjny<td>NdeI</td><td>NEB</td><td>R0111S</td> do <td>stosowania z wektorem pET3a</td></tr><tr><td>Żywica Ni-NTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI88221</td><td>Służy do wiązania rekombinowanych białek znakowanych przez jego. Ta silna interakcja może być wyparta przez wyższe stężenia imidazolu</td></tr>, <tr><td>niejonowego środka powierzchniowo czynnego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI28316</td><td>Detergent do przechowywania, zapobiegający agregacji MMP. Minimalizuje interakcje między pozostałościami hydrofobowymi na powierzchni MMP a cząsteczkami wody, nie zakłócając przy tym aktywności katalitycznej.</td></tr><tr><td>Mieszanka PCR</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>Odczynnik do PCR do wprowadzania N-końcowego znacznika his-tag do plazmidu pET wektorowego pET3a-pro-MMP-3cd</td></tr><tr><td></td><td>Addgene</td><td>n/a</td><td>Wektor pET3a oferuje oporność na ampicylinę, indukowalną ekspresję docelowego genu i sekwencjonowanie za pomocą starterów T7</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>Służy do powlekania transformantów na podłożach agarowych LB</td></tr><tr><td>Komórki R2DP</td><td>Novagen</td><td>714033</td><td>pochodne BL21 o zwiększonej ekspresji białek eukariotycznych. Zawierają tRNA kodonów, które okazały się rzadkie w</td></tr><tr><td>pożywce wzrostowej E</td>. coli SOC <td>NEB</td><td>B9020S</td><td>Nieselektywne podłoża wzrostowe do szybkiego wzrostu podczas transformacji</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>Stosowany w i pomaga w stabilności białek</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI89905</td><td>Detergent stosowany w ekstrakcji białek. Lizuje ściany komórkowe</td></tr><tr><td>Bufor solubilizacyjny</td><td>n/a</td><td>n/d</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M mocznik. Dostosuj pH do 8,0</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Powszechny bufor stosowany w fizjologicznym zakresie pH. Wrażliwy</td></tr><tr><td>na temperaturę Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M1122980101</td><td>Detergent stosowany do lizy komórek</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAJ75826A7</td><td>Pierwszy chaotropowy środek do zaburzania struktury drugorzędowej białka</td></tr><tr><td>Chlorek (ZnCl2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAA162810E</td><td>Stabilizuje strukturę MMP. Jon znajduje się w miejscu katalitycznym MMP-3</td></tr></tbody></table>

bakteryjna ekspresja i oczyszczanie metaloproteinazy ludzkiej macierzy-3 za pomocą chromatografii powinowactwa

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Metaloproteinazy macierzy (MMP) należą do rodziny proteaz metzinciny, które odgrywają kluczową rolę w degradacji i przebudowie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), a także wchodzą w interakcje z wieloma czynnikami wzrostu i cytokinami. Nadekspresja określonych MMP jest odpowiedzialna za kilka chorób, takich jak rak, choroby neurodegeneracyjne i choroby sercowo-naczyniowe. MMP znalazły się ostatnio w centrum uwagi jako cele w celu opracowania terapii, które mogą leczyć choroby skorelowane z nadekspresją MMP.
Aby zbadać mechanizm MMP w roztworze, potrzebne są łatwiejsze i bardziej wytrzymałe metody ekspresji i oczyszczania białek rekombinowanych do produkcji aktywnych, rozpuszczalnych MMP. Jednak domena katalityczna większości MMP nie może być wyrażona w Escherichia coli (E. coli) w postaci rozpuszczalnej z powodu braku maszynerii potranslacyjnej, podczas gdy systemy ekspresji ssaków są zwykle kosztowne i mają niższą wydajność. Ciała inkluzyjne MMP muszą przejść żmudny i pracochłonny proces intensywnego oczyszczania i ponownego fałdowania, co znacznie zmniejsza wydajność MMP w natywnej konformacji. W artykule przedstawiono protokół wykorzystujący komórki Rosetta2(DE3)pLysS (zwane dalej R2DP) do wytwarzania domeny katalitycznej metaloproteinazy-3 macierzy (MMP-3cd), która zawiera N-końcowy znacznik His, a następnie pro-domenę (Hisx6-pro-MMP-3cd) do stosowania w oczyszczaniu powinowactwa. Komórki R2DP zwiększają ekspresję białek eukariotycznych poprzez plazmid odporny na chloramfenikol zawierający kodony zwykle rzadkie w bakteryjnych systemach ekspresyjnych. W porównaniu z tradycyjną linią komórkową z wyboru do ekspresji białek rekombinowanych, BL21(DE3), oczyszczanie przy użyciu tego nowego szczepu poprawiło wydajność oczyszczonego Hisx6-pro-MMP-3cd. Po aktywacji i odsaleniu domena pro jest rozszczepiana wraz z N-końcowym znacznikiem His, zapewniając aktywny MMP-3cd do natychmiastowego użycia w niezliczonych zastosowaniach in vitro. Metoda ta nie wymaga drogiego sprzętu ani złożonych białek fuzyjnych i opisuje szybką produkcję rekombinowanych ludzkich MMP w bakteriach.

Podczas analizy próbek metodą SDS-PAGE, ze względu na to, że białko jest wyrażane w formie nierozpuszczalnych ciałek inkluzyjnych, frakcje po lizie i sonikacji powinny zawierać niewielką ilość lub wcale nie zawierać ekstraktu Hisx6-pro-MMP-3cd, ponieważ białko nie zostało jeszcze resolubilizowane w moczniku. Rysunek 3 przedstawia porównanie frakcji elucyjnych podczas oczyszczania za pomocą znacznika His białka Hisx6-pro-MMP-3cd z komórek BL21(DE3) oraz komórek R2DP. Frakcje elucyjne dla komó...

Oczyszczanie, dializa i aktywacja znacznika his-tag są stosowane w celu zwiększenia wydajności rozpuszczalnej, aktywnej metaloproteinazy-3 domeny katalitycznej ekspresji białka u bakterii. Frakcje białkowe są analizowane za pomocą żeli SDS-PAGE.

Bakteryjna ekspresja i oczyszczanie metaloproteinazy ludzkiej macierzy-3 za pomocą chromatografii powinowactwa

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...

Ten szczegółowy protokół opisuje wysoce wydajną i opłacalną metodę ekspresji bakteryjnej rekombinowanej domeny katalitycznej MMP-3 w E. Coli, która może być stosowana do innych celów terapeutycznych MMP. E. coli nie ma złożonego systemu fałdowania białek i przetwarzania potranslacyjnego. Metoda ta wykorzystuje szczep komórek R2DP w celu zwiększenia ekspresji białek eukariotycznych w E. coli.Nadprodukcja określonych MMP prowadzi do wielu chorób, takich jak rak, choroby sercowo-naczyniowe i neurodegeneracyjne. Aktywne rozpuszczalne MMP są potrzebne do opracowania leków hamujących MMP. Zaszczepić pojedynczą izolowaną kolonię transformantu katalitycznego domeny pET His-tag pro MMP-3 z płytki opornej na ampicylinę LB chloramfenikolu w pięciu mililitrach pożywki odpornej na ampicylinę LB w temperaturze chloramfenikolu w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Zachowaj porcje z każdej kultury i przygotuj 40% zapasy glicerolu. Zaszczepić jednolitrową kolbę zawierającą 500 mililitrów pożywki LB odpornej na ampicylinę, chloramfenikol, do gęstości optycznej od 0,05 do 0,1 przy 600 nanometrach za pomocą kultury nocnej. Zmierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach w kilku punktach czasowych, zwykle przez trzy do czterech godzin, aż spadnie między 0,4 a 0,6.Indukować hodowle z jednym molowym zapasem IPTG do końcowego stężenia jednego milimola. Inkubować w wytrząsarce o temperaturze 37 stopni przez dodatkowe trzy do czterech godzin. Odwirować komórki w stożkowych butelkach o pojemności 250 mililitrów w temperaturze 13 000 G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, powtarzając, aż kultury zostaną całkowicie granulowane.Dodać trzy mililitry buforu do lizy na gram osadu i ponownie zawiesić osad przez wirowanie lub pipetowanie. Dodaj 1,25 mililitra deoksycholanu sodu o stężeniu 10% na jeden litr kultury. Dodać 10 mikrolitrów DNazy I na jeden litr kultury.Wstrząsaj w temperaturze pokojowej przez 30 minut przy 150 obr./min. Wirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 g i czterech stopniach Celsjusza. Odrzucić supernatant.Ponownie zawiesić osad w 100 mililitrach na litr bufora do kultury inkluzji, pipetując w górę iw dół. Podczas sonikacji próbki należy przechowywać na lodzie, aby zapobiec przegrzaniu. Poddaj każdą próbkę sonifikacji przez sześć cykli po 15 sekund, wyjście pięć i 50% impulsu.Odwirowywać próbki przez 10 minut w temperaturze 13 000 g i czterech stopniach Celsjusza. Sprawdź pellet. Jeśli osad jest zwarty, wyrzucić supernatant.Ponownie zawiesić każdą osadkę z jednolitrowej kultury i pięciu mililitrów buforu do solubilizacji. Inkubować przez co najmniej 30 minut na lodzie, aby umożliwić rozpuszczenie białek. Odwiruj komórki przez 10 minut w temperaturze 13 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza.Jeśli osad tworzy się po odwirowaniu, wlej supernatant do oddzielnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Zawiesić osad w kolejnych pięciu mililitrach buforu do rozpuszczania na jeden litr kultury, pipetując w górę iw dół. Wirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 g i czterech stopniach Celsjusza.Następnie wyciągnij supernatanty. Wyrzuć osad lub przechowuj go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu dodatkowej sonikacji. Przeprowadzić ślepą próbę w stosunku do buforu płuczącego HT i zapisać A280 pierwszej frakcji płukania.Powtarzaj z innymi frakcjami, aż A280 zbliży się do linii podstawowej. Natychmiast wymyj białka znakowane przez His, dodając pięć mililitrów buforu elucyjnego HT. Zebrać przepływ o frakcjach od 0,5 do jednego mililitra w probówkach do mikrofug oznaczonych elucjącją.Zmierzyć A280 frakcji elucyjnej. Jeśli A280 jest większy niż 0,3 miligrama na mililitr, rozcieńczyć frakcję buforem równowagi HT. Zanurzyć wyluzowane frakcje MMP w rurkach dializacyjnych w jednym litrze pierwszego buforu do dializy i mieszać rurkę i jej zawartość na mieszadle magnetycznym przez co najmniej osiem godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przenieść do jednego litra buforu dializacyjnego dwa i mieszać rurkę i jej zawartość na mieszadle magnetycznym przez co najmniej osiem godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przenieść do jednego litra buforu do dializy trzy i mieszać rurkę i jej zawartość na mieszadle magnetycznym przez nie mniej niż osiem godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść próbkę do odpowiedniego pojemnika i oznaczyć ją jako wydializowany MMP.Zbadaj probówkę pod kątem osadów. Na jeden mililitr podwielokrotności jednego miligrama na mililitr MMP dodać 50 mikrolitrów 20-milimolowego APMA, aby osiągnąć końcowe stężenie APMA wynoszące jeden milimol. Jeśli utworzy się osad, odwiruj go z maksymalną prędkością przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przechowywać supernatant w 1,5-mililitrowej probówce do mikrofugi oznaczonej jako aktywowany MMP. Wyrzucić osad do pojemnika oznaczonego jako odpady APMA. SDS-PAGE uruchomiono w celu porównania frakcji elucji oczyszczania His-tag domeny katalitycznej His-tag pro MMP-3 z komórek BL21 DE3 w komórkach R2DP.Pierwsze osiem frakcji elucyjnych domeny katalitycznej MMP znakowanej His i komórek BL21 DE3 wykazało mniej białka niż te w domenie katalitycznej MMP znakowanej Hisem w komórkach R2DP. Pokazano indukowane, ponownie złożone, zagęszczone, aktywowane i odsolone frakcje komórek MMP3 CD i R2DP. Po aktywacji masa cząsteczkowa aktywowanego pasma CD MMP-3 wynosi około 20 kilodaltonów, w przeciwieństwie do zymogena znakowanego Hisem, który pozostaje na poziomie około 30 kilodaltonów.Podczas wirowania lizatów komórkowych granulki mogą nie być zwarte. Kiedy tak się stanie, należy poddać sonikacji więcej i odwirować dłużej. Podczas ponownego zagęszczania białka może dojść do wytrącania się.Rozpuść go w buforze do rozpuszczania i powtórz proces. Opisana tutaj procedura zapewnia szczegółową metodę rozpuszczalnej ekspresji aktywnych ludzkich MMP, która może ostatecznie zostać wykorzystana do zrozumienia molekularnego mechanizmu aktywności enzymatycznej MMP. Alternatywne metody oczyszczania białek, takie jak FPLC, mogą być stosowane w celu oczyszczenia białek MMP.

bacterial-expression-purification-human-matrix-metalloproteinase-3

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

MamA jest unikalnym białkiem powiązanym z magnetosomami, o którym wykazano, że bierze udział w ich aktywacji. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół oczyszczania mutanta z delecją MamA (MamAΔ41) z M. magneticum AMB-1.

Oczyszczanie białka MamAΔ41 związanego z magnetosomami szczepu AMB-1 M. magneticum

Opracowano i szczegółowo opisano nowatorski i wysoce wydajny dwuetapowy protokół chromatografii powinowactwa. Metoda ta opiera się na niewielkim znaczniku oczyszczającym o dwóch wrodzonych powinowactwach i jest możliwa do zastosowania w odniesieniu do szerokiego zakresu białek docelowych o różnych właściwościach.<br...

Ortogonalne oczyszczanie białek wspomagane przez mały bispecyficzny znacznik powinowactwa

Źródło: Becker, B. i inni. Prosty test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych niezbędnych do transportu łańcucha toksyny rycyny A (RTA) w drożdżach. J. Vis. Exp. (2017).Ten film demonstruje oczyszczanie rekombinowanego białka oznaczonego polisystydyną za pomocą chromatografii powinowactwa na bazie niklu. Określa kluczowe kroki, w tym lizę bakteryjną przez sonikację, klarowanie i filtrację lizatu oraz selektywne wiązanie i eluację docelowego białka za pomocą...

 Technika chromatografii powinowactwa do oczyszczania rekombinowanego białka bakteryjnego

Ten film demonstruje technikę oczyszczania przeciwciał monoklonalnych z supernatantu hodowli uzyskanego z hodowli komórkowej wytwarzającej przeciwciała. Proces ten polega na wykorzystaniu matrycy usieciowanych kulek agarozy ze sprzężonym białkiem A, które unieruchamia przeciwciała w supernatancie na kulkach, co pozwala na skuteczne oddzielenie od zanieczyszczeń. Poprzez zastosowanie buforu elucyjnego o niskim pH oddziaływanie białka A z przeciwciałem zostaje rozluźnione, co ułatwia zbieranie...

Technika chromatografii powinowactwa do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych

Ten protokół opisuje procedurę wzbogacania białek ECM z tkanek lub guzów oraz deglikozylacji i trawienia preparatów wzbogaconych w ECM na peptydy w celu analizy ich składu białkowego za pomocą spektrometrii mas.

Wzbogacanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej z tkanek i trawienie do peptydów do analizy spektrometrii mas

To jest szybki, efektywny kosztowo protokół produkcji wydzielanych, glikozylowanych białek ssaków i późniejszego jednoetapowego oczyszczania z wystarczającą wydajnością jednorodnego białka do krystalografii rentgenowskiej i innych badań biofizycznych.

Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Tutaj prezentujemy metodę wyrażania i oczyszczania S100A12 (kalgranulina C). Opisujemy protokół pomiaru jego aktywności przeciwdrobnoustrojowej wobec ludzkiego patogenu H. pylori.

Ekspresja, oczyszczanie i aktywność przeciwdrobnoustrojowa S100A12

Oczyszczanie kanałów jonowych jest często wyzwaniem, ale gdy już zostanie osiągnięte, może potencjalnie umożliwić badania in vitro funkcji i struktur kanałów. W tym miejscu opisujemy etapowe procedury ekspresji i oczyszczania białek bestrofiny ssaków, rodziny kanałów Cl- aktywowanych przezCa2+.

Ekspresja i oczyszczanie kanałów jonowych bestrofiny ssaków

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania metodą chromatografii z immobilizowanym metalem metodą powinowactwa do metalu, a następnie odtworzenia oznaczonej polihistydyną, niehemowej dioksygenazy wiążącej żelazo, odpowiedniej dla laboratorium nauczania na studiach licencjackich.

Laboratoryjna chromatografia powinowactwa do immobilizowanych metali, rekonstytucja i oznaczanie metaloenzymu znakowanego polihistydyną dla laboratorium licencjackiego

Tutaj przedstawiono protokół hermetyzacji i hodowli komórek w hydrożelach z poli(glikolu etylenowego) (PEG) funkcjonalizowanych peptydem degradowalnym przez metaloproteinazę o matrycy fluorogennej (MMP). Komórkowy MMP i aktywność metaboliczną mierzy się bezpośrednio z kultur hydrożelowych za pomocą standardowego czytnika mikropłytek.

Pomiar globalnej metaloproteinazy macierzy komórkowej i aktywności metabolicznej w hydrożelach 3D

Ten protokół szczegółowo opisuje procedury rekombinacyjnego wytwarzania ludzkiego holoenzymu miozyny-7a za pomocą systemu MultiBac Baculovirus oraz badania jego ruchliwości za pomocą dostosowanego testu ślizgowego in vitro.

Oczyszczanie oparte na systemie MultiBac i biofizyczna charakterystyka ludzkiej miozyny-7a

Poznaj metodę ekspresji i oczyszczania metaloproteinazy MMP-3 w bakteriach E. coli z wykorzystaniem szczepu R2DP. Protokół obejmuje chromatografię powinowactwa, dializę oraz aktywację białka.

Bakteryjna ekspresja i oczyszczanie metaloproteinazy ludzkiej macierzy-3 za pomocą chromatografii powinowactwa

Przeglądaj więcej filmów