Ocena funkcjonalna kinezyny-7 CENP-E w spermatocytach za pomocą inhibicji in vivo, immunofluorescencji i cytometrii przepływowej

Mejoza jest ewolucyjnie konserwatywnym wydarzeniem u eukariontów, które jest niezbędne do gametogenezy i rozmnażania płciowego. Nasz protokół zapewnia skuteczną metodę badań podziału mejotycznego i spermatogenezy. Opisaliśmy szereg protokołów do analizy spermatocytów.

Technika ta może być stosowana do obserwacji wrzeciona mejotycznego, chromosomów homologicznych i organelli subkomórkowych w spermatocytach. Metoda ta może być stosowana do analizy podziału mejotycznego, generowania modeli zwierzęcych do edycji genów oraz transfekcji genów w tkankach lub narządach. Eksperymentatorzy powinni utrzymywać sterylne środowisko podczas operacji jamy brzusznej i zwracać uwagę na temperaturę, czas i kluczowe warunki eksperymentalne tego protokołu.

Procedurę zademonstruje pani Meng-Fei Xu, doktorantka z mojego laboratorium. Rozpocznij budowę mysiego modelu hamowania białka centromerowego E lub CENP-E za pośrednictwem GSK923295, wiążąc znieczulone kończyny myszy i mocując je na tacce na woskowinę. Po zdezynfekowaniu obszaru operacyjnego za pomocą sterylnego skalpela należy wykonać pięciomilimetrowy otwór w jamie brzusznej myszy, a następnie umieścić sterylne zaciski chirurgiczne na skórze.

Następnie pociągnij poduszeczkę tłuszczową najądrza sterylnymi kleszczami preparacyjnymi, aby zlokalizować jądra za pomocą sterylnej pęsety. Po utrwaleniu jąder sterylnymi kleszczami pod stereoskopem, powoli wstrzyknąć 10 mikrolitrów GSK923295 do kanalików nasiennych w końcowym stężeniu 10 mikromolowych przy użyciu 10 mikrolitrów jodu. Po zakończeniu wepchnij jądra z powrotem do jamy brzusznej i zszyj miejsce operacji zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym.

W celu gradientowego odwodnienia pobranych jąder myszy, należy sekwencyjnie inkubować próbkę w różnych pożywkach, jak opisano w manuskrypcie. Po seryjnej inkubacji umieść tkankę na dnie pudełka do zatapiania i dodaj stopioną parafinę do pudełka. W celu całkowitego zestalenia parafiny należy schłodzić próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez sześć godzin.

Później zamocuj próbkę na uchwycie ultramikrotomu, utrzymując kąt między próbką a powierzchnią noża na poziomie od 5 do 10 stopni. Dostosuj grubość plastra do pięciu mikrometrów, aby przygotować odcinki o grubości pięciu mikrometrów za pomocą ultramikrotomu. Po przygotowaniu szkiełko należy rozprowadzić w łaźni wodnej w temperaturze 40 stopni Celsjusza, a następnie wysuszyć skrawki w suszarce do szkiełek przez 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po 12 godzinach wykonaj sekwencyjną inkubację szkiełek, jak wyjaśniono wcześniej. Następnie płucz szkiełka w wodzie destylowanej przez pięć minut, a następnie barwij roztworem hematoksyliny Mayera przez sześć minut w temperaturze pokojowej. Następnie płucz zabarwione szkiełka pod bieżącą wodą przez pięć minut i inkubuj w wodzie destylowanej przez dwie minuty.

Inkubować szkiełka w 1% chlorowodorku etanolu przez trzy sekundy, a następnie płukać pod bieżącą wodą przez dwie minuty. Wybarwić próbkę 1% eozyną przez 15 sekund, a następnie przeprowadzić seryjną inkubację. Po zakończeniu uszczelnij szkiełka za pomocą 15 mikrolitrów neutralnej gumy i szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 na 50 milimetrów.

W celu immunofluorescencji umieść szkiełko w roztworze do pobierania antygenu, aby gotowało się pod wysokim ciśnieniem w szybkowarze przez cztery minuty w celu pobrania antygenu. Następnie schłodzić szkiełko w naturalny sposób do temperatury pokojowej, a następnie dwukrotnie spłukać wodą destylowaną przez pięć minut i PBS przez pięć minut. Aby przeniknąć komórki, inkubuj szkiełko w 500 mikrolitrach 0,25% Triton X-100 w PBS przez 10 minut, a następnie trzykrotnie przepłucz szkiełka PBS przez pięć minut.

W celu zablokowania antygenu inkubować próbkę z 300 mikrolitrami 3% albuminy surowicy bydlęcej lub BSA przez jedną godzinę i z pierwszorzędowymi przeciwciałami w 3% BSA w PBST przez 16 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji umieść szkiełko w nawilżonym pudełku, aby zapobiec wysychaniu tkanek. Rozgrzej szkiełka w naturalny sposób do temperatury pokojowej przez 30 minut.

Odrzucić przeciwciało pierwszorzędowe, a następnie trzykrotnie przepłukać szkiełko w PBST przez pięć minut. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe 3% BSA i PBST. Następnie inkubować próbkę z rozcieńczonymi przeciwciałami drugorzędowymi przez jedną do dwóch godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po przepłukaniu próbki w PBST przez pięć minut pięć razy, wybarwić jądra 50 mikrolitrami DAPI przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zamontuj szkiełko nakrywkowe za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu i uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci. W przypadku cytometrii przepływowej zbierz jądra myszy na sześciocentymetrowych szalkach Petriego i pokrój jądra na jednomilimetrowe kawałki za pomocą nożyczek chirurgicznych.

Następnie trawić jądra w jednym mililitrze 1% kolagenazy w 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby wytrącić komórki spermatogenne, odwirować próbkę o sile 1 000 G przez pięć minut i wyrzucić supernatant przed dodaniem jednego mililitra 0,25% roztworu trypsyny EDTA do próbki przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie odwirować próbkę o sile 1 000 G przez pięć minut.

Wyrzuć supernatant do inkubacji wytrąconych komórek z jednym mililitrem 70% zimnego etanolu przez ponad osiem godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu w temperaturze 1 000 G przez pięć minut, zebrać osady komórkowe i wybarwić komórki spermatogenne 500 mikrolitrami jodku propidyny lub roztworu barwiącego PI w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji przefiltruj próbkę za pomocą sita o oczkach 300 w celu wyeliminowania resztek komórek i zbierz komórki w rurze przepływowej, aby przechowywać komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wykrywanie sygnałów fluorescencyjnych i rozpraszania światła na długości fali wzbudzenia przy 488 nanometrach za pomocą cytometru przepływowego. Przeanalizuj zawartość DNA w próbce i rozpraszanie światła za pomocą oprogramowania ModFit MF LT 32. Po wstrzyknięciu GSK923295 do jąder fala spermatogenna została zmieniona w kanalikach nasiennych z powodu hamowania CENP-E.

Jednak fala spermatogenna w kanalikach nasiennych była regularna i zorganizowana w grupie kontrolnej. Zaobserwowano, że kilka chromosomów homologicznych nie było wyrównanych na płytce równikowej po zahamowaniu CENP-E. Ponadto hamowanie CENP-E doprowadziło do wzrostu liczby spermatocytów metafazy I w kanalikach nasiennych.

Analiza immunofluorescencyjna wykazała zmniejszoną liczbę komórek dodatnich białka kompleksu antysynaptonemalnego three lub SYCP3 na kanalik nasienny po zahamowaniu CENP-E. Z drugiej strony, kropki SYP3 na komórkę metafazy i odcinki SYP3 na komórkę nie zostały naruszone w GSK92395 grupach. Odległości biegunów wrzeciona w spermatocytach metafazy I były zwiększone z powodu hamowania CENP-E.

Reprezentatywna analiza wykazała, że hamowanie CENP-E skutkowało zmniejszeniem liczby komórek haploidalnych w grupie GSK 923295 w porównaniu z kontrolą. Proporcje komórek diploidalnych i komórek aneuploidalnych nie uległy istotnemu wpływowi po zahamowaniu CENP-E. I odwrotnie, proporcje komórek tetraploidalnych wzrosły w grupie GSK923295 niż w grupie kontrolnej.

Analiza komórek spermatogennych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej wykazała zaburzoną organizację komórek spermatogennych w grupie GSK923295. Eksperymentator powinien zwrócić uwagę na pozycję iniekcji, dawkę leku, metodę iniekcji i metodę szwów podczas operacji jamy brzusznej i iniekcji do jąder. Technika ta, wraz z elektroporacją in vivo skoncentrowaną na docelowych białkach i narzędziach do edycji genów, może być stosowana w dziedzinie podziału miotycznego i spermatogenezy.