Name: Ocena funkcjonalna kinezyny-7 CENP-E w spermatocytach za pomocą inhibicji in vivo, immunofluorescencji i cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Poznaj metodę oceny funkcji kinezyny-7 CENP-E w spermatocytach myszy przy użyciu inhibicji in vivo, immunofluorescencji i cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia badanie podziału mejotycznego i stabilności genomu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim członkom Laboratorium Cytoszkieletu na Uniwersytecie Medycznym Fujian za pomocne dyskusje. Dziękujemy Jun-Jin Linowi z Publicznego Centrum Usług Technologicznych Uniwersytetu Medycznego Fujian za pomoc techniczną w zakresie cytometrii przepływowej. Dziękujemy Ming-Xia Wu i Lin-Ying Zhou z Laboratorium Mikroskopii Elektronowej Publicznego Centrum Usług Technologicznych Uniwersytetu Medycznego Fujian za pomoc techniczną w zakresie mikroskopii elektronowej. Dziękujemy Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke i Jun Song z Eksperymentalnego Centrum Nauczania Podstawowych Nauk Medycznych na Uniwersytecie Medycznym Fujian za ich wsparcie. Badanie to było wspierane przez następujące granty: Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (numer grantu 82001608), Fundacja Nauk Przyrodniczych Prowincji Fujian, Chiny (numer grantu 2019J05071), Fujian Provincial Health Technology Project (numer grantu 2018-1-69), Startup Fund for Scientific Research, Fujian Medical University (numer grantu 2017XQ1001), projekt finansowania start-upów w zakresie talentów naukowych na Uniwersytecie Medycznym Fujian (numer grantu XRCZX2017025) oraz projekt badawczy kształcenia i nauczania online studentów medycyny chińskiej (grant nr B-YXC20200202-06).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Medycznym Fujian (numer protokołu SYXK 2016-0007). Wszystkie eksperymenty na myszach przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi wytycznymi Opieki i Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych National Institutes of Health (publikacje NIH nr 8023, poprawione w 1978 r.).
1. Budowa modeli myszy hamujących CENP-E za pośrednictwem GSK923295
<ol>
	<li>Sterylizuj narzędzia chirurgiczne w temperaturze 121 °C przez 30 minut. Naświetlaj chirurgiczny ultraczysty stół warsztatowy ultrafioletem C (UVC) przez 2 godziny. Zważ 3-tygodniowe samce myszy ICR (Institute of Cancer Research) używane do eksperymentów i oblicz wymagane dawki środka znieczulającego.</li>
	<li>Znieczulenie myszy należy podając kombinację ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Sprawdź głębokość znieczulenia myszy poprzez kombinację odruchu rogówkowego myszy, odruchu nocyceptywnego, oddychania, a także napięcia mięśniowego. Upewnij się, że myszy są głęboko znieczulone. 
	UWAGA: Umieść zwierzę na poduszce grzewczej, aby zapewnić wsparcie termiczne podczas operacji.</li>
	<li>Zwiąż kończyny myszy i przymocuj je do tacki na wosk. Umieść kroplę maści weterynaryjnej na oczach myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Ogolić włosy na brzuchu myszy od dolnej części brzucha do moszny za pomocą eksperymentalnej maszynki do golenia dla zwierząt. Zabezpiecz obszar operacyjny sterylną serwetą.</li>
	<li>Zdezynfekuj brzuszną część brzucha peelingiem Betadine, a następnie trzykrotnie dodaj 75% etanolu. Otworzyć jamę brzuszną za pomocą sterylnego skalpela i wykonać otwór o średnicy <5 mm.</li>
	<li>Zacisnąć skórę sterylnymi klamrami chirurgicznymi i pociągnąć poduszeczkę tłuszczową najądrza sterylnymi kleszczami preparacyjnymi, aby zlokalizować jądra za pomocą sterylnej pęsety. Utrwalić jądro sterylnymi kleszczami pod stereoskopem i powoli wstrzyknąć 10 μl GSK923295 do kanalików nasiennych w końcowym stężeniu 10 μM przy użyciu 10 μL reodyne30. W celu budowy grupy kontrolnej wstrzyknąć 10 μl 1% roztworu DMSO (sultlenek dimetylu)/PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem). 
	UWAGA: Przechowywać roztwór GSK923295 w stężeniu 10 mM w temperaturze -80 °C. Rozpuścić 0,1 μl z 10 mM GSK923295 w 100 μl roztworu PBS, aby przygotować 10 μM roztworu GSK923295</li>.
	<li>Delikatnie wepchnij jądro z powrotem do jamy brzusznej za pomocą sterylnych kleszczy chirurgicznych. Zszyj otrzewną i skórę osobno za pomocą dwóch do czterech szwów za pomocą linii do szycia o średnicy 0,1 mm.</li>
	<li>Oznacz miejsce o wymiarach 3 x 3 mm na grzbiecie zwierzęcia markerem permanentnym po operacji jamy brzusznej, umieść mysz z powrotem w klatce do karmienia i zapewnij czyste i wolne od patogenów środowisko z wystarczającą ilością pożywienia i wody.</li>
	<li>Utrzymuj środowisko w stanie sterylnym przez przefiltrowane powietrze, sterylizowaną żywność i wodę. Opiekuj się zwierzęciem, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. W przypadku analgezji pooperacyjnej dawkę buprenorfiny (0,1 mg/kg) należy podawać podskórnie co 12 godzin przez 3 dni. Upewnij się, że mysz nie zostanie zwrócona do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje. 
	UWAGA: Myszom zapewnia się opiekę pooperacyjną i odpowiednio podaje się ranę w znieczuleniu miejscowym przy użyciu 0,5% lidokainy, aby w razie potrzeby zmniejszyć ból pooperacyjny.</li>
</ol>
2. Barwienie hematoksyliną-eozyną (HE) i histopatologia
<ol>
	<li>Cztery dni po operacji jamy brzusznej należy poddać myszy eutanazji z CO2 przy natężeniu przepływu 2 l/min w komorze CO2. Potwierdź zgon przez zwichnięcie szyjki macicy jako potwierdzającą metodę eutanazji. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby otworzyć mosznę i usunąć jądra za pomocą kleszczy. Zbierz jądra myszy 4 dni po GSK923295 wstrzyknięciu i utrwal je w 30 ml 10% roztworu formaldehydu w temperaturze pokojowej przez 12 godzin.</li>
	<li>W przypadku dehydratacji gradientowej należy sekwencyjnie inkubować próbkę w 40 ml 70% etanolu przez 1 godzinę, w 40 ml 85% etanolu przez 1 godzinę, w 40 ml 95% etanolu przez 1 godzinę i w 40 ml 100% etanolu przez 1 godzinę.</li>
	<li>Inkubować próbkę w 40 ml ksylenu przez 40 minut, a następnie w 40 ml parafiny przez 1 godzinę w temperaturze 65 °C. Umieścić tkanki na dnie pudełka do zatapiania. Dodaj stopioną parafinę do pudełka do zatapiania. Schłodzić tkanki do całkowitego zestalenia w temperaturze 4 °C przez 6 godzin.</li>
	<li>Zamocować próbki na uchwycie ultramikrotomu, utrzymać kąt między próbkami a powierzchnią noża na poziomie 5-10° i dostosować grubość plastra do 5 μm. Przygotować skrawki o grubości 5 μm za pomocą ultramikrotomu, rozprowadzić szkiełka w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C i wysuszyć skrawki w suszarce do szkiełek przez 12 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Inkubować szkiełka w 200 ml ksylenu przez 40 min, w 200 ml 100% etanolu przez 6 min, w 200 ml 95% etanolu przez 2 min, w 200 ml 90% etanolu przez 2 min, w 200 ml 80% etanolu przez 2 min, a w 200 ml 70% etanolu przez 2 min, a następnie w 200 ml 70% etanolu przez 2 min, odpowiednio.</li>
	<li>Opłucz szkiełka w wodzie destylowanej przez 5 minut i zabarwij je roztworem hematoksyliny Mayera przez 6 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Roztwór hematoksyliny Mayera: 0,011 mol/L hematoksyliny, 6,7% bezwodnego etanolu, 0,646 mol/L siarczanu glinowo-potasowego i 0,003 mol/l jodanu sodu.</li>
	<li>Opłucz szkiełka pod bieżącą wodą przez 5 minut i inkubuj w wodzie destylowanej przez 2 minuty.</li>
	<li>Inkubuj szkiełka w 1% chlorowodorku etanolu przez 3 s, a następnie płucz je pod bieżącą wodą przez 2 minuty.</li>
	<li>Próbkę barwić 1% eozyną przez 15 s, a następnie inkubować je z 95% etanolem przez 5 s, ze 100% etanolem przez 2 minuty i w ksylenie przez 40 minut.</li>
	<li>Uszczelnić szkiełka za pomocą 15 μl neutralnej gumy i szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 x 50 mm.</li>
</ol>
3. Immunofluorescencja i mikroskopia konfokalna
<ol>
	<li>Zbierz skrawki parafiny o grubości 5 μm jąder myszy w celu immunofluorescencji. Inkubować szkiełka w ksylenie przez 40 min, w 100% etanolu przez 6 min, w 95% etanolu przez 2 min, w 90% etanolu przez 2 min, w 80% etanolu przez 2 minuty i w 70% etanolu przez 2 min. Płukać szkiełka w wodzie destylowanej przez 5 minut, a następnie płukać szkiełka 0,01 M PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Umieścić szkiełka w roztworze do pobierania antygenu (0,01 M bufor cytrynianu) i gotować pod wysokim ciśnieniem w szybkowarze przez 4 minuty w celu pobrania antygenu. Schłodzić szkiełka w naturalny sposób do temperatury pokojowej. Płukać wodą destylowaną przez 5 minut dwa razy, a PBS przez 5 min. 
	UWAGA: 0,01 M bufor cytrynianowy (pH 6,0): 2,1 mmol/L kwas cytrynowy, 11,6 mmol/L dwuwodny cytrynian trisodowy.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek poprzez inkubację szkiełek w 500 μl 0,25% TritonX-100/PBS przez 10 minut. Przepłukać szkiełka PBS przez 5 minut trzy razy.</li>
	<li>W celu zablokowania antygenu inkubować próbki z 300 μl 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/PBST (0,1% Tween-20 w PBS) przez 1 godzinę. Próbki inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami w 3% BSA/PBST przez 16 godzin w temperaturze 4 °C. Umieścić szkiełka w wilgotnym pudełku, aby zapobiec wysychaniu tkanek. Rozgrzej szkiełka w naturalny sposób do temperatury pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Wyrzucić przeciwciało pierwszorzędowe, a następnie trzykrotnie płukać szkiełka w PBST przez 5 minut. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w 3% BSA/PBST. Inkubować próbki z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C. Przepłukać próbki w PBST przez 5 minut pięć razy.</li>
	<li>Wybarwić jądra 50 μl 4', 6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zamontuj szkiełko nakrywkowe za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu i uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci.</li>
	<li>Obserwuj i rejestruj sygnały fluorescencyjne na szkiełkach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw NA 40x/ 0,75.</li>
</ol>
4. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Zbierz jądra myszy na 6 cm szalkach Petriego i pokrój jądra na 1 mm3 kawałki za pomocą nożyczek chirurgicznych.</li>
	<li>Trawić jądra przy użyciu 1 ml 1% kolagenazy w 1,5 ml probówki wirówkowej przez 10 minut w temperaturze 37 °C, a następnie odwirowywać próbki przy 1 000 x g przez 5 minut w celu wytrącenia komórek plemnikowych.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, a następnie dodać 1 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA (kwasu etylenodiaminotetraoctowego) przez 20 minut w temperaturze 37 °C, a następnie odwirować próbki przy 1 000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, a następnie inkubować wytrącone komórki z 1 ml 70% zimnego etanolu przez ponad 8 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 1 000 x g przez 5 minut, a następnie zebrać osady komórkowe. Wybarwić komórki spermatogenne roztworem barwiącym 500 μl jodku propidyny (PI) (50 μg/ml PI, 100 μg/ml RNazy A i 0,2% Triton X-100 w PBS) w temperaturze 37 °C przez 30 min. 
	UWAGA: Delikatnie potrząsaj probówką wirówkową co 5 minut, aby uniknąć agregacji komórek.</li>
	<li>Przefiltrować próbki za pomocą sita o siatku 300 w celu pozbycia się resztek komórek; zebrać komórki w rurze przepływowej i przechowywać je w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wykrywanie sygnałów fluorescencyjnych i rozpraszania światła przy długości fali wzbudzenia 488 nm za pomocą cytometru przepływowego. Analizuj zawartość DNA i rozpraszanie światła za pomocą oprogramowania Modfit MFLT32.</li>
</ol>
5. Transmisyjna mikroskopia elektronowa
<ol>
	<li>Pokrój jądra na 1 mm3 kawałki za pomocą ostrego skalpela i szybko inkubuj próbki z 3% roztworem aldehydu glutarowego i 1,5% paraformaldehydu w 0,1 M PBS (pH 7,2) przez 4 godziny w 4 °C, aby uniknąć zmian ultrastruktury. Przepłukać próbki trzykrotnie 0,1 M PBS przez 5 minut. 
	UWAGA: Skalpel i nożyczki powinny być ostre i staraj się unikać sztucznego ściskania i ciągnięcia. Przetwarzanie próbek powinno odbywać się w płynie utrwalającym.</li>
	<li>Utrwalić próbki w 1% roztworze kwasu osmicznego i 1,5% żelazocyjanku potasu w temperaturze 4 °C przez 1,5 godziny. Osuszyć wodę bibułą filtracyjną i trzykrotnie płukać próbki 0,1 M PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Odwodnić próbki w 40 ml 50% alkoholu etylowego przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Próbki inkubować w 40 ml 70% alkoholu etylowego nasyconego octanem uranu w temperaturze 4 °C przez 12 godzin, w 40 ml 90% etanolu przez 10 minut w temperaturze 4 °C, w 40 ml 90% etanolu-acetonu przez 10 minut w temperaturze pokojowej, i w 40 ml bezwodnego acetonu przez 10 minut trzy razy w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Próbki inkubować w bezwodnej mieszaninie acetonu i żywicy epoksydowej 618 (v / v = 1:1) przez 1,5 godziny, a następnie zanurzyć próbki w środkach do zatapiania żywicy epoksydowej 618 w temperaturze 35 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>W przypadku polimeryzacji żywicy próbki inkubować w środkach do zatapiania żywicy epoksydowej 618 w temperaturze 35 °C przez 12 godzin, w temperaturze 45 °C przez 12 godzin, a następnie w temperaturze 60 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Zainstaluj próbki i szklany nóż, a następnie wyreguluj odległości między próbkami a nożem. Przygotuj ultracienkie skrawki o grubości 90 nm za pomocą ultracienkiego mikrotomu. Pokrój próbki ze stałą prędkością, a następnie umieść szkiełka na siatce niklowej. Umieść szkiełka na szalce Petriego w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Barwić szkiełka 2% octanem uranylu przez 10 minut, a następnie barwić próbki 2% cytrynianem ołowiu przez 10 minut. Szkiełka płukać wodą destylowaną. Suszyć szkiełka przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Obserwuj szkiełka i rejestruj obrazy elektronów przy napięciu 70-100 kV za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu ustaliliśmy model hamowania in vivo CENP-E jąder myszy za pomocą chirurgii jamy brzusznej i mikroiniekcji GSK923295. Chirurgia jamy brzusznej i metoda iniekcji jąder zastosowana w tym badaniu ma następujące zalety. Po pierwsze, nie ogranicza się do wieku myszy. Eksperymentatorzy mogą wykonać wstrzyknięcie do jąder na wczesnym etapie, na przykład u 3-tygodniowych lub młodszych myszy. Po drugie, GSK923295 ma specyficzne i doskonałe działanie hamujące na CENP-E. Po trzecie, metoda ta jest prosta w obs...

Mejoza jest jednym z najważniejszych, bardzo sztywnych, ewolucyjnie zachowanych zdarzeń w organizmach eukariotycznych i jest niezbędna dla gametogenezy, rozmnażania płciowego, integralności genomu i różnorodności genetycznej1,2,3. U ssaków komórki rozrodcze przechodzą dwa kolejne podziały komórkowe, mejozę I i II, po jednej rundzie replikacji DNA. W przeciwieństwie do chromatyd siostrzanych w mitozie, zduplikowane chromosomy homologiczne łączą się w pary i segregują na dwie komórki potomne podczas mejozy I4,5. W mejozie II chromatydy siostrzane rozdzielają się i segregują, tworząc haploidalne gamety bez replikacji DNA6. Błędy w którymkolwiek z dwóch podziałów mejotycznych, w tym wady montażu wrzeciona i nieprawidłowa segregacja chromosomów, mogą skutkować utratą gamet, bezpłodnością lub zespołami aneuploidii7,8,9.
Coraz więcej badań wykazało, że motory rodziny kinezyny odgrywają kluczową rolę w regulacji dopasowania i segregacji chromosomów, montażu wrzeciona, cytokinezy i progresji cyklu komórkowego zarówno w komórkach mitotycznych jak i mejotycznych10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (białko centromerowe E) jest silnikiem kinetochorowym ukierunkowanym na koniec dodatni, niezbędnym do kongresacji chromosomów, transportu i wyrównania chromosomów oraz regulacji punktu kontrolnego składania wrzeciona w mitozie13,14,15,16,17,18. Podczas mejozy hamowanie CENP-E przez specyficzny inhibitor GSK923295 prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego, niewspółosiowości chromosomów, dezorganizacji wrzeciona i niestabilności genomu w komórkach spermatogennych19. Wzorce lokalizacji i dynamika CENP-E w centromerach dzielących się spermatocytów wskazują, że CENP-E oddziałuje z białkami kinetochoru w celu sekwencyjnego składania centromerów podczas mejozy I20,21. W oocytach CENP-E jest wymagany do wyrównania chromosomów i zakończenia mejozy I13,22,23. Przeciwciała lub wstrzyknięcie morfoliny CENP-E powoduje niewspółosiowość chromosomów, nieprawidłową orientację kinetochoru i zatrzymanie mejozy zarówno u oocytów myszy, jak i Drosophila23. W porównaniu z zasadniczymi rolami CENP-E w mitozie, funkcje i mechanizmy CENP-E w mejozie pozostają w dużej mierze nieznane. Szczegółowe mechanizmy działania CENP-E w kongresacji chromosomów i stabilności genomu w męskich komórkach mejotycznych pozostają do wyjaśnienia.
Spermatogeneza to złożony i długotrwały proces fizjologiczny, obejmujący sekwencyjną proliferację spermatogonii, mejozę i spermiogenezę. W związku z tym cały proces jest niezwykle trudny do odtworzenia in vitro u ssaków i innych gatunków24,25. Niemożliwe jest wywołanie różnicowania spermatocytów po etapie pachytenu in vitro. Badania nad męskimi podziałami mejotycznym były na ogół ograniczone do eksperymentalnych analiz wczesnej profazy mejotycznej25,26. Pomimo wielu przedsięwzięć technologicznych, w tym krótkoterminowej hodowli spermatocytów27,28 i metod hodowli narządów25, istnieje niewiele skutecznych metod badania męskiego podziału mejotycznego. Co więcej, genetyczna delecja podstawowych genów zwykle powoduje zatrzymanie rozwoju i śmiertelność zarodka. Na przykład zarodki myszy pozbawione CENP-E nie zagnieżdżają się i nie mogą rozwinąć się po implantacji29, co jest przeszkodą w badaniach mechanistycznych CENP-E w meji. Podsumowując, ustanowienie praktycznego i wykonalnego systemu badania męskiego podziału mejotycznego może znacznie przyczynić się do rozwoju badań nad mejozą.
Inhibitor przenikający małe komórki jest potężnym narzędziem do badania silników kinezynowych w procesie podziału i rozwoju komórki. Inhibitor allosteryczny, GSK923295, specyficznie wiąże się z domeną motoryczną CENP-E, blokuje uwalnianie ADP (difosforanu adenozyny) i ostatecznie stabilizuje interakcje między CENP-E a mikrotubulami30. W tym badaniu przedstawiono mysi model hamowania in vivo poprzez chirurgię jamy brzusznej i wstrzyknięcie GSK923295 do jąder. Hamowanie CENP-E powoduje niewspółosiowość chromosomów w metafazie I pierwotnych spermatocytów. Ponadto hamowanie CENP-E prowadzi do mejotycznego zatrzymania spermatocytów i zaburzenia spermatogenezy. Opisano szereg protokołów do analiz spermatocytów, które można zastosować do obserwacji mikrotubul wrzeciona mejotycznego, chromosomów homologicznych i organelli subkomórkowych w spermatocytach. Nasza metoda inhibicji in vivo jest skuteczną metodą do badań podziału mejotycznego i spermatogenezy.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Strzykawka</td><td>Dostępnych</td><td></td> jest kilka marek komercyjnych <td>Sterylne.</td></tr><tr><td>1,5 ml Probówka wirówkowa</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>6 cm szalka Petriego</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>95% etanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10009164</td><td></td></tr><tr><td>tubulina królika przeciwciało poliklonalne</td><td>Beyotime</td><td>AF0001</td><td>Do testów immunofluorescencyjnych. Użyj w 1:100.</td></tr><tr><td>królicze przeciwciało monoklonalne anty-histon H3 (fosfo S10)</td><td>Abcam</td><td>ab267372</td><td>Do testów immunofluorescencyjnych. Użyj w 1:100.</td></tr><tr><td>królicze przeciwciało poliklonalne anty-TUBA4A</td><td>Sangon Biotech</td><td>D110022</td><td>Do testów immunofluorescencyjnych. Użyj w 1:100.</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało monoklonalne anty-SYCP3</td><td>Abcam</td><td>ab175191</td><td>Do testów immunofluorescencyjnych. Użyj w 1:100.</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe adhezyjne</td><td>CITOTEST</td><td>188105</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 kozie przeciwciało anty-królicze</td><td>Beyotime</td><td>A0423</td><td>Sencodary. Użyj o 1:500.</td></tr><tr><td>Siarczan glinowo-potasowy</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10001060</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny etanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>100092690</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe zapobiegające blaknięciu</td><td>Beyotime</td><td>P0131</td><td>Zapobiegaj fotowybielaniu sygnałów fluorescencyjnych.</td></tr><tr><td>BD FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>69003435</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5424BK745380</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat chloralu</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>80037516</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd</td><td>122670</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Sangon Biotech</td><td>A004194-0100</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>CITOTEST</td><td>10212020C</td><td>20 & razy; 20 mm. Grubość 0,13-0,16 mm.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime</td><td>C1006</td><td></td></tr><tr><td>do barwienia</td><td>Dostępnych jest kilka marek komercyjnych</td><td>91347802</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y, rozpuszczalny w alkoholu</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>71014460</td><td></td></tr><tr><td>Ether</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10009318</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd - roztwór wodny</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010018</td><td></td></tr><tr><td>GSK923295</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10299</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina, bezwodna</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>71020784</td><td></td></tr><tr><td>Mysz ICR</td><td>Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Image J</td><td>National Institutes of Health</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td> <td>Analiza obrazu fluorescencyjnego.</td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EM UC-7 ultramikrotom</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Modfit MFLT32</td><td>Verity Software House</td><td></td><td>Do analizy wyników cytometrii przepływowej.</td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td> Dostępnych <td></td><td></td><td>jest kilka marek komercyjnych</td></tr><tr><td>Guma neutralna</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10004160</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop Nikon Ti-S2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas pikrynowy</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>J60807</td><td></td></tr><tr><td>Rheodyne</td><td>Sangon Biotech</td><td>F519160-0001</td><td>10 &mu; l reodyna</td></tr><tr><td>Parafina w plastrach</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>69019461</td><td></td></tr><tr><td>Jodan sodu</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>80117214</td><td></td></tr><tr><td>Instrumenty chirurgiczne</td><td>Dostępnych</td><td></td> jest kilka marek komercyjnych <td>do chirurgii jamy brzusznej. Sterylizować w temperaturze 121 & C, 20 min.</td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrat cytrynianu trisodowego</td><td>Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd</td><td>173970</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>30188928</td><td>Rozcieńczyć w sterylnym PBS, aby uzyskać 0,25% roztwór roboczy.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>30189328</td><td>Rozcieńczyć w sterylnym PBS, aby uzyskać 0,1% roztwór roboczy.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>80096618</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10023418</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena funkcjonalna kinezyny-7 cenp-e w spermatocytach za pomocą inhibicji in vivo, immunofluorescencji i cytometrii przepływowej

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

U eukariontów mejoza jest niezbędna dla stabilności genomu i różnorodności genetycznej w rozmnażaniu płciowym. Eksperymentalne analizy spermatocytów w jądrach mają kluczowe znaczenie dla badań nad składaniem wrzeciona i segregacją chromosomów w męskim podziale mejotycznym. Spermatocyt myszy jest idealnym modelem do mechanistycznych badań mejozy, jednak brakuje skutecznych metod analizy spermatocytów. W artykule przedstawiono praktyczną i skuteczną metodę hamowania in vivo kinezyny-7 CENP-E w spermatocytach myszy. Przedstawiono szczegółową procedurę wstrzykiwania do jąder specyficznego GSK923295 inhibitora poprzez chirurgię jamy brzusznej u 3-tygodniowych myszy. Ponadto opisano tutaj szereg protokołów pobierania i utrwalania tkanek, barwienia hematoksyliny-eozyny, immunofluorescencji, cytometrii przepływowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Tutaj przedstawiamy model hamowania in vivo poprzez chirurgię jamy brzusznej i wstrzyknięcie jąder, który może być potężną techniką badania męskiej mejozy. Wykazaliśmy również, że hamowanie CENP-E powoduje niewspółosiowość chromosomów i zatrzymanie metafazy w pierwotnych spermatocytach podczas mejozy I. Nasza metoda hamowania in vivo ułatwi mechanistyczne badania mejozy, posłuży jako użyteczna metoda modyfikacji genetycznych męskich linii rozrodczych i rzuci światło na przyszłe zastosowania kliniczne.

Skutecznie opracowano model in vivo inhibicji CENP-E w jądrach myszy poprzez zabieg chirurgiczny jamy brzusznej i wstrzyknięcie GSK923295 do jąder19. Kluczowe kroki techniczne tej metody przedstawiono na Rysunku 1. Po 4 dniach od wstrzyknięcia GSK923295 do jąder, pobrano je do dalszych analiz. W grupie kontrolnej fala spermatogenezy w kanalikach nasiennych była regularna i uporządkowana (Rysunek 2A). Jednak w grupie GSK923295 fal...

Ten artykuł opisuje in-vivo hamowanie CENP-E poprzez operację jamy brzusznej i wstrzyknięcie do jąder GSK923295, cenny model męskiego podziału mejotycznego. Korzystając z testów immunofluorescencji, cytometrii przepływowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej, pokazujemy, że hamowanie CENP-E powoduje niewspółosiowość chromosomów i niestabilność genomu w spermatocytach myszy.

Ocena funkcjonalna kinezyny-7 CENP-E w spermatocytach za pomocą inhibicji in vivo, immunofluorescencji i cytometrii przepływowej

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...

Mejoza jest ewolucyjnie konserwatywnym wydarzeniem u eukariontów, które jest niezbędne do gametogenezy i rozmnażania płciowego. Nasz protokół zapewnia skuteczną metodę badań podziału mejotycznego i spermatogenezy. Opisaliśmy szereg protokołów do analizy spermatocytów.Technika ta może być stosowana do obserwacji wrzeciona mejotycznego, chromosomów homologicznych i organelli subkomórkowych w spermatocytach. Metoda ta może być stosowana do analizy podziału mejotycznego, generowania modeli zwierzęcych do edycji genów oraz transfekcji genów w tkankach lub narządach. Eksperymentatorzy powinni utrzymywać sterylne środowisko podczas operacji jamy brzusznej i zwracać uwagę na temperaturę, czas i kluczowe warunki eksperymentalne tego protokołu.Procedurę zademonstruje pani Meng-Fei Xu, doktorantka z mojego laboratorium. Rozpocznij budowę mysiego modelu hamowania białka centromerowego E lub CENP-E za pośrednictwem GSK923295, wiążąc znieczulone kończyny myszy i mocując je na tacce na woskowinę. Po zdezynfekowaniu obszaru operacyjnego za pomocą sterylnego skalpela należy wykonać pięciomilimetrowy otwór w jamie brzusznej myszy, a następnie umieścić sterylne zaciski chirurgiczne na skórze.Następnie pociągnij poduszeczkę tłuszczową najądrza sterylnymi kleszczami preparacyjnymi, aby zlokalizować jądra za pomocą sterylnej pęsety. Po utrwaleniu jąder sterylnymi kleszczami pod stereoskopem, powoli wstrzyknąć 10 mikrolitrów GSK923295 do kanalików nasiennych w końcowym stężeniu 10 mikromolowych przy użyciu 10 mikrolitrów jodu. Po zakończeniu wepchnij jądra z powrotem do jamy brzusznej i zszyj miejsce operacji zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym.W celu gradientowego odwodnienia pobranych jąder myszy, należy sekwencyjnie inkubować próbkę w różnych pożywkach, jak opisano w manuskrypcie. Po seryjnej inkubacji umieść tkankę na dnie pudełka do zatapiania i dodaj stopioną parafinę do pudełka. W celu całkowitego zestalenia parafiny należy schłodzić próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez sześć godzin.Później zamocuj próbkę na uchwycie ultramikrotomu, utrzymując kąt między próbką a powierzchnią noża na poziomie od 5 do 10 stopni. Dostosuj grubość plastra do pięciu mikrometrów, aby przygotować odcinki o grubości pięciu mikrometrów za pomocą ultramikrotomu. Po przygotowaniu szkiełko należy rozprowadzić w łaźni wodnej w temperaturze 40 stopni Celsjusza, a następnie wysuszyć skrawki w suszarce do szkiełek przez 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po 12 godzinach wykonaj sekwencyjną inkubację szkiełek, jak wyjaśniono wcześniej. Następnie płucz szkiełka w wodzie destylowanej przez pięć minut, a następnie barwij roztworem hematoksyliny Mayera przez sześć minut w temperaturze pokojowej. Następnie płucz zabarwione szkiełka pod bieżącą wodą przez pięć minut i inkubuj w wodzie destylowanej przez dwie minuty.Inkubować szkiełka w 1% chlorowodorku etanolu przez trzy sekundy, a następnie płukać pod bieżącą wodą przez dwie minuty. Wybarwić próbkę 1% eozyną przez 15 sekund, a następnie przeprowadzić seryjną inkubację. Po zakończeniu uszczelnij szkiełka za pomocą 15 mikrolitrów neutralnej gumy i szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 na 50 milimetrów.W celu immunofluorescencji umieść szkiełko w roztworze do pobierania antygenu, aby gotowało się pod wysokim ciśnieniem w szybkowarze przez cztery minuty w celu pobrania antygenu. Następnie schłodzić szkiełko w naturalny sposób do temperatury pokojowej, a następnie dwukrotnie spłukać wodą destylowaną przez pięć minut i PBS przez pięć minut. Aby przeniknąć komórki, inkubuj szkiełko w 500 mikrolitrach 0,25% Triton X-100 w PBS przez 10 minut, a następnie trzykrotnie przepłucz szkiełka PBS przez pięć minut.W celu zablokowania antygenu inkubować próbkę z 300 mikrolitrami 3% albuminy surowicy bydlęcej lub BSA przez jedną godzinę i z pierwszorzędowymi przeciwciałami w 3% BSA w PBST przez 16 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji umieść szkiełko w nawilżonym pudełku, aby zapobiec wysychaniu tkanek. Rozgrzej szkiełka w naturalny sposób do temperatury pokojowej przez 30 minut.Odrzucić przeciwciało pierwszorzędowe, a następnie trzykrotnie przepłukać szkiełko w PBST przez pięć minut. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe 3% BSA i PBST. Następnie inkubować próbkę z rozcieńczonymi przeciwciałami drugorzędowymi przez jedną do dwóch godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po przepłukaniu próbki w PBST przez pięć minut pięć razy, wybarwić jądra 50 mikrolitrami DAPI przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zamontuj szkiełko nakrywkowe za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu i uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci. W przypadku cytometrii przepływowej zbierz jądra myszy na sześciocentymetrowych szalkach Petriego i pokrój jądra na jednomilimetrowe kawałki za pomocą nożyczek chirurgicznych.Następnie trawić jądra w jednym mililitrze 1% kolagenazy w 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby wytrącić komórki spermatogenne, odwirować próbkę o sile 1 000 G przez pięć minut i wyrzucić supernatant przed dodaniem jednego mililitra 0,25% roztworu trypsyny EDTA do próbki przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie odwirować próbkę o sile 1 000 G przez pięć minut.Wyrzuć supernatant do inkubacji wytrąconych komórek z jednym mililitrem 70% zimnego etanolu przez ponad osiem godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu w temperaturze 1 000 G przez pięć minut, zebrać osady komórkowe i wybarwić komórki spermatogenne 500 mikrolitrami jodku propidyny lub roztworu barwiącego PI w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji przefiltruj próbkę za pomocą sita o oczkach 300 w celu wyeliminowania resztek komórek i zbierz komórki w rurze przepływowej, aby przechowywać komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Wykrywanie sygnałów fluorescencyjnych i rozpraszania światła na długości fali wzbudzenia przy 488 nanometrach za pomocą cytometru przepływowego. Przeanalizuj zawartość DNA w próbce i rozpraszanie światła za pomocą oprogramowania ModFit MF LT 32. Po wstrzyknięciu GSK923295 do jąder fala spermatogenna została zmieniona w kanalikach nasiennych z powodu hamowania CENP-E.Jednak fala spermatogenna w kanalikach nasiennych była regularna i zorganizowana w grupie kontrolnej. Zaobserwowano, że kilka chromosomów homologicznych nie było wyrównanych na płytce równikowej po zahamowaniu CENP-E. Ponadto hamowanie CENP-E doprowadziło do wzrostu liczby spermatocytów metafazy I w kanalikach nasiennych.Analiza immunofluorescencyjna wykazała zmniejszoną liczbę komórek dodatnich białka kompleksu antysynaptonemalnego three lub SYCP3 na kanalik nasienny po zahamowaniu CENP-E. Z drugiej strony, kropki SYP3 na komórkę metafazy i odcinki SYP3 na komórkę nie zostały naruszone w GSK92395 grupach. Odległości biegunów wrzeciona w spermatocytach metafazy I były zwiększone z powodu hamowania CENP-E.Reprezentatywna analiza wykazała, że hamowanie CENP-E skutkowało zmniejszeniem liczby komórek haploidalnych w grupie GSK 923295 w porównaniu z kontrolą. Proporcje komórek diploidalnych i komórek aneuploidalnych nie uległy istotnemu wpływowi po zahamowaniu CENP-E. I odwrotnie, proporcje komórek tetraploidalnych wzrosły w grupie GSK923295 niż w grupie kontrolnej.Analiza komórek spermatogennych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej wykazała zaburzoną organizację komórek spermatogennych w grupie GSK923295. Eksperymentator powinien zwrócić uwagę na pozycję iniekcji, dawkę leku, metodę iniekcji i metodę szwów podczas operacji jamy brzusznej i iniekcji do jąder. Technika ta, wraz z elektroporacją in vivo skoncentrowaną na docelowych białkach i narzędziach do edycji genów, może być stosowana w dziedzinie podziału miotycznego i spermatogenezy.

functional-assessment-kinesin-7-cenp-e-spermatocytes-using-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie białek centrosomalnych podczas spermatogenezy Drosophila jest skuteczną metodą identyfikacji nowych białek krytycznych dla biologii centrosomów, a także wyjaśnienia szczególnej funkcji znanych graczy w tym procesie.

Obrazowanie centrosomów w jądrach much

Tutaj opracowano nowatorski ilościowy test fluorescencyjny do pomiaru zmian poziomu białka szczególnie w centrosomach poprzez normalizację intensywności fluorescencji tego białka do odpowiedniego wzorca wewnętrznego.

Ilościowy test immunofluorescencyjny do pomiaru zmienności poziomów białek w centrosomach

Mięśnie szkieletowe są niezbędne do poruszania się i są głównym magazynem białka w organizmie. Pomiary zdrowia mięśni w obrębie C. Opisano elegans. Potencjalne zmiany w strukturze i funkcji mięśni ocenia się za pomocą zlokalizowanego GFP i barwników kationowych.

Metody oceny subkomórkowych kompartmentów mięśniowych u C. elegans

Tutaj prezentowany jest protokół identyfikacji ładunków Kinesin-1. Bezsilnikowy mutant ciężkiego łańcucha Kinesin-1 (KIF5B) agreguje się w cytoplazmie i indukuje agregację jej ładunków. Oba agregaty są wykrywane pod mikroskopią fluorescencyjną. Podobną strategię można zastosować do identyfikacji ładunków innych białek motorycznych.

Identyfikacja ładunków kinezyny-1 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj opisujemy protokoły wykrywania endogennych i egzogennych białek centromer-kinetochoru w komórkach ludzkich i ilościowego określania tych poziomów białek w centromerach-kinetochorach poprzez pośrednie barwienie immunofluorescencyjne za pomocą utrwalania (utrwalanie paraformaldehydu, acetonu lub metanolu).

Analiza immunofluorescencyjna endogennych i egzogennych białek centromerowo-kinetochorowych

Tutaj opisujemy lokalizację immunofluorescencji dynaminy, aby zilustrować protokoły wykrywania białek w zatopionych w parafinie odcinkach najądrza myszy oraz tych z nieśmiertelnej linii komórek najądrza (mECap18). Opisano również protokoły izolacji białek wydzielniczych zarówno z płynu najądrza, jak i kondycjonowanych pożywek komórkowych.

Analiza syntezy i wydzielania białek najądrza

Ubikwitylacja CENP-A jest ważnym wymogiem dla depozycji CENP-A w centromerze, dziedziczonym przez dimeryzację między podziałami komórkowymi i nieodzownym dla żywotności komórki. Tutaj opisujemy analizę spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji białka CENP-A (EYFP-CENP-A) znakowanego EYFP.

Analiza spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji CENP-A znakowanego EYFP (EYFP-CENP-A)

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Dwukierunkowa mitoza kinezyna-5 Cin8 gromadzi się w klastrach, które rozdzielają się i łączą podczas swojej ruchliwości. Akumulacja w gromadach zmienia również prędkość i kierunkowość Cin8. W tym miejscu opisano protokół oznaczania ruchliwości z oczyszczonym Cin8-GFP oraz analizy właściwości ruchliwych pojedynczych cząsteczek i klastrów Cin8.

Ruchliwość pojedynczych cząsteczek i klastrów dwukierunkowej kinezyny-5 Cin8 oczyszczonej z komórek S. cerevisiae

To badanie szczegółowo opisuje oczyszczanie KIF1A(1-393LZ), członka rodziny kinezyny-3, przy użyciu systemu ekspresji Sf9-bakulowirusa. Analiza in vitro pojedynczych cząsteczek i wielu silników ślizgowych tych oczyszczonych silników wykazała silne właściwości ruchliwości porównywalne z silnikami z lizatu komórkowego ssaków. W ten sposób system Sf9-bakulowirusa jest podatny na ekspresję i oczyszczanie białka motorycznego będącego przedmiotem zainteresowania.

Analiza pojedynczych cząsteczek oczyszczonych superprocesyjnych silników z rodziny Kinesin-3 Sf9

Poznaj metodę oceny funkcji kinezyny-7 CENP-E w spermatocytach myszy przy użyciu inhibicji in vivo, immunofluorescencji i cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia badanie podziału mejotycznego i stabilności genomu.

Ocena funkcjonalna kinezyny-7 CENP-E w spermatocytach za pomocą inhibicji in vivo, immunofluorescencji i cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal

Ocena funkcjonalna kinezyny-7 CENP-E w spermatocytach za pomocą inhibicji in vivo, immunofluorescencji i cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów