Name: Obrazowanie autofluorescencyjne w celu oceny metabolizmu komórkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Poznaj autofluorescencyjne obrazowanie NAD(P)H i FAD w celu oceny metabolizmu komórkowego. Ta bezinwazyjna metoda z rozdzielczością subkomórkową umożliwia badania żywych próbek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Źródła finansowania obejmują Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP200668) oraz Texas A&M University. Rysunek 1 został stworzony za pomocą BioRender.com.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Intensywność autofluorescencji i obrazowanie czasu życia są szeroko stosowane do oceny metabolizmu w komórkach21,55. FLIM ma wysoką rozdzielczość, a zatem rozpuszcza pojedyncze komórki, co jest ważne w badaniach nad rakiem, ponieważ heterogeniczność komórkowa przyczynia się do agresji guza i oporności na leki 7,39,41,44,45,46,58.</...

Metabolizm jest procesem komórkowym służącym do wytwarzania energii. Metabolizm komórkowy obejmuje wiele szlaków, w tym glikolizę, fosforylację oksydacyjną oraz glutaminolizę. Zdrowe komórki wykorzystują te szlaki metaboliczne do generowania energii niezbędnej do proliferacji i pełnienia funkcji, takich jak produkcja cytokin przez komórki odpornościowe. Wiele chorób, w tym zaburzenia metaboliczne, nowotwory i neurodegeneracja, charakteryzuje się zaburzonym metabolizmem komórkowym1. Na przykład niektóre typy komórek nowotworowych wykazują podwyższone tempo glikolizy, nawet w obecności tlenu, aby wytworzyć cząsteczki do syntezy kwasów nukleinowych, białek i lipidów2,3. Zjawisko to, znane jako efekt Warburga, jest cechą charakterystyczną wielu typów nowotworów, w tym raka piersi, raka płuc i glejaków4. Ze względu na zmiany w metabolizmie komórkowym związane z progresją nowotworu, metabolizm komórkowy może służyć jako zastępczy biomarker odpowiedzi na lek5,6. Ponadto zrozumienie skuteczności leku na poziomie komórkowym jest kluczowe, ponieważ heterogenność komórkowa może prowadzić do zróżnicowanych odpowiedzi na leki u poszczególnych osobników7,8.
Technologie identyfikujące i ilościowo określające zmiany w metabolizmie komórkowym są niezbędne w badaniach nad nowotworami i odpowiedzią na leki. Analizy chemiczne i białkowe są wykorzystywane do oceny metabolizmu komórek lub tkanek, lecz brakuje im rozdzielczości na poziomie pojedynczych komórek oraz informacji przestrzennych. Testy metaboliczne oparte na czytnikach płytek mogą mierzyć pH i zużycie tlenu w próbce w czasie oraz następujące po nim zaburzenia metaboliczne wywołane przez substancje chemiczne. Wartość pH może służyć do obliczenia szybkości zakwaszania zewnątrzkomórkowego (ECAR), co pozwala uzyskać wgląd w aktywność glikolityczną komórek9. Metody obrazowania całego ciała, w tym pozytonowa tomografia emisyjna z użyciem 2-[fluor-18] fluoro-D-glukozy (FDG PET) oraz spektroskopia rezonansu magnetycznego (MRS), to nieinwazyjne modalności obrazowania stosowane w klinice do identyfikacji nawrotów guza i oceny skuteczności leków za pomocą pomiarów metabolicznych10,11,12,13,14.
Obrazowanie FDG-PET pozwala na wizualizację wychwytu przez tkanki FDG, będącego radioznakowanym analogiem glukozy. Zwiększony wychwyt FDG-PET przez guzy w stosunku do tkanek otaczających wynika z efektu Warburga12,13. Metoda MRS obrazuje powszechne jądra atomowe cząsteczek wykorzystywanych w metabolizmie, takich jak 13C i 31P, i pozwala uzyskać dynamiczne informacje o tym, jak metabolizm zmienia się w odpowiedzi na bodźce, takie jak wysiłek fizyczny lub spożycie posiłku14. Chociaż FDG-PET i MRS mogą być stosowane w klinice, technologiom tym brakuje rozdzielczości przestrzennej niezbędnej do rozróżnienia heterogeniczności wewnątrzguzowej. Podobnie, pomiary zużycia tlenu są wykonywane na całej populacji komórek. Obrazowanie autofluorescencyjne pokonuje barierę rozdzielczości przestrzennej tych technologii i zapewnia nieinwazyjną metodę ilościowego oznaczania metabolizmu komórkowego.
<img alt="Schemat cyklu Krebsa w mitochondriach, pokazujący produkcję NADH, syntezę ATP i transport elektronów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63282/63282fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: NADH i FAD w powszechnych szlakach metabolicznych. NADH i FAD to koenzymy wykorzystywane w glikolizie, cyklu Krebsa oraz łańcuchu transportu elektronów. Obrazowanie autofluorescencji tych cząsteczek dostarcza informacji o metabolizmie komórkowym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63282/63282fig01largev2.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
Zredukowany nikotynamidoadeninowy (fosforanowy) dinukleotyd (NAD(P)H) oraz utleniony flawinoadeninowy dinukleotyd (FAD) to koenzymy reakcji metabolicznych, w tym glikolizy, fosforylacji oksydacyjnej i glutaminolizy (Rysunek 1). Zarówno NAD(P)H, jak i FAD wykazują autofluorescencję i zapewniają endogenny kontrast w obrazowaniu fluorescencyjnym1,15. NADPH posiada właściwości fluorescencyjne podobne do NADH. Z tego powodu NAD(P)H jest często stosowany do reprezentowania połączonego sygnału NADH i NADPH2,16.
Obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) pozwala na ilościowe oznaczenie czasu życia fluorescencji, czyli czasu, przez który fluorofor pozostaje w stanie wzbudzonym. Czas życia fluorescencji zależy od mikrośrodowiska fluoroforów i dostarcza informacji o metabolizmie komórkowym17. NAD(P)H oraz FAD mogą występować w komórkach w formie związanej z białkiem lub wolnej, a każda z tych konformacji charakteryzuje się innym czasem życia. Wolny NAD(P)H ma krótszy czas życia niż NAD(P)H związany z białkiem; przeciwnie, wolny FAD ma dłuższy czas życia niż FAD związany18,19. Czasy życia oraz wagi poszczególnych składowych czasu życia można wyznaczyć z danych o zaniku czasu życia fluorescencji za pomocą równania (1)20:
I(t) = α1e-t/τ1 + α2e-t/τ2 + C  (1)
Równanie (1) przedstawia znormalizowaną intensywność fluorescencji jako funkcję czasu. Symbole α1 i α2 w tym równaniu reprezentują proporcjonalne składniki krótkiego i długiego czasu życia (α1+ α2=1), natomiast τ1 i τ2 reprezentują odpowiednio krótki i długi czas życia; C odpowiada za światło tła7,20. Średni czas życia ważony amplitudą, reprezentowany tutaj jako τm, oblicza się za pomocą równania (2).
τm= α1τ1+ α2τ2  (2)
Średni czas życia można obliczyć, wyciągając średnią z „t” w funkcji spadku intensywności fluoroforu, co w przypadku rozkładu dwueksponencjalnego przedstawia równanie (3)17,21.
τ*m= (α1τ12+ α2τ22)/ (α1τ1+ α2τ2)  (3)
Obraz intensywności fluorescencji można obliczyć z obrazu czasu życia poprzez całkowanie zaniku czasu życia fluorescencji. Obrazowanie autofluorescencji jest niedestrukcyjną i bezznakową metodą, która może być stosowana do charakteryzacji metabolizmu żywych komórek z rozdzielczością podkomórkową. Optyczny stosunek redoks stanowi optyczny analog wskaźnika stanu redoks komórki i jest obliczany jako stosunek intensywności NAD(P)H do FAD. Choć wzór na obliczanie optycznego stosunku redoks nie jest ustandaryzowany22,23,24,25, zdefiniowano go tutaj jako stosunek intensywności FAD do sumy intensywności NAD(P)H i FAD. Taka definicja jest stosowana, ponieważ sumaryczna intensywność w mianowniku normalizuje wskaźnik w zakresie od 0 do 1, a oczekiwanym rezultatem inhibicji cyjankiem jest spadek stosunku redoks. Czas życia fluorescencji wolnego NAD(P)H i FAD pozwala na wgląd w zmiany w podłoże metabolicznym mikrośrodowisku, w tym pH, temperaturę, bliskość tlenu oraz osmolarity17.
Zmiany czasu życia fluorescencji frakcji związanych NAD(P)H i FAD mogą wskazywać na wykorzystanie szlaków metabolicznych oraz metabolizm specyficzny dla danego substratu26. Udziały poszczególnych składowych można interpretować jako zmiany w stosunku frakcji wolnej do związanej koenzymów18,19. Łącznie te ilościowe parametry czasu życia autofluorescencji umożliwiają analizę metabolizmu komórkowego, a obrazowanie autofluorescencyjne było wykorzystywane do identyfikacji nowotworów w tkankach prawidłowych27,28, charakteryzacji komórek macierzystych29,30, oceny funkcji komórek odpornościowych31,32,33,34,35, pomiaru aktywności neurologicznej36,37,38 oraz oceny skuteczności leków w typach nowotworów, takich jak rak piersi oraz nowotwory głowy i szyi21,39,40,41,42. Wysokorozdzielcze obrazowanie autofluorescencyjne można łączyć z segmentacją obrazu w celu analizy pojedynczych komórek i kwantyfikacji heterogeniczności wewnątrzpopulacyjnej43,44,45,46,47.
NAD(P)H oraz FAD można obrazować za pomocą jednofotonowych lub wielofotonowych mikroskopów fluorescencyjnych skonfigurowanych do obrazowania intensywności lub czasu życia. W przypadku mikroskopów jednofotonowych NAD(P)H i FAD są zazwyczaj wzbudzane odpowiednio przy długościach fal 375-405 nm oraz 488 nm, ze względu na powszechność źródeł laserowych o tych parametrach48. W dwufotonowym wzbudzeniu fluorescencyjnym NAD(P)H i FAD ulegają wzbudzeniu odpowiednio przy długościach fal od około 700 do 750 nm oraz od 700 do 900 nm15,49. Po wzbudzeniu fluoroforów NAD(P)H i FAD emitują fotony odpowiednio przy długościach fal od ~410 nm do ~490 nm oraz od ~510 nm do ~640 nm15. Maksymalne długości fal emisji dla NAD(P)H i FAD wynoszą odpowiednio około 450 nm i 535 nm48.
Ze względu na różne długości fal wzbudzenia i emisji, fluorescencję dwóch koenzymów metabolicznych można wyizolować widmowo. Zrozumienie charakterystyki widmowej NAD(P)H oraz FAD jest niezbędne do zaprojektowania i optymalizacji protokołów obrazowania autofluorescencji. Cyjanek jest inhibitorem kompleksu IV łańcucha transportu elektronów (ETC). Wpływ cyjanku na metabolizm komórkowy oraz natężenia i czasy życia autofluorescencji NAD(P)H i FAD wewnątrz komórek jest dobrze scharakteryzowany27,40. W związku z tym eksperyment z zaburzeniem wywołanym cyjankiem jest skutecznym sposobem walidacji protokołów obrazowania NAD(P)H i FAD. Pomyślny eksperyment z użyciem cyjanku daje pewność, że protokół obrazowania NAD(P)H i FAD może być wykorzystany do oceny metabolizmu nieznanych grup lub zaburzeń.

<table><tbody><tr><td>2-deoksy-d-glukoza (2-DG)</td><td>Sigma</td><td>AC111980000; AC111980010; AC111980050; </td><td></td>AC111980250</tr><tr><td>Antybiotyk Antybiotyk Przeciwbakteryjny (pen-strep)</td> <td>Próbki komórek Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>Nie</td> dotyczy <td>Linia nowotworowa MCF-7</td></tr><tr><td>CellProfiler</td><td>Broad Institute</td><td>Nie dotyczy</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Rurka stożkowa</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>Rurka stożkowa 15 ml</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>Pożywki</td></tr><tr><td>hodowlane Lustro dichroiczne FAD Filtr emisji</td> FAD <td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td>495 nm</td></tr><tr>Filtr<td>emisji FAD</td><td>Semrock</td><td>FF01-550/88-25</td><td>550/88 nm</td></tr><tr><td>Filtr wzbudzenia FAD</td><td>Semrock</td><td>FF01-458/64-25</td><td>458/64 nm</td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>16000036</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop czasu życia fluorescencji</td><td>3i</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Szklana podstawka</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Multiphoton Laser</td><td>Coherent</td><td>N/A</td><td>2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm</td></tr><tr><td>NAD(P)H lustro dichroiczne</td><td>Semrock</td><td>FF409-Di03-25x36</td><td>409 nm</td></tr><tr><td>Filtr emisji NAD(P)H</td><td>Semrock</td><td>FF02-447/60-25</td><td>447/60 nm</td></tr><tr><td>Filtr wzbudzenia NAD(P)H</td><td>Semrock</td><td>FF01-357/44-25</td><td>357/44 nm</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380970</td><td></td></tr><tr><td>SlideBooks 6</td><td>3i</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie do akwizycji obrazu</td></tr><tr><td>SPCImage</td><td>Becker & Hickl GmbH</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie do analizy czasu życia fluorescencji</td></tr><tr><td>Stage Top Inkubator</td><td>okoLab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Biosciences</td><td>786-262</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki YG</td><td>Polysciences</td><td>19096-2</td><td>Mikrosfery Yg (20,0 &mikro; m)</td></tr></tbody></table>

obrazowanie autofluorescencyjne w celu oceny metabolizmu komórkowego

Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism

Metabolizm komórkowy to proces, w którym komórki wytwarzają energię, a wiele chorób, w tym rak, charakteryzuje się nieprawidłowym metabolizmem. Zredukowany dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (fosforanowy) (NAD(P)H) i utleniony dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD) są koenzymami reakcji metabolicznych. NAD(P)H i FAD wykazują autofluorescencję i mogą być izolowane spektralnie za pomocą długości fal wzbudzenia i emisji. Oba koenzymy, NAD(P)H i FAD, mogą występować w konfiguracji wolnej lub związanej z białkiem, z których każdy ma odrębny czas życia fluorescencji - czas, przez który fluorofor pozostaje w stanie wzbudzonym. Obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) umożliwia ilościowe określenie intensywności fluorescencji i czasu życia NAD(P)H i FAD w celu bezznacznikowej analizy metabolizmu komórkowego. Mikroskopy o intensywności fluorescencji i żywotności można zoptymalizować pod kątem obrazowania NAD(P)H i FAD, dobierając odpowiednie długości fal wzbudzenia i emisji. Zaburzenia metaboliczne spowodowane cyjankiem weryfikują protokoły obrazowania autofluorescencyjnego w celu wykrycia zmian metabolicznych w komórkach. W artykule przedstawiona zostanie technika obrazowania autofluorescencyjnego NAD(P)H i FAD do pomiaru metabolizmu komórkowego.

Linia komórkowa raka piersi epithelialnego, MCF-7, była hodowana w medium DMEM uzupełnionym o 10% płotkowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Do obrazowania fluorescencyjnego komórki wysiano w gęstości 4 × 105 komórek na szklaną podstawkę do obrazowania o średnicy 35 mm na 48 h przed badaniem. Obrazowanie komórek przeprowadzono przed i po traktowaniu cyjankiem, stosując opisane powyżej protokoły. Celem eksperymentu z cyjankiem jest potwierdzenie izolacji spektralnej fluorescencji NAD(...

Ten protokół opisuje obrazowanie fluorescencyjne i analizę endogennych koenzymów metabolicznych, zredukowanego dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (fosforanu) (NAD(P)H) i utlenionego dinukleotydu flawinoadeninowego (FAD). Obrazowanie autofluorescencyjne NAD(P)H i FAD zapewnia bezznacznikową, nieniszczącą metodę oceny metabolizmu komórkowego.

Obrazowanie autofluorescencyjne w celu oceny metabolizmu komórkowego

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced ...

ADH i FAD to cząsteczki endogenne, które wykazują autofluorescencję przy różnych długościach fal wzbudzenia i emisji. Ze względu na ich zastosowanie jako koenzymów reakcji metabolicznych, mikroskopia autofluorescencyjna może ocenić metabolizm komórkowy. Obrazowanie autofluorescencyjne NADH i FAD nie wymaga znakowania egzogennego i jest metodą nieniszczącą o rozdzielczości subkomórkowej.Mikroskopia autofluorescencyjna może być stosowana na żywych próbkach i do badań w czasie. Obrazowanie autofluorescencyjne może być szeroko stosowane do dowolnych żywych komórek lub tkanek. Obrazowanie autofluorescencyjne było stosowane na neuronach, komórkach rakowych, nowotworach, in-vivo, komórkach macierzystych i komórkach odpornościowych.Procedurę zademonstruje Linghao Hu, doktorant z Quantitative Optical Imaging Laboratory na Texas A&M University. Rozpocznij eksperyment od włączenia wszystkich elementów wielofotonowego mikroskopu fluorescencyjnego, w tym źródła lasera i detektorów. Przed umieszczeniem próbki włącz lampę jasnego pola i upewnij się, że światło wpada do okularu.Następnie wybierz cel obrazowania komórki. Jeśli nie używasz obiektywu pneumatycznego, nałóż jedną kroplę odpowiedniego medium zanurzeniowego na wierzch obiektywu. Umieść naczynie ze szklanym dnem na uchwycie próbki na stoliku mikroskopu.Następnie wyśrodkuj próbkę z obiektywem za pomocą sterownika stolika X/Y Upewnij się, że próbka jest zabezpieczona i nie będzie się poruszać podczas obrazowania. Po zakończeniu spójrz w okular i przesuń obiektyw w górę, aby ustawić ostrość na komórkach. Jeśli mikroskop znajduje się w obudowie, zamknij drzwiczki kasetonu.Następnie otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazu i kliknij zakładkę Obrazowanie wielofotonowe, aby ustawić parametry obrazowania wielofotonowego zgodnie z opisem w manuskrypcie. Dostosuj wzmocnienie detektora do optymalnej wartości dla obrazowania czasu życia fluorescencji lub FILMU. Następnie zmień czas przebywania lasera na każdym pikselu próbki na żądaną wartość.W przypadku dinukleotydu fosforanu nikotynamidoadeninowego lub NADPH ustaw laser wielofotonowy na 750 nanometrów. Następnie upewnij się, że regulator mocy lasera jest ustawiony na zero, aby ogniwa nie zostały uszkodzone po otwarciu migawki lasera. Ustaw filtr emisyjny na 400 do 500 nanometrów.Po ustawieniu parametrów rozpocznij obrazowanie w trybie ustawiania ostrości lub podglądu na żywo, aby zoptymalizować ustawienia obrazu. Powoli zwiększaj moc lasera od trzech do ośmiu miliwatów, upewniając się, że ogniwa są ostre. Po wyregulowaniu zapisz maksymalną używaną moc.Użyj zarejestrowanego ustawienia maksymalnej mocy do obrazowania na innych segmentach szalki Petriego. Zbierz obraz NADPH-FILM o czasie integracji obrazu wynoszącym 60 sekund i sprawdź, czy obraz ma wystarczającą liczbę fotonów, taką jak pik 100 fotonów dla piksela cytoplazmy w obrębie krzywej rozpadu czasu życia fluorescencji. Jeśli liczba fotonów jest zbyt mała, zwiększ moc lasera lub czas akwizycji obrazu.W przypadku obrazowania dinukleotydu flawinoadeninowego lub FAD, ustaw laser wielofotonowy na 890 nanometrów i poczekaj, aż laser zablokuje się na nowej długości fali. Upewnij się, że regulator mocy lasera jest początkowo ustawiony na zero. Ustaw filtr emisyjny na 500 do 600 nanometrów.Aby zoptymalizować ustawienia obrazu, rozpocznij obrazowanie w trybie ustawiania ostrości lub podglądu na żywo, zwiększając moc lasera do 5 do 10 miliwatów i rejestrując maksymalną używaną moc. Użyć tego samego ustawienia mocy do obrazowania FAD kolejnych pól widzenia. Zbierz obraz FAD-FILM o czasie integracji obrazu wynoszącym 60 sekund i sprawdź, czy obraz ma wystarczającą ilość fotonów w krzywej rozpadu czasu życia fluorescencji.Jeśli liczba fotonów jest zbyt mała, zwiększ moc lasera lub czas akwizycji obrazu i powtórz obrazowanie dla dodatkowych czterech do pięciu pól widzenia (FOV), przy czym każdy obraz jest oddalony o dwa pola widzenia. Aby przygotować 80-milimolowy roztwór cyjanku sodu, rozpuść 130,24 miligrama cyjanku sodu w 25 mililitrach PBS. Z naczynia hodowlanego odessać 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej, aby zastąpić ją 100 mikrolitrami roztworu cyjanku sodu, aby uzyskać czteromilimolowe stężenie cyjanku w naczyniu.Umieść komórki w inkubatorze na pięć minut, aby komórki mogły zareagować z roztworem cyjanku. Po ekspozycji na cyjanek uzyskaj obrazy NADPH i FAD komórek, jak opisano wcześniej. W badaniu obliczono parametry żywotności fluorescencji przy użyciu zmierzonej funkcji odpowiedzi przyrządu (IRF) z mocznika.Parametry zostały uśrednione w pikselach cytoplazmy każdej komórki użytej do segmentacji. Poszczególne komórki zostały zidentyfikowane i zamaskowane w celu wyeliminowania szumu tła. Następnie jądro zostało zidentyfikowane i rzutowane na maskę komórkową.Ponadto komórki zostały przefiltrowane w celu usunięcia zamaskowanych obszarów, które nie pasują do rozmiaru typowych komórek. Obrazowanie czasu życia fluorescencji wielofotonowej NADPH i FAD pozwoliło na wizualizację morfologii i metabolizmu komórek przed i po leczeniu cyjankiem. Zaobserwowano, że czas życia NADPH zmniejsza się wraz z traktowaniem cyjankiem, podczas gdy czas życia FAD wydłuża się po leczeniu cyjankiem.Reprezentatywny wykres pudełkowy wykazał, że optyczny współczynnik redoks komórek MCF7 zmniejszył się po traktowaniu cyjankiem. Ekspozycja na cyjanek zmniejszyła czas życia NADPH zależny od amplitudy komórek MCF7. Krótkie i długie czasy życia zmniejszyły się w przypadku NADPH, ale wzrosły w przypadku NADPH alfa jeden.W przypadku FAS czas życia komórek MCF7 ważony amplitudą wydłużył się po ekspozycji na cyjanek. Zarówno krótki, jak i długi czas życia wydłużył się w przypadku FAD, ale zmniejszył się w przypadku FAD alpha one. Ważne jest, aby do próbek docierała wystarczająca moc lasera, ale pamiętaj, że zbyt duża moc może spowodować uszkodzenie ogniw.Ponieważ obrazowanie autofluorescencyjne nie jest szkodliwe dla komórek, kolejne testy biochemiczne można zastosować na tych samych próbkach.

autofluorescence-imaging-to-evaluate-cellular-metabolism

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano niezawodną metodę monitorowania transportu organelli do kwaśnego światła wakuoli drożdżowej w celu ich degradacji i recyklingu. Metoda ta opiera się na specyficznym znakowaniu docelowych organelli za pomocą genetycznie kodowanego dwuemisyjnego fluorescencyjnego biosensora pH oraz wizualizacji pojedynczych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii w drożdżach Saccharomyces cerevisiae

Fuzję mitochondriów mierzono poprzez śledzenie wyrównywania rozkładu fotokonwertowanego GFP skierowanego do macierzy w całej sieci mitochondrialnej w czasie. Do tej pory jednorazowo analizie kinetycznej trwającej godzinę mogła zostać poddana tylko jedna komórka. Przedstawiamy metodę, która umożliwia jednoczesny pomiar w wielu komórkach, co przyspiesza proces gromadzenia danych.

Szybszy test fuzji mitochondrialnej o wysokiej rozdzielczości, oparty na mtPA-GFP, umożliwiający równoległe pozyskiwanie danych kinetycznych z wielu komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Prezentujemy otwarty instrument do analizy wysokiej zawartości (HCA) wykorzystujący automatyczne obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) do oznaczania interakcji białek za pomocą odczytów opartych na transferze energii rezonansu Förstera (FRET). Akwizycja danych dla tego urządzenia openFLIM-HCA jest kontrolowana przez oprogramowanie napisane w μManager, a analiza danych odbywa się w FLIMfit.

Analiza Open Source o wysokiej zawartości z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Tutaj, wielospektralna cytometria przepływowa z funkcją analityczną, która porównuje jasne obrazy szczegółów 3 markerów autofagii i określa ilościowo ich kolokalizację, wraz z liczeniem plamek LC3, została użyta do pomiaru autofagii w obiektywny, ilościowy i statystycznie solidny sposób.

Ocena strumienia autofagicznego poprzez pomiar kolokalizacji LC3, p62 i LAMP1 za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Ta technika opisuje efektywny przepływ pracy do wizualizacji i ilościowego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych w komórkach HeLa za pomocą obrazowania na żywo opartego na fluorescencji.

Kwantyfikacja potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych na podstawie fluorescencji przy użyciu obrazowania na żywo w komórkach HeLa

Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.

Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych

Korzystając z platformy multimodalnej łączącej metody obrazowania optycznego bez znaczników, opracowaliśmy protokół do wizualizacji i ilościowego określania dynamiki komórkowej i metabolizmu. Dzięki obrazowaniu za pomocą fluorescencji wielofotonowej, generowania drugiej harmonicznej i wymuszonej mikroskopii rozpraszania Ramana możemy uzyskać całościowy przegląd środowiska komórkowego i molekularnego.

Multimodalna platforma obrazowania optycznego do badania metabolizmu komórkowego

Protokół ten przedstawia przewodnik krok po kroku dotyczący techniki mikroskopowej SLAM (Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic), w tym szczegółowe informacje na temat generowania laserowego źródła światła, przygotowania próbki tkanki, przeprowadzania obrazowania i analizowania danych. SLAM rozwija mikroskopię nieliniową, mierząc cztery komplementarne kontrasty bez znaczników w celu zbadania mikrośrodowiska tkankowego.

Jednoczesna autofluorescencyjna mikroskopia wieloharmoniczna bez znaczników

W wielu sytuacjach biologicznych i klinicznych korzystne jest badanie procesów komórkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku. W niniejszym materiale opisujemy montaż i zastosowanie niedrogiego mikroskopu światłowodowego, który umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym w hodowlach komórkowych, badaniach na zwierzętach oraz w badaniach klinicznych z udziałem pacjentów.

Wysokorozdzielcza mikroendoskopia światłowodowa do obrazowania komórkowego in situ

Poznaj autofluorescencyjne obrazowanie NAD(P)H i FAD w celu oceny metabolizmu komórkowego. Ta bezinwazyjna metoda z rozdzielczością subkomórkową umożliwia badania żywych próbek w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie autofluorescencyjne w celu oceny metabolizmu komórkowego

Przeglądaj więcej filmów