Obrazowanie autofluorescencyjne w celu oceny metabolizmu komórkowego

ADH i FAD to cząsteczki endogenne, które wykazują autofluorescencję przy różnych długościach fal wzbudzenia i emisji. Ze względu na ich zastosowanie jako koenzymów reakcji metabolicznych, mikroskopia autofluorescencyjna może ocenić metabolizm komórkowy. Obrazowanie autofluorescencyjne NADH i FAD nie wymaga znakowania egzogennego i jest metodą nieniszczącą o rozdzielczości subkomórkowej.

Mikroskopia autofluorescencyjna może być stosowana na żywych próbkach i do badań w czasie. Obrazowanie autofluorescencyjne może być szeroko stosowane do dowolnych żywych komórek lub tkanek. Obrazowanie autofluorescencyjne było stosowane na neuronach, komórkach rakowych, nowotworach, in-vivo, komórkach macierzystych i komórkach odpornościowych.

Procedurę zademonstruje Linghao Hu, doktorant z Quantitative Optical Imaging Laboratory na Texas A&M University. Rozpocznij eksperyment od włączenia wszystkich elementów wielofotonowego mikroskopu fluorescencyjnego, w tym źródła lasera i detektorów. Przed umieszczeniem próbki włącz lampę jasnego pola i upewnij się, że światło wpada do okularu.

Następnie wybierz cel obrazowania komórki. Jeśli nie używasz obiektywu pneumatycznego, nałóż jedną kroplę odpowiedniego medium zanurzeniowego na wierzch obiektywu. Umieść naczynie ze szklanym dnem na uchwycie próbki na stoliku mikroskopu.

Następnie wyśrodkuj próbkę z obiektywem za pomocą sterownika stolika X/Y Upewnij się, że próbka jest zabezpieczona i nie będzie się poruszać podczas obrazowania. Po zakończeniu spójrz w okular i przesuń obiektyw w górę, aby ustawić ostrość na komórkach. Jeśli mikroskop znajduje się w obudowie, zamknij drzwiczki kasetonu.

Następnie otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazu i kliknij zakładkę Obrazowanie wielofotonowe, aby ustawić parametry obrazowania wielofotonowego zgodnie z opisem w manuskrypcie. Dostosuj wzmocnienie detektora do optymalnej wartości dla obrazowania czasu życia fluorescencji lub FILMU. Następnie zmień czas przebywania lasera na każdym pikselu próbki na żądaną wartość.

W przypadku dinukleotydu fosforanu nikotynamidoadeninowego lub NADPH ustaw laser wielofotonowy na 750 nanometrów. Następnie upewnij się, że regulator mocy lasera jest ustawiony na zero, aby ogniwa nie zostały uszkodzone po otwarciu migawki lasera. Ustaw filtr emisyjny na 400 do 500 nanometrów.

Po ustawieniu parametrów rozpocznij obrazowanie w trybie ustawiania ostrości lub podglądu na żywo, aby zoptymalizować ustawienia obrazu. Powoli zwiększaj moc lasera od trzech do ośmiu miliwatów, upewniając się, że ogniwa są ostre. Po wyregulowaniu zapisz maksymalną używaną moc.

Użyj zarejestrowanego ustawienia maksymalnej mocy do obrazowania na innych segmentach szalki Petriego. Zbierz obraz NADPH-FILM o czasie integracji obrazu wynoszącym 60 sekund i sprawdź, czy obraz ma wystarczającą liczbę fotonów, taką jak pik 100 fotonów dla piksela cytoplazmy w obrębie krzywej rozpadu czasu życia fluorescencji. Jeśli liczba fotonów jest zbyt mała, zwiększ moc lasera lub czas akwizycji obrazu.

W przypadku obrazowania dinukleotydu flawinoadeninowego lub FAD, ustaw laser wielofotonowy na 890 nanometrów i poczekaj, aż laser zablokuje się na nowej długości fali. Upewnij się, że regulator mocy lasera jest początkowo ustawiony na zero. Ustaw filtr emisyjny na 500 do 600 nanometrów.

Aby zoptymalizować ustawienia obrazu, rozpocznij obrazowanie w trybie ustawiania ostrości lub podglądu na żywo, zwiększając moc lasera do 5 do 10 miliwatów i rejestrując maksymalną używaną moc. Użyć tego samego ustawienia mocy do obrazowania FAD kolejnych pól widzenia. Zbierz obraz FAD-FILM o czasie integracji obrazu wynoszącym 60 sekund i sprawdź, czy obraz ma wystarczającą ilość fotonów w krzywej rozpadu czasu życia fluorescencji.

Jeśli liczba fotonów jest zbyt mała, zwiększ moc lasera lub czas akwizycji obrazu i powtórz obrazowanie dla dodatkowych czterech do pięciu pól widzenia (FOV), przy czym każdy obraz jest oddalony o dwa pola widzenia. Aby przygotować 80-milimolowy roztwór cyjanku sodu, rozpuść 130,24 miligrama cyjanku sodu w 25 mililitrach PBS. Z naczynia hodowlanego odessać 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej, aby zastąpić ją 100 mikrolitrami roztworu cyjanku sodu, aby uzyskać czteromilimolowe stężenie cyjanku w naczyniu.

Umieść komórki w inkubatorze na pięć minut, aby komórki mogły zareagować z roztworem cyjanku. Po ekspozycji na cyjanek uzyskaj obrazy NADPH i FAD komórek, jak opisano wcześniej. W badaniu obliczono parametry żywotności fluorescencji przy użyciu zmierzonej funkcji odpowiedzi przyrządu (IRF) z mocznika.

Parametry zostały uśrednione w pikselach cytoplazmy każdej komórki użytej do segmentacji. Poszczególne komórki zostały zidentyfikowane i zamaskowane w celu wyeliminowania szumu tła. Następnie jądro zostało zidentyfikowane i rzutowane na maskę komórkową.

Ponadto komórki zostały przefiltrowane w celu usunięcia zamaskowanych obszarów, które nie pasują do rozmiaru typowych komórek. Obrazowanie czasu życia fluorescencji wielofotonowej NADPH i FAD pozwoliło na wizualizację morfologii i metabolizmu komórek przed i po leczeniu cyjankiem. Zaobserwowano, że czas życia NADPH zmniejsza się wraz z traktowaniem cyjankiem, podczas gdy czas życia FAD wydłuża się po leczeniu cyjankiem.

Reprezentatywny wykres pudełkowy wykazał, że optyczny współczynnik redoks komórek MCF7 zmniejszył się po traktowaniu cyjankiem. Ekspozycja na cyjanek zmniejszyła czas życia NADPH zależny od amplitudy komórek MCF7. Krótkie i długie czasy życia zmniejszyły się w przypadku NADPH, ale wzrosły w przypadku NADPH alfa jeden.

W przypadku FAS czas życia komórek MCF7 ważony amplitudą wydłużył się po ekspozycji na cyjanek. Zarówno krótki, jak i długi czas życia wydłużył się w przypadku FAD, ale zmniejszył się w przypadku FAD alpha one. Ważne jest, aby do próbek docierała wystarczająca moc lasera, ale pamiętaj, że zbyt duża moc może spowodować uszkodzenie ogniw.

Ponieważ obrazowanie autofluorescencyjne nie jest szkodliwe dla komórek, kolejne testy biochemiczne można zastosować na tych samych próbkach.