Trójwymiarowe obrazowanie unaczynienia opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości w mysim modelu zgorzeli kończyn tylnych
16 marca 2022
Obecny protokół opisuje unikalny, klinicznie istotny model choroby tętnic obwodowych, który łączy elektrokoagulację tętnicy udowej i żyły z podawaniem inhibitora syntazy tlenku azotu w celu wywołania zgorzeli kończyn tylnych u myszy FVB. Perfuzja DiI dosercowa jest następnie wykorzystywana do trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości.
W protokole przedstawiono sposób stworzenia modelu zgorzeli opuszki stopy myszy przy użyciu podawania inhibitora masy i koagulacji tętnicy udowej. Perfuzja DiI pozwala następnie na wizualizację unaczynienia opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości. Model ten ma znaczenie kliniczne i może być stosowany do przedklinicznych testów leków oraz do badania niedokrwienia kończyn.
Wizualizacja naczyń krwionośnych w wysokiej rozdzielczości oferuje technicznie łatwy sposób oceny neowaskularyzacji. Ten model zgorzeli opuszki stopy ma ważne zastosowania w badaniach przedklinicznych nad chorobą tętnic obwodowych i krytycznym niedokrwieniem kończyn. Perfuzja DiI jest użytecznym narzędziem do badania neowaskularyzacji w modelach zwierzęcych.
Procedurę zademonstrują Antoine Ribieras z rezydenta chirurgii i Yulexi Ortiz, pracownik naukowy z mojego laboratorium. Najpierw przygotuj roztwór roboczy DiI, dodając 200 mikrolitrów roztworu podstawowego DiI do 10 mililitrów roztworu rozcieńczalnika roboczego bezpośrednio przed użyciem. Wstrząśnij ręką, aby dobrze wymieszać.
Połącz szeregowo dwa lub trzy trójdrogowe krany i igłę motylkową o rozmiarze 25. Przygotuj 10-mililitrowe strzykawki z czterema mililitrami PBS, 10 mililitrami roztworu DiI i 10 mililitrami 10% neutralnej buforowanej formaliny. Podłączyć strzykawkę z formaliną do bliższego portu dopływu i wstrzyknąć roztwór, aby wypłukać powietrze z linii.
Następnie przekręć kurek, aby zamknąć port. Powtórzyć tę samą procedurę, łącząc strzykawki z DiI, a następnie PBS odpowiednio do środkowego i dystalnego portu dopływu. Po eutanazji ułożyć zwierzę w pozycji leżącej na podkładce chłonnej i zabezpieczyć pachy i kończyny dolne igłami.
Za pomocą nożyczek wykonaj poprzeczne nacięcie, aby otworzyć jamę brzuszną, a następnie odsłoń i podziel lewą i prawą przeponę, aby uzyskać dostęp do jamy klatki piersiowej. Przetnij ścianę klatki piersiowej po obu stronach mostka od dolnych żeber do pierwszego lub drugiego żebra. Użyj hemostatu, aby chwycić dolny koniec mostka i odbić go w kierunku głowy zwierzęcia, aby odsłonić klatkę piersiową.
Zidentyfikuj lewą komorę, która wydaje się jaśniejsza niż prawa. Delikatnie chwyć serce kleszczami i włóż igłę motylkową do lewej komory. Użyj nożyczek lub igły o rozmiarze 18, aby przebić prawy przedsionek, umożliwiając powrót krwi i roztworów perfuzyjnych do serca w celu odpływu.
Otwórz port strzykawki z PBS i ręcznie wstrzyknij od dwóch do czterech mililitrów z szybkością od jednego do dwóch mililitrów na minutę przez jedną do dwóch minut, aby wypłukać krew z układu naczyniowego. Upewnij się, że perfuzja zakończy się pomyślnie, obserwując krwawienie z prawego przedsionka. Po wstrzyknięciu należy zamknąć port strzykawki PBS.
Otwórz port strzykawki za pomocą DiI i wstrzyknij od pięciu do 10 mililitrów w tempie od jednego do dwóch mililitrów na minutę przez pięć minut. Po wstrzyknięciu należy zamknąć port strzykawki DiI i odczekać dwie minuty, aby umożliwić wprowadzenie barwnika przed wstrzyknięciem utrwalacza. Otwórz port strzykawki z formaliną i wstrzyknij od pięciu do 10 mililitrów w tempie od jednego do dwóch mililitrów na minutę przez pięć minut.
Po wstrzyknięciu należy wyjąć igłę z lewej komory. Za pomocą ciężkich nożyczek zwichnij kość piszczelową w kostce, całkowicie oddzielając lewą i prawą stopę od podudzi. Umieść zebrane stopy w 12-dołkowej płytce z jednym do dwóch mililitrów 10% roztworu formaliny.
Owiń talerz folią i przechowuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia zastąp roztwór utrwalający na 12-dołkowej płytce z jednym do dwóch mililitrów PBS na studzienkę. Wykonaj podłużne nacięcie skalpelem na podeszwowej i grzbietowej części stopy.
Następnie za pomocą ząbkowanych kleszczy i małego hemostatu ostrożnie usuń całą skórę ze stopy i palców, nie uszkadzając leżących pod nią tkanek miękkich. Aby zamontować tkanki, należy indywidualnie umieścić stopy między dwoma szklanymi szkiełkami mikroskopowymi z piankową podkładką biopsyjną złożoną na każdym końcu. Użyj dwóch małych spinaczy do segregatorów, aby ścisnąć szklane szkiełka ze sobą na każdym końcu.
Alternatywnie, umieść podkładkę pod stopy na 12-dołkowej płytce z jednym do dwóch mililitrów PBS. Po przykryciu folią przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby utrzymać fluorescencję do jednego miesiąca. Włącz system obrazowania, uruchom oprogramowanie do akwizycji i użyj obiektywu o małym powiększeniu lub małej przysłonie numerycznej, aby rejestrować obrazy.
Kliknij tak, aby przejść do okna dialogowego aktywacji etapu. Aktywuj laser 561 nanometrów w zakładce konfiguracji. Na ekranie głównym aktywuj widoczną ścieżkę wiązki, klikając widoczny przycisk.
Ustaw detektor w zakresie od 570 do 600 nanometrów, klikając odpowiednie aktywne pole wyboru. Wybierz ikonę skanowania kafelków na karcie akwizycji i ustaw żądaną rozdzielczość. Umieść suchą próbkę tkanki ściśniętą między szkiełkami na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość tkanki.
Przejdź do jednego z narożników przykładu. W menu skanowania kafelków kliknij przycisk oznaczania pozycji. Przejdź do przeciwległego rogu i ponownie kliknij przycisk oznaczania pozycji, ustawiając granice skanowania.
Aby ustawić głębokość stosu Z, kliknij przycisk na żywo. Przejdź do środka próbki i użyj pokrętła osi z, aby przewinąć do dołu próbki. W zakładce akwizycji w menu Z-stack kliknij przycisk rozpoczęcia.
Przewiń do górnej części próbki i kliknij przycisk zakończenia. Kliknij rozmiar kroku z i ustaw żądaną wartość. Następnie kliknij Start, aby rozpocząć pobieranie obrazu.
Rysunek przedstawia różnice w utracie tkanki, których można się spodziewać po tym modelu tydzień po operacji, z wynikami FABER zapisanymi w prawym dolnym rogu każdego obrazu. Obrazy z mikroskopii rekonstrukcyjnej ujawniają prawidłową anatomię naczyń krwionośnych w niepodwiązanej kontrolnej opuszki stopy w porównaniu ze znacznie zmniejszoną perfuzją do opuszki stopy podwiązanej kończyny tylnej pięć dni po operacji. 20 dni po zabiegu perfuzja do opuszki stopy znacznie się poprawiła, choć nie w takim stopniu, jak w przypadku kontroli bez podwiązania.
Na filmie widać, że renderowanie powierzchni zostało następnie utworzone przy użyciu funkcji animacji. Wypłucz wszystkie pęcherzyki powietrza z zestawu perfuzyjnego. Jeśli płuca rozszerzają się i zmieniają kolor na różowy podczas perfuzji, oznacza to, że igła przebiła prawą komorę i należy ją lekko schować.
Tkanki kończyn mogą być wykorzystywane do barwienia immunologicznego w celu oceny martwicy mięśni, regeneracji tkanek, gęstości naczyń i rekrutacji komórek progenitorowych oraz innych komórek naprawy tkanek. Technika perfuzji DiI w tym mysim modelu zgorzeli została wykorzystana w badaniach nad terapiami genowymi i komórkowymi. Badania mają na celu poprawę ukrwienia w kończynach pacjentów z krytycznym niedokrwieniem kończyn.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia klinicznie istotny model choroby tętnic obwodowych z wykorzystaniem kombinacji elektrokoagulacji tętnicy i żyły udowej wraz z inhibitorem syntazy tlenku azotu w celu wywołania zgorzeli kończyn dolnych u myszy FVB. Model ten umożliwia obrazowanie naczyń krwionośnych poduszki stopy w wysokiej rozdzielczości poprzez wewnątrzsercową perfuzję DiI.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia naczyń
- Badania przedkliniczne
Wstęp
- Miażdżyca tętnic obwodowych stanowi istotny problem zdrowotny.
- Zrozumienie niedokrwienia kończyn jest kluczowe dla opracowania skutecznych metod leczenia.
- Modele zwierzęce są niezbędne do przedklinicznych badań nad lekami.
- Techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości usprawniają badanie zmian naczyniowych.
Cel badania
- Stworzenie modelu mysiego do badania zgorzeli kończyn dolnych.
- Ocena wpływu hamowania syntazy tlenku azotu na stan naczyń krwionośnych.
- Umożliwienie prowadzenia badań nad neowaskularyzacją w chorobach tętnic obwodowych.
Zastosowane metody
- Elektrokoagulacja tętnicy i żyły udowej.
- Podanie inhibitora syntazy tlenku azotu.
- Wlewanie DiI do jam serca w celu obrazowania.
- Trójwymiarowe obrazowanie o wysokiej rozdzielczości naczyń krwionośnych poduszki stopy.
Główne wyniki
- Skuteczna indukcja zgorzeli kończyny tylnej u myszy FVB.
- Osiągnięto wysoką rozdzielczość wizualizacji naczyń krwionośnych poduszki stopy.
- Model wykazuje potencjał w badaniach nad niedokrwieniem kończyn.
- Przydatny do przedklinicznych testów interwencji terapeutycznych.
Wnioski
- Model ten dostarcza informacji na temat mechanizmów choroby tętnic obwodowych.
- Perfuzja DiI jest skuteczną metodą oceny zmian naczyniowych.
- Wyniki mogą pomóc w opracowaniu przyszłych strategii terapeutycznych dla niedokrwienia kończyn.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokorozdzielcze obrazowanie 3D naczyń krwionośnych w poduszce stopy myszy w modelu zgorzeli umożliwia precyzyjną ocenę neowaskularyzacji i perfuzji tkanek w badaniach nad choroby tętnic obwodowych (PAD). Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w przedklinicznych testach leków na krytyczne niedokrwienie kończyn, dostarczając ilościowych, rozdzielczych przestrzennie danych naczyniowych. Model ten zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, wspierając decyzje dotyczące portfela projektów w oparciu o analizę ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów przebudowy naczyniowej i neowaskularyzacji w modelach PAD.
- Wspiera biologiczną ocenę ryzyka poprzez ilościowe określanie zmian w perfuzji tkankowej i gęstości naczyń.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla terapii mających na celu poprawę perfuzji kończyn.
Przesiewanie i opracowanie analizy
- Zapewnia zwalidowany system przedkliniczny do oceny związków kandydackich ukierunkowanych na naprawę tkanek niedokrwiennych.
- Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania w celu standaryzacji testów i porównawczej analizy międzybadawczej.
- Umożliwia wysokoprzepustowe badania przesiewowe interwencji wpływających na regenerację naczyniową.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z punktami końcowymi istotnymi dla przebiegu krytycznego niedokrwienia kończyn oraz PAD.
- Wspiera rozwój biomarkerów poprzez korelację danych obrazowych z funkcjonalnymi efektami tkankowymi.
- Łączy wyniki badań podstawowych z przedklinicznymi badaniami skuteczności w terapii naczyniowej.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ten model zgorzeli z możliwością obrazowania wpisuje się w proces obejmujący etapy od wczesnego odkrywania, poprzez identyfikację wiodących związków, aż po walidację przedkliniczną terapii celowanych naczyniowo.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie neowaskularyzacji i perfuzji tkankowej w celu weryfikacji hipotez mechanistycznych w PAD.
- Przesiewy: Dostarczanie zestandaryzowanych obrazów o wysokiej rozdzielczości do oceny związków.
- Analityka: Generowanie ilościowych wskaźników naczyniowych do porównań statystycznych między grupami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Zapewnienie ciągłości między przedklinicznymi punktami końcowymi obrazowania a klinicznymi wynikami naczyniowymi.
- Zastosowania instytucjonalne: Oferowanie skalowalnej, wielokrotnego użytku platformy dla programów badań naczyniowych i rozwoju leków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów naczyniowych i mitygacji ryzyka mechanistycznego.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację przedklinicznych przepływów pracy w obrazowaniu naczyniowym.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje dotyczące kontynuacji lub przerwania badań (go/no-go) poprzez dostarczanie rzetelnych, ilościowych danych o skuteczności.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów na terapie naczyniowe w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w modelach chirurgicznych u myszy oraz w zaawansowanym obrazowaniu konfokalnym.
- Wymaga dostępu do aparatury perfuzyjnej i infrastruktury mikroskopowej o wysokiej rozdzielczości.
- Wymaga standaryzacji protokołów obrazowania i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do innych modeli niedokrwiennych lub chorób naczyniowych poprzez modyfikacje protokołu.
- Stabilność sygnału fluorescencji oraz sposób obchodzenia się z tkanką są kluczowe dla jakości danych.
