Name: Charakterystyka komórek śródbłonka rozrostu krwi (BOEC) z krwi obwodowej świń (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli komórek śródbłonka rozrostu krwi z krwi obwodowej świń. Technika ta umożliwia uzyskanie wysoko proliferacyjnych BOEC do zastosowań w inżynierii tkankowej i terapii komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za dofinansowanie z NIH/NHLBI R00 HL129068.

Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez odpowiednie Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) w Medical College of Wisconsin i Mayo Clinic.
UWAGA: W tym badaniu wykorzystano świnie domowe z krzyżówki Yorkshire/Landrace/Duroc (Sus domesticus), samce i samice, 40-80 kg, w wieku 3-6 miesięcy.
1. Pobieranie krwi obwodowej świń
<ol>
	<li>Przygotuj materiały.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć roztwór heparyny do 100 j./ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej.</li>
		<li>Dodaj 3-4 ml roztworu heparyny do każdej z dwóch stożkowych probówek o pojemności 50 ml i dwóch strzykawek o pojemności 60 ml.</li>
		<li>Pobrać nierozcieńczony roztwór heparyny (1 000 j./ml) do probówki przedłużającej.</li>
		<li>Podłączyć igłę 19 G do jednego końca rurki przedłużającej wypełnionej heparyną, a strzykawkę 60 ml zawierającą heparynę do drugiego końca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulić świnię zgodnie z polityką instytucjonalną
	<ol>
		<li>Podać domięśniowo wstrzyknięcie atropiny (0,05 mg/kg), tiletaminy/zolazepamu (2-5 mg/kg) i ksylazyny (2 mg/kg) w celu wywołania znieczulenia. 
		UWAGA: odpowiednie znieczulenie uzyskuje się, gdy zwierzę jest nieprzytomne, a mięśnie żuchwy nie są sztywne.</li>
		<li>Połóż zwierzę w pozycji leżącej na plecach i ułóż zwinięte ręczniki po obu stronach, aby zapewnić stabilność.</li>
		<li>Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
		<li>Zapewnij wsparcie termiczne podczas znieczulenia, w tym koce, poduszki grzewcze i/lub podgrzewany stół zabiegowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść obszar pachwiny udowej roztworem do peelingu betadyny.</li>
	<li>Nakłuć żyłę lub tętnicę udową igłą 19 G i powoli (~1-2 ml/s) pobrać 50 ml krwi do strzykawki. 
	UWAGA: Zbyt szybkie rysowanie może spowodować uszkodzenie komórek.</li>
	<li>Pozostawiając igłę na miejscu, natychmiast zagiąć rurkę przedłużającą i odłączyć strzykawkę o pojemności 60 ml</li>
	<li>Powoli przenieś krew do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej heparynę.</li>
	<li>Szczelnie zakręć stożkową probówkę o pojemności 50 ml, delikatnie odwróć kilka razy do wymieszania i umieść na lodzie.</li>
	<li>Podłącz pozostałą strzykawkę o pojemności 60 ml zawierającą heparynę do probówki przedłużającej, odkręć rurkę przedłużającą i powoli wciągnij do niej dodatkowe 50 ml krwi.</li>
	<li>Natychmiast wyjąć igłę z tętnicy lub żyły i powoli pobrać pozostałą krew z rurki przedłużającej do strzykawki.</li>
	<li>Odłączyć strzykawkę o pojemności 60 ml od rurki przedłużającej i powoli przenosić krew do pozostałej probówki stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej heparynę.</li>
	<li>Szczelnie zakręć stożkową probówkę o pojemności 50 ml, delikatnie odwróć kilka razy do wymieszania i umieść na lodzie.</li>
	<li>Zastosuj hemostazę uciskową w okolicy pachwiny udowej świni.</li>
	<li>Odzyskaj świnię zgodnie z polityką instytucjonalną. Stale monitoruj zwierzę, aż odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać pozycję leżącą mostka i powrócić do zwykłego pomieszczenia/hodowli.</li>
</ol>
2. Izolacja komórek jednojądrzastych
<ol>
	<li>Rozcieńczyć krew w stosunku 1:1 solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w czterech stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Ta praca musi być wykonywana w okapie do hodowli komórkowych przy użyciu techniki aseptycznej, aby uniknąć zanieczyszczenia kultury komórkowej.</li>
	<li>Dodaj 25 ml gotowego do użycia roztworu gradientu gęstości o temperaturze pokojowej do ośmiu stożkowych probówek o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Bardzo powoli odpipetować 25 ml roztworu krwi/soli fizjologicznej wzdłuż wnętrza każdego roztworu gradientu gęstości zawierającego 50 ml stożkowej probówki, trzymając probówkę pod ostrym kątem do końcówki pipety. 
	UWAGA: Roztwór krwi powinien delikatnie nakładać się na roztwór gradientu gęstości i utrzymywać dobrze zdefiniowany interfejs.</li>
	<li>Wirować probówki przez 30 minut przy 560 x g i temperaturze pokojowej (RT). 
	UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, wyłącz hamulec wirówki, jeśli to możliwe.</li>
	<li>Za pomocą cienkiej pipety ostrożnie zebrać kożuszek (mętną warstwę komórek jednojądrzastych powyżej roztworu gradientu gęstości i poniżej przezroczystego osocza) z każdej probówki i równomiernie rozprowadzić do dwóch nowych stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Roztwór gradientu gęstości zawierający probówki. 
	UWAGA: Zbierz jak najwięcej kożuchowego płaszcza, jednocześnie zbierając jak najmniej roztworu gradientu gęstości i plazmy, jak to możliwe.</li>
</ol>
3. Mycie i powlekanie komórek
<ol>
	<li>Pokryj 6-dołkową płytkę fibronektyną.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy fibronektyny z ludzkiego osocza, rozcieńczając go do 1 mg/ml w sterylnej wodzie. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotować 3,6 ml roztworu roboczego fibronektyny, rozcieńczając 600 μl roztworu podstawowego fibronektyny w 3 ml PBS.</li>
		<li>Przenieś 600 μl roztworu roboczego fibronektyny do każdego dołka 6-dołkowej płytki i delikatnie kołysz, aż do równomiernego pokrycia.</li>
		<li>Odczekaj 30 minut, aż fibronektyna pokryje studzienki i delikatnie odessaj roztwór z każdej studzienki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Czekając, aż fibronektyna pokryje się, umyj komórki jednojądrzaste
	<ol>
		<li>Uzupełnij probówki do 45 ml PBS</li>
		<li>Wirować przez 5 minut przy 560 x g i 4 °C z niskim hamowaniem. Odessać supernatant z obu probówek.</li>
		<li>Zawiesić każdą osadkę komórkową w 25 ml PBS.</li>
		<li>Powtórz tę czynność, aby umyć ją po raz drugi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawiesić każdą komórkę w 5 ml PBS i dodać 15 ml 0,8% roztworu chlorku amonu do każdej probówki. 
	UWAGA: Ten krok polega na lizie pozostałych czerwonych krwinek.</li>
	<li>Inkubować na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Umyć komórki jak poprzednio, uzupełniając probówki PBS i wirować przez 5 minut w temperaturze 560 x g i 4 °C z niskim hamulcem. Odessać supernatant z obu probówek.</li>
	<li>Ponownie zawiesić każdą komórkę w 25 ml PBS i powtórzyć płukanie po raz drugi.</li>
	<li>Zawiesić każdą komórkę w 6 ml pożywki hodowlanej EGM-2 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1x roztworem antybiotyku/antybiotyku zawierającym 10 000 U/ml penicyliny, 10 mg/ml streptomycyny i 25 μg/ml amfoterycyny. 
	UWAGA: Pożywka hodowlana EGM-2 składa się z pożywki EBM-2 uzupełnionej 200 μl hydrokortyzonu, 2 ml ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów (hFGF-B), 500 μl czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF), 500 μl rekombinowanego analogu insulinopodobnego czynnika wzrostu (R3 IGF-1), 500 μl kwasu askorbinowego, 500 μl ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (hEGF), 500 μl gentamycyny/amfoterycyny i 500 μl heparyny na 500 ml.</li>
	<li>Delikatnie przenieś 2 ml zawiesiny komórkowej do każdej studzienki 6-dołkowej płytki pokrytej fibronektyną i delikatnie kołysz, aż do równomiernego pokrycia. 
	UWAGA: Celem jest zasianie jak największej liczby komórek, aby zmaksymalizować liczbę kolonii śródbłonka, które się uformują.</li>
</ol>
4. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 100%.</li>
	<li>Następnego dnia delikatnie dodaj 1 ml świeżej pożywki hodowlanej do każdego dołka. 
	UWAGA: ważne jest, aby być delikatnym, aby nie przeszkadzać komórkom, które luźno przylegają do powłoki fibronektyny.</li>
	<li>Następnego dnia należy zmienić pożywkę o połowę, delikatnie zasysając 1,5 ml pożywki hodowlanej z każdej studzienki i zastępując ją 1,5 ml świeżej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>W każdym z następnych 5 dni delikatnie wykonuj pełną zmianę pożywki hodowlanej w każdym dołku (2 ml świeżej pożywki na studzienkę).</li>
	<li>Następnie delikatnie zmieniaj pożywkę hodowlaną trzy razy w tygodniu.</li>
	<li>Regularnie wizualizuj kultury komórkowe pod mikroskopią świetlną o małej mocy (obiektyw 4x). 
	UWAGA: Kolonie komórek śródbłonka z przylegającym przerostem krwi (BOEC) zaczną pojawiać się w studzienkach 7-10 dni po posiewaniu. Nieprzylegające typy komórek zostaną odrzucone ze zmianami pożywki, a inne przylegające typy komórek będą stopniowo rozpraszać się w miarę wzrostu kolonii BOEC.</li>
	<li>Przenieś BOEC do kolby T-75 pokrytej fibronektyną, gdy ~70%-80% zlewa się i kontynuuj zmianę pożywki hodowlanej trzy razy w tygodniu. 
	UWAGA: Gęstość wysiewu można kontrolować, przenosząc kolonie do kolby T25. Kolejne pasaże nie wymagają powlekania fibronektyną, a zmiany pożywki hodowlanej można ograniczyć do dwóch razy w tygodniu.</li>
	<li>Komórki z pasaży 1-3 mogą być wykorzystane do eksperymentów lub przeniesione do pożywki zamrażającej i przechowywane w ciekłym azocie do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>

<ol><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium%3A+II.+Representative+vascular+beds%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium%3A+I.+Structure%2C+function%2C+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms.</a> Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).</li>
<li>Pober, J. S., Tellides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+blood+vessel+cells+in+human+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses.</a> Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).</li>
<li>Navarro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+cell+protein+C+receptor%3A+its+role+in+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis.</a> Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).</li>
<li>Hasstedt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecule+1%3A+a+novel+risk+factor+for+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis.</a> Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).</li>
<li>Ormiston, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+culture+of+blood+outgrowth+endothelial+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384(2015).</li>
<li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).</li>
<li>Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+outgrowth+endothelial+cells+from+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood.</a> Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).</li>
<li>Gulati, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+origin+and+function+of+cells+with+endothelial+phenotype+obtained+from+adult+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood.</a> Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).</li>
<li>Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+endothelial+cells%3A+utility+from+ambiguity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Blood endothelial cells: utility from ambiguity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).</li>
<li>Medina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitors%3A+A+consensus+statement+on+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).</li>
<li>Medina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+endothelial+progenitor+cell+%28EPC%29+subtypes+reveals+two+distinct+cell+populations+with+different+identities%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genomics%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities.</a> BMC Medical Genomics. 3, 18(2010).</li>
<li>Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+question+based+on+cross-platform+microarray+data+normalization%3A+are+BOEC+more+like+large+vessel+or+microvascular+endothelial+cells+or+neither+of+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioinformatics+and+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them.</a> Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).</li>
<li>Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-supervised+learning+via+penalized+mixture+model+with+application+to+microarray+sample+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification.</a> Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).</li>
<li>Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+identity%2C+phenotype%2C+and+fate+of+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).</li>
<li>Fernandez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+outgrowth+endothelial+cells+from+hereditary+haemorrhagic+telangiectasia+patients+reveal+abnormalities+compatible+with+vascular+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions.</a> Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).</li>
<li>Critser, P. J., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+colony-forming+cell+role+in+neoangiogenesis+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Organ+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+aortic+endothelial+cells+from+miniature+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673(2019).</li>
<li>Chang Milbauer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+endothelial+systems+biology+of+sickle+stroke+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk.</a> Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).</li>
<li>Wei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+endothelial+cell+gene+expression+by+African+Americans+versusCaucasian+Americans%3A+a+possible+contribution+to+health+disparity+in+vascular+disease+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer.</a> BMC Medicine. 9 (1), 2(2011).</li>
<li>Hasstedt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecule+1%3A+a+novel+risk+factor+for+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%2C+The+Journal+of+the+American+Society+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).</li>
<li>Milbauer, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+outgrowth+endothelial+cell+migration+and+trapping+in+vivo%3A+a+window+into+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy.</a> Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).</li>
<li>Matsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+gene+therapy+for+hemophilia+A+that+enhances+safe+delivery+and+sustained+in+vivo+factor+VIII+expression+from+lentivirally+engineered+endothelial+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors.</a> Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).</li>
<li>De Meyer, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+correction+of+von+Willebrand+disease+type+3+blood-derived+endothelial+cells+with+lentiviral+vectors+expressing+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor.</a> Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).</li>
<li>Bodempudi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+outgrowth+endothelial+cell-based+systemic+delivery+of+antiangiogenic+gene+therapy+for+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors.</a> Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).</li>
<li>Dudek, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+inhibition+of+tumour+angiogenesis+by+endothelial+cell-based+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy.</a> British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).</li>
<li>Moubarik, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+late+outgrowth+endothelial+progenitor+cells+as+cell+therapy+product+for+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).</li>
<li>Pislaru Sorin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+forces+enable+rapid+endothelialization+of+synthetic+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts.</a> Circulation. 114 (1), 314(2006).</li>
<li>Satyananda, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+of+immune+modulation+in+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">New concepts of immune modulation in xenotransplantation.</a> Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).</li>
<li>Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+pigs+as+organ+donors+for+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).</li>
<li>Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipiński, D., Słomski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas+technology+in+pig-to-human+xenotransplantation+research%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196(2021).</li>
<li>Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered pigs.</a> Lancet. 342 (8872), 682-683 (1993).</li>
<li>Cozzi, E., White, D. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+transgenic+pigs+as+potential+organ+donors+for+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans.</a> Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).</li>
<li>Phelps, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+alpha+1%2C3-galactosyltransferase-deficient+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs.</a> Science. 299 (5605), New York, N.Y. 411-414 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

BOEC są potężnym narzędziem, które może być wykorzystywane w różnych podejściach naukowych i terapeutycznych 7,8,16. BOEC zostały wykorzystane do analizy ekspresji genów EC w celu wyjaśnienia kluczowych czynników odpowiedzialnych za rozwój chorób naczyniowych i nowotworów 5,19,20,21. BOEC są również wy...

Śródbłonek jest bardzo złożoną, dynamiczną strukturą i istotnym elementem ściany naczynia. Wyściela wewnętrzną powierzchnię naczyń krwionośnych, aby zapewnić fizyczny interfejs między krążącą krwią a otaczającymi tkankami. Wiadomo, że ta niejednorodna struktura pełni różne funkcje, takie jak angiogeneza, zapalenie, regulacja naczyń krwionośnych i hemostaza1,2,3,4. Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej są szeroko badanym typem komórek do oceny funkcjonalności komórek śródbłonka. Jednak specyficzna dla pacjenta zmienność partii, niespójny fenotyp i minimalna wydajność podziału sugerują potrzebę określenia źródła komórek, które mogłoby poprawić wszystkie te cechy5.
Uzyskanie jednorodnej populacji pierwotnych komórek śródbłonka może być technicznie trudne, a pierwotne komórki śródbłonka nie mają wysokiej zdolności proliferacyjnej6. Stąd, aby zbadać regenerację naczyń krwionośnych i ocenić procesy patofizjologiczne, różne grupy próbowały uzyskać i ocenić różne typy komórek śródbłonka pochodzących z krwi obwodowej, np. komórki progenitorowe śródbłonka (EPC) lub komórki śródbłonka wyrastające z krwi (BOEC)6,7,8,9. Wrzecionowate wczesne EPC pochodzą z hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) i mają ograniczoną siłę wzrostu oraz ograniczoną zdolność angiogenną do wytwarzania dojrzałych komórek śródbłonka. Ponadto bardzo przypominają monocyty zapalne. Ponadto ich zdolność do dalszego różnicowania się w funkcjonalne, proliferujące, dojrzałe komórki śródbłonka jest nadal dyskusyjna6,7,9,10. Ciągła hodowla komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) może dać początek wtórnej populacji komórek znanych jako EPC późnego wzrostu, BOEC lub komórki tworzące kolonie śródbłonka (ECFC)6,7,9,10. Medina i in. w 2018 r. uznali ograniczenia EPC, niejednoznaczność ich nomenklatury, a także ogólny brak zgodności z wieloma odrębnymi typami komórek stale grupowanymi w EPCs11. W przeciwieństwie do tego, BOEC stały się znane ze swojej roli w naprawie naczyń krwionośnych, zdrowiu i chorobie oraz terapii komórkowej. Dalsze badania i zastosowanie terapeutyczne tych komórek będą opierać się na protokołach konsekwentnego wyprowadzania tych typów komórek z krążących komórek progenitorowych.
Pierwotne komórki, takie jak BOEC, mogą być używane jako substytuty do uzyskania wysoce proliferacyjnych dojrzałych komórek śródbłonka6. BOEC są fenotypowo odmienne od wczesnych EPC i wykazują typowe cechy śródbłonka, takie jak morfologia kostki brukowej i ekspresja połączeń adherens i kaweoli12. Profilowanie genów przeprowadzone przez Hebbel et al.13,14,15 wykazało, że BOEC lub ECFC są prawdziwymi komórkami śródbłonka, ponieważ sprzyjają tworzeniu mikronaczyń krwionośnych i dużych naczyń. W ten sposób BOEC mogą być używane jako narzędzie do oceny procesów patofizjologicznych i zmienności genetycznej16. Są one również uważane za doskonałe źródło komórek w terapii komórkowej w celu regeneracji naczyń krwionośnych17. Dlatego niezbędny jest ustandaryzowany protokół konsekwentnego wyprowadzania tych wysoce proliferacyjnych komórek.
Podczas gdy BOEC dostarczają potężnego narzędzia do badania ludzkiej zmienności patofizjologicznej i genetycznej, bardziej jednorodne źródło BOEC może zapewnić bardziej solidne i wiarygodne wyniki eksperymentalne i terapeutyczne. Najwyższą jednorodność można osiągnąć przy użyciu ksenogenicznych źródeł komórkowych pochodzących od genetycznie podobnych zwierząt hodowanych w podobnych warunkach18. Podczas gdy ksenogeniczne źródła komórek są podatne na wywoływanie odpowiedzi immunologicznej gospodarza, opracowywane są strategie immunomodulacji, których celem jest generowanie immunokompatybilnych zwierząt i produktów zwierzęcych, w tym komórek. W szczególności świnie są obfitym źródłem krwi obwodowej i są powszechnie wykorzystywane do badania wyrobów medycznych i innych terapii ze względu na anatomiczne i fizjologiczne podobieństwa do ludzi. W związku z tym badanie to udoskonala protokół izolacji i ekspansji wysoce proliferacyjnych BOEC z krwi obwodowej świń. Opisany poniżej protokół jest prostą i niezawodną metodą uzyskiwania dużej liczby BOEC ze stosunkowo niewielkiej objętości krwi. Hodowle mogą być rozszerzane przez kilka pasaży, aby wygenerować miliony komórek z jednej próbki krwi.

<table><tbody><tr><td>19 G igła</td><td>Covidien</td><td>1188818112</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki stożkowe</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>strzykawki 60 ml</td><td>Covidien</td><td>8881560125</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorku amonu (0,8%)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07850</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk/roztwór przeciwgrzybiczy (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-253-839</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana EGM-2</td><td>Lonza Walkersville</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Rurka przedłużająca</td><td>Hanna Pharmaceutical Supply Co.</td><td>03382C6227</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Atlas Biologicals</td><td>F-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque 1077</td><td>Cytiva</td><td>17144003</td><td>Roztwór gradientu gęstości</td></tr><tr><td>Heparyna sodowa do wstrzykiwań (1,000 jednostek/ml)</td><td>Pfizer</td><td>00069-0058-01</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna z ludzkiego osocza</td><td>Gibco</td><td>33016-015</td><td></td></tr><tr><td>Lód</td><td>Nie dotyczy</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw pipet</td><td>Eppendorf</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda</td><td>Gibco</td><td>15230-162</td><td></td></tr><tr><td>Cienka pipeta</td><td>Celltreat Scientific</td><td>229280</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka komórek śródbłonka rozrostu krwi (boec) z krwi obwodowej świń

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

Śródbłonek jest dynamiczną, zintegrowaną strukturą, która odgrywa ważną rolę w wielu funkcjach fizjologicznych, takich jak angiogeneza, hemostaza, stan zapalny i homeostaza. Śródbłonek odgrywa również ważną rolę w patofizjologiach, takich jak miażdżyca, nadciśnienie i cukrzyca. Komórki śródbłonka tworzą wewnętrzną wyściółkę naczyń krwionośnych i limfatycznych oraz wykazują niejednorodność pod względem struktury i funkcji. Różne grupy oceniały funkcjonalność komórek śródbłonka pochodzących z ludzkiej krwi obwodowej, ze szczególnym uwzględnieniem komórek progenitorowych śródbłonka pochodzących z hematopoetycznych komórek macierzystych lub komórek śródbłonka wyrastających z dojrzałej krwi (lub komórek tworzących kolonie śródbłonka). Komórki te stanowią autologiczny zasób do terapii i modelowania chorób. Komórki ksenogeniczne mogą stanowić alternatywne źródło terapii ze względu na ich dostępność i jednorodność osiągniętą dzięki wykorzystaniu genetycznie podobnych zwierząt hodowanych w podobnych warunkach. W związku z tym przedstawiono solidny protokół izolacji i ekspansji wysoce proliferacyjnych komórek śródbłonka wyrostka krwi z krwi obwodowej świń. Komórki te mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, takich jak inżynieria tkankowa układu krążenia, terapia komórkowa, modelowanie chorób, badania przesiewowe leków, badanie biologii komórek śródbłonka oraz kohodowle in vitro w celu zbadania reakcji zapalnych i krzepnięcia w ksenotransplantacji.

Morfologię hodowanych komórek obserwowano od początku hodowli aż do momentu pojawienia się kolonii BOEC (Rycina 1). Mniejsza populacja komórek adherentnych zaczęła przylegać do naczyń hodowlanych i rosnąć, podczas gdy komórki nieadherentne były usuwane podczas wymian pożywki (Rycina 1B). Kolonie pojawiły się po raz pierwszy w 6. dniu jako skupiska komórek o fenotypie endotelialnym, proliferujących promieniście od punktu centralnego (Rycina 1...

Charakterystyka komórek śródbłonka rozrostu krwi (BOEC) z krwi obwodowej świń

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

Protokół zapewnia wysoce proliferacyjne komórki śródbłonka wyrastające z krwi, które można wykorzystać do różnych badań inżynierii tkankowej, terapii komórkowej i modelowania chorób. Ta technika konsekwentnie daje wiele komórek z jednego pobrania krwi. Aby ta technika była skuteczna, ważne jest, aby jak najszybciej umieścić komórki w pożywce hodowlanej i środowisku inkubatora.Najpierw rozcieńczyć roztwór heparyny do 100 jednostek na mililitr w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. Dodaj trzy do czterech mililitrów roztworu heparyny do każdej z dwóch 50-mililitrowych stożkowych probówek i dwóch 60-mililitrowych strzykawek. Następnie pobrać nierozcieńczony roztwór heparyny o objętości 1 000 jednostek na mililitr do probówki przedłużającej.Podłącz igłę o rozmiarze 19 do jednego końca rurki przedłużającej wypełnionej heparyną, a 60-mililitrową strzykawkę zawierającą heparynę do drugiego końca rurki przedłużającej. Następnie oczyść obszar pachwiny udowej znieczulonej świni roztworem do peelingu Betadine. Nakłuć żyłę lub tętnicę udową igłą o rozmiarze 19 i z prędkością od jednego do dwóch mililitrów na sekundę powoli wciągnąć 50 mililitrów krwi do strzykawki.Pozostawiając igłę na miej

characterization-blood-outgrowth-endothelial-cells-boec-from-porcine

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Endotelialne komórki progenitorowe tworzące kolonie (ECFCs) stanowią obiecujące narzędzie do badania homeostazy i regeneracji naczyń krwionośnych.1,2 Niniejsza praca przedstawia nową metodę izolacji i ekspansji ECFC z heparynowanej krwi obwodowej dorosłego człowieka bez użycia surowicy zwierzęcej, z wykorzystaniem puli lizatu płytek krwi człowieka (pHPL), co zmniejsza ryzyko immunizacji przeciwko białkom bydlęcym.

Izolacja i wielkoskalowa ekspansja dorosłych ludzkich endotelialnych komórek progenitorowych zdolnych do tworzenia kolonii

Przedstawiamy metodę izolacji i hodowli czystych populacji komórek śródbłonka zastawek serca (VEC). Komórki VEC można izolować z obu stron cuspisu lub płatka zastawki, a bezpośrednio po tym procesie możliwe jest łatwe wyizolowanie znajdujących się pod nimi komórek śródmiąższowych (VIC).

Izolacja komórek śródbłonka zastawek

Opisano metodę zasiewania autologicznymi komórkami biomateriałów tytanowych mających kontakt z krwią oraz testowania ich biokompatybilności. Metoda ta wykorzystuje komórki progenitorowe śródbłonka oraz rurki tytanowe, zasiewane na kilka minut przed chirurgiczną implantacją do żył głównych świni. Technika ta może zostać dostosowana do wielu innych implantowalnych urządzeń biomedycznych.

Technologia zasiewiania autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka oraz badanie biokompatybilności urządzeń sercowo-naczyniowych w modelu dużych zwierząt

Opisujemy metodę poddawania przylegających komórek naprężeniom ścinającym w przepływie laminarnym w sterylnym obwodzie przepływu ciągłego. Poprzez przezroczystą komorę można badać adhezję i morfologię komórek, a z obwodu można pobierać próbki do analizy metabolitów oraz zbierać komórki po ekspozycji na siły ścinające do dalszych eksperymentów lub hodowli.

Komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego w przepływie laminarnym

Komórki endotelialne tworzące kolonie (ECFCs) to krążące komórki endotelialne o silnym potencjale proliferacyjnym klonalnym, które wykazują wrodzone in vivo zdolność do tworzenia naczyń. Fenotypowa i funkcjonalna charakterystyka komórek śródbłonka wyhodowanych z krwi pępowinowej jest istotna dla ich identyfikacji i izolacji bona fide ECFCy do potencjalnych zastosowań klinicznych w naprawie uszkodzonych tkanek.

Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna komórek endotelialnych tworzących kolonie pochodzących z krwi pępowinowej człowieka

W tym filmie pokazujemy izolację komórek śródbłonka z aorty brzusznej modelu świni za pomocą jednoetapowego trawienia kolagenazy. Komórki śródbłonka mogą być hodowane do dalszych zastosowań.

Izolacja komórek śródbłonka aorty świń (pAEC): oparta na enzymach metoda izolowania komórek śródbłonka z pobranej aorty brzusznej świni

Ten protokół pozwala na wiarygodne generowanie i charakteryzowanie komórek śródbłonka (BOEC) z małej objętości dorosłej krwi obwodowej. BOEC mogą być stosowane jako substytut komórek śródbłonka od pacjentów z zaburzeniami naczyniowymi oraz jako substrat do wytwarzania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie i hodowla komórek śródbłonka przerostu krwi z ludzkiej krwi obwodowej

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Celem tego protokołu jest odizolowanie komórek progenitorowych śródbłonka od krwi pępowinowej. Niektóre z zastosowań obejmują wykorzystanie tych komórek jako biomarkera do identyfikacji pacjentów z ryzykiem sercowo-naczyniowym, leczenia chorób niedokrwiennych oraz tworzenia konstruktów naczyń krwionośnych i zastawek serca za pomocą inżynierii tkankowej.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej

Prezentujemy model in vitro, który pozwala na badanie i analizę krzepnięcia w pełnej, nieantykoagulowanej krwi. Antykoagulacja w ustroju zależy od naturalnego działania przeciwzakrzepowego zdrowych komórek śródbłonka, a aktywacja komórek śródbłonka spowoduje krzepnięcie.

Ocena właściwości przeciwzakrzepowych i przeciwzapalnych komórek śródbłonka z wykorzystaniem hodowli komórkowej 3D i nieantykoagulowanej krwi pełnej

Ten protokół opisuje tworzenie samoorganizujących się naczyń krwionośnych z ludzkich pluripotencjalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Te sieci naczyń krwionośnych wykazują rozległą i połączoną sieć śródbłonka otoczoną perycytami, aktyną mięśni gładkich i ciągłą błoną podstawną.

Wytwarzanie organoidów ludzkich naczyń krwionośnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę izolacji i hodowli komórek śródbłonka rozrostu krwi z krwi obwodowej świń. Technika ta umożliwia uzyskanie wysoko proliferacyjnych BOEC do zastosowań w inżynierii tkankowej i terapii komórkowej.

Charakterystyka komórek śródbłonka rozrostu krwi (BOEC) z krwi obwodowej świń

Przeglądaj więcej filmów