Charakterystyka komórek śródbłonka rozrostu krwi (BOEC) z krwi obwodowej świń

Protokół zapewnia wysoce proliferacyjne komórki śródbłonka wyrastające z krwi, które można wykorzystać do różnych badań inżynierii tkankowej, terapii komórkowej i modelowania chorób. Ta technika konsekwentnie daje wiele komórek z jednego pobrania krwi. Aby ta technika była skuteczna, ważne jest, aby jak najszybciej umieścić komórki w pożywce hodowlanej i środowisku inkubatora.

Najpierw rozcieńczyć roztwór heparyny do 100 jednostek na mililitr w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. Dodaj trzy do czterech mililitrów roztworu heparyny do każdej z dwóch 50-mililitrowych stożkowych probówek i dwóch 60-mililitrowych strzykawek. Następnie pobrać nierozcieńczony roztwór heparyny o objętości 1 000 jednostek na mililitr do probówki przedłużającej.

Podłącz igłę o rozmiarze 19 do jednego końca rurki przedłużającej wypełnionej heparyną, a 60-mililitrową strzykawkę zawierającą heparynę do drugiego końca rurki przedłużającej. Następnie oczyść obszar pachwiny udowej znieczulonej świni roztworem do peelingu Betadine. Nakłuć żyłę lub tętnicę udową igłą o rozmiarze 19 i z prędkością od jednego do dwóch mililitrów na sekundę powoli wciągnąć 50 mililitrów krwi do strzykawki.

Pozostawiając igłę na miejscu, natychmiast zagiąć rurkę przedłużającą i odłączyć 60-mililitrową strzykawkę. Powoli przenieś krew do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej heparynę. Szczelnie zakręć stożkową rurkę, delikatnie odwróć rurkę kilka razy, aby wymieszać i umieść ją na lodzie.

Podłączyć pozostałą 60-mililitrową strzykawkę zawierającą heparynę do rurki przedłużającej. Odkręć rurkę przedłużającą i powoli wciągnij dodatkowe 50 mililitrów krwi do strzykawki. Natychmiast wyjąć igłę z tętnicy lub żyły i powoli pobrać pozostałą krew z rurki przedłużającej do strzykawki.

Odłącz 60-mililitrową strzykawkę od rurki przedłużającej i powoli przenoś krew do pozostałej 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej heparynę. Szczelnie zakręć 50-mililitrową stożkową rurkę, delikatnie odwróć kilka razy do wymieszania i umieść na lodzie. Zastosuj hemostazę uciskową w okolicy pachwiny udowej świni.

Rozcieńczyć krew jeden do jednego PBS w czterech 50-mililitrowych stożkowych probówkach. Dodaj 25 mililitrów gotowego do użycia roztworu gradientu gęstości o temperaturze pokojowej do ośmiu 50-mililitrowych stożkowych rurek. Powoli odpipetować 25 mililitrów roztworu soli fizjologicznej krwi do każdej 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej roztwór gradientu gęstości, trzymając probówkę pod ostrym kątem do końcówki pipety.

Wirować probówki przez 30 minut w temperaturze 560 g i temperaturze pokojowej. Ostrożnie zebrać cienką pipetą kożuchową powłokę, która jest mętną warstwą komórek jednojądrzastych powyżej roztworu gradientu gęstości i poniżej przezroczystego osocza, i rozprowadzić ją równomiernie do dwóch nowych 50-mililitrowych stożkowych probówek. Odrzucić roztwór gradientu gęstości zawierający probówki.

Aby pokryć sześciodołkową płytkę fibronektyną, przygotuj podstawowy roztwór fibronektyny z ludzkiego osocza, rozcieńczając go do jednego miligrama na mililitr w sterylnej wodzie. Przygotuj 3,6 mililitra roboczego roztworu fibronektyny, rozcieńczając 600 mikrolitrów roztworu podstawowego fibronektyny w trzech mililitrach PBS. Przenieś 600 mikrolitrów roztworu roboczego fibronektyny do każdej studzienki sześciodołkowej płytki i delikatnie kołysz, aż do równomiernego pokrycia.

I delikatnie odessaj roztwór z każdej studzienki. Aby umyć komórki jednojądrzaste w oczekiwaniu na pokrycie fibronektyny, uzupełnij probówki do 45 mililitrów PBS, wiruj przez pięć minut przy 560 X g i czterech stopniach Celsjusza z niską przerwami. Odessać supernatant z obu probówek.

Zawieś każdą osadkę komórkową w 25 mililitrach PBS. Zawiesić każdą komórkę w pięciu mililitrach PBS i dodać 15 mililitrów 0,8% roztworu chlorku amonu do każdej probówki. Umyj komórki jak poprzednio, dodając PBS.

Odessać supernatant z obu probówek. Zawieś każdą osadkę komórkową w 25 mililitrach PBS. Ponownie zawiesić każdą osadkę komórkową w sześciu mililitrach pożywki hodowlanej EGM-2 uzupełnionej 10% FBS i 1X roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym.

Delikatnie przenieś dwa mililitry zawiesiny komórkowej do każdej studzienki sześciodołkowej płytki pokrytej fibronektyną i delikatnie kołysz, aż do równomiernego pokrycia. 24 godziny po wysianiu komórek delikatnie dodaj jeden mililitr świeżej pożywki hodowlanej do każdej studzienki. Następnego dnia delikatnie odessaj 1,5 mililitra pożywki hodowlanej z każdej studzienki i zastąp ją 1,5 mililitra świeżej pożywki hodowlanej.

Przez następne pięć dni delikatnie zmieniaj pożywkę hodowlaną z dwoma mililitrami świeżej pożywki na studzienkę. Regularnie wizualizuj kultury komórkowe pod mikroskopią światła obiektywowego 4X o niskiej mocy. Morfologię hodowanych komórek obserwowano od początku hodowli do momentu zaobserwowania kolonii BOEC.

Mniejsza populacja komórek przylegających zaczęła przyczepiać się do szalek hodowlanych i rosnąć, podczas gdy komórki nieprzylegające zostały usunięte ze zmianami pożywki hodowlanej. Kolonie pojawiły się po raz pierwszy szóstego dnia jako zbiór komórek podobnych do śródbłonka proliferujących promieniście na zewnątrz od centralnego punktu. Wraz z postępem hodowli kolonie komórkowe stawały się gęstsze i wykazywały brukową morfologię podobną do dojrzałych komórek śródbłonka.

Dwuwymiarowa mikroskopia z kontrastem fazowym została wykorzystana do zobrazowania tworzenia się probówek w pożywce bez surowicy i kompletnej pożywce wzrostowej. Komórki w obu warunkach pożywki uległy zróżnicowaniu morfologicznemu i szybko zorganizowały się w rozległe sieci struktur przypominających rurki kapilarne. BOEC scharakteryzowano ponadto poprzez ekspresję markera dojrzałych komórek śródbłonka CD31 lub cząsteczki adhezji komórek śródbłonka płytek krwi one.

BOEC wykazały jednolitą ekspresję CD31. Ponadto analiza cytometrii przepływowej BOEC z przeciwciałem CD14 AF 700 w porównaniu z kontrolą pozytywną potwierdziła brak EPC, ponieważ komórki były barwione ujemnie na obecność markera monocytów CD14 w porównaniu z pozytywną grupą kontrolną PBMC. Dodatnie barwienie CD14 pokazano na niebiesko, a niebarwione komórki pokazano na czerwono.

Podczas pobierania krwi ważne jest, aby zebrać jak najwięcej warstwy kożucha kożuchowego, jednocześnie zbierając jak najmniej sąsiednich warstw. Technika ta umożliwiła naukowcom zbadanie nowych strategii endotelializacji wszczepialnych urządzeń sercowo-naczyniowych przy użyciu modelu świni z autologicznymi komórkami śródbłonka wyrastającymi z krwi.