Szybka izolacja dzikich nicieni za pomocą lejka Baermanna

Nicienie Caenorhabditis to prawdziwe zwierzęta, które żyją w naturze. Kolekcjonowanie dzikich nicieni pozwala nam badać geny i genomy w ich naturalnym kontekście, ujawniając funkcje, które mogą być przesłonięte przez sztuczne warunki panujące w laboratorium. Technika ta polega na ekstrakcji robaków z bogatych w bakterie substratów organicznych na polu i tworzeniu czystych kultur na szalkach Petriego, rejestrując migawkę każdej populacji w momencie jej zebrania.

Populacje te są dobrze przystosowane do zagadnień ekologii, genetyki populacyjnej lub metagenetyki. Kultury dzikich szczepów są również cenne dla ilościowych badań genetycznych. Ta technika jest prosta i łatwa do wykonania, nawet dla nowicjusza w badaniach terenowych.

Jednak udana wyprawa kolekcjonerska wymaga przemyślanego przygotowania materiałów, przed podróżą. Zidentyfikuj bogate w bakterie podłoże na polu, takie jak gnijące owoce, kwiaty, grzyby, łodygi roślin zielnych, gleba lub ściółka z liści. Umieść niewielką objętość podłoża w oznakowanej plastikowej torbie.

Jeśli gnijący materiał jest rzadki po stronie pola, umieść trochę owoców jako przynętę. Pozostaw go do skały, a następnie odzyskaj go i wszelkie robaki, które go skolonizowały. Zapisać numer identyfikacyjny próbki, szerokość i długość geograficzną, datę i opis podłoża.

Należy zapisać wszelkie inne lokalne pomiary środowiskowe istotne dla doświadczenia, takie jak temperatura otoczenia i podłoża, stan podłoża, czas zbierania oraz obecność makrobezkręgowców związanych z substratem. Użyj nożyczek, aby wyciąć trzycentymetrowy odcinek gumowej rurki z każdego lejka. Załóż rurkę na koniec plastikowego lejka.

Nasuń rurkę clamp na gumową rurkę i clamp go. Aby zrobić uchwyt na lejek, wytnij okrągłe otwory w środku rozłożonej tekturowej tacy na muchy. Odwróć karton, złóż boki raz do góry i sklej je ze sobą.

Stworzy to nogi, które podnoszą otwory ponad ławkę. Upewnij się, że rurka clamps, są w pozycji zamkniętej i umieść lejki w otworach. Wlej sterylną wodę do każdego lejka, napełniając go około trzech centymetrów poniżej krawędzi.

Postukaj w lejek, aby uwolnić wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w rurce. Złóż niestrzępiącą się chusteczkę na pół, aby zrobić kwadrat i umieść ją nad lejkiem. Następnie naciśnij chusteczkę w dół, aby zanurzyć ją w wodzie.

Ręcznie rozbij wszelkie duże stałe kawałki naturalnego podłoża. Delikatnie umieść część próbki na chusteczce w lejku. Upewnij się, że nie przekłujesz chusteczki ani nie pozostawisz żadnej próbki wystającej ponad krawędź.

Ostrożnie złóż rogi chusteczki nad próbką, aby zapobiec przedostawaniu się wody, przez krawędź lejka. Oznacz lejek identyfikatorem próbki, odpowiadającym uwagom do zbierania pól. Wybierz wszelkie aktywne owady lub inne zwierzęta, które mogą przemieszczać się i zanieczyszczać krzyżowo próbki.

Dodaj więcej wody do każdego lejka, aby zanurzyć całą próbkę. Podczas inkubacji w temperaturze pokojowej przez noc aktywne nicienie będą poruszać się po tkance i opadać na dno lejka. Napisz identyfikator próbki lejka na spodzie sześciocentymetrowej płytki ślimakowej NGM, na której znajduje się plamka bakterii OP50 E. coli.

Zdjąć pokrywkę z płytki, wyjąć lejek zawierający próbkę ze stojaka lejka i jedną ręką trzymać go pionowo, nad otwartą płytką ślimakową. Drugą ręką zwolnij nacisk na rurkę clamp i pozwól, aby jedna lub dwie krople wody spadły z rurki na płytkę ślimakową obok trawnika bakteryjnego. Gdy tylko woda spadnie z lejka, szybko zaciśnij go ponownie, aby zapobiec zalaniu płyty NGM.

Aby posprzątać, wyrzuć zawartość lejków i umyj je gorącą wodą w celu późniejszego ponownego użycia. Obserwuj izolowane nicienie pod mikroskopem stereoskopowym. Oprócz nicieni od czasu do czasu pojawią się małe pierścienice Oligokit, niesporczaki, wrotki i małe skorupiaki.

Aby ustalić hermafrodytę ISO lub linie żeńskie ISO, przenieś każdą hermafrodytę L4 lub pokrytą dorosłą samicę na oddzielną 3,5-centymetrową płytkę NGM, osadzoną z OP50. Wysterylizuj wytrych, przed i po każdym transferze. Na koniec dokładnie owiń talerze na czas podróży folią parafinową.

Na wyspie Barro Colorado w Panamie w 2018 r. tą metodą przetworzono 131 substratów, z czego 99% dało nicienie. 34% dało nicienie.

W Czarnobylskiej Strefie Wykluczenia na Ukrainie w 2019 r. tą metodą przetworzono 170 substratów, z których 56% dało nicienie, z których żaden nie był Caenorhabditis. Ta metoda działa, ponieważ nicienie pływają przez chusteczkę.

Ale podłoże i inne zwierzęta pozostają na wierzchu. Wiele aspektów protokołu można modyfikować, aby wykorzystać wszelkie zasoby dostępne w terenie. Próbki zebrane przy użyciu tej metody pozwalają naukowcom odpowiedzieć na szeroki wachlarz pytań z zakresu biologii populacji w ustalonych kulturach do późniejszych badań laboratoryjnych.