Name: Szybka izolacja dzikich nicieni za pomocą lejka Baermanna (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Naucz się szybkiej izolacji dzikich nicieni z próbek terenowych za pomocą lejka Baermanna. Ta metoda pozwala badać geny i genomy Caenorhabditis w naturalnym kontekście ekologicznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH R35GM141906 i R21ES031364 oraz stypendium Damona Runyona DRG-2371-19.

1. Przygotowanie wysianych płytek NGM w terenie
<ol>
	<li>Przed wyjazdem odważ 23,005 g proszku do pożywki Nematode Growth Medium (NGM) (patrz Tabela materiałów) i zapakuj go do szczelnej plastikowej torebki. Przygotuj jedną torebkę na każdy litr pożywki. 
	UWAGA: Wstępne pakowanie przed wyjazdem eliminuje konieczność posiadania sprawnej wagi w terenie.</li>
	<li>Przed wyjazdem przygotuj 1 mL 1M MgSO4, 1 mL 1M CaCl2 oraz 25 mL 1M buforu fosforanowego potasu na każdy litr pożywki. Aby przygotować 1 L buforu fosforanowego potasu, rozpuść 108,3 g KH2PO4 i 35,6 g K2HPO4 w wodzie, zgodnie z opisem w WormBook20.</li>
	<li>Przed wyjazdem przygotuj nocną kulturę OP50 (patrz Tabela materiałów) hodowaną w LB w 37 °C, zgodnie z opisem w WormBook20. Rozdziel kulturę do 50 mL probówek stożkowych i owiń ich górne części folią parafinową, aby zapobiec wyciekom.</li>
	<li>W terenie rozpuść zawartość torebki NGM w 973 mL wody podwójnie destylowanej (ddH20) lub najczystszej, najbardziej sterylnej wody dostępnej, w kolbie lub butelce o pojemności 1 L.</li>
	<li>Umieść kolbę lub butelkę z pożywką, z luźno zamkniętą zakrętką lub przykrytą folią aluminiową, w kąpieli z wrzącej wody na płycie grzewczej lub kuchence. Mieszaj sporadycznie, aż cały proszek się rozpuści i roztwór stanie się klarowny (zajmuje to ok. 30 min). 
	UWAGA: Jeśli dostępna jest magnetyczna płyta grzewcza, magnes mieszający jest doskonałym rozwiązaniem w celu ograniczenia ilości mieszania ręcznego.</li>
	<li>Wyjmij pożywkę z kąpieli wodnej i schłodź do ok. 58 °C, sporadycznie wstrząsając lub używając magnesu mieszającego. Po schłodzeniu pożywki do 58 °C użyj pipet serologicznych lub standardowych, aby dodać 25 mL 1M buforu fosforanowego potasu, 1 mL 1M MgSO4 oraz 1 mL 1M CaCl2, dobrze mieszając po każdym kroku.</li>
	<li>W najbardziej sterylnym dostępnym środowisku pipetuj lub wlej pożywkę do szalek o pożądanej wielkości i pozostaw do ostygnięcia i zastygnięcia na noc. Przygotuj jedną szalkę 60 mm (~10 mL) dla każdej próbki podłoża. Przygotuj jedną szalkę 35 mm (~3,5 mL) dla każdej linii izofemale; liczbę potrzebnych małych szalek trudno przewidzieć z wyprzedzeniem.</li>
	<li>Naniesienie pipetą 50 µL kultury OP50 na każdą szalkę i pozostaw do wyschnięcia i wzrostu na noc przed użyciem.</li>
</ol>
2. Pobieranie substratów z nicieniami
<ol>
	<li>Zidentyfikuj w terenie podłoże bogate w bakterie. Przykłady obejmują gnijące owoce, kwiaty, grzyby oraz łodygi roślin zielnych. Gleba i ściółka liściowa są również odpowiednie, choć rzadko zawierają Caenorhabditis.</li>
	<li>Używając dłoni w rękawiczce, umieść próbkę tego podłoża (1-15 cm3) w szczelnym worku plastikowym (patrz Tabela materiałów) oznaczonym unikalnym identyfikatorem próbki (Rycina 1A).</li>
	<li>Zanotuj identyfikator próbki, szerokość i długość geograficzną, datę, opis podłoża oraz wszelkie inne lokalne pomiary środowiskowe istotne dla eksperymentu, w tym temperaturę otoczenia i podłoża, godzinę pobrania, stan podłoża, obecność makrobezkręgowców związanych z podłożem i tak dalej. Do usprawnienia tego procesu dostępna jest aplikacja na smartfona21.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zestawu lejków Baermanna
<ol>
	<li>Dla każdego lejka odciąć nożyczkami fragment gumowej rurki (patrz Tabela materiałów) o długości ok. 3 cm.</li>
	<li>Nałożyć fragment rurki na końcówkę plastikowego lejka (patrz Tabela materiałów). Może to wymagać pewnego wysiłku, ponieważ dopasowanie jest bardzo ciasne.</li>
	<li>Nasunąć zacisk do rurek na gumową rurkę i zacisnąć go.</li>
	<li>Aby wykonać uchwyt na lejki, za pomocą skalpela wyciąć w dnie tekturowej tacy na fiolki do muszek (patrz Tabela materiałów) otwory okrągłe o średnicy 35 mm, zanim taca zostanie złożona z płaskiego opakowania transportowego. Standardowa taca pomieści 12 takich otworów w układzie 3 x 4.</li>
	<li>Odwrócić tekturę, raz złożyć boki (nie dwa razy, jak przy tworzeniu tacy na fiolki do muszek) i skleić boki taśmą, aby unieść odwróconą tekturową tacę (Rysunek 2).</li>
	<li>Umieścić lejki w otworach, upewniając się najpierw, że zaciski do rurek są w pozycji zamkniętej.</li>
</ol>
<img alt="Układ eksperymentu kiełkowania nasion; konstrukcja z tektury z plastikowymi kubkami do uprawy roślin." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przerobione tekturowe tacki do fiolek dla muszek, złożone i docięte tak, aby pomieścić po 12 lejków Baermanna w każdej z nich.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
4. Przenoszenie próbek do lejków
<ol>
	<li>Wlej wodę (najbardziej sterylną z dostępnych) do każdego lejka, wypełniając go do poziomu około 3 cm poniżej krawędzi. Jeśli w rurkach uwięzły pęcherzyki powietrza, opukaj lejek, aby je usunąć.</li>
	<li>W rękawiczkach włóż bezpyłową chusteczkę lub konkretnie Kimwipe (złożoną na pół, aby uzyskać kwadrat) na lejek i dociśnij środek, aby chusteczka została zanurzona w wodzie.</li>
	<li>Ręcznie rozdrobnij duże, stałe części substratów naturalnych (owoców, kwiatów, gleby, ściółki liściowej itp.) na mniejsze fragmenty, aby zminimalizować odległość, jaką dżdżownice muszą przebyć, aby wypaść z substratu. 
	UWAGA: Ściółkę liściową i próbki o nieregularnych kształtach można poddać wstępnej obróbce w procesorze spożywczym lub blenderze.</li>
	<li>Ostrożnie umieść próbkę naturalnego substratu (1-15 cm3) na chusteczce/bezpyłowej ściereczce w lejku, uważając, aby nie przebić chusteczki i aby próbka nie wystawała ponad krawędź.</li>
	<li>Oznacz lejek lub tekturę obok lejka identyfikatorem próbki odpowiadającym notatkom z poboru terenowego.</li>
	<li>Zawiń rogi chusteczki/bezpyłowej ściereczki nad próbką (Rycina 1B). Należy zadbać o to, aby próbka pozostała zamknięta wewnątrz chusteczki/bezpyłowej ściereczki, tak aby gleba lub zanieczyszczenia nie przedostały się na dno lejka. 
	UWAGA: Ten krok ma na celu zapobieganie zwisaniu rogów chusteczki poza krawędź lejka, co mogłoby spowodować odciąganie wody z lejka na zewnątrz.</li>
	<li>Ręcznie, za pomocą szpatułki lub końcówki pipety, usuń wszelkie aktywne owady, paciorkowce lub inne zwierzęta, które mogłyby przemieszczać się z lejka do lejka, powodując kontaminację krzyżową próbek. Owiń chusteczkę/bezpyłową ściereczkę całkowicie wokół próbki lub połóż drugą chusteczkę na górze próbki, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej.</li>
	<li>Dolej wody do lejków tak, aby cała próbka została zanurzona (Rycina 3).</li>
</ol>
<img alt="Eksperyment fermentacji herbaty; próbki w kubkach na siatce obserwacyjnej do analizy mikrobiologicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Złożone lejki Baermanna. Każda próbka jest owinięta w chusteczkę/przepustkę beztkaninową i zanurzona w wodzie w lejku, który jest szczelnie zamknięty zaciskiem. W ciągu około 12 h nicienie przemieszczą się przez tkaninę na dno lejka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
5. Ekstrakcja nicieni z lejkow
<ol>
	<li>Odczekać ok. 12 h lub pozostawić przez noc. W tym czasie aktywne nicienie wyślizgną się z podłoża, przejdą przez tkankę/przepustkę beztkankową i opadną na dno zaklampowanego lejka. 
	UWAGA: Odczekanie znacznie dłużej niż 12 h grozi śmiercią nicieni z powodu hipoksji lub infekcji patogennej, co może być ryzykiem również przy krótszych odstępach czasu w przypadku próbek szczególnie gęsto zasiedlonych nicieniami i bakteriami.</li>
	<li>Zapisać identyfikator próbki z lejka na spodzie 60 mm płytki NGM z wysianą plamką bakterii E. coli OP50. Zdjąć pokrywkę z płytki.</li>
	<li>Zdjąć lejek zawierający daną próbkę ze stojaka na lejki. Trzymając jedną ręką lejek pionowo nad otwartą płytką z nicieniami, drugą ręką zwolnić ucisk zacisku na rurce, pozwalając jednej kropli wody spaść z rurki na płytkę (Rysunek 1C). Gdy tylko woda spadnie z lejka, należy go szybko ponownie zacisnąć, aby zapobiec zalaniu płytki NGM. 
	UWAGA: Aby wyselekcjonować nicienie przyciągane przez OP50, w tym gatunki Caenorhabditis, należy wypuścić kroplę z dala od lawns bakterii. Gdy woda wniknie w płytkę lub odparuje, nicienie Caenorhabditis wpełzną na lawn bakterii.</li>
	<li>Sprzątanie: Wyrzucić zawartość lejków. Umyć lejki gorącą wodą w celu ich ponownego wykorzystania.</li>
</ol>
6. Zakładanie kultur
<ol>
	<li>Obserwuj wyizolowane nicienie pod stereomikroskopem przy powiększeniu od 5x do 50x. Na szalkach powinny znajdować się nicienie, a z znacznie mniejszą częstotliwością małe pierścienice z grupy oligoset, niesiorców, wrotki i małe skorupiaki (Rysunek 4). 
	​UWAGA: Jeśli lejek został ustawiony prawidłowo, żadne roztocza, owady ani widoczny materiał nieożywiony nie przedostaną się przez niego.</li>
</ol>
<img alt="Obraz mikroskopowy nicieni; badanie biologiczne; obserwacja mikroskopowa; analiza organizmu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Zawartość pierwszej kropli zlejonej z lejka Baermanna na płytkę NGM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol start="2">
	<li>Aby utworzyć linie izohermafrodytyczne lub izofemale, użyj pętliczki do przeniesienia każdego hermafrodyty w stadium L4 lub zapłodnionej dorosłej samicy (rozpoznawalnej po większym rozmiarze ciała i braku charakterystycznego ogona samca22) na oddzielną płytkę NGM o średnicy 35 mm z wysianym szczepem OP50 (Rysunek 1D). Przed i po przenoszeniu nicieni wysterylizuj pętliczkę za pomocą zapalniczki.</li>
	<li>Użyj folii parafiny do dokładnego owinięcia płytek przed transportem.</li>
</ol>

<ol><li>Frezal, L., Felix, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+outside+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">C. elegans outside the Petri dish.</a> Elife. 4, 05849(2015).</li>
<li>Greene, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+selection+shapes+density-dependent+foraging+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour.</a> Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).</li>
<li>Reddy, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+paralogs+control+a+switch+between+growth+and+pathogen+resistance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Antagonistic paralogs control a switch between growth and pathogen resistance in C. elegans.</a> PLOS Pathogens. 15 (1), 1007528(2019).</li>
<li>Schulenburg, H., Felix, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+biotic+environment+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485(2017).</li>
<li>Andersen, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-scale+selective+sweeps+shape+Caenorhabditis+elegans+genomic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome-scale selective sweeps shape Caenorhabditis elegans genomic diversity.</a> Nature Genetics. 44 (3), 285-290 (2012).</li>
<li>Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CeNDR%2C+the+Caenorhabditis+elegans+natural+diversity+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource.</a> Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2017).</li>
<li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sampling+of+Hawaiian+Caenorhabditis+elegans+reveals+high+genetic+diversity+and+admixture+with+global+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Deep sampling of Hawaiian Caenorhabditis elegans reveals high genetic diversity and admixture with global populations.</a> Elife. 8, 50465(2019).</li>
<li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+selection+maintains+hyper-divergent+haplotypes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Balancing selection maintains hyper-divergent haplotypes in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Ecology & Evolution. 5 (6), 794-807 (2021).</li>
<li>Rockman, M. V., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinational+landscape+and+population+genomics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Recombinational landscape and population genomics of Caenorhabditis elegans.</a> PLOS Genetics. 5 (3), 1000419(2009).</li>
<li>Evans, K. S., van Wijk, M. H., McGrath, P. T., Andersen, E. C., Sterken, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+QTL+to+gene%3A+C.+elegans+facilitates+discoveries+of+the+genetic+mechanisms+underlying+natural+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">From QTL to gene: C. elegans facilitates discoveries of the genetic mechanisms underlying natural variation.</a> Trends in Genetics. 37, 933-947 (2021).</li>
<li>Gaertner, B. E., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+molecular+quantitative+genetics+and+the+systems+biology+of+natural+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+Research+%28Cambridge+Core%29%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation.</a> Genetics Research (Cambridge Core). 92 (5-6), 331-348 (2010).</li>
<li>Noble, L. M., Rockman, M. V., Teotonio, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-level+quantitative+trait+mapping+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">Gene-level quantitative trait mapping in Caenorhabditis elegans.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 11 (2), 061(2021).</li>
<li>Van Bezooijen, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+Bezooijen%2C+J+%22Methods+and+techniques+for+nematology%22">Methods and techniques for nematology</a>. , Wageningen University. (2006).</li>
<li>Barrièrre, A., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+C.+elegans.+and+related+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Wormbook%22%5BJournal%5D)">Isolation of C. elegans. and related nematodes.</a> Wormbook. , wormbook.1.115.2 (2014).</li>
<li>Baermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eine+einfache+Methode+zur+Auffindung+von+Anklostomum+%28Nematoden%29+Larven+in+Erdproben%5BTitle%5D)+AND+%22Geneeskundig+tijdschrift+voor+Nederlandsch-Indi%C3%AB%22%5BJournal%5D)">Eine einfache Methode zur Auffindung von Anklostomum (Nematoden) Larven in Erdproben.</a> Geneeskundig tijdschrift voor Nederlandsch-Indië. 57, 131-137 (1917).</li>
<li>Gray, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+of+nematophagous+fungi+Panagrellus+redivivus+as+the+target+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Soil%22%5BJournal%5D)">Ecology of nematophagous fungi Panagrellus redivivus as the target organism.</a> Plant and Soil. 297, 293-297 (1983).</li>
<li>Mallez, S., Castagnone, C., Espada, M., Viera, P., Eisenback, J., Mota, M., Guillemaud, T., Castagnone-Sereno, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+insights+into+the+genetic+diversity+of+the+pinewood+nematode+in+its+native+area+using+new+polymorphic+microsatellite+loci%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">First insights into the genetic diversity of the pinewood nematode in its native area using new polymorphic microsatellite loci.</a> PLOS ONE. 8 (3), 4-11 (2013).</li>
<li>Kerfahi, D., Tripathi, M. B., Porazinska, L. D., Park, J., Go, R., Adams, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+tropical+rain+forest+soils+have+greater+nematode+diversity+than+High+Arctic+tundra%3F+A+metagenetic+comparison+of+Malaysia+and+Svalbard%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Ecology+and+Biogeography%22%5BJournal%5D)">Do tropical rain forest soils have greater nematode diversity than High Arctic tundra? A metagenetic comparison of Malaysia and Svalbard.</a> Global Ecology and Biogeography. 25, 716-728 (2016).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Di Bernardo, M., Crombie, T. A., Cook, D. E., Andersen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((easyFulcrum%3A+An+R+package+to+process+and+analyze+ecological+sampling+data+generated+using+the+Fulcrum+mobile+application%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">easyFulcrum: An R package to process and analyze ecological sampling data generated using the Fulcrum mobile application.</a> PLOS ONE. 16, 0254293(2021).</li>
<li>Lints, R., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handbook+of+C.+elegans+male+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22WormAtlas%22%5BJournal%5D)">Handbook of C. elegans male anatomy.</a> WormAtlas. , (2005).</li>
<li>Kiontke, K., Félix, M. -A., Ailion, M., Rockman, M. V., Braendle, C., Pénigault, J. -B., Fitch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phylogeny+and+molecular+barcodes+for+Caenorhabditis%2C+with+numerous+new+species+from+rotting+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">A phylogeny and molecular barcodes for Caenorhabditis, with numerous new species from rotting fruits.</a> BMC Evolutionary Biology. 11, 339(2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Główną zasadą tej metody jest to, że nicienie przejdą przez tkankę zanurzoną w wodzie, podczas gdy ich podłoże i większe zanieczyszczenia bezkręgowców nie. Krytycznymi etapami protokołu są: (1) zebranie odpowiedniego substratu, (2) zanurzenie substratu, owiniętego w materiał filtrujący, w wodzie, (3) zebranie robaków, które przeszły przez filtr i opadły na dno wody, oraz (4) odizolowanie pojedynczych robaków w celu utworzenia linii izożeńskich lub izohermafrodytowych. Wszystkie inne części metody mogą być modyfikowane w razie potrzeby w zależności od dostępnych zasobów, charakteru substratów lub celów prac terenowych. Oto kilka modyfikacji, które warto rozważyć.
Przynęta na robaki poprzez sadzenie owoców Jeśli na terenie pola nie ma wystarczającej ilości bogatego w bakterie gnijącego materiału, można przynieść próbkę, taką jak kawałek jabłka lub pomidora, aby pozostawić ją do zgnicia. Dobrze przypnij przynętę kilkoma kołkami, aby większe zwierzęta ich nie usunęły i aby można ją było później łatwo znaleźć do zbioru. Unikaj bezpośredniego światła słonecznego, w którym przynęta może wyschnąć, zanim zgnije.
Konstruowanie aparatury lejkowej z dowolnych dostępnych materiałów Sprawdzi się każda konstrukcja z otworami wystarczająco dużymi, aby pomieścić zacisk rurki i wystarczająco stabilnymi, aby utrzymać ciężki lejek. W przypadku pojedynczego lejka odpowiednim uchwytem jest szklanka do picia. Można użyć każdego rodzaju chusteczek higienicznych – chusteczki higienicznej, papieru toaletowego lub ręczników papierowych.
Umieszczanie mniejszej ilości materiału w lejkach lub dostosowanie czasu oczekiwania, aby zapobiec niedotlenieniu lub infekcji Jeśli próbka ma bardzo wysokie stężenie robaków lub bakterii, nicienie mogą zacząć umierać z powodu niedotlenienia lub infekcji przed zakończeniem 12-godzinnej inkubacji. Jeśli jest to powód do niepokoju, badacz może wcześniej sprawdzić lejki lub przygotować dodatkowy lejek z bardzo małą podpróbką wysoce zaludnionego substratu.
Dostosowanie przygotowania płytek NGM do potrzeb i ograniczeń eksperymentalnych Płytki NGM można przygotować z dowolnymi pożywkami i źródłem pożywienia odpowiednimi dla eksperymentu. Opisany powyżej protokół terenowy ma na celu zminimalizowanie wagi bagażu. W zależności od ograniczeń bagażowych i czasu pracy w terenie, przyniesienie już wylanych płytek NGM – przygotowanych w laboratorium lub zakupionych komercyjnie – może być lepsze niż wylewanie płyt w terenie.
Wykonywanie izolacji lejków w laboratorium W protokole opisano przeprowadzenie pełnej procedury w warunkach polowych w celu schwytania populacji nicieni występującej w naturze. W przypadku niektórych celów badawczych wystarczające może być wyizolowanie nicieni później, po powrocie do laboratorium z próbkami w szczelnie zamkniętych workach. Nawet wtedy metoda lejkowa Baermanna zapewnia czystszą i kompletną próbkę nicieni, które przeżyły, niż inne metody izolacji. Jednak próbki w szczelnie zamkniętych workach mogą ulec selekcji podczas podróży, ponieważ są narażone na potencjalne ekstremalne temperatury i niedotlenienie. Można to zminimalizować, wykonując izolacje tak szybko, jak to możliwe po pobraniu próbki.
Powszechna metoda alternatywna dla lejka Baermanna polega na umieszczeniu podłoża bezpośrednio na płytce NGM i czekaniu, aż robaki wypełzną, co jest albo bardzo pracochłonne, albo skutkuje niekompletnym zebraniem populacji. Daje również płytki zanieczyszczone roztoczami i larwami owadów. Metoda lejkowa Baermanna to tania, niewymagająca technologii i pracochłonna strategia szybkiego oddzielenia całej populacji aktywnych robaków od ich podłoża.
Metoda lejkowa Baermanna nie ma uniwersalnego zastosowania do zbierania wszystkich rodzajów dzikich nicieni. Niektóre nicienie żyjące w roślinach potrzebują znacznie więcej niż 12 godzin, aby wyłonić się z podłoża i nie będą dostępne w przypadku zbyt wcześnie uwolnionej kropli, podczas gdy niektóre pasożyty owadów będą pełzać na górę lejka, a nie na dół, również unikając zbioru14. Alternatywy dla lejka Baermann wymagają albo bardziej specjalistycznego sprzętu, albo więcej pracy w celu odzyskania robaków. Jednak nadal mogą być preferowane, jeśli powyższe zastrzeżenia stanowią problem dla eksperymentu. Alternatywne opcje, sprawdzone przez van Bezooijen14, obejmują metodę natryskiwania lejka, która zapewnia stałą mgłę wody do lejków, dodając tlen i umożliwiając przelewanie się bakterii w zawiesinie. Pozwala to na wydłużenie okresu ekstrakcji nicieni z roślin. Metoda flotacji odśrodkowej mieszalnika odzyskuje nicienie wolno poruszające się, nieaktywne lub pełzające w górę poprzez oddzielenie ich ciężaru właściwego, elutriator Oostenbrink stosuje prąd podziemny do oddzielenia osadu osadzającego się od zawieszonych nicieni, a metoda Cobba wykorzystuje szereg sit do izolowania nicieni według ich wielkości, kształtu i szybkości sedymentacji14. Jednak do zbierania rabditydów lejek Baermann skutecznie wytwarza czyste próbki szybko i przy minimalnym wysiłku.

Cenne spostrzeżenia biologiczne pojawiają się w miarę jak badacze studiujący C. elegans w laboratorium rozszerzają zakres swoich zainteresowań na C. elegans oraz pokrewne nicienie rhabditidy występujące w naturze. Badania nicieni dzikich pozwalają osadzić geny i genomy w ich naturalnym kontekście, ujawniając funkcje, które mogą być maskowane przez warunki laboratoryjne1,2,3,4,5. Badania te dostarczają wiedzy na temat warunku niezbędnego dla samej ewolucji, jakim jest zmienność genetyczna6,7,8,9,10. Naturalna zmienność genetyczna uchwycona w próbkach dzikich stanowi również punkt wyjścia do badania podłoża genetycznego wielu złożonych cech11,12,13.
Podczas projektowania badań wymagających izolacji naturalnych populacji nicieni, zwłaszcza w przypadku prowadzenia prac terenowych w odległych lokalizacjach, kluczowe stają się kwestie praktyczne. Niniejszy protokół ma na celu czystą izolację całych populacji aktywnych nicieni, które mogą być hodowane na OP50, z przynęt lub podłoży naturalnych. Metoda ta jest dobrze dostosowana do ekstrakcji wolnożyjących nicieni z grup rhabditid i diplogasterid, w tym Caenorhabditis, Oscheius oraz Pristionchus.
Istnieje wiele technik izolowania nicieni z ich podłoży14,15. Najprostszym podejściem jest umieszczenie podłoża bezpośrednio na płytce z pożywką dla nicieni i wyłapywanie zwierząt w momencie, gdy z niego wychodzą8,15. Metoda ta wymaga dużych nakładów czasu i pracy, jeżeli celem jest wyizolowanie wszystkich nicieni z próbki. Bardziej zaawansowane techniki wykorzystują masę, rozmiar, mobilność zwierząt lub kombinację tych cech14. Każda metoda ma swoje zalety i wady pod względem przygotowania oraz wydajności. Różnią się one również pod kątem błędów próbkowania i mogą selekcjonować określone nicienie, jeśli zwierzęta w próbce różnią się wzdłuż osi zasady separacji danej metody.
Metoda lejka Baermanna została po raz pierwszy opisana w 1917 roku przez holenderskiego lekarza G. K. T. F. Baermanna, który wynalazł to urządzenie na Jawie podczas badań nad nicieniami glebowymi, w tym nad pasożytniczymi nicieniami haczykowatymi16. Lejek Baermanna działa w oparciu o zasadę mobilności. Substrat umieszcza się w lejku wyłożonym filtrem z tkaniny lub papieru (w niniejszym badaniu zastosowano „Kimwipe”, określany w bieżącym protokole jako „przepiórka bezpyłowa”) i uszczelnia go u dołu. Następnie lejek napełnia się wodą, zanurzając próbkę, podczas gdy filtr oddziela ją od zamkniętego wylotu. Aktywne nicienie znajdujące się w próbce uwalniają się do wody i przepływają przez filtr, ostatecznie osiadając na dnie lejka. Wylot lejka zostaje otwarty, a kropla zawierająca nicienie jest wypuszczana na płytkę (Rycina 1).
<img alt="Schemat entomologii sądowej, analiza cyklu życia muchówki za pomocą leja Baermanna, badanie ekosystemu rozkładu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Podsumowanie techniki leja Baermanna. (A) Pobieranie próbki bogatej w bakterie z wyznaczonego miejsca. (B) Zanurzenie próbki w leju Baermanna i oczekiwanie, aż nicienie wyślizgną się i opadną na dno. (C) Wypuszczenie pojedynczej kropli z leja. (D) Przenoszenie pojedynczych hermafrodytów lub zapłodnionych samic na oddzielne płytki. Ilustracja autorstwa Ramina Rahni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Lejek Baermanna nie będzie skuteczny dla każdego rodzaju nicieni (alternatywne metody opisano w sekcji Dyskusja) i najlepiej nadaje się do form aktywnych o rozmiarach zbliżonych do Caenorhabditis lub mniejszych14. Jeśli jednak w badaniu można zastosować lejek Baermanna, wiąże się to z wieloma zaletami. Metoda ta jest praktyczna w warunkach terenowych, wymagając minimalnej konfiguracji, czasu pracy oraz nakładów finansowych. Badacz otrzymuje czystą próbkę bez zanieczyszczeń z podłoża na płytce, co ułatwia wyławianie osobników. Zastosowanie filtra zapobiega również kontaminacji płytki larwami owadów lub roztoczami, które mogą niszczyć podłoże lub polować na nicienie w próbce. Co najważniejsze, lejek Baermanna efektywnie ekstrahuje niemal całą populację z podłoża14, co może być wymagane w zależności od projektu badania. Przykładowo, metoda ta może być przydatna dla badaczy zainteresowanych liczeniem rozkładu stadiów rozwojowych lub płci w populacjach dzikich, poszukiwaniem genotypów rzadkich lub wolno rosnących, bądź próbkowaniem nicieni, które nie są przyciągane przez OP50. Jest to odpowiednie dla naukowców badających kwestie ekologiczne17, genetyki populacyjnej18 lub metagenetyczne19, ponieważ schemat próbkowania pozwala na uchwycenie stanu populacji w momencie pobrania próbek.
Niniejszy artykuł opisuje kompletny protokół izolowania populacji nicieni przy użyciu lejka Baermanna oraz tworzenia linii izofemałych i izohermafrodytnych w terenie, z wykorzystaniem sprzętu dobranego pod kątem łatwego transportu. W przypadku badaczy prowadzących prace terenowe w pobliżu swoich laboratoriów, wiele z tych kroków można pominąć lub uprościć.

<table><tbody><tr><td>Butelka szklana 1 L</td><td>NA</td><td></td><td>NA Krok 1 - naczynie do produkcji pożywek płytkowych</td></tr><tr><td>1 ml końcówki do pipet</td><td>dowolne</td><td>BRAK DANYCH</td><td>Krok 1 - dozowanie dodatków do pożywki ślimakowej i płytek nasiennych</td></tr><tr><td>Pitter 1 ml</td><td>dowolny</td><td>BRAK DANYCH</td><td>Krok 1 - dozowanie dodatków do pożywki ślimakowej i płytek nasiennych</td></tr><tr><td>Płytki ślimakowe 35 mm</td><td>Tritech</td><td>T3500</td><td>Krok 1 - płytki ślimakowe</td></tr><tr><td>rurka gumowa 4mm ID</td><td>Fisher</td><td>14178A</td><td>Krok 3 - część lejka</td></tr><tr><td>Płytki ślimakowe 60 mm</td><td>Greiner</td><td>628161</td><td>Krok 1 - płytki ślimakowe</td></tr><tr><td>65 mm Lejek</td><td>Fisher</td><td>22170156</td><td>Krok 3 - część lejka</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Krok 1 - płyta ślimakowa medium</td></tr><tr><td>Garnek do gotowania</td><td>NA</td><td></td><td>NA Krok 1 - kąpiel wodna do topienia agaru do nalewania talerzy</td></tr><tr><td>E. coli szczep OP50</td><td>Centrum Genetyki Caenorhabditis</td><td>OP50</td><td>Krok 1 - pokarm dla robaków</td></tr><tr><td>Mikroskop polowy</td><td>OMAX</td><td>G223CS</td><td>Krok 6 - do oglądania robaków w terenie</td></tr><tr><td>Tacka do przechowywania fiolek na muchy</td><td>Azer Scientific</td><td>ES-260T</td><td>Krok 3 - zbudowanie platformy na 12 lejków</td></tr><tr><td>Płyta grzewcza lub piec</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Krok 1 - podgrzanie łaźni wodnej</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>KimberlyClark</td><td>34120</td><td>Krok 4 - filtr do lejków</td></tr><tr><td>LB media</td><td>Gibco</td><td>10855021</td><td>Krok 1 - do uprawy zapalniczki OP50</td></tr><tr><td></td><td>NA</td><td>NA</td><td>Krok 6 - wysterylizuj pick do robaków</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td>Krok 1 - płytka ślimakowa medium</td></tr><tr><td>Agar NGM-lite</td><td>USBiological</td><td>N1000</td><td>Krok 1 - płytka ślimakowa medium</td></tr><tr><td>Folia do pakowania Parafilm</td><td>M Fisher</td><td>13-374-10</td><td>Krok 6 - zapakuj płytki ślimakowe do podróży</td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Fisher</td><td>BP363-500</td><td>Krok 1 - płytka ślimakowa medium</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Fisher</td><td>P285-3</td><td>Krok 1 - płytka ślimakowa średni</td></tr><tr><td>skalpel</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Krok 3 - wyciąć otwory na lejki</td></tr>, <tr><td>nożyczki</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Krok 3 - przeciąć gumową rurkę</td></tr><tr><td>Taśma</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Krok 3 - sklej uchwyt lejka</td></tr><tr><td>taśmą Zaciski do węży</td><td>Fisher</td><td>5869</td><td>Krok 3 - część lejka</td></tr><tr><td>Wytrysk ślimakowy</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Krok 6 - do izolowania pojedynczych robaków</td></tr><tr><td>Worki do przechowywania w stylu ziplock</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Krok 2 - aby zapakować próbkę substratu</td></tr></tbody></table>

szybka izolacja dzikich nicieni za pomocą lejka baermanna

Rapid Isolation of Wild Nematodes by Baermann Funnel

Poza tym, że są solidnymi eksperymentalnymi organizmami modelowymi, Caenorhabditis elegans i jego krewni są również prawdziwymi zwierzętami żyjącymi w naturze. Badania dzikich nicieni w ich naturalnym środowisku są cenne dla zrozumienia wielu aspektów biologii, w tym reżimów selektywnych, w których ewoluują charakterystyczne cechy genomowe i fenotypowe, genetycznych podstaw złożonej zmienności cech oraz naturalnej różnorodności genetycznej fundamentalnej dla wszystkich populacji zwierząt. Ten manuskrypt opisuje prostą i skuteczną metodę ekstrakcji nicieni z ich naturalnych substratów, w tym gnijących owoców, kwiatów, grzybów, ściółki z liści i gleby. Metoda lejkowa Baermanna, klasyczna technika nematologiczna, selektywnie izoluje aktywne nicienie od ich substratów. Ponieważ technika lejka Baermanna pozwala na odzyskanie rzadkich i wolno rosnących genotypów, które współwystępują z licznymi i szybko rosnącymi genotypami, co może zostać pominięte w metodach ekstrakcji obejmujących wiele pokoleń rozmnażania. Technika ta doskonale nadaje się również do rozwiązywania problemów metagenetycznych, populacyjnie i ekologicznych. Obejmuje jednocześnie całą populację w próbce, umożliwiając bezstronny wgląd w naturalny rozkład wieku, płci i genotypów. Protokół pozwala na wdrożenie na dużą skalę w terenie, szybko przekształcając podłoża w płytki ślimakowe, a autorzy potwierdzili go poprzez prace terenowe na wielu kontynentach.

Niniejszy protokół został zastosowany do izolacji nicieni z owoców, kwiatów, grzybów, gleby i łodyg na wyspie Barro Colorado w Panamie, w stacji terenowej Instytutu Badań Tropikalnych Smithsonian w sierpniu 2018 roku. Ze 131 podłoży przetworzonych przez jednego badacza w ciągu czterech dni, 130 podłoży (99,2%) dostarczyło nicieni. Czterdzieści cztery podłoża (33,6%) pozwoliły na wyizolowanie nicieni z rodzaju Caenorhabditis (Rysunek 5). Dalsza analiza kultur ustanowionych z tych czterdziestu czterech podłoży, przeprowadzona za pomocą PCR i testów krzyżowania23, wykazała obecność sześciu różnych gatunków Caenorhabditis – C. becei, C. tropicalis, C. briggsae, C. sp. 24, C. sp. 57 oraz C. panamensis.
Niniejszy protokół został ponownie zastosowany do izolacji nicieni z różnych substratów w Strefie Wykluczenia Czarnobyla na Ukrainie w ciągu czterech dni w sierpniu 2019 roku. Żywe nicienie odzyskano z 62 z 63 próbek gleby, 1 z 17 próbek bezkręgowców, 31 z 75 próbek owoców, 1 z 12 próbek przynęt (patrz sekcja Dyskusja), natomiast nie odzyskano żadnych nicieni z próbek grzybów, trzciny rzecznej ani odchodów wilka (pobrano jedną próbkę każdego z tych materiałów). Następujące sekwencjonowanie rybosomalnego DNA 18S15 pozwoliło zidentyfikować te nicienie jako Oscheius, Panagrolaimus, Acrobeloides, Mesorhabditis, Panagrellus, Pristionchus oraz Pelodera, jednak nie zidentyfikowano żadnych przedstawicieli rodzaju Caenorhabditis (Rycina 5).
<img alt="Wykres słupkowy porównujący próbki nicieni z Panamy i Ukrainy; analiza nicieni w stosunku do Caenorhabditis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Odsetki sukcesu dwóch wypraw kolekcjonistycznych. Panama w 2018 roku (po lewej) i Ukraina w 2019 roku (po prawej). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig05large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>

Ten protokół przedstawia metodę efektywnego wydobywania żywych nicieni z naturalnych substratów w terenie.

Szybka izolacja dzikich nicieni za pomocą lejka Baermanna

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild ...

Nicienie Caenorhabditis to prawdziwe zwierzęta, które żyją w naturze. Kolekcjonowanie dzikich nicieni pozwala nam badać geny i genomy w ich naturalnym kontekście, ujawniając funkcje, które mogą być przesłonięte przez sztuczne warunki panujące w laboratorium. Technika ta polega na ekstrakcji robaków z bogatych w bakterie substratów organicznych na polu i tworzeniu czystych kultur na szalkach Petriego, rejestrując migawkę każdej populacji w momencie jej zebrania.Populacje te są dobrze przystosowane do zagadnień ekologii, genetyki populacyjnej lub metagenetyki. Kultury dzikich szczepów są również cenne dla ilościowych badań genetycznych. Ta technika jest prosta i łatwa do wykonania, nawet dla nowicjusza w badaniach terenowych.Jednak udana wyprawa kolekcjonerska wymaga przemyślanego przygotowania materiałów, przed podróżą. Zidentyfikuj bogate w bakterie podłoże na polu, takie jak gnijące owoce, kwiaty, grzyby, łodygi roślin zielnych, gleba lub ściółka z liści. Umieść niewielką objętość podłoża w oznakowanej plastikowej torbie.Jeśli gnijący materiał jest rzadki po stronie pola, umieść trochę owoców jako przynętę. Pozostaw go do skały, a następnie odzyskaj go i wszelkie robaki, które go skolonizowały. Zapisać numer identyfikacyjny próbki, szerokość i długość geograficzną, datę i opis podłoża.Należy zapisać wszelkie inne lokalne pomiary środowiskowe istotne dla doświadczenia, takie jak temperatura otoczenia i podłoża, stan podłoża, czas zbierania oraz obecność makrobezkręgowców związanych z substratem. Użyj nożyczek, aby wyciąć trzycentymetrowy odcinek gumowej rurki z każdego lejka. Załóż rurkę na koniec plastikowego lejka.Nasuń rurkę clamp na gumową rurkę i clamp go. Aby zrobić uchwyt na lejek, wytnij okrągłe otwory w środku rozłożonej tekturowej tacy na muchy. Odwróć karton, złóż boki raz do góry i sklej je ze sobą.Stworzy to nogi, które podnoszą otwory ponad ławkę. Upewnij się, że rurka clamps, są w pozycji zamkniętej i umieść lejki w otworach. Wlej sterylną wodę do każdego lejka, napełniając go około trzech centymetrów poniżej krawędzi.Postukaj w lejek, aby uwolnić wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w rurce. Złóż niestrzępiącą się chusteczkę na pół, aby zrobić kwadrat i umieść ją nad lejkiem. Następnie naciśnij chusteczkę w dół, aby zanurzyć ją w wodzie.Ręcznie rozbij wszelkie duże stałe kawałki naturalnego podłoża. Delikatnie umieść część próbki na chusteczce w lejku. Upewnij się, że nie przekłujesz chusteczki ani nie pozostawisz żadnej próbki wystającej ponad krawędź.Ostrożnie złóż rogi chusteczki nad próbką, aby zapobiec przedostawaniu się wody, przez krawędź lejka. Oznacz lejek identyfikatorem próbki, odpowiadającym uwagom do zbierania pól. Wybierz wszelkie aktywne owady lub inne zwierzęta, które mogą przemieszczać się i zanieczyszczać krzyżowo próbki.Dodaj więcej wody do każdego lejka, aby zanurzyć całą próbkę. Podczas inkubacji w temperaturze pokojowej przez noc aktywne nicienie będą poruszać się po tkance i opadać na dno lejka. Napisz identyfikator próbki lejka na spodzie sześciocentymetrowej płytki ślimakowej NGM, na której znajduje się plamka bakterii OP50 E. coli.Zdjąć pokrywkę z płytki, wyjąć lejek zawierający próbkę ze stojaka lejka i jedną ręką trzymać go pionowo, nad otwartą płytką ślimakową. Drugą ręką zwolnij nacisk na rurkę clamp i pozwól, aby jedna lub dwie krople wody spadły z rurki na płytkę ślimakową obok trawnika bakteryjnego. Gdy tylko woda spadnie z lejka, szybko zaciśnij go ponownie, aby zapobiec zalaniu płyty NGM.Aby posprzątać, wyrzuć zawartość lejków i umyj je gorącą wodą w celu późniejszego ponownego użycia. Obserwuj izolowane nicienie pod mikroskopem stereoskopowym. Oprócz nicieni od czasu do czasu pojawią się małe pierścienice Oligokit, niesporczaki, wrotki i małe skorupiaki.Aby ustalić hermafrodytę ISO lub linie żeńskie ISO, przenieś każdą hermafrodytę L4 lub pokrytą dorosłą samicę na oddzielną 3,5-centymetrową płytkę NGM, osadzoną z OP50. Wysterylizuj wytrych, przed i po każdym transferze. Na koniec dokładnie owiń talerze na czas podróży folią parafinową.Na wyspie Barro Colorado w Panamie w 2018 r. tą metodą przetworzono 131 substratów, z czego 99% dało nicienie. 34% dało nicienie.W Czarnobylskiej Strefie Wykluczenia na Ukrainie w 2019 r. tą metodą przetworzono 170 substratów, z których 56% dało nicienie, z których żaden nie był Caenorhabditis. Ta metoda działa, ponieważ nicienie pływają przez chusteczkę.Ale podłoże i inne zwierzęta pozostają na wierzchu. Wiele aspektów protokołu można modyfikować, aby wykorzystać wszelkie zasoby dostępne w terenie. Próbki zebrane przy użyciu tej metody pozwalają naukowcom odpowiedzieć na szeroki wachlarz pytań z zakresu biologii populacji w ustalonych kulturach do późniejszych badań laboratoryjnych.

rapid-isolation-of-wild-nematodes-by-baermann-funnel

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Aby zbadać mutualizm między bakteriami Xenorhabdus a nicieniami Steinernema, opracowano metody monitorowania obecności i lokalizacji bakterii wewnątrz nicieni. Podejście eksperymentalne, które można zastosować w innych systemach, polega na zmodyfikowaniu bakterii w celu ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego oraz wizualizacji bakterii wewnątrz przezroczystego nicienia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Wizualizacja bakterii w nicieniach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Źródło: Morgan, E. i in. Selektywne oczyszczanie dzikich nicieni Caenorhabditis w celu wzbogacenia bakterii mikrobiomu jelitowego. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje protokół izolowania interesujących bakterii jelitowych od dzikich robaków Caenorhabditis . Robaki są najpierw głodzone i myte, aby wyeliminować pozostałości bakterii żerujących z ich powierzchni i światła jelit, jednocześnie zachowując docelowe mikroorganizmy. Po oczyszczeniu powierzchni i kilku etapach pełzania robaki są...

Selektywne oczyszczanie robaków wywołanych chorobą piersiową w celu wzbogacenia mikrobioty jelitowej

Dzikie zwierzęta są często pasożytowane przez szeroki zakres robaków. Cztery główne typy robaków to "glisty" (nicienie), "robaki o kolczastych głowach" (acanthocephalans), "przywry" (przywry) i "tasiemce" (tasiemce). Tutaj opisujemy, w jaki sposób robaki są zbierane od kręgowców oraz jak są one zachowywane i identyfikowane taksonomicznie.

Zbieranie i identyfikacja robaków od dzikich zwierząt

Nicienie entomopatogeniczne to glisty zamieszkujące glebę, które pasożytują na szerokiej gamie owadów.  Pokazujemy metody pobierania próbek stosowane do izolacji tych nicieni z gleby przy użyciu dwóch technik: przynęty na owady i zmodyfikowanej białej pułapki, do odzyskiwania nicieni odpowiednio z próbek gleby i zakażonych zwłok owadów.

Pobieranie próbek z gleby i izolacja nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Celem tej prezentacji jest zademonstrowanie in vivo i in vitro technik hodowli nicieni entomopatogenicznych. Metody in vivo uwzględniają hodowlę tych nicieni z owadem żywicielem, podczas gdy metody in vitro wykorzystują bogate podłoża agarowe.

Hodowla in vivo i in vitro nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae i Heterorhabditidae)

Heligmosomoides polygyrus to mysi nicień o potężnych zdolnościach immunomodulacyjnych, które są bardzo podobne do tych z bardzo rozpowszechnionej infekcji ludzkim robakiem pasożytniczym. W tym miejscu opisujemy protokół długoterminowego utrzymania cyklu życiowego H. polygyrus.

Hodowla Heligmosomoides polygyrus: immunomodulującego pasożyta nicieni i wydzielanych przez niego produktów

Przedstawiono protokół badania zachowań godowych nicienia sosnowego, Bursaphelenchus xylophilus. Cechy behawioralne B. xylophilus są opisane w procesie krycia.

Obserwacja i kwantyfikacja zachowań godowych nicieni sosnówki, Bursaphelenchus xylophilus

Dzikie nicienie Caenorhabditis są związane z wieloma drobnoustrojami, często w świetle jelit lub infekującymi jelita. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę wzbogacania niekulturowych drobnoustrojów kolonizujących jelito, wykorzystując odporność naskórka dauer.

Selektywne czyszczenie dzikich nicieni Caenorhabditis w celu wzbogacenia o bakterie mikrobiomu jelitowego

Funkcjonalny zestaw narzędzi genomicznych dla pasożytniczych nicieni Strongyloides stercoralis i Strongyloides ratti obejmuje transgenezę, mutagenezę za pośrednictwem CRISPR/Cas9 oraz RNAi. Protokół ten pokaże, jak wykorzystać mikroiniekcje dogonadalne do wprowadzenia transgenów i składników CRISPR do S. stercoralis i S. ratti.

Generowanie transgeników i nokautów u gatunków Strongyloides za pomocą mikroiniekcji

Ten protokół może być używany do przeprowadzania badań ekologicznych na dużą skalę nicieni Caenorhabditis. Podstawową zaletą tej metody jest sprawna organizacja i analiza danych ekologicznych i molekularnych związanych z nicieniami zebranymi z natury.

Wysoce skalowalne podejście do przeprowadzania badań ekologicznych nicieni Caenorhabditis

Caenorhabditis elegans jest jednym z głównych gatunków modelowych w biologii, jednak prawie wszystkie badania są prowadzone pod nieobecność naturalnie związanych z nim mikrobów. Opisane tutaj metody pomogą lepiej zrozumieć różnorodność powiązanych mikroorganizmów jako podstawę przyszłych badań funkcjonalnych nad C. elegans.

Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans

Naucz się szybkiej izolacji dzikich nicieni z próbek terenowych za pomocą lejka Baermanna. Ta metoda pozwala badać geny i genomy Caenorhabditis w naturalnym kontekście ekologicznym.

Szybka izolacja dzikich nicieni za pomocą lejka Baermanna

Przeglądaj więcej filmów