Name: Czasoprzestrzenna subkomórkowa manipulacja cytoszkieletu mikrotubul w żywym zarodku myszy przed implantacją za pomocą fotostatyn (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Poznaj metodę manipulacji cytoszkieletem mikrotubul w żywych zarodkach myszy przed implantacją za pomocą fotostatyn. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę czasoprzestrzenną dynamiki mikrotubul przy użyciu światła.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Oliverowi Thorn-Sesholdowi i Li Gao za dostarczenie nam fotostatyn i porad dotyczących przygotowania rękopisu, Monash Production za wsparcie w filmowaniu oraz Monash Micro Imaging za wsparcie mikroskopowe.
Ta praca była wspierana przez projekt National Health and Medical Research Council (NHMRC) grant APP2002507 dla J.Z. oraz Kanadyjski Instytut Badań Zaawansowanych (CIFAR) Stypendium Azrieli dla J.Z. Australijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej jest wspierany przez dotacje rządu stanowego Wiktorii i rządu australijskiego.

Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Zwierząt Uniwersytetu Monash pod numerem etycznym 19143. Zwierzęta były utrzymywane w warunkach wolnych od określonych patogenów w jednostce zwierzęcej (Monash Animal Research Platform) w ścisłej zgodności z wytycznymi etycznymi.
1. Pobieranie mysich embrionów przedimplantacyjnych
<ol>
	<li>Przeprowadzić superowulację i kopulację myszy zgodnie z wcześniejszym opisem16,18, zgodnie z instytucyjnymi wytycznymi dotyczącymi etyki badań na zwierzętach. 
	UWAGA: Najczęściej stosowanymi szczepami do pobierania żywych zarodków są myszy C57BL/6 lub FVB/N. Wszystkie przedstawione tutaj dane zostały uzyskane z wykorzystaniem myszy FVB/N.</li>
	<li>Rano, dzień po kopulacji, wypłukać zygoty z jajowodów przy użyciu medium M2 zgodnie z opisem20 lub medium Human Tubal Fluid (HTF). Korzystając z aparatu do pipetowania ustnego zgodnie z opisem21,22, przenieść zygoty do świeżych kropel medium Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM), uprzednio ogrzanych do 37 °C i równoważonych z 5% CO2, w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm, przykrytym odpowiednią objętością oleju mineralnego w celu zapewnienia pokrycia mediów.</li>
	<li>Wykonać mikroiniekcję zygot zgodnie z opisem20 za pomocą cRNA kodującego marker końca plus mikrotubul znakowany czerwonym fluorescencyjnie. W tym przypadku zastosowano cRNA dla białka End Binding protein 3 (EB3)-dTomato w stężeniu 30 ng/µL po przygotowaniu i oczyszczeniu zgodnie z opisem16,18 oraz rozcieńczeniu w buforze do mikroiniekcji. 
	UWAGA: Zaleca się przygotowanie cRNA z wyprzedzeniem i przechowywanie go w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Hodować zarodki w ciemności w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do momentu osiągnięcia przez zarodki pożądanego stopnia rozwoju do traktowania PST-1P. 
	UWAGA: Kompleksowe źródło informacji o czasach hodowli wymaganych dla różnych stadiów embrionalnych znajduje się w23. W przypadku zastosowanych tutaj zarodków w stadium 16 komórek, hodować do 3. dnia embrionalnego (E3) po zapłodnieniu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie leku i szalki do obrazowania
UWAGA: W krokach od 2.1 do 2.10 należy pracować wyłącznie w ciemności lub przy świetle czerwonym, aby uniknąć niezamierzonej aktywacji PST-1P. Wszystkie probówki i szalki zawierające PST należy osłonić folią aluminiową lub ciemnymi pokrywami.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór zapasowy PST-1P o stężeniu 50 mM w wodzie ultrapurej. 
	UWAGA: Masa cząsteczkowa PST-1P wynosi 440 g/mol. Roztwór zapasowy jest stabilny w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku. PST-1P rozpuszcza się w wodzie lub buforze wodnym, ale nie rozpuszcza się łatwo w DMSO.</li>
	<li>Na podstawie kroku 2.1 przygotować pośrednie stężenie robocze PST-1P o wartości 800 µM w wodzie ultrapurej.</li>
	<li>Rozcieńczyć PST-1P do stężenia końcowego 40 µM w świeżym KSOM. Ponieważ typowy eksperyment wymaga około 20 µL KSOM z dodatkiem PST-1P, należy rozcieńczyć 1 µL PST-1P o stężeniu 800 µM w 19 µL KSOM, aby uzyskać objętość końcową 20 µL i zapewnić wcześniejsze przygotowanie wystarczającej ilości medium, korzystając wyłącznie z czerwonego światła w celu zapewnienia widoczności. 
	UWAGA: Zarówno stężenie, jak i stan aktywacji rozcieńczenia PST-1P można sprawdzić, wykonując widmo absorbancji UV-Vis za pomocą spektrofotometru, co powinno zostać przeprowadzone podczas etapu ustalania procedury. Absorbancja przy 380 nm (A380) dla rozcieńczenia 40 µM w formie całkowicie trans w kuwecie 1 cm powinna wynosić około 0,8. Zarówno formy cis, jak i trans mają taką samą absorbancję przy 455 nm (A455). Gdy stosunek A380 do A455 wynosi około 9:1, rozcieńczenie jest nieaktywne (całkowicie trans). Gdy stosunek A380:A455 wynosi 1:2, rozcieńczenie jest w pełni aktywowane (całkowicie cis). Stosunki pośrednie odzwierciedlają pośrednie stany aktywacji.</li>
	<li>Aby przygotować szkiełko z komorą do obrazowania żywych komórek, nalać pipetą 10 µL KSOM z dodatkiem PST-1P do środka jednej z dołek, tworząc kroplę hemisferyczną (Rysunek 1A).</li>
	<li>Ostrożnie dodać odpowiednią ilość oleju mineralnego, aby przykryć kroplę, dbając o to, by nie doprowadzić do rozproszenia medium. Zapobiegnie to odparowaniu kropli.</li>
	<li>Podgrzać wstępnie i zrównoważyć pod względem CO2 szkiełko z komorą w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 przez minimum 3 h lub maksymalnie przez noc.</li>
	<li>Po zakończeniu okresu równoważenia w kroku 2.6 przygotować 35-milimetrową płytkę hodowlaną z 10 µL kroplą wstępnie podgrzanego i zrównoważonego KSOM z dodatkiem PST-1P jako etap płukania. Nie przykrywać olejem.</li>
	<li>Przenieść embriony za pomocą pipetowania ustnego do kropli KSOM z dodatkiem PST-1P z kroku 2.7. 
	UWAGA: Kroki 2.7 i 2.8 są zalecane przy pipetowaniu ustnym embrionów, ale są opcjonalne.</li>
	<li>Natychmiast przenieść embriony za pomocą pipetowania ustnego do środka kropli KSOM z dodatkiem PST-1P w szkiełku z komorą do obrazowania przygotowanym w krokach 2.4-2.6 (Rysunek 1A).</li>
	<li>Inkubować embriony w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 w KSOM z dodatkiem PST-1P w szkiełku z komorą do obrazowania przez co najmniej 1 h przed obrazowaniem. Jeśli to możliwe, zamocować szkiełko z komorą na mikroskopie wewnątrz komory środowiskowej w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2, w całkowitej ciemności, aby zapewnić, że wszystkie cząsteczki PST-1P znajdują się w nieaktywnej konfiguracji trans i że embriony mogą opaść na dno naczynia.</li>
</ol>
3. Obrazowanie na żywo i fotoaktywacja PST-1P
UWAGA: Kroki od 3.1 do 3.13 wykonuje się na konfokalnym mikroskopie skaningowym z laserem, wyposażonym w detektory fotodiod lawinowych (APDs) oraz ciemną komorę środowiskową. Instrukcje te odnoszą się konkretnie do konfiguracji obrazowania z wykorzystaniem oprogramowania akwizycyjnego opisanego w Tabeli Materiałów; można je jednak zastosować również do innych systemów mikroskopii konfokalnej.
<ol>
	<li>Przygotować obiektyw imersyjny wodno-olejowy 63x/1,2 NA z zalecanym medium imersyjnym.</li>
	<li>Używając czerwonej latarki do naprowadzania, przesunąć obiektyw tak, aby zetknął się z medium imersyjnym. Na tym etapie należy unikać używania światła białego lub jasnego pola do poszukiwania embrionów, ponieważ mogłoby to doprowadzić do przedwczesnej aktywacji PST-1P.</li>
	<li>Korzystając z okularu i przy oświetleniu czerwonym, zlokalizować krawędź kropli medium i ustawić obiektyw bezpośrednio nad tym obszarem. Może to pomóc użytkownikowi w ustaleniu orientacji i znalezieniu płaszczyzny ogniskowania.</li>
	<li>Następnie, przez okular lub w trybie skanowania na żywo w oprogramowaniu, użyć filtra o długości fali czerwonej lub lasera 561 nm, aby zlokalizować embriony wewnątrz kropli.</li>
	<li>Użyć sterowników stolika i trybu skanowania na żywo, aby ustawić punkty początkowy i końcowy dla akwizycji stosu z (z-stack) całego embrionu.</li>
	<li>Dostosować ustawienia mocy lasera (zazwyczaj w przypadku bardzo czułych detektorów, takich jak APD, wystarczająca jest moc lasera 561 nm poniżej 5%), offset cyfrowy (zazwyczaj na poziomie -0,900) w celu optymalizacji obrazu komet EB3-dTomato i minimalizacji szumu tła, przysłonę (pinhole) na 2 µm, rozdzielczość pikseli 512 x 512 oraz czas przebywania piksela (pixel dwell time) 3,15 µs.</li>
	<li>Wykonać akwizycję stosu z całego embrionu z interwałami sekcji 1 µm, aby ocenić obszary wzrostu mikrotubul w całym organizmie (Rycina 1B).</li>
	<li>Użyć obrazu 3D z kroku 3.7 do zidentyfikowania obszarów zainteresowania (ROI) dla eksperymentów śledzenia EB3-dTomato. Zwiększyć powiększenie do 3x i wyrysować prostokątny obszar ROI wokół konkretnego obszaru subkomórkowego.</li>
	<li>Nagrać film time-lapse z pojedynczej płaszczyzny z wykorzystaniem typowych wartości parametrów obrazowania: moc lasera 561 nm na poziomie 5%, offset cyfrowy -0,900, rozdzielczość pikseli 512 x 512, przysłona 3 µm, czas przebywania piksela 3,15 µs, powiększenie 3x, interwał czasowy 500 ms. 
	UWAGA: 120 klatek czasowych zapewni film śledzący o długości 1 min, co powinno być wystarczające do analizy danych. Akwizycję można kontynuować dłużej, pod warunkiem, że wyblaknięcie fluoroforu jest minimalne (Rycina 1C).</li>
	<li>Aby aktywować PST-1P, przełączyć na laser 405 nm i nagrać kolejny film time-lapse z mocą lasera 405 nm ustawioną na 10%, rozdzielczością pikseli 512 x 512, maksymalnie otwartą przysłoną, czasem przebywania piksela 3,15 µs, powiększeniem 3x, interwałem czasowym 500 ms i łącznie 20 klatkami (Rycina 1D).</li>
	<li>Przełączyć z powrotem na laser 561 nm i powtórzyć akwizycję zgodnie z krokiem 3.9, aby potwierdzić zanik komet EB3-dTomato po aktywacji PST-1P (Rycina 1E). Należy upewnić się, że akwizycja ta odbywa się jak najszybciej po aktywacji. 
	UWAGA: Krok 3.10 można powtarzać w celu dłuższego hamowania komet EB3-dTomato. Należy jednak uważnie monitorować embriony, aby uniknąć uszkodzeń spowodowanych światłem UV.</li>
	<li>Aby przywrócić PST-1P do nieaktywnego stanu trans, użyć lasera 514 nm przy mocy 10%. Nagrać film time-lapse z mocą lasera 514 nm ustawioną na 10%, rozdzielczością pikseli 512 x 512, maksymalnie otwartą przysłoną, czasem przebywania piksela 3,15 µs, powiększeniem 3x, interwałem czasowym 500 ms i łącznie 20 klatkami czasowymi (Rycina 1F).</li>
	<li>Powtórzyć krok 3.11, aby zwizualizować powrót komet EB3-dTomato (Rycina 1G).</li>
</ol>
4. Analiza danych obrazowych
<ol>
	<li>Do analizy i ilościowego określenia hamowania polimeryzacji mikrotubul przez PST należy wykorzystać programy komputerowe dostępne dla badaczy, dopasowane do ich konkretnych potrzeb. Zalecane programy powinny posiadać narzędzie do śledzenia, które umożliwia ręczne lub automatyczne śledzenie ruchu, kierunku i prędkości komet EB3-dTomato16,18.</li>
</ol>
<img alt="Schemat aktywacji/dezaktywacji PST-1P przy użyciu laserów; śledzenie komet EB3-dTomato; konfiguracja mikroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63290/63290fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie fotoaktywacji i dezaktywacji PST-1P w żywym 3D zarodku myszy w okresie przedimplantacyjnym. Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane w całkowitej ciemności (czarne tło) lub wyłącznie przy oświetleniu czerwonym światłem. (A) Żywe zarodki myszy w okresie przedimplantacyjnym wykazujące ekspresję EB3-dTomato są hodowane do stadium 16 komórek, a następnie przenoszone do kropli medium KSOM zawierającego 40 µM PST-1P na szkiełku z komorą obrazową. (B) Obraz 3D całego zarodka umożliwia ocenę wzrostu mikrotubul poprzez wizualizację rozkładu komet EB3-dTomato. (C) Aby rozpocząć eksperyment, komety EB3-dTomato są śledzone w regionie subkomórkowym przy użyciu obrazowania poklatkowego. (D) Następująca fotoaktywacja PST-1P w tym samym regionie subkomórkowym przy użyciu lasera 405 nm skutkuje zanikiem komet EB3-dTomato (E). W razie potrzeby można zastosować intensywniejszą aktywację PST-1P poprzez sekwencyjne naświetlanie światłem 405 nm. (F-G) Aby przywrócić PST-1P do stanu nieaktywnego i odnowić komety EB3-dTomato, do tego samego regionu subkomórkowego przykładany jest laser 514 nm. Jeśli jest to wymagane, można przeprowadzić wielokrotne cykle fotoaktywacji i dezaktywacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63290/63290fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<ol><li>Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-dependent+subcellular+organisation+of+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells.</a> Development. 148 (20), (2021).</li>
<li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-organizing+centers%3A+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).</li>
<li>Galli, M., Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+size+determines+the+strength+of+the+spindle+assembly+checkpoint+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell size determines the strength of the spindle assembly checkpoint during embryonic development.</a> Developmental Cell. 36 (3), 344-352 (2016).</li>
<li>Vazquez-Diez, C., Paim, L. M. G., FitzHarris, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-size-independent+spindle+checkpoint+failure+underlies+chromosome+segregation+error+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-size-independent spindle checkpoint failure underlies chromosome segregation error in mouse embryos.</a> Current Biology. 29 (5), 865-873 (2019).</li>
<li>Baudoin, J. P., Alvarez, C., Gaspar, P., Metin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nocodazole-induced+changes+in+microtubule+dynamics+impair+the+morphology+and+directionality+of+migrating+medial+ganglionic+eminence+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nocodazole-induced changes in microtubule dynamics impair the morphology and directionality of migrating medial ganglionic eminence cells.</a> Developmental Neuroscience. 30 (1-3), 132-143 (2008).</li>
<li>Munz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+lose+their+functional+properties+after+paclitaxel+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 312(2018).</li>
<li>Jordan, M. A., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+as+a+target+for+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microtubules as a target for anticancer drugs.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).</li>
<li>Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomolar+concentrations+of+nocodazole+alter+microtubule+dynamic+instability+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro.</a> Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).</li>
<li>Borowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoswitchable+inhibitors+of+microtubule+dynamics+optically+control+mitosis+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Photoswitchable inhibitors of microtubule dynamics optically control mitosis and cell death.</a> Cell. 162 (2), 403-411 (2015).</li>
<li>Gaspari, R., Prota, A. E., Bargsten, K., Cavalli, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+cis-+and+trans-Combretastatin+binding+to+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22Chem%22%5BJournal%5D)">Structural basis of cis- and trans-Combretastatin binding to tubulin.</a> Chem. 2 (1), 102-113 (2017).</li>
<li>Thorn-Seshold, O., Meiring, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocontrolling+microtubule+dynamics+with+photoswitchable+chemical+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22ChemRxiv%22%5BJournal%5D)">Photocontrolling microtubule dynamics with photoswitchable chemical reagents.</a> ChemRxiv. , (2021).</li>
<li>Kopf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+control+cellular+shape+and+coherence+in+amoeboid+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubules control cellular shape and coherence in amoeboid migrating cells.</a> Journal of Cell Biology. 219 (6), 201907154(2020).</li>
<li>Sawada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PlexinD1+signaling+controls+morphological+changes+and+migration+termination+in+newborn+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">PlexinD1 signaling controls morphological changes and migration termination in newborn neurons.</a> The EMBO Journal. 37 (4), 97404(2018).</li>
<li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+microtubule+dynamics+directs+cell+mechanics+and+coordinates+forces+during+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Polarized microtubule dynamics directs cell mechanics and coordinates forces during epithelial morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 20 (10), 1126-1133 (2018).</li>
<li>Kepiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azidoblebbistatin%2C+a+photoreactive+myosin+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Azidoblebbistatin, a photoreactive myosin inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (24), 9402-9407 (2012).</li>
<li>Zenker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microtubule-organizing+center+directing+intracellular+transport+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo.</a> Science. 357 (6354), 925-928 (2017).</li>
<li>White, M. D., Zenker, J., Bissiere, S., Plachta, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instructions+for+assembling+the+early+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Instructions for assembling the early mammalian embryo.</a> Developmental Cell. 45 (6), 667-679 (2018).</li>
<li>Zenker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+actin+rings+zipper+the+mouse+embryo+for+blastocyst+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expanding actin rings zipper the mouse embryo for blastocyst formation.</a> Cell. 173 (3), 776-791 (2018).</li>
<li>Theisen, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+and+motor+proteins+support+zebrafish+neuronal+migration+by+directing+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubules and motor proteins support zebrafish neuronal migration by directing cargo.</a> Journal of Cell Biology. 219 (10), 201908040(2020).</li>
<li>Rulicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pronuclear+microinjection+of+mouse+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pronuclear microinjection of mouse zygotes.</a> Methods in Molecular Biology. 254, 165-194 (2004).</li>
<li>Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+culture+of+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro culture of mouse oocytes.</a> Bio-protocol. 11 (15), 4104(2021).</li>
<li>Subramanian, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocytes+mount+a+noncanonical+DNA+damage+response+involving+APC-Cdh1-mediated+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Oocytes mount a noncanonical DNA damage response involving APC-Cdh1-mediated proteolysis.</a> Journal of Cell Biology. 219 (4), 201907213(2020).</li>
<li>Mihajlovic, A. I., Bruce, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+cell-fate+decision+of+mouse+preimplantation+embryo+development%3A+integrating+cell+position+and+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">The first cell-fate decision of mouse preimplantation embryo development: integrating cell position and polarity.</a> Open Biology. 7 (11), 170210(2017).</li>
<li>Roostalu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+speed+of+GTP+hydrolysis+determines+GTP+cap+size+and+controls+microtubule+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The speed of GTP hydrolysis determines GTP cap size and controls microtubule stability.</a> Elife. 9, 51992(2020).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photocontrol+of+microtubule+dynamics+and+integrity%2C+migration+and+mitosis%2C+by+the+potent+GFP-imaging-compatible+photoswitchable+reagents+SBTubA4P+and+SBTub2M%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv.+bioRxiv%22%5BJournal%5D)">In vivo photocontrol of microtubule dynamics and integrity, migration and mitosis, by the potent GFP-imaging-compatible photoswitchable reagents SBTubA4P and SBTub2M.</a> BioRxiv. bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Tichy, A. M., Gerrard, E. J., Legrand, J. M. D., Hobbs, R. M., Janovjak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+strategy+and+vector+library+for+the+rapid+generation+of+modular+light-controlled+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineering strategy and vector library for the rapid generation of modular light-controlled protein-protein interactions.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3046-3055 (2019).</li>
<li>van Haren, J., Adachi, L. S., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of microtubule dynamics.</a> Methods in Molecular Biology. 2101, 211-234 (2020).</li>
<li>Adikes, R. C., Hallett, R. A., Saway, B. F., Kuhlman, B., Slep, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+microtubule+dynamics+using+an+optogenetic+microtubule+plus+end-F-actin+cross-linker%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of microtubule dynamics using an optogenetic microtubule plus end-F-actin cross-linker.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 779-793 (2018).</li>
<li>Kogler, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+rapid+and+reversible+optogenetic+perturbation+of+nuclear+proteins+in+living+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos.</a> Developmental Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).</li>
<li>Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+of+the+microtubule+cytoskeleton%3A+setting+up+and+working+with+an+ablation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: setting up and working with an ablation system.</a> Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).</li>
<li>Bukhari, S. N. A., Kumar, G. B., Revankar, H. M., Qin, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+combretastatins+as+potent+tubulin+polymerization+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of combretastatins as potent tubulin polymerization inhibitors.</a> Bioorganic Chemistry. 72, 130-147 (2017).</li>
<li>Gilazieva, Z., Ponomarev, A., Rutland, C., Rizvanov, A., Solovyeva, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promising+applications+of+tumor+spheroids+and+organoids+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Promising applications of tumor spheroids and organoids for personalized medicine.</a> Cancers (Basel). 12 (10), 2727(2020).</li>
<li>Scherer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+and+uptake+of+the+anticancer+drug+combretastatin+in+cell+spheroids+and+photoisomerization+in+gels+with+multiphoton+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging and uptake of the anticancer drug combretastatin in cell spheroids and photoisomerization in gels with multiphoton excitation.</a> Journal of Biomedical Optics. 20 (7), 78003(2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak interesów konkurencyjnych lub finansowych.

Sieć mikrotubul jest integralną częścią podstawowych wewnętrznych funkcji komórki. W związku z tym stanowi to wyzwanie w manipulowaniu dynamiką mikrotubul w organizmach żywych, ponieważ wszelkie zakłócenia w sieci mają zwykle rozległe konsekwencje dla wszystkich aspektów funkcji komórkowych. Pojawienie się fotoprzełączalnych związków ukierunkowanych na mikrotubule stanowi sposób na precyzyjne manipulowanie cytoszkieletem na poziomie subkomórkowym, z doskonałą kontrolą indukcji i odwrócenia zahamowania wzrostu mikrotubul<...

Architektura mikrotubul różni się znacznie w zależności od typu komórek, aby wspierać różne funkcje1,2. Jego dynamiczna natura wzrostu i kurczenia się pozwala na szybką adaptację do sygnałów zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych oraz reagowanie na stale zmieniające się potrzeby komórki. W związku z tym można go uznać za "morfologiczny odcisk palca" odgrywający kluczową rolę w tożsamości komórkowej.
Farmakologiczne celowanie w cytoszkielet mikrotubul za pomocą inhibitorów małych cząsteczek doprowadziło do mnóstwa fundamentalnych odkryć w biologii rozwojowej, biologii komórek macierzystych, biologii nowotworów i neurobiologii3,4,5,6,7. Podejście to, choć niezbędne, wiąże się z różnymi ograniczeniami, takimi jak toksyczność i skutki niezamierzone. Na przykład jeden z najczęściej stosowanych środków ukierunkowanych na mikrotubule, nokodazol, jest silnym lekiem depolimeryzującym mikrotubule8. Jednak inhibitory małocząsteczkowe, takie jak nokodazol, są aktywne od momentu aplikacji, a biorąc pod uwagę zasadniczy charakter cytoszkieletu mikrotubul dla wielu krytycznych funkcji komórkowych, globalna depolimeryzacja mikrotubul może powodować efekty niezgodne z celem, które mogą być nieodpowiednie dla wielu zastosowań. Dodatkowo, leczenie nokodazolem jest nieodwracalne, chyba że próbki zostaną wypłukane z leku, co uniemożliwi ciągłe obrazowanie na żywo, a tym samym precyzyjne śledzenie poszczególnych włókien mikrotubul.
Rozwój związków aktywowanych światłem rozpoczął się od stworzenia fotoklatkowych cząsteczek i zwiastował nową erę w celowaniu i monitorowaniu efektów hamowania wzrostu mikrotubul w sposób precyzyjny i kontrolowany czasowo. Jedna rodzina odwracalnie fotoprzełączalnych leków, fotostatyny (PST), została opracowana przez zastąpienie składnika stilbenu komretastatyny A-4 azobenzenem9. PST są nieaktywne do momentu oświetlenia światłem UV, przy czym nieaktywna konfiguracja trans przekształca się w aktywną konfigurację cis przez odwracalną izomeryzację. Cis-PST hamują polimeryzację mikrotubul poprzez wiązanie się z miejscem wiązania kolchicyny β-tubuliny, blokując jej interfejs z β-tubuliną i zapobiegając dimeryzacji wymaganej do wzrostu mikrotubul10. W kohorcie PST PST-1P pojawił się jako związek wiodący, ponieważ ma najwyższą moc, jest w pełni rozpuszczalny w wodzie i wykazuje szybki początek bioaktywności po naświetleniu.
Najbardziej efektywna izomeryzacja trans- do cis-izomeryzacji PST występuje przy długościach fal między 360-420 nm, co umożliwia podwójne opcje aktywacji PST. Linia laserowa o długości fali 405 nm w typowym mikroskopie konfokalnym może być podawana w celu optymalnego ukierunkowania przestrzennego na zahamowanie wzrostu mikrotubul. Możliwość precyzyjnego określenia miejsca i czasu aktywacji PST za pomocą oświetlenia laserowego 405 nm ułatwia precyzyjną kontrolę czasową i przestrzenną, umożliwiając zakłócenie dynamiki mikrotubul na poziomie subkomórkowym, w czasie reakcji poniżej sekundy9. Alternatywnie, niedrogie światło LED UV pozwala na oświetlenie całego organizmu w celu wywołania zakłócenia architektury mikrotubul w całym organizmie. Może to być opłacalna alternatywa dla badaczy, dla których celem jest precyzyjnie określony początek hamowania, a nie celowanie przestrzenne. Kolejną cechą PST jest ich inaktywacja na żądanie poprzez zastosowanie zielonego światła o długości fali w zakresie 510-540 nm9. Umożliwia to śledzenie włókien mikrotubul przed, w trakcie i po zahamowaniu wzrostu za pośrednictwem PST.
PST, choć wciąż stosunkowo nowym projektem, były używane w licznych zastosowaniach in vitro w różnych dziedzinach badań11, w tym badając nowe mechanizmy migracji komórek u ameboidów12, w neuronach wyizolowanych z mózgu nowonarodzonego myszy13, oraz rozwój nabłonka skrzydeł u Drosophila melanogaster14. Inne leki reagujące na światło okazały się cennymi narzędziami w ukierunkowanym zaburzeniu funkcji komórkowych. Na przykład, analog blebbistatyny, azydoblebbistatyna, został użyty do zwiększonego hamowania miozyny w oświetleniu15,16. Podkreśla to potencjał nowych odkryć dzięki zdolności do kontrolowanego czasowo hamowania funkcji komórkowych.
Żywe organizmy 3D prezentują doskonałe, ale bardziej delikatne systemy do manipulowania dynamiką mikrotubul na poziomie całego zwierzęcia, pojedynczej komórki lub subkomórki w warunkach fizjologicznych. W szczególności preimplantacyjny zarodek myszy oferuje wyjątkowy wgląd w wewnętrzne funkcjonowanie komórki, a także relacje międzykomórkowe w organizmie17. Ukierunkowane czasowo i przestrzennie następujące po sobie cykle aktywacji i dezaktywacji PST przyczyniły się do scharakteryzowania mostka interfazowego, postcytokinetycznej struktury między komórkami, jako niecentrycznego centrum organizującego mikrotubule w preimplantacyjnym zarodku myszy16. Podobny układ eksperymentalny wykazał udział rosnących mikrotubul w uszczelnianiu zarodka myszy, aby umożliwić tworzenie blastocysty18. Co więcej, PST wykorzystano również w całych zarodkach danio pręgowanego do zbadania migracji komórek neuronalnych poprzez hamowanie wzrostu mikrotubul w podzbiorze komórek w tyłomózgowiu19.
Ten protokół opisuje eksperymentalną konfigurację i użycie PST-1P w preimplantacyjnym zarodku myszy. Przedstawione tutaj instrukcje mogą również pomóc w zastosowaniu PST do szerokiego zakresu celów, takich jak badanie segregacji chromosomów i podziału komórek, transport ładunku wewnątrzkomórkowego oraz morfogeneza i migracja komórek. Co więcej, takie badania pomogą we wdrożeniu PST w układach organoidowych, blastoidach i innych modelach zarodków, takich jak Caenorhabditis elegans i Xenopus laevis, a także potencjalnie rozszerzą zastosowanie PST w technologiach zapłodnienia in vitro.

<table><tbody><tr><td>Rurka aspiratora</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td>Do aparatu do aspiracji jamy ustnej</td></tr><tr><td>Szkiełka komorowe - LabTek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NUN155411</td><td></td></tr><tr><td>kodowanie cRNA dla EB3-dPomidor</td><td>Nr dotyczy</td><td></td><td>Przygotowane zgodnie z instrukcją producenta przy użyciu zestawu do transkrypcji mMessage in vitro Naczynia</td></tr><tr><td>do hodowli - 35mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150560</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki hormon wzrostu kosmówki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8554</td><td></td></tr><tr><td>Płyn jajowodowy (HTF) medium</td><td>Cosmo-Bio</td><td>CSR-R-B071</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil W 2010</td><td>Carl Zeiss</td><td>444969-0000-000</td><td>Do użytku z obiektywem zanurzeniowym</td></tr><tr><td>LED do mikroskopu - czerwone światło</td><td>Celestron</td><td>93588</td><td></td></tr><tr><td>M2 średni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Myszy - typ dziki FVB/N, samce i samice</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Samice w wieku 8-9 tygodni. Samce w wieku 2-6 miesięcy.</td></tr><tr><td>Pipety mikrokapilarne - Kimble</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z543306</td><td>Do aparatury do aspiracji jamy ustnej</td></tr><tr><td>Bufor do mikroiniekcji</td><td>N/A</td><td>N/D</td><td>5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,4</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Origio</td><td>ART-4008-5P</td><td></td></tr><tr><td>mMessage Zestaw do transkrypcji in vitro Zestaw do transkrypcji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Spektrofotometr</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium Simplex Optimized Medium (KSOM)</td><td>medium Cosmo-Bio</td><td>CSR-R-B074</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotropina surowicy klaczy</td><td>ciężarnych Prospec Bio</td><td>HOR-272</td><td></td></tr><tr><td>PST-1P</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Borowiak, M. et al., Fotoprzełączalne inhibitory dynamiki mikrotubul optycznie kontrolują mitozę i śmierć komórki. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania RNA</td><td>Sangon</td><td>B511361-0100</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysta woda</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W1503</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Black Software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

czasoprzestrzenna subkomórkowa manipulacja cytoszkieletu mikrotubul w żywym zarodku myszy przed implantacją za pomocą fotostatyn

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

Cytoszkielet mikrotubul tworzy szkielet komórki i ma fundamentalne znaczenie dla transportu wewnątrzkomórkowego, podziału komórki i transdukcji sygnału. Tradycyjne farmakologiczne zakłócenie wszechobecnej sieci mikrotubul za pomocą np. nokodazolu może mieć katastrofalne konsekwencje dla każdej komórki. Odwracalnie fotoprzełączalne inhibitory mikrotubul mają potencjał, aby przezwyciężyć ograniczenia, umożliwiając realizację efektów działania leków w sposób kontrolowany czasowo. Jedną z takich rodzin leków są fotostatyny na bazie azobenzenu (PST). Związki te są nieaktywne w ciemnych warunkach, a po naświetleniu światłem UV wiążą się z miejscem wiązania kolchicyny β-tubuliny i blokują polimeryzację mikrotubul oraz dynamiczny obrót. W tym przypadku zastosowanie PST w trójwymiarowym (3D) żywym zarodku myszy preimplantacyjnej ma na celu zakłócenie sieci mikrotubul na poziomie subkomórkowym. Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące konfiguracji eksperymentalnej, a także parametry aktywacji i dezaktywacji światła dla PST przy użyciu mikroskopii konfokalnej z żywymi komórkami. Zapewnia to powtarzalność i umożliwia innym zastosowanie tej procedury do swoich pytań badawczych. Innowacyjne fotoprzełączniki, takie jak PST, mogą ewoluować jako potężne narzędzia do pogłębiania wiedzy na temat dynamicznej wewnątrzkomórkowej sieci mikrotubul i nieinwazyjnego manipulowania cytoszkieletem w czasie rzeczywistym. Ponadto PST mogą okazać się przydatne w innych strukturach 3D, takich jak organoidy, blastoidy lub zarodki innych gatunków.

Zgodnie z protokołem, do zarodków myszy przed implantacją wstrzyknięto metodą mikroiniekcji cRNA dla EB3, oznakowane czerwonym fluorescencyjnym białkiem dTomato (EB3-dTomato). Umożliwia to wizualizację rosnących mikrotubul, ponieważ EB3 wiąże się z polimeryzującymi końcami plus mikrotubul24.
Doświadczenia przeprowadzono 3 dni po zapłodnieniu (E3), gdy zarodek myszy składa się z 16 komórek. W zależności od badanej kwestii naukowej można wykorzystać dowolny inny przedimpl...

Typowe inhibitory mikrotubul, szeroko stosowane w badaniach podstawowych i stosowanych, mają dalekosiężny wpływ na komórki. Ostatnio fotostatyny pojawiły się jako klasa fotoprzełączalnych inhibitorów mikrotubul, zdolnych do natychmiastowej, odwracalnej, czasoprzestrzennie precyzyjnej manipulacji mikrotubulami. Ten protokół krok po kroku szczegółowo opisuje zastosowanie fotostatyn w żywym zarodku myszy preimplantacyjnej 3D.

Czasoprzestrzenna subkomórkowa manipulacja cytoszkieletu mikrotubul w żywym zarodku myszy przed implantacją za pomocą fotostatyn

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. ...

Protokół ten jest pierwszym w swoim rodzaju, w którym stosuje się fotostatyny na żywym zarodku myszy przed implantacją i dotyczy zastosowań leków przełączanych światłem na innych systemach fizjologicznych 3D. Fotostatyny przełączane światłem umożliwiają manipulowanie wzrostem mikrotubul w przestrzeni i czasie oraz konwersję z powrotem do stanu wyłączenia. Niezamierzone wystawienie fotostatyn na działanie niebieskiego światła przed eksperymentem może je przedwcześnie aktywować.Dlatego zalecamy pracę w całkowitej ciemności lub w warunkach czerwonego światła przez cały czas przygotowywania próbek. W ściśle ciemnych warunkach, używając tylko czerwonego światła do oświetlenia, rozpocznij wytwarzanie zapasu i pośredniego roztworu roboczego PST-1P w ultraczystej wodzie. Zgodnie z opisem w rękopisie tekstu.Następnie rozcieńczyć PST-1P w świeżym KSOM, aby osiągnąć końcowe stężenie 40 M.To przygotować szkiełko komory do obrazowania na żywo, dodać 10 l KSOM poddanego działaniu PST-1P do środka jednej studzienki, aby utworzyć półkulistą kroplę. Aby zapobiec odparowaniu kropli, przykryj ją odpowiednią ilością oleju mineralnego. Następnie luźno zawiń przygotowaną szalkę hodowlaną w folię lub umieść naczynie hodowlane w niehermetycznym nieprzezroczystym pojemniku w inkubatorze, aby zapewnić brak ekspozycji na światło.Po przeniesieniu zarodków do kropli KSOM potraktowanej PST-1P, upewnij się, że zarodki są skupione w środku kropli i osadzone na dnie naczynia. Po przygotowaniu soczewki obiektywu zanurzeniowego zamontuj szkiełko komory na mikroskopie, w komorze środowiskowej. Ustaw w temperaturze 37 C i 5% CO2 i w całkowitej ciemności, aby upewnić się, że wszystkie PST-1P są w nieaktywnej konfiguracji trans i że zarodki mogą opaść na dno naczynia.Użyj latarki z czerwonym światłem, aby ustawić soczewkę obiektywu w kontakcie z medium zanurzeniowym. Następnie zlokalizuj krawędź kropli podłoża i umieść obiektyw bezpośrednio nad nią. Korzystając z trybu skanowania na żywo i lasera o długości fali 561 nm, zlokalizuj zarodki w kropelce.Użyj kontrolerów etapów i trybu skanowania na żywo, aby ustawić punkt początkowy i końcowy do uzyskania stosu Z całego zarodka. Dostosuj ustawienia mocy lasera do maksymalnie 5% zgodnie z sygnałem. I ustaw cyfrowe przesunięcie na maksimum 0,900, w zależności od sygnału, aby zoptymalizować wygląd komet EB3-dTomato.Zminimalizuj hałas w tle. Ustaw otwór na 2 m. Rozdzielczość pikseli 512 na 512.A czas przebywania pikseli wynosi 3,15 s. I ustaw powiększenie na 2x. Pobrać z-stos całego zarodka w odstępach między sekcjami 1 m, aby ocenić obszary wzrostu mikrotubul w całym organizmie.W przypadku eksperymentów ze śledzeniem komet EB3-dTomato otwórz obraz 3D z-stack, zwiększ powiększenie do trzech razy. I narysuj prostokątny ROI wokół określonego subkomórkowego obszaru zainteresowania. Następnie pobierz film poklatkowy pojedynczej płaszczyzny z, korzystając z ustawionych parametrów, w odstępie czasu 500 ms.Aby aktywować PST-1P, przełącz się na laser 405 nm i uzyskaj kolejny film poklatkowy, z laserem ustawionym na 10% mocy, maksymalnie otwartym otworkiem, rozdzielczością pikseli 512 na 512, czasem przebywania pikseli 3,15 s, trzykrotnym zoomem, w odstępie czasu 500 ms i ustawieniem 20 klatek do pobrania. Natychmiast po aktywacji przełącz się z powrotem na laser 561 nm i powtórz akwizycję, jak pokazano wcześniej, aby potwierdzić utratę komet EB3-dTomato po aktywacji PST-1P. Teraz, aby odwrócić PST-1P z powrotem do nieaktywnego stanu trans-stanu, włącz laser 514 nm i uzyskaj kolejny film poklatkowy z ustawionymi parametrami.Aby zobrazować regenerację komet EB3-dTomato, przełącz się z powrotem na laser o długości fali 561 nm i powtórz akwizycję. W nieleczonych zarodkach kontrolnych, przed oświetleniem laserem o długości fali 405 nm, sygnał EB3-dTomato był wysoki w całej cytoplazmie komórki, z wyjątkiem obszaru jądrowego. Po naświetleniu nie wykryto zmian w sygnale.Wskazuje to, że laser o długości fali 405 nm nie spowodował fotouszkodzenia zarodka ani dynamiki mikrotubul. Podczas leczenia PST-1P zarodków w stadium 16-komórkowym, w ściśle ciemnych warunkach, wykryto silną ekspresję EB3-dTomato w obrazie 3D, wykazując, że nieaktywny PST-1P nie powodował hamowania polimeryzacji mikrotubul w ciemnych warunkach. Przed aktywacją PST-1P obrazowanie poklatkowe pojedynczej płaszczyzny z potwierdziło silną ekspresję EB3-dTomato i polimeryzację mikrotubul w regionie subkomórkowym.Po aktywacji światła o długości fali 405 nm, w ciągu kilku sekund, wykryto zmniejszenie sygnału komety EB3-dTomato. Odzyskanie sygnału osiągnięto po dezaktywacji PST-1P przy użyciu lasera o długości fali 514 nm. Zarodki, którym wstrzyknięto mikro EB3-dTomato i inkubowano z PST-1P, wykazywały normalny potencjał embrionalny, rozwijając się do stadium blastocysty.I normalna dynamika mikrotubul podczas mitozy. Wskazujące na nietoksyczność aktywnego PST-1P dla zarodka. Na pozyskanych filmach poklatkowych etykietowanie EB3-dTomato wyglądało jak struktury podobne do komet i umożliwiło śledzenie rosnących włókien mikrotubul.W zarodkach traktowanych PST-1P, trzymanych w ciemnych warunkach, pojedyncze komety EB3-dTomato emanowały z mostka międzyfazowego, który działa jako niecentrosomalne centrum organizacyjne mikrotubul we wczesnym zarodku myszy. Stos t pokazuje komety EB3-dTomato w rejonie mostka międzyfazowego. Po aktywacji PST-1P, komety EB3-dTomato zostały zredukowane u podstawy mostka międzyfazowego i w stosie t.Pamiętaj, że białe światło może przedwcześnie aktywować PST-1P. Dlatego używaj tylko czerwonych źródeł światła, aby zapewnić widoczność. Zielone światło dezaktywuje również PST-1P, dlatego należy unikać używania zielonych znaczników fluorescencyjnych.Technika ta została zastosowana u drosophila, ameby, myszy i wielu systemów in vitro, aby ukierunkować wzrost mikrotubul w celu zbadania migracji komórek i tworzenia tkanek.

spatiotemporal-subcellular-manipulation-microtubule-cytoskeleton

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikroiniekcji i obrazowania o wysokiej rozdzielczości w zarodku syncytialnym Drosophila melanogaster w celu badania mitozy.

Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w embrionie syncytialnym Drosophila melanogaster

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Demonstrujemy metodę szczepienia hodowanych komórek w określone miejsca wczesnych embrionów myszy, aby określić ich potencjał in vivo. Wprowadzamy również zoptymalizowaną metodę elektroporacji, która wykorzystuje szklane naczynia włosowate o znanej średnicy, co pozwala na precyzyjne dostarczenie egzogennego DNA do kilku komórek w zarodkach.

Metody precyzyjnie zlokalizowanego transferu komórek lub DNA do wczesnych zarodków myszy po implantacji

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Celem tego protokołu jest opisanie metody funkcji utraty i zysku, która ma zastosowanie do identyfikacji neogeniny jako specyficznego dla etapu receptora, który prowadzi do trofektodermy i różnicowania wewnętrznej masy komórkowej w preimplantacyjnych zarodkach myszy.

Podejście oparte na utracie i wzmocnieniu funkcji w celu zbadania determinantów wczesnego losu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Ten artykuł ma na celu pokazanie użycia partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych jako substytutu plemników do budowy półklonowanych embrionów.

Zastosowanie partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych myszy jako substytutu plemników

Tutaj dostępny jest zoptymalizowany protokół krok po kroku do utrwalania, barwienia immunologicznego i sekcji zarodków w celu wykrycia wyspecjalizowanych filopodiów sygnałowych zwanych cytonemami w rozwijających się tkankach myszy.

Utrwalanie zarodkowej tkanki myszy do analizy cytonemu

Przedstawiono zoptymalizowany protokół, który umożliwia wyczerpanie cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy podczas metafazy I za pomocą lasera femtosekundowego bliskiej podczerwieni.

Wielofotonowa ablacja laserowa cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy

Tutaj opisujemy metodę efektywnego manipulowania krytycznymi ścieżkami rozwojowymi w łożysku myszy in vivo. Odbywa się to poprzez wstrzyknięcie i elektroporację plazmidów CRISPR do łożysk ciężarnych matek w 12,5 dniu embrionalnym.

Mysz In Vivo Ukierunkowana manipulacja CRISPR

Poznaj metodę manipulacji cytoszkieletem mikrotubul w żywych zarodkach myszy przed implantacją za pomocą fotostatyn. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę czasoprzestrzenną dynamiki mikrotubul przy użyciu światła.

Czasoprzestrzenna subkomórkowa manipulacja cytoszkieletu mikrotubul w żywym zarodku myszy przed implantacją za pomocą fotostatyn (Wideo) | JoVE Journal

Czasoprzestrzenna subkomórkowa manipulacja cytoszkieletu mikrotubul w żywym zarodku myszy przed implantacją za pomocą fotostatyn

Przeglądaj więcej filmów