Czasoprzestrzenna subkomórkowa manipulacja cytoszkieletu mikrotubul w żywym zarodku myszy przed implantacją za pomocą fotostatyn
30 listopada 2021
Typowe inhibitory mikrotubul, szeroko stosowane w badaniach podstawowych i stosowanych, mają dalekosiężny wpływ na komórki. Ostatnio fotostatyny pojawiły się jako klasa fotoprzełączalnych inhibitorów mikrotubul, zdolnych do natychmiastowej, odwracalnej, czasoprzestrzennie precyzyjnej manipulacji mikrotubulami. Ten protokół krok po kroku szczegółowo opisuje zastosowanie fotostatyn w żywym zarodku myszy preimplantacyjnej 3D.
Protokół ten jest pierwszym w swoim rodzaju, w którym stosuje się fotostatyny na żywym zarodku myszy przed implantacją i dotyczy zastosowań leków przełączanych światłem na innych systemach fizjologicznych 3D. Fotostatyny przełączane światłem umożliwiają manipulowanie wzrostem mikrotubul w przestrzeni i czasie oraz konwersję z powrotem do stanu wyłączenia. Niezamierzone wystawienie fotostatyn na działanie niebieskiego światła przed eksperymentem może je przedwcześnie aktywować.
Dlatego zalecamy pracę w całkowitej ciemności lub w warunkach czerwonego światła przez cały czas przygotowywania próbek. W ściśle ciemnych warunkach, używając tylko czerwonego światła do oświetlenia, rozpocznij wytwarzanie zapasu i pośredniego roztworu roboczego PST-1P w ultraczystej wodzie. Zgodnie z opisem w rękopisie tekstu.
Następnie rozcieńczyć PST-1P w świeżym KSOM, aby osiągnąć końcowe stężenie 40 M.To przygotować szkiełko komory do obrazowania na żywo, dodać 10 l KSOM poddanego działaniu PST-1P do środka jednej studzienki, aby utworzyć półkulistą kroplę. Aby zapobiec odparowaniu kropli, przykryj ją odpowiednią ilością oleju mineralnego. Następnie luźno zawiń przygotowaną szalkę hodowlaną w folię lub umieść naczynie hodowlane w niehermetycznym nieprzezroczystym pojemniku w inkubatorze, aby zapewnić brak ekspozycji na światło.
Po przeniesieniu zarodków do kropli KSOM potraktowanej PST-1P, upewnij się, że zarodki są skupione w środku kropli i osadzone na dnie naczynia. Po przygotowaniu soczewki obiektywu zanurzeniowego zamontuj szkiełko komory na mikroskopie, w komorze środowiskowej. Ustaw w temperaturze 37 C i 5% CO2 i w całkowitej ciemności, aby upewnić się, że wszystkie PST-1P są w nieaktywnej konfiguracji trans i że zarodki mogą opaść na dno naczynia.
Użyj latarki z czerwonym światłem, aby ustawić soczewkę obiektywu w kontakcie z medium zanurzeniowym. Następnie zlokalizuj krawędź kropli podłoża i umieść obiektyw bezpośrednio nad nią. Korzystając z trybu skanowania na żywo i lasera o długości fali 561 nm, zlokalizuj zarodki w kropelce.
Użyj kontrolerów etapów i trybu skanowania na żywo, aby ustawić punkt początkowy i końcowy do uzyskania stosu Z całego zarodka. Dostosuj ustawienia mocy lasera do maksymalnie 5% zgodnie z sygnałem. I ustaw cyfrowe przesunięcie na maksimum 0,900, w zależności od sygnału, aby zoptymalizować wygląd komet EB3-dTomato.
Zminimalizuj hałas w tle. Ustaw otwór na 2 m. Rozdzielczość pikseli 512 na 512.
A czas przebywania pikseli wynosi 3,15 s. I ustaw powiększenie na 2x. Pobrać z-stos całego zarodka w odstępach między sekcjami 1 m, aby ocenić obszary wzrostu mikrotubul w całym organizmie.
W przypadku eksperymentów ze śledzeniem komet EB3-dTomato otwórz obraz 3D z-stack, zwiększ powiększenie do trzech razy. I narysuj prostokątny ROI wokół określonego subkomórkowego obszaru zainteresowania. Następnie pobierz film poklatkowy pojedynczej płaszczyzny z, korzystając z ustawionych parametrów, w odstępie czasu 500 ms.
Aby aktywować PST-1P, przełącz się na laser 405 nm i uzyskaj kolejny film poklatkowy, z laserem ustawionym na 10% mocy, maksymalnie otwartym otworkiem, rozdzielczością pikseli 512 na 512, czasem przebywania pikseli 3,15 s, trzykrotnym zoomem, w odstępie czasu 500 ms i ustawieniem 20 klatek do pobrania. Natychmiast po aktywacji przełącz się z powrotem na laser 561 nm i powtórz akwizycję, jak pokazano wcześniej, aby potwierdzić utratę komet EB3-dTomato po aktywacji PST-1P. Teraz, aby odwrócić PST-1P z powrotem do nieaktywnego stanu trans-stanu, włącz laser 514 nm i uzyskaj kolejny film poklatkowy z ustawionymi parametrami.
Aby zobrazować regenerację komet EB3-dTomato, przełącz się z powrotem na laser o długości fali 561 nm i powtórz akwizycję. W nieleczonych zarodkach kontrolnych, przed oświetleniem laserem o długości fali 405 nm, sygnał EB3-dTomato był wysoki w całej cytoplazmie komórki, z wyjątkiem obszaru jądrowego. Po naświetleniu nie wykryto zmian w sygnale.
Wskazuje to, że laser o długości fali 405 nm nie spowodował fotouszkodzenia zarodka ani dynamiki mikrotubul. Podczas leczenia PST-1P zarodków w stadium 16-komórkowym, w ściśle ciemnych warunkach, wykryto silną ekspresję EB3-dTomato w obrazie 3D, wykazując, że nieaktywny PST-1P nie powodował hamowania polimeryzacji mikrotubul w ciemnych warunkach. Przed aktywacją PST-1P obrazowanie poklatkowe pojedynczej płaszczyzny z potwierdziło silną ekspresję EB3-dTomato i polimeryzację mikrotubul w regionie subkomórkowym.
Po aktywacji światła o długości fali 405 nm, w ciągu kilku sekund, wykryto zmniejszenie sygnału komety EB3-dTomato. Odzyskanie sygnału osiągnięto po dezaktywacji PST-1P przy użyciu lasera o długości fali 514 nm. Zarodki, którym wstrzyknięto mikro EB3-dTomato i inkubowano z PST-1P, wykazywały normalny potencjał embrionalny, rozwijając się do stadium blastocysty.
I normalna dynamika mikrotubul podczas mitozy. Wskazujące na nietoksyczność aktywnego PST-1P dla zarodka. Na pozyskanych filmach poklatkowych etykietowanie EB3-dTomato wyglądało jak struktury podobne do komet i umożliwiło śledzenie rosnących włókien mikrotubul.
W zarodkach traktowanych PST-1P, trzymanych w ciemnych warunkach, pojedyncze komety EB3-dTomato emanowały z mostka międzyfazowego, który działa jako niecentrosomalne centrum organizacyjne mikrotubul we wczesnym zarodku myszy. Stos t pokazuje komety EB3-dTomato w rejonie mostka międzyfazowego. Po aktywacji PST-1P, komety EB3-dTomato zostały zredukowane u podstawy mostka międzyfazowego i w stosie t.
Pamiętaj, że białe światło może przedwcześnie aktywować PST-1P. Dlatego używaj tylko czerwonych źródeł światła, aby zapewnić widoczność. Zielone światło dezaktywuje również PST-1P, dlatego należy unikać używania zielonych znaczników fluorescencyjnych.
Technika ta została zastosowana u drosophila, ameby, myszy i wielu systemów in vitro, aby ukierunkować wzrost mikrotubul w celu zbadania migracji komórek i tworzenia tkanek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół wprowadza zastosowanie fotostatyn do manipulowania mikrotubulami w żywych embrionach myszy w okresie przedimplantacyjnym. Podkreślono w nim znaczenie warunków oświetlenia podczas przygotowywania próbek, aby zapobiec przedwczesnej aktywacji fotostatyn.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia rozwoju
Wprowadzenie
- Inhibitory mikrotubul są szeroko stosowane w badaniach.
- Fotostatyny stanowią nową klasę fotoprzewłączalnych inhibitorów mikrotubul.
- Umożliwiają one precyzyjną przestrzenną i czasową kontrolę dynamiki mikrotubul.
- Zastosowanie w fizjologicznych systemach 3D jest nowatorskim podejściem.
Cel badania
- Zastosowanie fotostatyn w żywych embrionach myszy w stadium przedimplantacyjnym.
- Zbadanie manipulacji wzrostem mikrotubul przy użyciu leków aktywowanych światłem.
- Opracowanie protokołów stosowania fotostatyn w warunkach ciemności.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworów zapasowych i pracujących PST-1P w wodzie ultrapurej.
- Przeprowadzanie eksperymentów w całkowitej ciemności lub przy świetle czerwonym.
- Zastosowanie fotostatyń przełączalnych światłem do manipulowania mikrotubulami.
- Monitorowanie wpływu ekspozycji na światło na aktywację fotostatyń.
Główne wyniki
- Skuteczna manipulacja dynamiką mikrotubul w żywych embrionach.
- Wykazanie znaczenia warunków oświetleniowych w eksperymentach.
- Opracowanie nowego protokołu stosowania fotostatyn w systemach 3D.
- Przedstawienie spostrzeżeń na temat odwracalnej kontroli wzrostu mikrotubul.
Wnioski
- Fotostatyny są skuteczne w precyzyjnej manipulacji mikrotubulami.
- Praca w warunkach ciemności jest kluczowa dla sukcesu eksperymentu.
- Metoda ta otwiera nowe możliwości badania dynamiki mikrotubul w różnych kontekstach biologicznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Precyzyjna kontrola czasoprzestrzenna dynamiki mikrotubul umożliwia mechaniczną weryfikację ryzyka na wczesnym etapie walidacji celu poprzez izolację wkładu cytoszkieletu w fenotypy komórkowe. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w badaniach przesiewowych fenotypowych, umożliwiając odwracalną perturbację podkomórkową bez wywoływania globalnej cytotoksyczności. Zastosowanie tej metody w fizjologicznych systemach 3D, takich jak embriony, zwiększa znaczenie translacyjne w procesie weryfikacji ryzyka dla związków wiodących celujących w szlaki cytoszkieletowe.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów zależnych od mikrotubul w testach fenotypowych poprzez sterowaną światłem, odwracalną inhibicję.
- Wartość operacyjna: Dostarcza nietoksycznego, fotoprzełączalnego narzędzia do walidacji celów subkomórkowych w żywych modelach 3D.
- Wartość prognostyczna: Wspiera testowanie hipotez poprzez izolację zmiennych cytoszkieletowych w złożonych kontekstach biologicznych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Ułatwia przygotowanie standaryzowanych, kontrolowanych pod kątem ekspozycji na światło systemów perturbacji mikrotubul w celu zapewnienia powtarzalności screeningu związków.
- Wartość operacyjna: Umożliwia przygotowanie testu dzięki postępowaniu w warunkach ciemności oraz precyzyjnym parametrom aktywacji światłem.
- Skalowalność: Pozwala na ponowne wykorzystanie platformy w modelach 3D, takich jak organoidy i blastoidy, do badań nad oddziaływaniem z celami cytoszkieletowymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Demonstracja manipulacji cytoszkieletem istotnej dla przebiegu choroby w embrionach ssaków, co potwierdza poprawność modelu przedklinicznego.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie ciągłości od etapu odkryć do badań przedklinicznych poprzez odwracalną, nieniszczącą modulację mikrotubul.
- Łagodzenie ryzyka: Potwierdzenie nietoksyczności aktywnych fotostatyn w rozwijających się embrionach, co zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w profilowaniu bezpieczeństwa.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z biologią odkrywczą w celu testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych, umożliwia opracowywanie testów dla celów cytoszkieletowych oraz wspiera badania translacyjne poprzez odwracalną manipulację mikrotubulami w systemach 3D.
- Biologia odkrywcza: Wspiera minimalizowanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie precyzyjnego, odwracalnego badania dynamiki mikrotubul w żywych embrionach.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację testów dzięki zdefiniowanym protokołom aktywacji/dezaktywacji światłem oraz targetowaniu obszarów zainteresowania (ROI) w obrębie komórki.
- Analityka: Zapewnia ilościowe wyniki poprzez śledzenie komet EB3-dTomato w celu pomiaru dynamiki polimeryzacji mikrotubul.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez wykazanie formowania blastocysty i prawidłowej mitozy po zastosowaniu procedury.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Pozycjonuje fotostatyny jako platformę z przełącznikiem optycznym do wielokrotnego wykorzystania w walidacji celów cytoszkieletowych w trójwymiarowych systemach fizjologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu dzięki odwracalnemu, czasowo-przestrzennemu zaburzeniu mikrotubul.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność poprzez rygorystyczne przestrzeganie warunków oświetlenia oraz określone parametry laserowe.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez ograniczenie efektów poza celowych w obrębie cytoszkieletu podczas przesiewu fenotypowego.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja celów cytoszkieletowych skorygowana o ryzyko, z wykorzystaniem nietoksycznej, odwracalnej modulacji w modelach opartych na embrionach.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w zakresie konfokalnej mikroskopii żywych komórek oraz pracy z związkami fotoprzełączalnymi.
- Wymagane są systemy laserowe umożliwiające pracę na długościach fal 405 nm (aktywacja), 514 nm (dezaktywacja) i 561 nm (obrazowanie).
- Konieczna jest standaryzacja protokołów ekspozycji na światło pomiędzy zespołami w celu zapobieżenia przedwczesnej aktywacji PST-1P.
- Wymagane są dostosowania dotyczące znakowania EB3-dTomato lub równoważnych reporterów śledzących koniec plus mikrotubul.
- Należy uwzględnić ograniczenia praktyczne, takie jak unikanie światła zielonego oraz znaczników fluorescencyjnych, które mogą dezaktywować fotostatyny.
