Indukcja zapalenia jelit przez adoptywny transfer transgenicznych limfocytów T CD4 + CBir1 TCR do myszy z niedoborem odporności
16 grudnia 2021
W tym protokole opisany jest model adoptywnego transferowego zapalenia jelita grubego dla antygenu mikrobioty jelitowej z limfocytów T. Limfocyty T CD4 + izoluje się od myszy transgenicznych CBir1 TCR. Są one specyficzne dla immunodominującego antygenu mikrobioty jelitowej CBir1 flageliny, który jest przenoszony do myszy biorcy Rag1-/-, prowadząc do zapalenia jelit.
Nieswoiste zapalenie jelit (IBD) stanowi znaczne obciążenie zdrowotne i finansowe dla jednostek i społeczeństwa. Ten model zapalenia jelita grubego jest pomocny w badaniu mechanizmów IBD i ocenie leczenia IBD. Ten immunodominujący model adoptywnego transferowego zapalenia jelita grubego swoistego dla limfocytów T flageliny Cbir zapewnia wgląd w to, w jaki sposób antygen bakterii jelitowych indukuje odpowiedzi komórek T w celu wywołania zapalenia jelita grubego.
Po eutanazji myszy wykonaj około jednocentymetrowe nacięcie lewej części brzucha i odciągnij skórę od tkanki mięśniowej brzucha. Następnie wykonaj około trzycentymetrowe nacięcie w tkance mięśniowej brzucha. Następnie usuń śledzionę sterylnymi nożyczkami i kleszczami.
Umieść śledzionę w naczyniu hodowlanym zawierającym pięć mililitrów wstępnie schłodzonego buforu do mycia. Zmiel śledzionę szorstką powierzchnią dwóch sterylnych szkiełek podstawowych. Przenieś zawiesinę komórek do 50-mililitrowej probówki wirówkowej, przepuszczając ją przez sitko do komórek o średnicy 100 mikrometrów.
Przepłukać szkiełka szklane i naczynie hodowlane pięcioma mililitrami wstępnie schłodzonego buforu do przemywania i przenieść bufor myjący do probówki. Odwirować zawiesinę komórkową, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą pięciu mililitrów wstępnie podgrzanego buforu do lizy chlorku tris-amonu na śledzionę. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Dodaj 10 mililitrów wstępnie schłodzonego buforu myjącego do probówki. Następnie odwirować zawiesinę komórkową, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 10 mililitrów wstępnie schłodzonego buforu izolacyjnego. Aby policzyć komórki, dokładnie wymieszaj po 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej i błękitu trypanowego, a następnie załaduj 10 mikrolitrów na szkiełko.
Następnie włóż szkiełko do automatycznego licznika komórek, aby uzyskać żywy numer komórki. Odwirować pozostałą zawiesinę komórkową i odrzucić cały supernatant. Odwiruj cząsteczki magnetyczne CD4 przeciwko myszy, bezpośrednio dodaj 50 mikrolitrów cząstek na 10 milionów komórek i dokładnie wymieszaj z granulkami komórek.
Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść zawiesinę cząstek komórek do sterylnej probówki zbiorczej. Dodaj 3,5 mililitra wstępnie schłodzonego buforu izolacyjnego do probówki.
Umieść probówkę na magnesie do separacji komórek na osiem minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie odessać supernatant za pomocą trzymililitrowej pipety transferowej. Wyjmij rurkę z magnesu do separacji komórek.
Następnie ponownie zawieś ogniwa za pomocą 3,5 mililitra wstępnie schłodzonego bufora izolacyjnego i umieść rurkę na magnesie na cztery minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odessać supernatant za pomocą trzymililitrowej pipety. Na koniec ponownie zawieś ogniwa w jednym mililitrze wstępnie schłodzonego bufora FACS.
Aby przenieść komórki do myszy biorcy, ponownie zawieś transgeniczne, nieuszkodzone wcześniej CD4-dodatnie limfocyty T Cbir1 TCR do 5 milionów komórek na mililitr w 1x PBS. Ogrzej myszy pod lampą grzewczą i skrępuj myszy za pomocą ogranicznika dla myszy. Dożylnie wstrzyknąć 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do żyły ogonowej myszy.
Po eutanazji myszy wykonaj około jednocentymetrowe brzuszne nacięcie skóry w linii środkowej. Odciągnij skórę od tkanki mięśniowej brzucha. Następnie wykonaj trzycentymetrowe nacięcie w tkance mięśniowej brzucha.
Następnie zidentyfikuj kokum i usuń całą okrężnicę sterylnymi nożyczkami i kleszczami. Zwilż okrężnicę wstępnie schłodzonym PBS w naczyniu hodowlanym. Naciąć okrężnicę wzdłuż i opłukać ją wstępnie schłodzonym PBS.
Wytnij 1/3 okrężnicy wzdłuż. Umieść pasek okrężnicy w ręczniku papierowym stroną świetlną skierowaną do góry. Wykonaj zwijanie po szwajcarsku za pomocą wykałaczki.
Umieść okrężnicę Swiss w kasecie i włóż kasetę do 10% buforowanej formaliny na 24 godziny. Odwodnić i zatopić parafinę w okrężnicy za pomocą automatycznego procesora. Następnie wytnij pięciomikrometrowe skrawki tkanek na mikrotomie.
Zamontuj tkankę na szkiełkach i wykonaj barwienie hematoksyliną i eozyną. Myszy z nokautem Rag zaczęły tracić na wadze około trzech tygodni po przeniesieniu komórek, a ich waga osiągnęła około 80 do 85% ich pierwotnej wagi sześć tygodni po przeniesieniu komórek. Myszy biorcy wykazywały krótką długość okrężnicy sześć tygodni po transferze komórek.
Myszy biorcy wykazywały większą infiltrację komórek w blaszce właściwej jelita cztery tygodnie po transferze komórek. Wykazali utratę komórek kubkowych i przerost komórek nabłonka jelitowego pięć tygodni po transferze komórek, a także erozję błony śluzowej i naciek komórek zapalnych w błonie podśluzowej okrężnicy sześć tygodni po transferze komórek. Wyniki histopatologiczne znacznie wzrosły od czterech do sześciu tygodni.
Jednocześnie nie stwierdzono stanu zapalnego u myszy z nokautem Rag otrzymujących sam PBS. Korzystając z tej procedury, poziomy cytokin w okrężnicy można określić za pomocą ELISA i qPCR.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje model zapalenia jelita grubego indukowanego przez adopcyjny transfer limfocytów T swoistych dla antygenu mikrobioty jelitowej. Limfocyty T CD4+ od transgenicznych myszy CBir1 TCR są przenoszone do myszy Rag1 -/-, co indukuje stan zapalny jelit.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Gastrologia
Wprowadzenie
- Nieswoiste zapalenia jelit (IBD) stanowią istotne wyzwanie dla zdrowia publicznego.
- Niniejszy model pomaga w zrozumieniu mechanizmów IBD.
- Służy on do oceny potencjalnych metod leczenia IBD.
- Dostarcza on informacji na temat odpowiedzi limfocytów T na bakterie jelitowe.
Cel badania
- Opracowanie modelu do badania nieswoistych zapaleń jelit (IBD).
- Zbadanie odpowiedzi limfocytów T na antygeny mikrobioty jelitowej.
- Ocena interwencji terapeutycznych w nieswoistych zapaleniach jelit (IBD).
Zastosowane metody
- Izolacja limfocytów T CD4+ z myszy transgenicznych.
- Adoptywny transfer limfocytów T do myszy biorców.
- Indukcja stanu zapalnego jelit.
- Procedury chirurgiczne w celu analizy tkanek.
Główne wyniki
- Skuteczne wywołanie zapalenia jelit u myszy biorców.
- Charakterystyka odpowiedzi limfocytów T na antygeny mikrobioty.
- Wgląd w rolę bakterii jelitowych w nieswoistych zapaleniach jelit (IBD).
- Potencjał do oceny strategii terapeutycznych.
Wnioski
- Model ten stanowi platformę do badań nad IBD.
- Umożliwia on lepsze zrozumienie odpowiedzi immunologicznych na antygeny jelitowe.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać ten model do oceny skuteczności leczenia.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten model transferu limfocytów T swoistych dla antygenu umożliwia mechaniczną analizę odpowiedzi immunologicznych indukowanych przez mikrobiotę jelitową w nieswoistych zapaleniach jelit, wspierając walidację celów terapeutycznych oraz przedkliniczną redukcję ryzyka. Poprzez odtworzenie fenotypów limfocytów T istotnych dla ludzi oraz progresji histopatologicznej, stanowi on system prognostyczny do oceny leków immunomodulujących. Model ten wspiera wczesne etapy procesów badawczych skoncentrowanych na wyjaśnianiu szlaków sygnałowych i potwierdzaniu celów w patogenezie IBD.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie flagelliny CBir1 jako istotnego terapeutycznie antygenu mikrobioty jelitowej w patogenezie IBD.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zdefiniowany system specyficzny dla antygenu do izolacji i walidacji mechanizmów zapalenia jelit zależnych od limfocytów T.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność co do wyboru celu poprzez powiązanie konkretnych antygenów mikrobiologicznych z patogennymi odpowiedziami limfocytów T in vivo.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych odczytów histopatologicznych i komórkowych do oceny wpływu związków na zapalenie jelita grubego.
- Wartość operacyjna: Umożliwia stworzenie powtarzalnego fenotypu zapalenia jelita grubego z mierzalną utratą masy ciała, skróceniem jelita grubego i infiltracją immunologiczną w celu standaryzacji testów.
- Wartość strategiczna: Umożliwia przesiewowe badanie immunomodulatorów z wykorzystaniem klinicznie istotnych punktów końcowych, takich jak nadżerki błony śluzowej i profile cytokin.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Odzwierciedla kluczowe cechy histopatologiczne ludzkich nieswoistych zapaleń jelit (IBD), w tym zanik komórek kubkowych, hiperplazję nabłonka i zapalenie submukozy.
- Wartość operacyjna: Umożliwia długofalowy monitoring ciężkości choroby poprzez śledzenie masy ciała, długości okrężnicy oraz ocenę histologiczną w celu dopasowania parametrów farmakokinetycznych i farmakodynamicznych.
- Wartość strategiczna: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o ocenę ryzyka dzięki modelowaniu przewlekłego zapalenia jelita grubego indukowanego przez limfocyty T, istotnego dla patofizjologii choroby Crohna.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Model ten integruje się z procesami badawczymi od etapu odkrycia do badań przedklinicznych, stanowiąc pomost mechanistyczny między aktywacją limfocytów T specyficznych dla antygenu a patologią na poziomie tkankowym, co umożliwia testowanie hipotez i optymalizację wiodących związków w terapii IBD.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez dotyczących antygenów mikrobioty jelitowej oraz specyficzności receptorów limfocytów T w indukowaniu stanu zapalnego jelit.
- Przesiewy: Dostarcza ustandaryzowanych, ilościowych wyników, w tym wyników histopatologicznych i poziomów cytokin, do oceny związków.
- Analityka: Umożliwia pomiar poziomów cytokin w okrężnicy za pomocą testów ELISA i qPCR w celu skorelowania aktywacji immunologicznej z odpowiedzią terapeutyczną.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy limfocytów T myszy z mechanizmami IBD istotnymi dla ludzi poprzez antygenowo specyficzną patologię immunologiczną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do iteracyjnego testowania kandydatów immunomodulujących celujących w szlaki limfocytów T zależne od antygenów.
Wpływ operacyjny i instytucjonalny
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celów poprzez indukcję colitis za pomocą antygenowo swoistych limfocytów T.
- Wartość operacyjna: Standaryzowane protokoły indukcji i oceny zapewniają powtarzalność w różnych laboratoriach i badaniach.
- Wartość strategiczna: Redukcja ryzyka biologicznego poprzez walidację celów w fizjologicznie istotnym modelu zapalenia napędzanego antygenowo.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez powiązanie modulacji celu z wynikami histopatologicznymi i klinicznymi.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w izolacji limfocytów T, sortowaniu magnetycznym oraz technikach transferu adoptywnego.
- Zależność od dostępu do myszy transgenicznych CBir1 TCR oraz biorców z niedoborem Rag1 w celu zapewnienia wiarygodności modelu.
- Wymaga standaryzowanej oceny histologicznej i obróbki tkanek w celu spójnej oceny stanu zapalnego.
- Obejmuje procedury chirurgiczne i perfuzję, które wymagają zachowania zasad aseptyki oraz precyzji anatomicznej.
- Ograniczone do badań mechanistycznych odpowiedzi swoistej antygenowo; nie modeluje samoistnie złożoności mikrobiomu ani dysfunkcji bariery.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Isolation and Transfer of Splenic CBir1 TCR Tg CD4+ T Cells
4:39
Colon Collection and Histopathological Scoring
6:03
Results: Morphological and Histopathological Features of the Adoptive Transfer Colitis Model
7:11
Conclusion
