Name: Hodowla limfocytów w symulowanej mikrograwitacji przy użyciu rotacyjnego systemu hodowli komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Poznaj hodowlę limfocytów w symulowanej mikrograwitacji przy użyciu rotacyjnego systemu hodowli komórek. Ta metoda pozwala badać zachowanie komórek immunologicznych w warunkach mikrograwitacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Kanadyjską Agencję Kosmiczną (CSA), grant badawczy (17ILSRA3, Immuno Profile). Autorzy pragną podziękować dr Roxanne Fournier (University of Toronto), dr Randal Gregg (Lincoln Memorial University) i Preteesh Mylabathula (University of Arizona) za ich pomoc we wstępnym rozwiązywaniu problemów z tym protokołem.

<ol><li>ElGindi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((May+the+force+be+with+you+%28or+not%29%3A+the+immune+system+under+microgravity%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">May the force be with you (or not): the immune system under microgravity.</a> Cells. 10 (8), 1941(2021).</li>
<li>Choukèr, A., Ullrich, O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChouk%C3%A8r%2C+A+%22The+Immune+System+in+Space%3A+Are+we+Prepared%22">The Immune System in Space: Are we Prepared</a>. , Springer International Publishing. Cham. (2016).</li>
<li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+system+dysregulation+during+spaceflight%3A+potential+countermeasures+for+deep+space+exploration+missions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1437(2018).</li>
<li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Countermeasures-based+improvements+in+stress%2C+immune+system+dysregulation+and+latent+herpesvirus+reactivation+onboard+the+International+Space+Station+-+relevance+for+deep+space+missions+and+terrestrial+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+%26+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station - relevance for deep space missions and terrestrial medicine.</a> Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).</li>
<li>Herranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ground-based+facilities+for+simulation+of+microgravity%3A+organism-specific+recommendations+for+their+use%2C+and+recommended+terminology%5BTitle%5D)+AND+%22Astrobiology%22%5BJournal%5D)">Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology.</a> Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).</li>
<li>Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitations+of+current+microgravity+platforms+for+space+biology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research.</a> Applied Sciences. 11 (1), 68(2020).</li>
<li>Murphy, K., Weaver, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurphy%2C+K+%22Janeway%27s+Immunobiology+9th+Edition%22">Janeway's Immunobiology 9th Edition</a>. , Garland Science/Taylor & Francis Group LLC. New York, NY. (2016).</li>
<li>Dedolph, R. R., Dipert, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physical+basis+of+gravity+stimulus+nullification+by+clinostat+rotation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation.</a> Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).</li>
<li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+suspension+culture%3A+the+rotating-wall+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).</li>
<li>Crabbé, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+proteomic+responses+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+to+spaceflight+conditions+involve+Hfq+regulation+and+reveal+a+role+for+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).</li>
<li>Ulbrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+simulated+and+real+microgravity+on+bone+cells+and+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells.</a> BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).</li>
<li>Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spaceflight+and+simulated+microgravity+cause+a+significant+reduction+of+key+gene+expression+in+early+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).</li>
<li>Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+human+cell+line+%28NK-92%29+with+phenotypical+and+functional+characteristics+of+activated+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells.</a> Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).</li>
<li>Williams, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+trial+of+NK-92+cells+for+refractory+hematological+malignancies+relapsing+after+autologous+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell.</a> Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).</li>
<li>Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol">https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol</a> (2022).</li>
<li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2022).</li>
<li>Mylabathula, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulated+microgravity+disarms+human+NK-cells+and+inhibits+anti-tumor+cytotoxicity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Astronautica%22%5BJournal%5D)">Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro.</a> Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+simulated+microgravity+on+primary+human+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Astrobiology%22%5BJournal%5D)">Effects of simulated microgravity on primary human NK cells.</a> Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).</li>
<li>Shao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+the+effect+of+simulated+microgravity+on+the+cytotoxicity+of+NK+cells+following+the+DNA+methylation+of+NKG2D+and+the+expression+of+DAP10%5BTitle%5D)+AND+%22Microgravity+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10.</a> Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6(2021).</li>
<li>Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+attachment-independent+biofilm+formation+and+repression+of+hfq+expression+by+low-fluid-shear+culture+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).</li>
<li>Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+air+bubble-isolating+rotating+wall+vessel+bioreactor+for+improved+spheroid%2Forganoid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

W miarę jak ludzkość przygotowuje się do dłuższych misji kosmicznych na Księżyc i Marsa, należy przeprowadzić więcej badań, aby złagodzić poważne zagrożenia dla zdrowia astronautów. Jednym z głównych aspektów środowiska kosmicznego, który wpływa na fizjologię człowieka, jest mikrograwitacja. W tym miejscu opisano metodę hodowli komórkowej służącą do poddawania limfocytów działaniu SMG przy użyciu dostępnego na rynku rotacyjnego systemu hodowli komórek.
Ten protokół zawiera kilka krytycznych kr...

Wykazano, że loty kosmiczne wpływają na wiele aspektów ludzkiej fizjologii, w tym na układ odpornościowy. Wiele badań wykazało dysregulację immunologiczną w wyniku lotów kosmicznych in vivo i ekspozycji na symulowaną mikrograwitację (SMG) in vitro1,2,3,4. Jednym z głównych aspektów środowiska kosmicznego, który wpływa na fizjologię człowieka, jest mikrograwitacja. Mikrograwitacja odnosi się do "nieważkości" doświadczanej z powodu niskich sił grawitacyjnych w środowisku kosmicznym5. W miarę jak ludzkość przygotowuje się do dłuższych misji kosmicznych na Księżyc i Marsa, należy przeprowadzić więcej badań, aby złagodzić poważne zagrożenia dla zdrowia astronautów.
Prawdziwe warunki mikrograwitacji dla badań naukowych można osiągnąć w przestrzeni kosmicznej na pokładzie Międzynarodowej Stacji Kosmicznej (ISS) lub w nanosatelitach wystrzelonych na orbitę; jednak te opcje mogą być niezwykle kosztowne i skomplikowane do zorganizowania. Biorąc pod uwagę obecne ograniczenia w prowadzeniu badań biologicznych w kosmosie, istnieje kilka opcji wywołania prawdziwej mikrograwitacji i pistoletu maszynowego na Ziemi. Istnieją operacje na dużą skalę, które mogą wytwarzać krótkie okresy prawdziwej mikrograwitacji na Ziemi, w tym wieże zrzutowe, loty paraboliczne i rakiety sondażowe. Jednak metody te nie są zbyt odpowiednie do badania wpływu mikrograwitacji na systemy biologiczne, głównie ze względu na krótkie okresy leczenia mikrograwitacją (tj. sekundy do 20 minut). Metody te są omówione bardziej szczegółowo w innym miejscu5,6. Opcje, które są odpowiednie do biologicznej hodowli komórek, obejmują urządzenia na małą skalę, takie jak klinostatyki 2D lub urządzenia z obrotowymi naczyniami ściennymi (RWV) oraz klinostatyki 3D lub maszyny do losowego pozycjonowania (RPM). Urządzenia te mogą być ustawione w inkubatorach do hodowli komórkowych utrzymywanych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i obracają hodowlę komórkową wokół osi poziomej (2D) lub wokół dwóch prostopadłych osi (3D) 5. Należy jednak podkreślić, że te metody hodowli wytwarzają SMG, w przeciwieństwie do prawdziwej mikrograwitacji, która jest najbardziej możliwa do osiągnięcia w kosmosie w kontekście badań biologicznych.
Celem obecnego artykułu jest nakreślenie etapów poddawania limfocytów SMG za pomocą komercyjnie dostępnego urządzenia RWV (Tabela Materiałów), które podpada pod klasyfikację 2D klinostatu. Chociaż producent udostępnia ogólny protokół obsługi tego urządzenia, niniejszy artykuł ma na celu bardziej szczegółowe omówienie kroków rozwiązywania problemów i optymalizacji. W tym artykule omówiono również teorię działania tego urządzenia w celu produkcji SMG w hodowli komórek zawiesinowych, w szczególności w przypadku limfocytów. W tym kontekście hodowla komórek zawiesinowych odnosi się do komórek rosnących swobodnie w uzupełnionych pożywkach hodowlanych, bez przylegania do dodatkowego rusztowania. W zawiesinowej hodowli komórkowej hoduje się wiele typów komórek, w tym limfocyty. Limfocyty to komórki układu odpornościowego, w tym komórki T, B i NK (Natural Killer), które znajdują się w narządach limfatycznych i krwiobiegu7.
Opisany tutaj klinostat RWV 2D działa na zasadzie uśrednianego w czasie unieważniania wektora grawitacji5,6,8,9, przy czym wektor grawitacji jest losowo wybierany poprzez obrót kultury komórkowej na osi poziomej. Osiąga się to poprzez dopasowanie prędkości obrotowej naczynia hodowlanego do prędkości sedymentacji komórek. Tak długo, jak prędkość obrotowa naczynia hodowlanego jest dobrze dopasowana do prędkości sedymentacji komórek, komórki są utrzymywane w swobodnym spadku i nie są zdolne do sedymentacji, jak ma to miejsce w środowisku kosmicznym. Po początkowej fazie przyspieszania, pożywka w naczyniu hodowlanym ostatecznie osiąga z czasem "rotację ciała stałego". Ta rotacja pozioma indukuje również przepływ laminarny w naczyniu do hodowli komórkowej. Tworzy to środowisko "niskiego ścinania", biorąc pod uwagę, że naprężenie ścinające indukowane na komórki przez przepływ laminarny jest znacznie mniejsze niż w przypadku przepływu turbulentnego. Biorąc jednak pod uwagę, że klinostat nie jest systemem doskonałym, wprowadza się pewne małe, laminarne ruchy płynu, które powodują minimalne naprężenia ścinające w komórkach. W związku z tym komórki zawieszone w pożywce są ciągnięte przez ten przepływ podczas obracania. Podczas obrotu poziomego wektor grawitacji działa na komórki i wprowadza je w trajektorię oscylacyjną, jak pokazano na rysunku Rysunek 1. Innym małym źródłem naprężeń ścinających jest spowodowane "opadaniem" komórek przez pożywkę, powodując przepływ laminarny wokół komórek. Gdy naczynie hodowlane obraca się wokół osi poziomej, wektor grawitacji doświadczany przez komórki również się obraca. Z biegiem czasu ten wirujący wektor grawitacji zbliża się średnio do zera; zjawisko to nazywa się uśrednionym w czasie unieważnieniem wektora grawitacji i indukuje stan SMG5,6,8,9. To urządzenie zostało użyte do zbadania wpływu SMG na wiele typów komórek, z których niektóre są opisane w bibliografii10,11,12. Więcej przykładów można znaleźć na stronie producenta urządzenia.
To urządzenie RWV korzysta ze specjalistycznych "naczyń o wysokim współczynniku kształtu" (HARV) dostępnych przez producenta urządzenia. Każdy z tych HARV mieści 10 ml hodowli komórkowej; jednak dostępne są również HARV o pojemności 50 ml. Można użyć HARV o pojemności 10 ml lub 50 ml, w zależności od liczby komórek potrzebnych do wykonania dalszych testów eksperymentalnych, co opisano w dalszej części dyskusji. HARV są wykonane z poliwęglanu i zawierają silikonową membranę natleniającą, która umożliwia wymianę gazową podczas hodowli komórkowej. Utrzymuje to pH pożywki komórkowej i pozwala na efektywne oddychanie komórkowe. Na czole naczynia znajduje się główny port napełniania i dwa zaślepione porty strzykawki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Po załadowaniu kultury komórkowej przez główny port napełniania, dwie strzykawki są ładowane do naczynia, aby pomóc w usuwaniu pęcherzyków. W przypadku korzystania z naczyń o pojemności 10 ml dobrze sprawdzają się dwie strzykawki o pojemności 3 ml. Jedna strzykawka jest dołączona do urządzenia pusta, z całkowicie wciśniętą strzykawką, a druga jest wypełniona 3 ml hodowli komórkowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2E). Są one używane w połączeniu do usuwania pęcherzyków z naczynia, co jest ważne dla utrzymania leczenia SMG. Ogólnie rzecz biorąc, zaleca się ustanowienie dwóch kontroli ujemnych, które można określić jako kontrolę "kolbową" i kontrolę "1G". Kontrola "Kolby" odpowiada komórkom, które są hodowane w standardowej kolbie do hodowli komórek w zawiesinie T25. Kontrola 1G odpowiada komórkom, które są hodowane w specjalistycznym naczyniu hodowlanym o pojemności 10 ml, które jest po prostu umieszczane w inkubatorze (tj. bez poddawania ich działaniu SMG). Zapoznaj się z sekcją Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji na temat elementów sterujących.
Opisana tutaj metoda jest odpowiednia dla każdego badacza, który chce badać wpływ SMG na limfocyty, ze szczególnym naciskiem na komórki NK za pomocą linii komórkowej NK9213. Wyniki tych badań mogą pomóc nam lepiej zrozumieć i złagodzić niekorzystny wpływ lotów kosmicznych na ludzki układ odpornościowy.

<table><tbody><tr><td>Jednorazowe naczynie o wysokim współczynniku kształtu (HARV) (10 ml)</td><td>Synthecon</td><td>D-410</td><td>Naczynia hodowlane sterylizowane gamma (4 w pudełku)</td></tr><tr><td>Strzykawki z końcówką Luer-Lok (3 ml)</td><td>309657 BD</td><td></td><td>Do podłączenia do 10 mL</td></tr><tr><td>HARV NK92 Linia komórkowa</td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td></td></tr><tr><td>Obrotowy system hodowli komórek (RCCS)</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-4D</td><td>Obrotowe naczynie ścienne; Klinostat 2D</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe Sarsedt 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-809-220</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe Sarsedt 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-809-218</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pipety serologiczne Sarsedt</td><td>Fisher Scientific</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli zawiesinowych T25</td><td>Sarsedt</td><td>83.3910.502</td><td>Do kontroli kolb</td></tr></tbody></table>

hodowla limfocytów w symulowanej mikrograwitacji przy użyciu rotacyjnego systemu hodowli komórek

Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System

Biorąc pod uwagę obecne ograniczenia prowadzenia badań biologicznych w kosmosie, istnieje kilka opcji poddania hodowli komórkowej symulowanej mikrograwitacji (SMG) na Ziemi. Opcje te różnią się metodami, zasadami i przydatnością do stosowania z hodowlą komórek zawiesinowych. W tym miejscu opisano metodę hodowli komórkowej polegającą na poddaniu limfocytów symulowanej mikrograwitacji przy użyciu dostępnego na rynku systemu rotacyjnej hodowli komórek, znanego również jako klinostat 2D lub urządzenie o obrotowych ściankach (RWV). Ta metoda hodowli komórkowej wykorzystuje zasadę uśrednionego w czasie unieważniania wektora grawitacji do symulacji mikrograwitacji poprzez obracanie komórek wokół osi poziomej. Komórki hodowane w tym systemie mogą być zbierane i wykorzystywane w wielu różnych testach eksperymentalnych w celu oceny wpływu symulowanej mikrograwitacji na funkcję komórkową i fizjologię. Technika hodowli może się nieznacznie różnić w zależności od rodzaju użytej komórki lub linii, ale opisana tutaj metoda może być zastosowana do dowolnej hodowli komórek zawiesinowych.

Tę metodę hodowli uznaje się za skuteczną, jeśli 1) proliferacja komórek jest w przybliżeniu spójna we wszystkich grupach kontrolnych (a idealnie także we wszystkich grupach eksperymentalnych), 2) proliferacja jest odpowiednia w stosunku do gęstości zasiewu, czasu trwania inkubacji oraz czasu podwojenia danego typu/linii komórkowej oraz 3) żywotność zebranych komórek wynosi 85% lub więcej (Tabela 1). Idealnie otrzymane komórki powinny być tak samo zdrowe, jak w przypadku standardowej hodowli komórkowej, ...

To jest przewodnik krok po kroku dotyczący korzystania z dostępnego na rynku systemu rotacyjnej hodowli komórkowej do hodowli limfocytów w symulowanej mikrograwitacji przy użyciu specjalistycznych jednorazowych naczyń hodowlanych. Ta metoda hodowli może być stosowana do każdej hodowli komórek zawiesinowych.

Hodowla limfocytów w symulowanej mikrograwitacji przy użyciu rotacyjnego systemu hodowli komórek

Given the current limitations of conducting biological research in space, a few options exist for subjecting cell culture to simulated microgravity (SMG) ...

Technika ta pozwala nam badać wpływ symulowanej mikrograwitacji na komórki odpornościowe, aby pomóc nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób aspekty środowiska kosmicznego wpływają na fizjologię człowieka na poziomie molekularnym. Technika ta jest ekonomicznie wykonalna i stosunkowo łatwa do skonfigurowania i utrzymania w porównaniu z wysyłaniem hodowli komórkowych w przestrzeń kosmiczną lub innymi metodami poddawania hodowli komórkowej symulowanej mikrograwitacji na Ziemi. Zaleca się powolne napełnianie naczyń, aby uniknąć przelania i rozlania.Po wstępnym usunięciu pęcherzyków należy upewnić się, że naczynia są całkowicie wypełnione za pomocą strzykawek. Zminimalizuje to ryzyko tworzenia się dużych pęcherzyków przez cały czas trwania zabiegu. Zacznij od wyjęcia naczyń hodowlanych z plastikowego opakowania.Oznacz każde naczynie na brzegu zgodnie z typem używanej komórki lub linią, niezależnie od tego, czy jest to kontrola, czy leczenie, oraz wszelkie inne istotne informacje. Ustabilizuj naczynie i ostrożnie otwórz otwór wlewu, nie dotykając kołka zaślepki portu wlewu ani O-ringu. Umieść nakrętkę na podkładce etanolowej z kołkiem lub O-ringiem skierowanym do góry, podczas gdy naczynie jest napełnione.Nie zdejmować nasadek z portów strzykawki. Napełnić naczynie 10 ml odpowiedniej kompletnej pożywki do hodowli komórkowej za pomocą sterylnej pipety serologicznej i ostrożnie umieścić nakrętkę na króćcu napełniania. Upewnij się, że zaślepki portu strzykawki i port napełniania są dobrze zamknięte.Następnie umieść napełnione naczynia w inkubatorze, wykonując kolejne kroki, aby przygotować naczynia do hodowli komórek. Pobrać naczynia zagruntowane pożywką z inkubatora. W celu kontroli w kolbie należy załadować kolbę hodowlaną zawiesiny T25 10 ml kultury komórkowej z podstawki przygotowanej powyżej.Dodać 10 ml podstawowej hodowli komórkowej do oddzielnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml, która zostanie użyta do załadowania strzykawek. Odkręć zaślepki portu strzykawki, aby wyjąć je z naczynia i upewnij się, że kurki kolby są w pozycji otwartej. Ustabilizuj naczynie i ostrożnie otwórz otwór wlewu, nie dotykając kołka zaślepki portu wlewu ani O-ringu.Umieść nakrętkę na podkładce etanolowej z kołkiem lub O-ringiem skierowanym do góry podczas napełniania naczynia. Upewnij się, że kurki są w pozycji otwartej. Naczynie można opróżnić, wlewając pożywkę z naczynia do pojemnika na odpady za pomocą pipety serologicznej.Alternatywnie, można zassać pożywkę za pomocą sterylnego szkła obok pipety podłączonej do systemu próżniowego. Podczas korzystania z pipety lub systemu próżniowego należy pamiętać, aby nie dotykać membrany natleniającej, ponieważ może to spowodować jej uszkodzenie i uniemożliwić korzystanie z naczynia. Szczelnie zamknąć stożkową probówkę o pojemności 50 ml zawierającą przygotowaną hodowlę komórek podstawowych i delikatnie odwrócić ją kilka razy, aby dokładnie wymieszać zawartość.Pobrać 10 ml bulionu hodowli komórkowych z probówki o pojemności 50 ml za pomocą świeżej, sterylnej pipety serologicznej. Podnieś naczynie i przechyl je tak, aby otwór napełniania był skierowany do góry. Następnie ostrożnie dozuj bulion z kultur komórkowych do naczynia przez otwór napełniania.Napełnij naczynie aż do końcówki otworu napełniania, jednocześnie przechylając naczynie z powrotem w dół, aby uniknąć rozlania. Należy uważać, aby nie dotknąć pipetą membrany natleniającej, ponieważ jest ona bardzo delikatna. Po załadowaniu naczynia ostrożnie załóż z powrotem korek portu wlewu, nie dotykając O-ringu.Wyjąć pierwszą strzykawkę o pojemności 3 ml z opakowania i przepompować ją kilka razy, aby ją poluzować. Następnie podłączyć strzykawkę do jednego z portów strzykawki, upewniając się, że strzykawka jest całkowicie wciśnięta. Szczelnie zamknij stożkową probówkę o pojemności 15 ml zawierającą 10 ml podwielokrotnej hodowli komórkowej i delikatnie odwróć ją kilka razy, aby dokładnie wymieszać zawartość.Podobnie, wyjąć drugą strzykawkę o pojemności 3 ml z opakowania i przepompować ją kilka razy. Następnie ostrożnie zanurzyć tę strzykawkę w kulturze komórkowej z stożkowej probówki o pojemności 15 ml i pobrać trochę hodowli. Zminimalizuj pęcherzyki powietrza, całkowicie dozując strzykawkę z powrotem do probówki i pobierając 3 ml kultury.Podłączyć napełnioną strzykawkę do pozostałego portu strzykawki i ostrożnie zdezynfekować strzykawki oraz wokół portu napełniania za pomocą podkładki etanolowej. Nie dopuścić do przedostania się etanolu na membranę natleniającą. Powtórz ten proces dla pozostałych naczyń.Jeśli w stożkowej probówce o pojemności 50 ml do ostatniego naczynia pozostała niewystarczająca ilość hodowli komórkowej, odzyskaj pozostałą ilość z stożkowej probówki o pojemności 15 ml używanej do ładowania strzykawek. Upewnij się, że zawory odcinające port strzykawki są zamknięte, aby ograniczyć migrację komórek i pęcherzyków ze strzykawek do naczyń. Odwróć naczynie do góry nogami i uderz nim kilka razy w bok, aby zebrać początkowe bąbelki.Szybko odwróć naczynie z powrotem do góry, a następnie pod lekkim kątem skierowanym w bok, tak aby wszystkie bąbelki unosiły się na górną stronę naczynia. Manewruj bąbelkami pod portem za pomocą pustej strzykawki i obserwuj, jak zaczynają wchodzić do portu. Otworzyć oba zawory odcinające portu strzykawki.Delikatnie uderzyć w naczynie, aby pęcherzyki powietrza uniosły się do pustej strzykawki. Powoli zasysać większe pęcherzyki pustą strzykawką, jednocześnie ostrożnie wciskając pełną strzykawkę, aby utrzymać ciśnienie w naczyniu, aby membrana natleniająca nie pękła. Powtórz ten proces kilka razy, aby upewnić się, że wszystkie pęcherzyki zostały usunięte.Gdy pęcherzyki zostaną skutecznie usunięte, zamknij kran portu strzykawki. Trzymać strzykawki włączone podczas leczenia, aby umożliwić późniejsze usunięcie pęcherzyków, upewniając się, że objętość w obu strzykawkach jest w przybliżeniu równa. Ostrożnie przetrzyj powierzchnię obrotowej podstawy i taśmowego 70% etanolem.Upewnij się, że taśmowy jest podłączony do zasilacza. Umieść obrotową podstawę w inkubatorze i przymocuj taśmowy do podstawy. Umieść zasilacz w pobliżu, ale na zewnątrz inkubatora.Przymocuj naczynie zabiegowe SMG, wyrównując gwinty naczynia z obrotowym kołkiem i delikatnie obracając obrotowy kołek na podstawie w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Upewnij się, że naczynie jest dobrze zamocowane. Utrzymuj inkubator na poziomie około 100% wilgotności, napełniając tackę na wodę wodą z autoklawu RO.Dostosuj prędkość obrotową inkubatora do prędkości sedymentacji komórek, tak aby komórki nie wypadały przez pożywkę. W pierwszym dniu przygotowania do leczenia należy co kilka godzin sprawdzać, czy nie tworzą się pęcherzyki, zgodnie z opisem w rękopisie tekstu. Usuwaj bąbelki co najmniej raz dziennie, aż do końca pożądanej długości zabiegu.Po upływie planowanej długości zabiegu należy zatrzymać obrót i zdemontować aparat. Wyjmij naczynie zabiegowe, delikatnie przytrzymując naczynie nieruchomo, jednocześnie obracając obrotowy kołek urządzenia w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara. Przenieść kolbę kontrolną, naczynie kontrolne i poddane działaniu środka naczynie do sterylnej komory bezpieczeństwa biologicznego.Weź każde naczynie z wyjątkiem kolby kontrolnej i odwróć ją tak, aby była skierowana w dół. Następnie delikatnie uderz w niego, aby doprowadzić wszystkie komórki do zawiesiny. Następnie obróć naczynie na bok z portem napełniania skierowanym do dołu i uderz nim ponownie, aby poprowadzić komórki w kierunku portu napełniania w celu skutecznego zasysania.Z każdym naczyniem należy obchodzić się indywidualnie. Odkręcić strzykawki od dwóch portów i wsypać je do odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne. Otworzyć kurki na portach strzykawki.Ostrożnie zdjąć korek portu napełniania i pobrać zawartość za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 10 ml, przechylając naczynie podczas opróżniania. Dozować zawartość wszystkich grup kontrolnych i badanych do indywidualnie oznakowanych stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Zamknij każdą tubkę i delikatnie odwróć je kilka razy, aby upewnić się, że są odpowiednio wymieszane.Należy zastosować preferowaną metodę określania stężenia i żywotności otrzymanej kultury komórkowej w celu przygotowania się do kolejnych testów eksperymentalnych. Początkową żywotność linii komórkowej NK-92 i gęstość osadzenia porównano z uzyskaną żywotnością końcową i stężeniami końcowymi. Po 72-godzinnym leczeniu SMG porównano dwa przypadki negatywnych i pozytywnych wyników.Dla porównania, optymalny zakres stężeń zastosowanej linii komórkowej NK-92 wynosił od 0,3 do 1,2 miliona komórek na mililitr przy czasie podwojenia wynoszącym około dwóch do trzech dni. Proliferacja w grupie leczonej SMG była w przybliżeniu równa w grupie kontrolnej i leczonej. Parametry te były niezbędne dla powodzenia dalszego eksperymentu, a uzyskane komórki z dwóch grup kontrolnych wypadły podobnie w dalszych testach eksperymentalnych.Kluczowe znaczenie ma monitorowanie i uwzględnianie powstawania pęcherzyków w trakcie leczenia, zwłaszcza w hodowli komórkowej poddawanej symulowanej mikrograwitacji. Tworzenie się dużych pęcherzyków może spowodować zakłócenia dynamiki płynów w naczyniu, a to zasadniczo zaneguje symulowane warunki mikrograwitacji.

culturing-lymphocytes-simulated-microgravity-using-rotary-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano rotujący system hodowli komórkowej, który umożliwia wzrost komórek nabłonkowych w warunkach fizjologicznych, co prowadzi do tworzenia trójwymiarowych agregatów komórkowych. Powstałe agregaty wykazują cechy podobne do tych obserwowanych in vivo, których nie stwierdzono w konwencjonalnych modelach hodowli, i służą jako dokładniejszy organotypowy system modelowy dla wielu badań naukowych.

Hodowla i zastosowania trójwymiarowych modeli komórek nabłonkowych otrzymywanych w bioreaktorze z rotującą ścianką (Rotating Wall Vessel)

Komórki rosnące w środowisku trójwymiarowym (3D) reprezentują wyraźną poprawę w stosunku do hodowli komórek w środowiskach 2D (np. kolby lub szalki). W tym artykule opisano rozwój wielokomórkowego 3-wymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej jelita ludzkiego hodowanej w warunkach mikrograwitacji zapewnianej przez bioreaktory o obrotowych ściankach i naczyniach (RWV).

Opracowanie wielokomórkowego trójwymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej jelit człowieka hodowanej w warunkach mikrograwitacji

Nierównomierna utrata podłoża z płytek mikromiareczkowych wpływa na odtwarzalność jednorodnego tworzenia sferoidów guza wielokomórkowego. Poprawa warunków hodowli w celu zmniejszenia znacznych strat pożywki poprawi odtwarzalność tworzenia sferoidów oraz wyniki testów opartych na sferoidach z wykorzystaniem techniki nakładania cieczy.

Warunek hodowli redukujący parowanie zwiększa odtwarzalność tworzenia wielokomórkowych sferoidów na płytkach mikromiareczkowych

Wysoce obiecującą techniką generowania konstruktów tkankowych bez użycia matrycy jest hodowla komórek w symulowanych warunkach mikrograwitacji. Korzystając z systemu hodowli rotacyjnej, zbadaliśmy wzrost pęcherzyków jajnikowych i dojrzewanie oocytów pod kątem przeżycia pęcherzyków, morfologii, wzrostu i funkcji oocytów w symulowanych warunkach mikrograwitacji.

In vitro Wzrost pęcherzyków przedantralnych myszy w symulowanej mikrograwitacji

Tutaj prezentujemy protokół korzystania z naczyń w kształcie litery O, wyspecjalizowanych do hodowli zawiesinowych agregatów komórkowych, z wytrząsaniem orbitalnym. Komórki HEK293 wyhodowane w tej torbie tworzą bardziej jednorodne agregaty niż te hodowane w konwencjonalnych naczyniach hodowlanych.

Orbitalna hodowla wstrząsowa komórek ssaków w naczyniach w kształcie litery O w celu wytworzenia jednolitych agregatów

Prezentujemy napędzane silnikiem odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe, które może hodować sferoidy komórek. Za pomocą tego urządzenia sferoidy jednego lub wielu typów komórek mogą być łatwo hodowane w warunkach wysokiej grawitacji.

Platforma lab-on-a-CD do generowania wielokomórkowych trójwymiarowych sferoid

W dobie immunoterapii i profilowania genomu pojedynczej komórki, biologia nowotworów wymaga nowatorskich narzędzi in vitro i obliczeniowych do badania interfejsu nowotworowo-immunologicznego we właściwym kontekście czasoprzestrzennym. Opisujemy protokoły wykorzystania kokultur mikroprzepływowych immunologicznych z nowotworami w warunkach 2D i 3D, kompatybilnych z dynamicznym, wieloparametrycznym monitorowaniem funkcji komórkowych.

Mikroprzepływowe modele kohodowli do analizy odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowiskach nowotworowych in vitro

Ten protokół przedstawia metodę hodowli i 3D hodowli komórek podobnych do ameloblastów w mikrograwitacji, aby zachować ich wydłużony i spolaryzowany kształt, a także ekspresję białek specyficzną dla szkliwa. Opisano również warunki hodowli konstruktów inżynierii przyzębia i narządów płuc w warunkach mikrograwitacji.

Rozmnażanie komórek i narządów zębów i dróg oddechowych w mikrograwitacji

Tutaj prezentujemy skuteczny, łatwy i szybki protokół hodowli 3D do tworzenia sferoid dwóch linii komórkowych danio pręgowanego (Danio rerio): ZEM2S (zarodek) i ZFL (normalny hepatocyt).

Metoda hodowli 3D sferoid embrionalnych i wątrobowych linii komórkowych danio pręgowanego

Przedstawiamy protokół do hodowli sferoidów o wysokiej powtarzalności i ich charakterystyki fenotypowej za pomocą przechwytywania obrazów i proteomiki.

Półautomatyczna analiza fenotypowa funkcjonalnych hodowli komórek sferoidalnych 3D

W tym artykule proponujemy protokół do produkcji hybrydowych sferoidów za pomocą pęsety optycznej. Metoda ta pozwala na precyzyjną kontrolę wczesnych etapów procesu powstawania sferoidów, co jest nieosiągalne innymi metodami.

Wykorzystanie pęsety optycznej do generowania sferoid hybrydowych

Poznaj hodowlę limfocytów w symulowanej mikrograwitacji przy użyciu rotacyjnego systemu hodowli komórek. Ta metoda pozwala badać zachowanie komórek immunologicznych w warunkach mikrograwitacji.

Hodowla limfocytów w symulowanej mikrograwitacji przy użyciu rotacyjnego systemu hodowli komórek

Przeglądaj więcej filmów