Hodowla limfocytów w symulowanej mikrograwitacji przy użyciu rotacyjnego systemu hodowli komórek

Technika ta pozwala nam badać wpływ symulowanej mikrograwitacji na komórki odpornościowe, aby pomóc nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób aspekty środowiska kosmicznego wpływają na fizjologię człowieka na poziomie molekularnym. Technika ta jest ekonomicznie wykonalna i stosunkowo łatwa do skonfigurowania i utrzymania w porównaniu z wysyłaniem hodowli komórkowych w przestrzeń kosmiczną lub innymi metodami poddawania hodowli komórkowej symulowanej mikrograwitacji na Ziemi. Zaleca się powolne napełnianie naczyń, aby uniknąć przelania i rozlania.

Po wstępnym usunięciu pęcherzyków należy upewnić się, że naczynia są całkowicie wypełnione za pomocą strzykawek. Zminimalizuje to ryzyko tworzenia się dużych pęcherzyków przez cały czas trwania zabiegu. Zacznij od wyjęcia naczyń hodowlanych z plastikowego opakowania.

Oznacz każde naczynie na brzegu zgodnie z typem używanej komórki lub linią, niezależnie od tego, czy jest to kontrola, czy leczenie, oraz wszelkie inne istotne informacje. Ustabilizuj naczynie i ostrożnie otwórz otwór wlewu, nie dotykając kołka zaślepki portu wlewu ani O-ringu. Umieść nakrętkę na podkładce etanolowej z kołkiem lub O-ringiem skierowanym do góry, podczas gdy naczynie jest napełnione.

Nie zdejmować nasadek z portów strzykawki. Napełnić naczynie 10 ml odpowiedniej kompletnej pożywki do hodowli komórkowej za pomocą sterylnej pipety serologicznej i ostrożnie umieścić nakrętkę na króćcu napełniania. Upewnij się, że zaślepki portu strzykawki i port napełniania są dobrze zamknięte.

Następnie umieść napełnione naczynia w inkubatorze, wykonując kolejne kroki, aby przygotować naczynia do hodowli komórek. Pobrać naczynia zagruntowane pożywką z inkubatora. W celu kontroli w kolbie należy załadować kolbę hodowlaną zawiesiny T25 10 ml kultury komórkowej z podstawki przygotowanej powyżej.

Dodać 10 ml podstawowej hodowli komórkowej do oddzielnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml, która zostanie użyta do załadowania strzykawek. Odkręć zaślepki portu strzykawki, aby wyjąć je z naczynia i upewnij się, że kurki kolby są w pozycji otwartej. Ustabilizuj naczynie i ostrożnie otwórz otwór wlewu, nie dotykając kołka zaślepki portu wlewu ani O-ringu.

Umieść nakrętkę na podkładce etanolowej z kołkiem lub O-ringiem skierowanym do góry podczas napełniania naczynia. Upewnij się, że kurki są w pozycji otwartej. Naczynie można opróżnić, wlewając pożywkę z naczynia do pojemnika na odpady za pomocą pipety serologicznej.

Alternatywnie, można zassać pożywkę za pomocą sterylnego szkła obok pipety podłączonej do systemu próżniowego. Podczas korzystania z pipety lub systemu próżniowego należy pamiętać, aby nie dotykać membrany natleniającej, ponieważ może to spowodować jej uszkodzenie i uniemożliwić korzystanie z naczynia. Szczelnie zamknąć stożkową probówkę o pojemności 50 ml zawierającą przygotowaną hodowlę komórek podstawowych i delikatnie odwrócić ją kilka razy, aby dokładnie wymieszać zawartość.

Pobrać 10 ml bulionu hodowli komórkowych z probówki o pojemności 50 ml za pomocą świeżej, sterylnej pipety serologicznej. Podnieś naczynie i przechyl je tak, aby otwór napełniania był skierowany do góry. Następnie ostrożnie dozuj bulion z kultur komórkowych do naczynia przez otwór napełniania.

Napełnij naczynie aż do końcówki otworu napełniania, jednocześnie przechylając naczynie z powrotem w dół, aby uniknąć rozlania. Należy uważać, aby nie dotknąć pipetą membrany natleniającej, ponieważ jest ona bardzo delikatna. Po załadowaniu naczynia ostrożnie załóż z powrotem korek portu wlewu, nie dotykając O-ringu.

Wyjąć pierwszą strzykawkę o pojemności 3 ml z opakowania i przepompować ją kilka razy, aby ją poluzować. Następnie podłączyć strzykawkę do jednego z portów strzykawki, upewniając się, że strzykawka jest całkowicie wciśnięta. Szczelnie zamknij stożkową probówkę o pojemności 15 ml zawierającą 10 ml podwielokrotnej hodowli komórkowej i delikatnie odwróć ją kilka razy, aby dokładnie wymieszać zawartość.

Podobnie, wyjąć drugą strzykawkę o pojemności 3 ml z opakowania i przepompować ją kilka razy. Następnie ostrożnie zanurzyć tę strzykawkę w kulturze komórkowej z stożkowej probówki o pojemności 15 ml i pobrać trochę hodowli. Zminimalizuj pęcherzyki powietrza, całkowicie dozując strzykawkę z powrotem do probówki i pobierając 3 ml kultury.

Podłączyć napełnioną strzykawkę do pozostałego portu strzykawki i ostrożnie zdezynfekować strzykawki oraz wokół portu napełniania za pomocą podkładki etanolowej. Nie dopuścić do przedostania się etanolu na membranę natleniającą. Powtórz ten proces dla pozostałych naczyń.

Jeśli w stożkowej probówce o pojemności 50 ml do ostatniego naczynia pozostała niewystarczająca ilość hodowli komórkowej, odzyskaj pozostałą ilość z stożkowej probówki o pojemności 15 ml używanej do ładowania strzykawek. Upewnij się, że zawory odcinające port strzykawki są zamknięte, aby ograniczyć migrację komórek i pęcherzyków ze strzykawek do naczyń. Odwróć naczynie do góry nogami i uderz nim kilka razy w bok, aby zebrać początkowe bąbelki.

Szybko odwróć naczynie z powrotem do góry, a następnie pod lekkim kątem skierowanym w bok, tak aby wszystkie bąbelki unosiły się na górną stronę naczynia. Manewruj bąbelkami pod portem za pomocą pustej strzykawki i obserwuj, jak zaczynają wchodzić do portu. Otworzyć oba zawory odcinające portu strzykawki.

Delikatnie uderzyć w naczynie, aby pęcherzyki powietrza uniosły się do pustej strzykawki. Powoli zasysać większe pęcherzyki pustą strzykawką, jednocześnie ostrożnie wciskając pełną strzykawkę, aby utrzymać ciśnienie w naczyniu, aby membrana natleniająca nie pękła. Powtórz ten proces kilka razy, aby upewnić się, że wszystkie pęcherzyki zostały usunięte.

Gdy pęcherzyki zostaną skutecznie usunięte, zamknij kran portu strzykawki. Trzymać strzykawki włączone podczas leczenia, aby umożliwić późniejsze usunięcie pęcherzyków, upewniając się, że objętość w obu strzykawkach jest w przybliżeniu równa. Ostrożnie przetrzyj powierzchnię obrotowej podstawy i taśmowego 70% etanolem.

Upewnij się, że taśmowy jest podłączony do zasilacza. Umieść obrotową podstawę w inkubatorze i przymocuj taśmowy do podstawy. Umieść zasilacz w pobliżu, ale na zewnątrz inkubatora.

Przymocuj naczynie zabiegowe SMG, wyrównując gwinty naczynia z obrotowym kołkiem i delikatnie obracając obrotowy kołek na podstawie w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Upewnij się, że naczynie jest dobrze zamocowane. Utrzymuj inkubator na poziomie około 100% wilgotności, napełniając tackę na wodę wodą z autoklawu RO.

Dostosuj prędkość obrotową inkubatora do prędkości sedymentacji komórek, tak aby komórki nie wypadały przez pożywkę. W pierwszym dniu przygotowania do leczenia należy co kilka godzin sprawdzać, czy nie tworzą się pęcherzyki, zgodnie z opisem w rękopisie tekstu. Usuwaj bąbelki co najmniej raz dziennie, aż do końca pożądanej długości zabiegu.

Po upływie planowanej długości zabiegu należy zatrzymać obrót i zdemontować aparat. Wyjmij naczynie zabiegowe, delikatnie przytrzymując naczynie nieruchomo, jednocześnie obracając obrotowy kołek urządzenia w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara. Przenieść kolbę kontrolną, naczynie kontrolne i poddane działaniu środka naczynie do sterylnej komory bezpieczeństwa biologicznego.

Weź każde naczynie z wyjątkiem kolby kontrolnej i odwróć ją tak, aby była skierowana w dół. Następnie delikatnie uderz w niego, aby doprowadzić wszystkie komórki do zawiesiny. Następnie obróć naczynie na bok z portem napełniania skierowanym do dołu i uderz nim ponownie, aby poprowadzić komórki w kierunku portu napełniania w celu skutecznego zasysania.

Z każdym naczyniem należy obchodzić się indywidualnie. Odkręcić strzykawki od dwóch portów i wsypać je do odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne. Otworzyć kurki na portach strzykawki.

Ostrożnie zdjąć korek portu napełniania i pobrać zawartość za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 10 ml, przechylając naczynie podczas opróżniania. Dozować zawartość wszystkich grup kontrolnych i badanych do indywidualnie oznakowanych stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Zamknij każdą tubkę i delikatnie odwróć je kilka razy, aby upewnić się, że są odpowiednio wymieszane.

Należy zastosować preferowaną metodę określania stężenia i żywotności otrzymanej kultury komórkowej w celu przygotowania się do kolejnych testów eksperymentalnych. Początkową żywotność linii komórkowej NK-92 i gęstość osadzenia porównano z uzyskaną żywotnością końcową i stężeniami końcowymi. Po 72-godzinnym leczeniu SMG porównano dwa przypadki negatywnych i pozytywnych wyników.

Dla porównania, optymalny zakres stężeń zastosowanej linii komórkowej NK-92 wynosił od 0,3 do 1,2 miliona komórek na mililitr przy czasie podwojenia wynoszącym około dwóch do trzech dni. Proliferacja w grupie leczonej SMG była w przybliżeniu równa w grupie kontrolnej i leczonej. Parametry te były niezbędne dla powodzenia dalszego eksperymentu, a uzyskane komórki z dwóch grup kontrolnych wypadły podobnie w dalszych testach eksperymentalnych.

Kluczowe znaczenie ma monitorowanie i uwzględnianie powstawania pęcherzyków w trakcie leczenia, zwłaszcza w hodowli komórkowej poddawanej symulowanej mikrograwitacji. Tworzenie się dużych pęcherzyków może spowodować zakłócenia dynamiki płynów w naczyniu, a to zasadniczo zaneguje symulowane warunki mikrograwitacji.